專利名稱:一種褐藻中巖藻黃素的提取純化方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于海洋生物天然產(chǎn)物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種褐藻中巖藻黃素的提取純化方法。
背景技術(shù):
自1982年《聯(lián)合國(guó)海洋法公約》簽訂以來(lái),世界各海洋國(guó)家紛紛將開(kāi)發(fā)利用海洋資源作為國(guó)家戰(zhàn)略決策,大力推動(dòng)相關(guān)科學(xué)研究和技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。海洋天然產(chǎn)物作為重要的研究分支,提供了大量具有藥用價(jià)值的活性物質(zhì)。巖藻黃素作為海洋天然活性物質(zhì)中的一種,在海洋環(huán)境中分布尤為廣泛,其含量占到了類胡蘿卜素自然總含量的10%左右。但與β-胡蘿卜素等類胡蘿卜素不同的是,巖藻黃素是首個(gè)從褐藻中分離出的有特殊的丙二烯碳骨架的分子,因而它具有極強(qiáng)的抗氧化能力。同時(shí),巖藻黃素分子含有羥基、酯鍵和多個(gè)不飽和α,不飽和鍵,可以作為接受體·與很多重要蛋白發(fā)生麥克加成反應(yīng),從而改善生物體的代謝循環(huán),發(fā)揮其生物活性功能。通過(guò)現(xiàn)階段細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,巖藻黃素具有促進(jìn)健康的作用。特別是在抗氧化、抗炎、抗癌、抗血栓、抗瘧疾、抑制肥胖和糖尿病,以及肝臟、腦、骨骼、皮膚、眼睛和心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用方面具有極大的潛在藥用價(jià)值。與目前的同類成品藥物β_胡蘿卜素和蝦青素相比,巖藻黃素在抑制肥胖、成熟T細(xì)胞增值和海勒癌細(xì)胞發(fā)育方面有著更加突出的表現(xiàn)。盡管人體直接食用藻類過(guò)程中巖藻黃素的生物利用率較低,但通過(guò)食用純化巖藻黃素和食用油脂混合可以大大提高巖藻黃素的吸收率,以及巖藻黃醇和Amarouciaxanthin A等巖藻黃素代謝中間產(chǎn)物在體內(nèi)的濃度。同時(shí)生物毒理實(shí)驗(yàn)表明,月艮用巖藻黃素具有毒副作用小、不影響脂代謝循環(huán)等特點(diǎn),因而巖藻黃素是一種具有極大潛在藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋活性天然產(chǎn)物。目前國(guó)外很多企業(yè)和科研單位都已經(jīng)將巖藻黃素應(yīng)用于新藥的開(kāi)發(fā)研制。日本也已經(jīng)推出了以巖藻黃素為添加物的護(hù)膚品,并獲得了較高的市場(chǎng)占有率。但就目前來(lái)說(shuō),巖藻黃素市場(chǎng)主要存在兩個(gè)問(wèn)題。一是國(guó)內(nèi)外高純度巖藻黃素市場(chǎng)仍然空缺。而且在我國(guó),高純度巖藻黃素主要還是依賴國(guó)外進(jìn)口。二是分離成本過(guò)高,分離工程中環(huán)境污染嚴(yán)重。因此急需一種操作簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)環(huán)保的分離純化技術(shù),以滿足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)對(duì)巖藻黃素的需求。迄今為止,關(guān)于巖藻黃素的提取的專利有中國(guó)公開(kāi)號(hào)為CN1706836(—種從海藻中分離巖藻黃素的方法)、CN101565411 (一種從褐藻中分離巖藻黃素的方法)等。CN1706836涉及用二甲基亞砜在黑暗中浸提新鮮海藻,CN101565411是將新鮮的褐藻打漿,加入有機(jī)試劑,再加入質(zhì)量千分?jǐn)?shù)為O. 5-1的抗氧化劑,浸提22-26小時(shí)后抽濾,得到浸提液。二甲基亞砜沸點(diǎn)高且較貴,后續(xù)處理成本很高;且0附01565411專利中所采用的方法,操作時(shí)間長(zhǎng),產(chǎn)品得率較低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種褐藻中巖藻黃素的提取純化方法,即提供一種分離制備巖藻黃素的方法,以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的巖藻黃素,其分子式為
HO #^|^N^0C0CH3
JiT^r
HOFucoxanthin本發(fā)明的提取方法,包括如下的步驟I)在褐藻粉內(nèi)添加丙酮和甲醇混合溶劑進(jìn)行超聲浸提,浸提液濃縮蒸干獲得初提樣品;2)將I)中獲得的初提樣品加入甲醇進(jìn)行溶解,溶解液樣品進(jìn)行紫外/可見(jiàn)光譜分析,選取450nm處吸收峰的樣品作為褐藻浸提液進(jìn)行后續(xù)的分離純化;3)對(duì)2)中制備的褐藻浸提液進(jìn)行柱層析分離,柱填料為硅藻土,用食用石油醚和丙酮的混合溶劑做洗脫劑;獲得洗脫液并濃縮;4)使用HPLC對(duì)步驟3)中獲得的洗脫液再進(jìn)行分離,選用正向ODS柱,石油醚、二氯甲烷和丙酮的混合試劑作為流動(dòng)相,色譜分離獲得高純化巖藻黃素。其中步驟I)中丙酮和甲醇混合溶劑中丙酮和甲醇的體積比為3:1。其中步驟3)中食用石油醚和丙酮體的積比為I :0. 43 2. 33。其中步驟4)石油醚、二氯甲烷和丙酮的混合試劑中石油醚、二氯甲烷和丙酮的體積比為10:5:3。本發(fā)明的巖藻黃素是一種具有潛在藥用價(jià)值的海洋天然產(chǎn)物??梢杂糜谛滦涂寡趸⒖寡?、抗癌、抗血栓、抗瘧疾、抑制肥胖和糖尿病藥物的研發(fā),同時(shí)也可開(kāi)發(fā)為保肝、減肥和保護(hù)視力的保健品,以及美白保濕的護(hù)膚品等。本發(fā)明提供了一種安全低毒、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的巖藻黃素制備方案。本發(fā)明首次采用硅藻土做柱填料分離巖藻黃素。硅藻土具有價(jià)格經(jīng)濟(jì)、綠色環(huán)保的特點(diǎn)。同時(shí)使用食用石油醚分離,降低了最終產(chǎn)品中有毒物質(zhì)的殘留。經(jīng)硅藻土分離后,即可得低成本、安全健康的巖藻黃素保健品原料。再經(jīng)高效液相色譜分離純化后,便可得到色譜純巖藻黃素。本發(fā)明為滿足國(guó)內(nèi)外高純度巖藻黃素市場(chǎng)提供了安全低毒的分離技術(shù),大大提高了褐藻類水產(chǎn)品的附加值,具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
圖I :本發(fā)明從褐藻中的制備巖藻黃素過(guò)程示意圖。圖2:本發(fā)明海帶粗提樣品0316-2紫外/可見(jiàn)吸收光譜。圖3 :本發(fā)明從海帶中提取巖藻黃素高效液相色譜圖。圖4 :本發(fā)明從巨藻中提取巖藻黃素高效液相色譜圖。圖5 :本發(fā)明從馬尾藻中提取巖藻黃素高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明對(duì)褐藻巖藻黃素的制備純化步驟中試劑的進(jìn)行了長(zhǎng)期的篩選,并對(duì)提取液、柱層析液和HPLC的洗脫液進(jìn)行了優(yōu)化,從而完成了本發(fā)明。實(shí)施例I :從海帶中提取純化巖藻黃素一、海帶粗提液制備和篩選將IOkg海帶洗凈晾干,置于烘箱中,45°C下烘干,得海帶干重346. 49g。將干海帶壓碎研磨成粉末,使用丙酮甲醇=3:1混合液45°C下超聲浸提4h。浸提3次,浸提液過(guò)濾,清液45 V下真空旋轉(zhuǎn)蒸干,得海帶粗提浸膏。 在海帶粗提浸膏中依次分別加入食用石油醚、丙酮和甲醇進(jìn)行溶解,得到樣品0316-1 3。使用紫外分光光度計(jì)對(duì)0316-1 3樣品進(jìn)行300 500nm波長(zhǎng)掃描,分別用相應(yīng)純?nèi)軇┳隹瞻讌⒄?。結(jié)果表明,樣品0316-3,即甲醇浸提液在450nm處吸收峰值最大,類胡蘿卜素及其衍生物含量最高;0316-3紫外吸收光譜見(jiàn)圖2。二、分離純化巖藻黃素首先使用干法裝柱,柱填料為硅藻土。樣品0316-3加入少量硅藻土拌干上樣;以體積比為I :0. 55的食用石油醚和丙酮做洗脫劑梯度洗脫,最后用IL丙酮洗脫。收集不同色帶洗脫物,濃縮并編號(hào)為1# 9#。使用HPLC系統(tǒng)對(duì)以上獲得的1# 9#進(jìn)行分離。選用正向ODS柱,溶劑體系為石油醚、二氯甲烷和丙酮(10:5:3)混合體系,流速為O. 5mL/min,于樣品中分離純化獲得巖藻黃素。具體液相色譜見(jiàn)圖3,根據(jù)HPLC系統(tǒng)自生成報(bào)告可知,所分離的化合物純度可以達(dá)到94. 77%。實(shí)施例2 :從巨藻中提取純化巖藻黃素一、巨藻粗提液的制備將IOkg巨藻洗凈晾干,置于烘箱中,45°C下烘干。將干巨藻壓碎研磨成粉末,使用丙酮甲醇=3:1混合液45°C下超聲浸提4h。浸提3次,浸提液過(guò)濾,清液45°C下真空旋轉(zhuǎn)蒸干,得到巨藻粗提干樣。加入20ml甲醇溶解干樣,作為柱層析樣品。二、分離純化巖藻黃素首先使用干法裝柱,柱填料為硅藻土。上述步驟中所獲樣品加入少量硅藻土拌干上樣。以體積比為I :0.75的食用石油醚和丙酮做洗脫劑梯度洗脫,最后用IL丙酮洗脫。收集不同色帶洗脫物并濃縮。使用HPLC系統(tǒng)對(duì)上一步驟獲得的樣品進(jìn)行分離。選用正向ODS柱,溶劑體系為石油醚、二氯甲烷和丙酮(10:5:3)混合體系,流速為lmL/min,于樣品中分離純化獲得巖藻黃素。具體液相色譜見(jiàn)圖4,根據(jù)HPLC系統(tǒng)自生成報(bào)告可知,所分離的化合物純度可以達(dá)到90. 07%。實(shí)施例3 :從馬尾藻中提取純化巖藻黃素一、馬尾藻粗提液的制備將IOkg馬尾藻洗凈晾干,置于烘箱中,45°C下烘干。將干馬尾藻壓碎研磨成粉末,使用丙酮甲醇=3:1混合液45°C下超聲浸提4h。浸提3次,浸提液過(guò)濾,清液45°C下真空旋轉(zhuǎn)蒸干,得到馬尾藻粗提干樣。加入20ml甲醇溶解干樣,作為柱層析樣品。
二、分離純化巖藻黃素首先使用干法裝柱,柱填料為硅藻土。上述步驟中所獲樣品加入少量硅藻土拌干上樣。以體積比為I :0.52的食用石油醚和丙酮做洗脫劑梯度洗脫,最后用IL丙酮洗脫。收集不同色帶洗脫物并濃縮。使用HPLC系統(tǒng)對(duì)上一步驟獲得的樣品進(jìn)行分離。選用正向ODS柱,溶劑體系為石油醚、二氯甲烷和丙酮(10:5:3)混合體系,流速為lmL/min,于樣品中分離純化獲得巖藻黃素。具體液相色譜見(jiàn)圖5,根據(jù)HPLC系統(tǒng)自生成報(bào)告可知,所分離的化合物純度可以達(dá)到75. 72%。本發(fā)明得到海洋天然產(chǎn)物具有活性高、毒副作用小的特點(diǎn),可以用于抗氧化、抗炎、抗癌、抗血栓、抗瘧疾、抑制肥胖和糖尿病藥物的研發(fā)。也可用于開(kāi)發(fā)保肝、保護(hù)視力、減肥的保健品和美白保濕護(hù)膚品。
本發(fā)明采用的制備方案具有低毒安全、環(huán)保經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。使用硅藻土分離后,獲得的產(chǎn)品即可應(yīng)用于保健食品的開(kāi)發(fā)以及護(hù)膚品的添加。在獲得目標(biāo)產(chǎn)物的同時(shí),提高了產(chǎn)品的食用安全性,降低了對(duì)環(huán)境的污染和生產(chǎn)成本。經(jīng)高效液相色譜分離后,即可獲得色譜純巖藻黃素。滿足了國(guó)內(nèi)外對(duì)高純度巖藻黃素的需求,因而具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種褐藻中巖藻黃素的提取純化方法,其特征在于,包括有如下步驟 1)在褐藻粉內(nèi)添加丙酮和甲醇混合溶劑進(jìn)行超聲浸提,浸提液濃縮蒸干獲得初提樣品; 2)將I)中獲得的初提樣品加入甲醇進(jìn)行溶解,溶解液樣品進(jìn)行紫外/可見(jiàn)光譜分析,選取450nm處吸收峰的樣品作為褐藻浸提液進(jìn)行后續(xù)的分離純化; 3)對(duì)2)中制備的褐藻浸提液進(jìn)行柱層析分離,柱填料為硅藻土,用食用石油醚和丙酮的混合溶劑做洗脫劑;獲得洗脫液并濃縮; 4)使用高效液相色譜對(duì)步驟3)中獲得的洗脫液再進(jìn)行分離,選用正向ODS柱,以石油醚、二氯甲烷和丙酮的混合試劑做為流動(dòng)相,色譜分離獲得純化的巖藻黃素。
2.如權(quán)利要求I所述的提取純化方法,其特征在于所述的步驟I)中丙酮和甲醇混合溶劑中丙酮和甲醇的體積比為3:1。
3.如權(quán)利要求I所述的提取純化方法,其特征在于所述的步驟3)中食用石油醚和丙酮體的積比為I :0. 43 2. 33。
4.如權(quán)利要求I所述的提取純化方法,其特征在于所述的步驟4)石油醚、二氯甲烷和丙酮的混合試劑中石油醚、二氯甲烷和丙酮的體積比為10:5:3。
5.如權(quán)利要求I所述的提取純化方法,其特征在于所述的褐藻為海帶、巨藻或馬尾藻。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種褐藻中巖藻黃素的提取純化方法,包括有初提樣品制備、甲醇溶解、柱層析分離和HPLC純化步驟。本發(fā)明提供了一種安全低毒、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的巖藻黃素制備方案。本發(fā)明首次采用硅藻土做柱填料分離巖藻黃素。硅藻土具有價(jià)格經(jīng)濟(jì)、綠色環(huán)保的特點(diǎn)。同時(shí)使用食用石油醚分離,降低了最終產(chǎn)品中有毒物質(zhì)的殘留。經(jīng)硅藻土分離后,即可得低成本、安全健康的巖藻黃素保健品原料。再經(jīng)高效液相色譜分離純化后,便可得到色譜純巖藻黃素。本發(fā)明為滿足國(guó)內(nèi)外高純度巖藻黃素市場(chǎng)提供了安全低毒的分離技術(shù),大大提高了褐藻類水產(chǎn)品的附加值,具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C07D301/32GK102911138SQ20121030556
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月25日
發(fā)明者陳顥, 秦松, 張璇, 李培海, 張學(xué)雷, 張克誠(chéng) 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第一海洋研究所, 中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所, 上海誠(chéng)博生物科技有限公司