一種利用溫度誘導(dǎo)雙水相體系分離純化蘆丁的方法
【專利摘要】一種利用溫度誘導(dǎo)雙水相體系分離純化蘆丁的方法，包括以下步驟：(1)將槐米粉碎后經(jīng)飽和石灰水浸泡，再經(jīng)超聲提取，過濾，向濾液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3～4，過濾析出的沉淀，沉淀經(jīng)少量的水洗滌三次，在60℃以下干燥即得蘆丁粗品；(2)將EOPO和水按體積比1～3∶1～4混合，然后向其中加入鹽，混合均勻，向溶液中加入蘆丁粗品，混合均勻后，離心分離水相和富含EOPO的有機相；(3)將步驟(2)得到的有機相在50～70℃水浴10～30min，溶液自動分成兩相，離心分離有機相和水相，蘆丁在水相富集，EOPO在有機相富集并得以回收；(4)將步驟(3)得到的水相冷卻至室溫，放置過夜，析出結(jié)晶，過濾得到蘆丁純品。該方法經(jīng)濟、環(huán)保、低能耗，且能最大程度地獲得高純度蘆丁。
【專利說明】一種利用溫度誘導(dǎo)雙水相體系分離純化蘆丁的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用溫度誘導(dǎo)雙水相體系分離純化蘆丁的方法，屬于生物化工【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]蘆丁是黃酮類化合物，易溶解于熱水、熱乙醇中。以往提取蘆丁時通常采用的方法是堿提取酸沉淀法。該方法是利用蘆丁具有酸性，可與堿成鹽而溶于水，加酸使成酸性后，其游離析出的原理，再經(jīng)重結(jié)晶得到較純的蘆丁。該方法雖然多年來一直被視為較理想的方法，但由于是加熱提取，常有一定的水解產(chǎn)物存在，產(chǎn)率較低(一般為9%?13% )。
[0003]專利文獻(xiàn)CN101081859公開的一種蘆丁提取方法，蘆丁粗品用乙醇和醋酸乙酯的混合物攪拌，過濾，將上述濾液進行吸附，洗柱，濃縮洗脫液回收乙醇，離心過濾,烘干。專利文獻(xiàn)CN1410423公開的一種提取蘆丁的工藝，將蘆丁溶劑提取，溶劑為甲醇、乙醇、丙酮或甲醛，提取濾液用吸附柱進行吸附，吸附柱為聚酰胺柱、氧化鋁柱、凝膠柱、葡聚糖凝膠柱、纖維素粉柱、硅膠柱、大孔吸附樹脂柱、離子交換樹脂柱，用乙醇、甲醇、蒸餾水、甲醛中的一種或兩種洗柱，洗脫液經(jīng)蒸餾濃縮回收溶劑，離心過濾，80°C以下烘干得精品蘆丁。
[0004]雙水相萃取技術(shù)是一種新型的分離技術(shù)，親水性聚合物水溶液在一定條件下可以形成雙水相體系，通過被分離物在兩相中分配不同，便可實現(xiàn)分離。該技術(shù)自研究開發(fā)以來，被廣泛用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分離和提取。雙水相萃取技術(shù)設(shè)備投資少，操作簡單，且不存在有機溶劑殘存問題，因此在天然藥物分離與提取中也有良好的應(yīng)用前景。但是，由于聚合物回收困難，所以在一定程度上阻礙了雙水相技術(shù)的應(yīng)用。.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種利用溫度誘導(dǎo)雙水相體系分離純化蘆丁的方法，該方法經(jīng)濟、環(huán)保、低能耗，且能最大程度地獲得高純度蘆丁，并能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0007]—種利用溫度誘導(dǎo)雙水相體系分離純化蘆丁的方法，該方法包括以下步驟:
[0008](I)提取蘆丁粗品:將槐米粉碎后經(jīng)飽和石灰水浸泡30?40min，再經(jīng)頻率20kHz的超聲提取20?60min，過濾；藥渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，向濾液中加入鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3?4，過濾析出的沉淀，沉淀經(jīng)少量的水洗滌三次，在60°C以下干燥即得蘆丁粗品;
[0009](2)雙水相分離:將環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物和水按體積比I?3:1?4混合，然后向其中加入鹽，混合均勻，所得溶液中鹽的濃度為0.1?0.2g/mL,向溶液中按2.0?
5.0mg/mL的量加入蘆丁粗品，混合均勻后，以轉(zhuǎn)速為1000?2000r/min離心分離2?5min,分離水相和富含環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物的有機相，蘆丁在有機相富集，雜質(zhì)在水相富集；[0010](3)溫度誘導(dǎo)雙水相分離:將步驟⑵得到的有機相在50?70°C水浴10?30min,溶液自動分成兩相，以轉(zhuǎn)速為1000?2000r/min離心分離3?5min,分離有機相和水相，蘆丁在水相富集，環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物在有機相富集并得以回收；
[0011](4)濃縮干燥:將步驟(3)得到的水相冷卻至室溫，放置過夜，析出結(jié)晶，過濾得到蘆丁純品。
[0012]在本發(fā)明的方法中，常溫下環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物(EOPO)與鹽水溶液形成雙水相體系，將蘆丁富集到EOPO相。由于EOPO具有較低的濁點，升高EOPO相溫度，當(dāng)溫度上升至EOPO的濁點溫度以上時，溶液自動分成水相和有機相，蘆丁再次分配到水相，而富含EOPO的有機相得以回收。
[0013]其中，所述步驟(I)中的槐米粉碎至30?60目。所述步驟(2)中的EOPO平均分子量優(yōu)選為2000?3000。所述的鹽為磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀或無水硫酸鈉。EOPO與水的體積比優(yōu)選為 1: 1、1: 2、1: 3、1: 4、2: 3、3: 2 或 3: 4。
[0014]在溫度誘導(dǎo)雙水相分離過程中，操作環(huán)境始終保持在EOPO的濁點以上的溫度，即離心分離過程中的體系溫度保持在50?70°C，優(yōu)選控制為60°C，離心分離過程可以分兩次操作。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0016]本發(fā)明采用EOPO/鹽雙水相分配結(jié)合溫度誘導(dǎo)相分離從天然植物槐米中提取蘆丁，與以往采用的聚乙二醇的雙水相體系分離純化過程相比，雙水相分相迅速，且沒有乳化層，同時富含EOPO的一相可以回收并循環(huán)使用，工藝環(huán)保、操作簡單、降低物耗。
[0017]本發(fā)明采用的EO PO的濁點與蘆丁產(chǎn)物的溶解度匹配適當(dāng)，所得蘆丁產(chǎn)品純度較聞。
【具體實施方式】
[0018]以下通過具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。以下實施例中所使用的試劑均為試劑級。
[0019]實施例1
[0020]I)提取蘆丁粗品:取20g槐米粉碎后，置于IOOOmL燒杯中，加水200mL飽和石灰水浸泡30min，采用頻率20kHz的超聲提取30min，過濾；藥渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，加鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3，析出蘆丁，抽濾，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，500C以下干燥或自然干燥，即得蘆丁粗品16.6g，含量為38.3%。
[0021]2)雙水相分離:配制EOPO/鹽雙水相體系，其中EOPO (分子量2000) IOmLjjC 15mL，磷酸氫二鉀的濃度為0.lg/mL。向該雙水相體系中加入蘆丁粗品2mg/mL，混合均勻后，以轉(zhuǎn)速為2000r/min離心分離3min，分離有機相(富含Ε0Ρ0) 20.2mL和水相4.1mL,蘆丁在有機
相富集，雜質(zhì)在水相富集。
[0022]3)溫度誘導(dǎo)雙水相分離:對有機相(富含Ε0Ρ0)進行溫度誘導(dǎo)相分離。在60°C水浴IOmin后，溶液自動分成兩相，其中上相富含Ε0Ρ0，下相富含水，在離心機中以轉(zhuǎn)速2000r/min離心分離5min,分離有機相(富含Ε0Ρ0) 14.7mL和水相5.2mL,蘆丁在水相富集
2.7mg/mL，有機相EOPO得以回收。
[0023]4)水相冷卻至室溫，放置過夜，析出結(jié)晶，過濾得到蘆丁純品12.6mg，純度為92.8%，收率為 61.1%。
[0024]實施例2
[0025]I)提取蘆丁粗品:取20g槐米粉碎后，置于IOOOmL燒杯中，加水200mL飽和石灰水浸泡30min，采用頻率20kHz的超聲提取30min，過濾；藥渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，加鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3，析出蘆丁，抽濾，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，500C以下干燥或自然干燥，即得蘆丁粗品16.6g，含量為38.3%。
[0026]2)雙水相分離:配制EOPO/鹽雙水相體系，其中EOPO (分子量2500) IOmLjjC 15mL，磷酸氫二鉀的濃度為0.lg/mL。向該雙水相體系中加入蘆丁粗品2mg/mL，混合均勻后，以轉(zhuǎn)速為2000r/min離心分離3min，分離有機相(富含Ε0Ρ0) 18.2mL和水相5.7mL,蘆丁在有機
相富集，雜質(zhì)在水相富集。
[0027]3)溫度誘導(dǎo)雙水相分離:對有機相(富含Ε0Ρ0)進行溫度誘導(dǎo)相分離。在60°C水浴IOmin后，溶液自動分成兩相，其中上相富含Ε0Ρ0，下相富含水，在離心機中以轉(zhuǎn)速2000r/min離心分離5min,分離有機相(富含Ε0Ρ0) 9.3mL和水相8.3mL,蘆丁在水相富集
1.4mg/mL，有機相EOPO得以回收。
[0028]4)水相冷卻至室溫，放置過夜，析出結(jié)晶，過濾得到蘆丁純品10.7mg,純度為94.0%，收率為 52.5%0
[0029]實施例3
[0030]I)提取蘆丁粗品:取20g槐米粉碎后，置于IOOOmL燒杯中，加水200mL飽和石灰水浸泡30min，采用頻率20kHz的超聲提取30min，過濾；藥渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，加鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3，析出蘆丁，抽濾，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，500C以下干燥或自然干燥，即得蘆丁粗品16.6g，含量為38.3%。
[0031]2)雙水相分離:配制EOPO/鹽雙水相體系，其中EOPO (分子量2750) IOmLjjC 15mL，磷酸氫二鉀的濃度為0.lg/mL。向該雙水相體系中加入蘆丁粗品2mg/mL，混合均勻后，以轉(zhuǎn)速為2000r/min離心分離3min，分離有機相(富含Ε0Ρ0) 19.0mL和水相5.3mL,蘆丁在有機
相富集，雜質(zhì)在水相富集。
[0032]3)溫度誘導(dǎo)雙水相分離:對有機相(富含Ε0Ρ0)進行溫度誘導(dǎo)相分離。在60°C水浴IOmin后，溶液自動分成兩相，其中上相富含Ε0Ρ0，下相富含水，在離心機中以轉(zhuǎn)速2000r/min離心分離5min,分離有機相(富含Ε0Ρ0) 13.1mL和水相5.3mL,蘆丁在水相富集
2.lmg/mL，有機相EOPO得以回收。
[0033]4)水相冷卻至室溫，放置過夜，析出結(jié)晶，過濾得到蘆丁純品10.lmg，純度為
93.9%，收率為 49.5%。
[0034]實施例4
[0035]I)提取蘆丁粗品:取20g槐米粉碎后，置于IOOOmL燒杯中，加水200mL飽和石灰水浸泡30min，采用頻率20kHz的超聲提取30min，過濾；藥渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，加鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3，析出蘆丁，抽濾，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，500C以下干燥或自然干燥，即得蘆丁粗品16.6g，含量為38.3%。
[0036]2)雙水相分離:配制EOPO/鹽雙水相體系，其中EOPO (分子量2000) IOmLjjC 15mL，磷酸二氫鉀的濃度為0.lg/mL。向該雙水相體系中加入蘆丁粗品2mg/mL，混合均勻后，以轉(zhuǎn)速為2000r/min離心分離3min，分離有機相(富含Ε0Ρ0) 17.0mL和水相7.7mL,蘆丁在有機相富集，雜質(zhì)在水相富集。
[0037]3)溫度誘導(dǎo)雙水相分離:對有機相(富含Ε0Ρ0)進行溫度誘導(dǎo)相分離。在60°C水浴IOmin后，溶液自動分成兩相，其中上相富含Ε0Ρ0，下相富含水，在離心機中以2000r/min離心分離5min,分離有機相(富含Ε0Ρ0) 4.6mL和水相12.1mL,蘆丁在水相富集0.8mg/mL,有機相EOPO回收量較少。
[0038]4)水相冷卻至室溫，放置過夜，析出結(jié)晶，過濾得到蘆丁純品8.6mg,純度為
92.7%，收率為 41.6%。
[0039]實施例5
[0040]I)提取蘆丁粗品:取20g槐米粉碎后，置于IOOOmL燒杯中，加水200mL飽和石灰水浸泡30min，采用頻率20kHz的超聲提取30min，過濾；藥渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，加鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3，析出蘆丁，抽濾，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，500C以下干燥或自然干燥，即得蘆丁粗品16.6g，含量為38.3%。
[0041]2)雙水相分離:配制EOPO/鹽雙水相體系，其中EOPO (分子量2000) IOmLjjC 15mL，Na2SO4的濃度為0.lg/mL。向該雙水相體系中加入蘆丁粗品2mg/mL,混合均勻后，以轉(zhuǎn)速為2000r/min離心分離3min,分離有機相(富含Ε0Ρ0) 13.6mL和水相9.1mL,蘆丁在有機相富
集，雜質(zhì)在水相富集。
[0042]3)溫度誘導(dǎo)雙水相分離:對有機相(富含Ε0Ρ0)進行溫度誘導(dǎo)相分離。在60°C水浴IOmin后，溶液自動分成兩相，其中上相富含Ε0Ρ0，下相富含水，在離心機中以2000r/min離心分離5min,分離有機相 (富含Ε0Ρ0) 1.6mL和水相11.2mL,蘆丁在水相富集0.7mg/mL,有機相EOPO回收量較少。
[0043]4)水相冷卻至室溫，放置過夜，析出結(jié)晶，過濾得到蘆丁純品7.4mg,純度為
93.9%，收率為 36.3%0
[0044]實施例6
[0045]I)提取蘆丁粗品:取20g槐米粉碎后，置于IOOOmL燒杯中，加水200mL飽和石灰水浸泡30min，采用頻率20kHz的超聲提取30min，過濾；藥渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，加鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3，析出蘆丁，抽濾，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，500C以下干燥或自然干燥，即得蘆丁粗品16.6g，含量為38.3%。
[0046]2)雙水相分離:配制EOPO/鹽雙水相體系，其中EOPO (分子量2000) IOmLjjC 10mL，磷酸氫二鉀的濃度為0.lg/mL。向該雙水相體系中加入蘆丁粗品2mg/mL，混合均勻后，以轉(zhuǎn)速為2000r/min離心分離3min，分離有機相(富含Ε0Ρ0) 13.7mL和水相4.4mL,蘆丁在有機
相富集，雜質(zhì)在水相富集。
[0047]3)溫度誘導(dǎo)雙水相分離:對有機相(富含Ε0Ρ0)進行溫度誘導(dǎo)相分離。在60°C水浴IOmin后，溶液自動分成兩相，其中上相富含Ε0Ρ0，下相富含水，在離心機中以2000r/min離心分離5min,分離有機相(富含E0P0)9.5mL和水相3.3mL,蘆丁在水相富集3.0mg/mL,有機相EOPO得以回收。
[0048]4)水相冷卻至室溫，放置過夜，析出結(jié)晶，過濾得到蘆丁純品8.0mg,純度為92.3%，收率為 38.6%。
[0049]實施例7
[0050]I)提取蘆丁粗品:取20g槐米粉碎后，置于IOOOmL燒杯中，加水200mL飽和石灰水浸泡30min，采用頻率20kHz的超聲提取30min，過濾；藥渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，加鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3，析出蘆丁，抽濾，沉淀用少量冷水洗三次，抽干，500C以下干燥或自然干燥，即得蘆丁粗品16.6g，含量為38.3%。
[0051]2)雙水相分離:配制EOPO/鹽雙水相體系，其中EOPO (分子量2000) 15mL，水10mL，磷酸氫二鉀的濃度為0.lg/mL。向該雙水相體系中加入蘆丁粗品2mg/mL，混合均勻后，以轉(zhuǎn)速為2000r/min離心分離3min，分離有機相(富含Ε0Ρ0) 13.1mL和水相5.2mL,蘆丁在有機
相富集，雜質(zhì)在水相富集。
[0052]3)溫度誘導(dǎo)雙水相分離:對有機相(富含Ε0Ρ0)進行溫度誘導(dǎo)相分離。在60°C水浴IOmin后，溶液自動分成兩相，其中上相富含Ε0Ρ0，下相富含水，在離心機中以2000r/min離心分離5min,分離有機相(富含Ε0Ρ0) 5.3mL和水相6.9mL,蘆丁在水相富集2.6mg/mL,有機相EOPO得以回收。
[0053]4)水相冷卻至室溫，放置過夜，析出結(jié)晶，過濾得到蘆丁純品14.6mg，純度為92.4%，收率為 70.4%。.
【權(quán)利要求】
1.一種利用溫度誘導(dǎo)雙水相體系分離純化蘆丁的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)提取蘆丁粗品:將槐米粉碎后經(jīng)飽和石灰水浸泡30?40min，再經(jīng)頻率20kHz的超聲提取20?60min，過濾；藥渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，向濾液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3?4，過濾析出的沉淀，沉淀經(jīng)少量的水洗滌三次，在60°C以下干燥即得蘆丁粗品； (2)雙水相分離:將環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物和水按體積比I?3: I?4混合，然后向其中加入鹽，混合均勻，所得溶液中鹽的濃度為0.1?0.2g/mL,向溶液中按2.0?5.0mg/mL的量加入蘆丁粗品，混合均勻后，以轉(zhuǎn)速為1000?2000r/min離心分離2?5min,分離水相和富含環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物的有機相，蘆丁在有機相富集，雜質(zhì)在水相富集; (3)溫度誘導(dǎo)雙水相分離:將步驟(2)得到的有機相在50?70°C水浴10?30min，溶液自動分成兩相，以轉(zhuǎn)速為1000?2000r/min離心分離3?5min，分離有機相和水相，蘆丁在水相富集，環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物在有機相富集并得以回收； (4)濃縮干燥:將步驟(3)得到的水相冷卻至室溫，放置過夜，析出結(jié)晶，過濾得到蘆丁純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用溫度誘導(dǎo)雙水相體系分離純化蘆丁的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的槐米粉碎至30?60目。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用溫度誘導(dǎo)雙水相體系分離純化蘆丁的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物的平均分子量為2000?3000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用溫度誘導(dǎo)雙水相體系分離純化蘆丁的方法，其特征在于，所述的鹽為磷酸 氫二鉀、磷酸二氫鉀或無水硫酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用溫度誘導(dǎo)雙水相體系分離純化蘆丁的方法，其特征在于，所述步驟(2)中環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷共聚物與水的體積比為1: 1、1: 2、1: 3、1: 4、2: 3、3: 2或3: 4。
【文檔編號】C07D311/40GK103435585SQ201310339629
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月6日
【發(fā)明者】霍清, 繆剛, 楊宏偉 申請人:北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院