從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液中制備高純度紫杉醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及紫杉醇的制備方法，尤其是涉及從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液中制備高純度紫杉醇的方法，其包括將細(xì)胞培養(yǎng)液過(guò)濾、經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附富集，得粗提物、經(jīng)常壓堿性氧化鋁柱層析、經(jīng)過(guò)C18反相高效制備液相分離，分部收集組分、離心獲取沉淀、將沉淀冷凍干燥后得高純度紫杉醇單體。本發(fā)明選用紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞系培養(yǎng)液作為原材料，與紅豆杉枝葉、樹(shù)皮等提取相比，所含色素、脂質(zhì)等雜志更少，相比于真菌和細(xì)菌發(fā)酵液，其所含紫杉醇更高，該材料方便提??；同時(shí)從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液中直接用大孔樹(shù)脂富集紫杉醇，省去大量有機(jī)溶劑使用，工藝簡(jiǎn)單，節(jié)約環(huán)保，回收率高，獲得的紫杉醇純度高。
【專利說(shuō)明】從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液中制備高純度紫杉醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及紫杉醇的制備方法，尤其是涉及從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液中制備高純度紫杉醇的方法。
【背景技術(shù)】[0002]紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，也是目前所了解的惟一一種可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物。紫杉醇是全球最暢銷的抗腫瘤藥物，同時(shí)也是世界上公認(rèn)的廣譜強(qiáng)活性抗癌藥物，隨著臨床用途的急劇擴(kuò)大，國(guó)際醫(yī)藥市場(chǎng)對(duì)紫杉醇原料藥有巨大的需求。[0003]近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)紫杉醇制備多從植物的樹(shù)皮、枝葉等組織提取，工藝復(fù)雜，溶劑能量消耗較多，成本較高。野生紅豆杉受到法律保護(hù)后，只能從人工栽培的紅豆杉獲取樹(shù)皮，但紅豆杉生長(zhǎng)緩慢，限制了樹(shù)皮原料來(lái)源。目前，還有一些方法:如通過(guò)半合成方法制備紫杉醇，但其必需先從植物材料中獲取紫杉醇前提化合物，所以也會(huì)受到資源限制；還如紫杉醇全合成方法，但其制備步驟及其復(fù)雜，成本很高，至今無(wú)法工業(yè)化生產(chǎn)；再如從真菌和細(xì)菌發(fā)酵液提取紫杉醇，因其含量太低，目前沒(méi)有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。美國(guó)與意大利在利用細(xì)胞培養(yǎng)法直接生產(chǎn)紫杉醇原料藥發(fā)展較快，迄今為止，全球利用紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)紫杉醇的總規(guī)模每年仍只有數(shù)千升，在目前全球紫杉醇原料總產(chǎn)量中，細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)的紫杉醇所占份額極小。但由于細(xì)胞培養(yǎng)法不會(huì)消耗寶貴的紫杉樹(shù)或紅豆杉樹(shù)資源，故這一方法屬于“綠色生產(chǎn)新工藝”并代表著紫杉醇原料藥產(chǎn)業(yè)的未來(lái)，具有有廣闊的發(fā)展前景和市場(chǎng)增長(zhǎng)空間。[0004]目前，植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的一個(gè)顯著特點(diǎn)是培養(yǎng)液體積龐大，紫杉醇在培養(yǎng)液中的含量比較低，一般在20mg/L左右，它既有一部分分泌到培養(yǎng)液中，還有一大部分存留在細(xì)胞中?，F(xiàn)有技術(shù)中，出現(xiàn)了從細(xì)胞內(nèi)提取紫杉醇的方法，其是將收獲期的細(xì)胞與培養(yǎng)液分離，然后將細(xì)胞烘干后提取，在這種方法中，那些因分泌或部分細(xì)胞破裂流失到培養(yǎng)液中的的紫杉醇將被丟棄，導(dǎo)致回收率較低；還出現(xiàn)了從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液濾液中富集提取紫杉醇的方法，其是用大量有機(jī)溶劑對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行液-液萃取。這種方法必然會(huì)導(dǎo)致大量有機(jī)溶劑耗費(fèi)和環(huán)境憂患，還要投入大量資金用于購(gòu)置大尺寸的液-液萃取設(shè)備；還出現(xiàn)了采用膜分離濃縮技術(shù)從從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法，盡管該方法可省去溶劑萃取步驟，能除去一部分雜質(zhì)，但該方法操作麻煩，回收率不高。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液中制備高純度紫杉醇的新方法，該方法不僅工藝簡(jiǎn)單，而且回收率高。[0006]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案為:從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液中制備高純度紫杉醇的方法，其包括以下步驟:(1)將紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行固液分離，得到原液和細(xì)胞；然后將細(xì)胞破壁后過(guò)濾，得到濾液和濾渣；再將所述原液與濾液混合；
(2)將上述混合液體通過(guò)非極性大孔樹(shù)脂吸附層析柱富集，然后用蒸餾水沖洗，再用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，并將洗脫液中的乙醇蒸干；
(3)向上述蒸干乙醇的洗脫液中加入萃取劑，進(jìn)行兩次液液萃取，收集有機(jī)溶劑層，低溫真空干燥，得到大孔樹(shù)脂柱富集紫杉醇粗品；
(4)將上述粗品轉(zhuǎn)載于用堿性氧化鋁做填料的層析柱，用洗脫溶液進(jìn)行洗脫，分部收集洗脫部分，并真空干燥，得到樣品；
(5)將上述樣品通過(guò)C18高效液相色譜柱純化，然后用含甲醇溶液作流動(dòng)相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置于通風(fēng)廚，揮發(fā)有機(jī)相，待出現(xiàn)結(jié)晶后轉(zhuǎn)至4°C冰箱放置24h，離心收集一部分晶體，然后將上清液繼續(xù)放置使結(jié)晶完全，離心收集另一部分晶體，再將收集的全部晶體冷凍干燥，得到高純度紫杉醇單體。
[0007]作為優(yōu)選，步驟(1)中將所述培養(yǎng)液離心，獲得細(xì)胞，然后將細(xì)胞用勻漿機(jī)勻漿，再將勻漿后的糊狀流體加入等體積的乙醇進(jìn)行超聲提取，并離心過(guò)濾后得到所述濾液。
[0008] 作為另一種優(yōu)選，步驟(1)中將所述培養(yǎng)液經(jīng)砂芯漏斗抽濾或經(jīng)板框過(guò)濾，得到細(xì)胞，然后將細(xì)胞用勻漿機(jī)勻漿，再將勻漿后的糊狀流體加入等體積的乙醇進(jìn)行超聲提取，并用砂芯漏斗抽濾，得到所述濾液。
[0009]進(jìn)一步地，步驟(2)中采用體積濃度為75~85%乙醇溶液進(jìn)行洗脫。
[0010]進(jìn)一步地，向蒸干乙醇的洗脫液中加入等體積的萃取劑，萃取劑為1:1的二氯甲烷與水或?yàn)?:1的三氯甲烷與水。
[0011]進(jìn)一步地，步驟(4)采用三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
(I)本發(fā)明選用紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞系培養(yǎng)液作為原材料，與紅豆杉枝葉、樹(shù)皮等提取相t匕，所含色素、脂質(zhì)等雜質(zhì)更少，相比于真菌和細(xì)菌發(fā)酵液，其所含紫杉醇更高，該材料方便提取，所含雜質(zhì)更少。
[0012](2)從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液中直接用大孔樹(shù)脂富集紫杉醇，相對(duì)于溶劑提取，節(jié)約了大量有機(jī)溶劑使用；相對(duì)于膜分離技術(shù)，操作更簡(jiǎn)便，回收率更高；且大量有機(jī)溶劑采用乙醇，環(huán)保安全；
(3)本發(fā)明的總回收率在90%以上，利用高效制備液相能很好控制產(chǎn)品純度，獲得的紫杉醇純度高，可大于99.5% ；
(4)高效制備液相分離紫杉醇的同時(shí)，可以分部收集其他紫杉烷類化合物；
(5)整個(gè)工藝流程簡(jiǎn)便，易于放大產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為本發(fā)明的流程框圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合圖1對(duì)本發(fā)明的方法作進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明:
本方法是:(I)將紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行固液分離，得到原液和細(xì)胞，固液分離可采用用離心、板框過(guò)濾、砂芯漏斗抽濾等方式，大規(guī)模生產(chǎn)一般用板框過(guò)濾或者離心方式；然后將細(xì)胞破壁后過(guò)濾，得到濾液和濾渣；再將所述原液與濾液混合；細(xì)胞培養(yǎng)液中的紫杉醇幾乎完全溶解在最后混合液中，通過(guò)離心或過(guò)濾可以除去破碎的細(xì)胞成分，所得濾液所含雜質(zhì)更少，便于后續(xù)的大孔吸附樹(shù)脂富集。
[0015](2)將上述混合液體通過(guò)非極性大孔樹(shù)脂吸附層析柱富集，非極性大孔吸附樹(shù)脂可為D-101，HP-30, D4020的一種；然后用蒸餾水沖洗,再用乙醇溶液洗脫,收集洗脫液,并將洗脫液中的乙醇蒸干；這樣能夠從大量液體中富集紫杉醇，濃縮后紫杉醇含量可達(dá)I~
5% ο
[0016](3)向上述蒸干乙醇的洗脫液中加入萃取劑，進(jìn)行兩次液液萃取，收集有機(jī)溶劑層，低溫真空干燥，得到大孔樹(shù)脂柱富集紫杉醇粗品；萃取后可以除去一部分雜質(zhì)，并且能除去水分，便于后續(xù)氧化鋁柱層析。
[0017](4)將上述粗品轉(zhuǎn)載于用堿性氧化鋁做填料的層析柱，用洗脫溶液進(jìn)行洗脫，分部收集洗脫部分，并真空干燥，得到樣品；堿性氧化鋁層析柱在分離紫杉醇同時(shí)可以催化7-表-紫杉醇等紫杉烷類化合物向紫杉醇轉(zhuǎn)化，除去較難分離的雜質(zhì)同時(shí)提高回收率。
[0018](5)將上述樣品通過(guò)C18高效液相色譜柱純化，然后用含甲醇溶液作流動(dòng)相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置于通風(fēng)廚，揮發(fā)有機(jī)相，待出現(xiàn)結(jié)晶后轉(zhuǎn)至4°C冰箱放置24h，離心收集一部分晶體，然后將上清液繼續(xù)放置使結(jié)晶完全，離心收集另一部分晶體，再將收集的全部晶體冷凍干燥，得到高純度紫杉醇單體。由于利用C18高效液相色譜柱，能高效分離紫杉醇，重復(fù)性好，便于控制。具體實(shí)施例如下:
實(shí)施例1
紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液300mL，經(jīng)H PLC檢測(cè)培養(yǎng)液中和細(xì)胞內(nèi)共含紫杉醇27mg。
[0019](I)將培養(yǎng)液5000r/min離心5min，獲得82mL細(xì)胞固體，將細(xì)胞用勻漿機(jī)在10000r/min的轉(zhuǎn)速下勻漿2min，將勻漿后的糊狀流體加入等體積的95%乙醇超聲提取30min, 5000r/min離心過(guò)濾后得129mL,與之前液體混合共得347mL。
[0020](2)取國(guó)產(chǎn)D-101大孔吸附樹(shù)脂，濕法裝成1.5X30cm的層析柱，將混合液加載到大孔樹(shù)脂色譜柱頂(上樣量約為3mg紫杉醇/mL樹(shù)脂)，用蒸餾水沖洗，除去水溶性雜質(zhì)和色素，用體積百分比含乙醇75%的水溶液洗脫，收集30mL洗脫液，將洗脫液中的乙醇蒸干，加入等體積的三氯甲烷:水(1:1)進(jìn)行液液萃取，收集有機(jī)溶劑層，低溫真空干燥得到1.150g大孔樹(shù)脂柱富集紫杉醇粗品，經(jīng)HPLC分析含紫杉醇2.3% (25.9mg)，紫杉醇收率為95.9%。
[0021](3)將上述1.150g大孔樹(shù)脂柱分離粗品，轉(zhuǎn)載于用堿性氧化鋁做填料的層析柱，三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液做流動(dòng)相，分部收集洗脫部分，低溫真空干燥得樣品0.116g ;經(jīng)HPLC分析含紫杉醇21.7% (25.2mg)，紫杉醇回收率為97.3%.[0022](4)樣品通過(guò)C18高效液相色譜柱純化，用含甲醇55%的甲醇水溶液作流動(dòng)相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置于通風(fēng)廚，揮發(fā)有機(jī)相，待出現(xiàn)結(jié)晶后轉(zhuǎn)至4°C冰箱放置24h，離心獲取晶體，上清液繼續(xù)放置使結(jié)晶盡量完全，將收集的晶體冷凍干燥后，得高純度紫杉醇單體。獲得純度為99.6%的精分離紫杉醇24.8mg，回收率為98.4%，總回收率為91.5%。
[0023]實(shí)施例2
紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液IL J^HPLC檢測(cè)培養(yǎng)液中和細(xì)胞內(nèi)共含紫杉醇92mg。[0024](1)將培養(yǎng)液經(jīng)砂芯漏斗抽濾后得260mL細(xì)胞固體，將細(xì)胞用勻漿機(jī)在1000Or/min的轉(zhuǎn)速下勻衆(zhòng)2min,將勻衆(zhòng)后的糊狀流體加入等體積的95%乙醇超聲提取30min,砂芯漏斗抽濾后得405mL,與之前液體混合后共得1145mL。
[0025](2)取進(jìn)口 HP-30大孔吸附樹(shù)脂，濕法裝成2 X 30cm的層析柱，將混合液加載到大孔樹(shù)脂色譜柱頂(上樣量約為3mg紫杉醇/mL樹(shù)脂)，用蒸餾水沖洗，除去水溶性雜質(zhì)和色素，用體積百分比含乙醇80%的水溶液洗脫，收集IOOmL的洗脫液，將洗脫液中的乙醇蒸干，加入等體積的二氯甲烷:水(1:1)進(jìn)行液液萃取，收集有機(jī)溶劑層，低溫真空干燥得到3.351g大孔樹(shù)脂柱富集紫杉醇粗品，經(jīng)HPLC分析含紫杉醇2.6% (88.5mg)，紫杉醇回收率為96.2%。
[0026](3)將上述3.351g大孔樹(shù)脂柱分離粗品，轉(zhuǎn)載于用堿性氧化鋁做填料的層析柱，三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液做流動(dòng)相，分部收集洗脫部分，50°C真空干燥，得樣品0.349g ;經(jīng)HPLC分析含紫杉醇24.8% (86.7mg)，紫杉醇回收率為98.0%。
[0027](4)樣品通過(guò)C18高效液相色譜柱純化，用含甲醇55%的甲醇水溶液作流動(dòng)相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置于通風(fēng)廚，揮發(fā)有機(jī)相，待出現(xiàn)結(jié)晶后轉(zhuǎn)至4°C冰箱放置24h，離心獲取晶體，上清液繼續(xù)放置使結(jié)晶盡量完全，將收集的晶體冷凍干燥后，得高純度紫杉醇單體85.63mg，純度為99.5%，回收率為98.3 %，總回收率為92.6%。
[0028]實(shí)施例3
紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液3L，經(jīng)HPLC檢測(cè)培養(yǎng)液中和細(xì)胞內(nèi)共含紫杉醇265mg。
[0029](I)將培養(yǎng)液經(jīng)砂芯漏斗抽濾后得775mL細(xì)胞固體，將細(xì)胞用勻漿機(jī)在1000Or/min的轉(zhuǎn)速下勻衆(zhòng)2min,將勻衆(zhòng)后的糊狀流體加入等體積的95%乙醇超聲提取30min,過(guò)濾后得1210mL，與之前液體混合共得3435mL。
[0030](2)取國(guó)產(chǎn)D-101大孔吸附樹(shù)脂，濕法裝成3X30cm的層析柱，將混合液加載到大孔樹(shù)脂色譜柱頂(上樣量約為3mg紫杉醇/mL樹(shù)脂)，用蒸餾水沖洗，除去水溶性雜質(zhì)和色素，用體積百分比含乙醇85%的水溶液洗脫，收集300mL的洗脫液，將洗脫液中的乙醇蒸干，加入等體積的三氯甲烷:水(1:1)進(jìn)行液液萃取，收集有機(jī)溶劑層，低溫真空干燥得到12.130g大孔樹(shù)脂柱富集紫杉醇粗品，經(jīng)HPLC分析含紫杉醇2.1% (251mg)，紫杉醇收率為94.7%。
[0031](3)將上述12.130g大孔樹(shù)脂柱分離粗品，裝載于用堿性氧化鋁做填料的層析柱，三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液做流動(dòng)相，分部收集洗脫部分，低溫真空干燥，得樣品1.098g,經(jīng)HPLC分析含紫杉醇22.3% (245mg)，紫杉醇回收率為97.6%。
[0032](4)樣品通過(guò)C18高效液相色譜柱純化，用含甲醇50%的甲醇水溶液作流動(dòng)相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置于通風(fēng)廚，揮發(fā)有機(jī)相，待出現(xiàn)結(jié)晶后轉(zhuǎn)至4°C冰箱放置24h，離心獲取晶體，上清液繼續(xù)放置使結(jié)晶盡量完全，將收集的晶體冷凍干燥后，得高純度紫杉醇單體。獲得純度為99.5%的精分離紫杉醇242mg，回收率為98.5%，總回收率為90.9%
上述實(shí)施方式僅供說(shuō)明本發(fā)明之用，而并非是對(duì)本發(fā)明的限制，有關(guān)【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下，還可以作出各種變化和變型，因此所有等同的技術(shù)方案也應(yīng)屬于本發(fā)明的范疇。
【權(quán)利要求】
1.從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液中制備高純度紫杉醇的方法，其包括以下步驟: (1)將紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行固液分離，得到原液和細(xì)胞；然后將細(xì)胞破壁后過(guò)濾，得到濾液和濾渣；再將所述原液與濾液混合； (2)將上述混合液體通過(guò)非極性大孔樹(shù)脂吸附層析柱富集，然后用蒸餾水沖洗，再用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，并將洗脫液中的乙醇蒸干； (3)向上述蒸干乙醇的洗脫液中加入萃取劑，進(jìn)行兩次液液萃取，收集有機(jī)溶劑層，低溫真空干燥，得到大孔樹(shù)脂柱富集紫杉醇粗品； (4)將上述粗品轉(zhuǎn)載于用堿性氧化鋁做填料的層析柱，用洗脫溶液進(jìn)行洗脫，分部收集洗脫部分，并真空干燥，得到樣品； (5)將上述樣品通過(guò)C18高效液相色譜柱純化，然后用含甲醇溶液作流動(dòng)相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置于通風(fēng)廚，揮發(fā)有機(jī)相，待出現(xiàn)結(jié)晶后轉(zhuǎn)至4°C冰箱放置24h，離心收集一部分晶體，然后將上清液繼續(xù)放置使結(jié)晶完全，離心收集另一部分晶體，再將收集的全部晶體冷凍干燥，得到高純度紫杉醇單體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中將所述培養(yǎng)液離心，獲得細(xì)胞，然后將細(xì)胞用勻漿機(jī)勻漿，再將勻漿后的糊狀流體加入等體積的乙醇進(jìn)行超聲提取，并離心過(guò)濾后得到所述濾液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中將所述培養(yǎng)液經(jīng)砂芯漏斗抽濾或經(jīng)板框過(guò)濾，得到細(xì)胞，然后將細(xì)胞用勻漿機(jī)勻漿，再將勻漿后的糊狀流體加入等體積的乙醇進(jìn)行超聲提取，并用砂芯漏斗抽濾，得到所述濾液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于:步驟(2)中采用體積濃度為75~85%乙醇溶液進(jìn)行洗脫。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方`法，其特征在于:在步驟(3)中，向蒸干乙醇的洗脫液中加入等體積的萃取劑，萃取劑為1:1的二氯甲烷與水或?yàn)?:1的三氯甲烷與水。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:步驟(4)采用三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液。
【文檔編號(hào)】C07D305/14GK103570647SQ201310546214
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】熊興耀, 楊星星, 蘇小軍, 王仁才 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)