專利名稱：大豆凝集素提取純化方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，確切地說是大豆凝集素提取純化方法。大豆凝集素(soybean agglutinin，SBA)，是大豆中的一種重要的蛋白。1909年由Wienhaus首次發(fā)現(xiàn)，1952年由Liener和Pallansh等分離得到，1958年制備得到純品。 經(jīng)過長期的研究人們發(fā)現(xiàn)大豆凝集素是大豆中能夠特異性結合半乳糖、半乳糖胺、N-乙?；?D-半乳糖胺的四聚體糖蛋白。通常所說的大豆凝集素是指分子量為120kDa的四聚體， 有兩種稍有不同的亞基組成，有兩個半乳糖結合位點，等電點為5. 81，超速離心時隨著7S 蛋白一起沉降。研究表明SBA的凝集活性受Ca2+和Mn2+的影響，原因是SBA的每一個亞基中含有一個Ca2+和Mn2+。研究表明，這兩個離子有先后的結合在亞基上并對其糖結合特異性有一定影響。另外含有一種分子量為175kDa的凝集素，有兩種不同的亞基構成四聚體?，F(xiàn)有研究表明大豆凝集素具有如下功能1、細胞凝集活性，能夠凝集多種動物如兔、鼠、奶牛、人的紅細胞，多種動物的T淋巴細胞，小腸上皮細胞等；2、有絲分裂原活性，能夠促進淋巴細胞的有絲分裂，SBA能夠引起細胞代謝的增加，如DNA和蛋白質(zhì)合成，此外， SBA還能夠促進F-actin向G-actin的轉(zhuǎn)變，影響細胞形態(tài)。3、大豆凝集素的抗營養(yǎng)作用， 有較強的抗營養(yǎng)作用，主要表現(xiàn)在是動物采食量降低，對動物生長性能的抑制作用，對消化道結構的破壞作用，影響消化道消化吸收功能，影響消化道內(nèi)菌群的分布。由于大豆凝集素的具有上特性，大豆凝集素的應用范圍十分廣泛，動物營養(yǎng)學用純品凝集素研究其對動物的抗營養(yǎng)作用；大豆凝集素作為識別含有半乳糖，半乳糖胺， N-乙酰氨基-D-半乳糖糖鏈的探針，用于細胞表面的糖基化模式的研究；以及對于標記癌癥的分化程度有重要作用等多個領域。目前市場對純化的大豆凝集素需求日益增加，大多依賴進口，價格也比較昂貴。大豆凝集素傳統(tǒng)的純化方法包括離子交換和磷酸鈣層析。Liener和 Pallansch(1952)采用等電點沉淀、硫酸銨分級沉淀法分離得到了純化的大豆凝集素。Wade 等(1958)、張洪淵等(1991)采用離子交換纖維素、羥基磷灰石(HA)柱層析等方法成功進行了大豆凝集素的分離純化。親和層析也被應用于大豆凝集素的純化過程，并且純化工藝在不斷更新。由于傳統(tǒng)的大豆凝集素純化方法的純化效率較低，因而人們利用大豆凝集素能于 N-乙酰基-D-半乳糖胺、半乳糖等配基或配體發(fā)生特異性結合的能力制備了大豆凝集素親和純化體系。根據(jù)所采用親和介質(zhì)的不同，主要分為半乳糖胺-CH-kphar0Se4B、N-乙酰基-D-半乳糖胺-SepharoseeB和瓜爾膠親和層析體系。以上體系均存在一定的限制，瓜爾膠純化效率和純度較低，N-乙酰基-D-半乳糖胺-S印har0Se6B由于配基N-乙?；?D-半乳糖胺成本較高限制了其大規(guī)模使用，半乳糖胺-CH-kphar0Se4B流速有一定限制。純化過程主要包括，豆粉的脫脂，磷酸緩沖液溶解，40C過夜，離心，硫酸銨鹽析，離心，親和層析純化等過程。這種方法純化周期較長，硫酸銨使用量大容易造成水體污染
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種價格低廉、再生簡單的、流速高的純化大豆凝集素的親和層析填料。純化大豆凝集素親和層析填料D-GalN-FF-s印har0Se4B，其分子式為
權利要求
1.純化大豆凝集素親和層析填料D-GalN-FF-S印har0Se4B，其分子式為
2.純化大豆凝集素親和層析填料D-GalN-FF-s印har0Se4B的制備方法，它包括1)凝膠的溶脹與洗滌FF-S印harose4B在0. 5M NaCl溶液中吸水溶脹，吸出剩下的水分，脫氣；2)凝膠的活化脫氣后的凝膠，懸浮于按每8-10毫升4MNaOH溶液，加入18. OOmg硼氫化鈉(NaBH4)和5. OmL環(huán)氧氯丙烷的溶液中，保持pH值在13 14，懸浮液在20 25°C下混合反應1 池后，用2M NaOH淋洗，用蒸餾水淋洗至中性，再用0. 5M NaOH淋洗，脫氣；3)半乳糖胺交聯(lián)脫氣后活化的凝膠懸浮于含有10%半乳糖氨的0.5MNaOH溶液中， 輕輕攪拌后，室溫下靜置過夜；用0. 5M NaOH溶液淋洗，再用蒸餾水沖洗至pH達到中性，由 0. 15M NaCl溶液平衡。
3.大豆凝集素提取純化方法，它包括1)脫脂稱取豆粉，加入10倍質(zhì)量的正己烷，室溫下攪拌1.5-池，靜止后更換正己烷， 重復上述步驟三次，風干后保存?zhèn)溆谩?)粗提取脫脂豆粉，溶于40-50倍質(zhì)量的蒸餾水中充分攪拌，10000 15000rpm離心 10 20min。3)過濾離心后棄沉淀，上清經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過濾后進行親和層析；4)親和層析取D-GalN-FF-s印har0Se4B裝入層析柱中，用生理鹽水平衡后，將步驟3) 的粗提液加入層析柱中，用生理鹽水洗滌雜蛋白，待蛋白濃度回歸基線時，加入含0. 3M半乳糖的生理鹽水洗脫大豆凝集素，自開始出現(xiàn)蛋白峰時收集洗脫液，直到蛋白峰回歸至基線.線，5)透析蛋白溶液裝入透析袋中用蒸餾水透析，除去NaCl；6)濃縮透析袋外側(cè)加入聚乙二醇以濃縮蛋白；7)冷凍干燥。
4.根據(jù)權利要求3所述的大豆凝集素提取純化方法，其特征在于親和層析流速為 3ml/min。
5.根據(jù)權利要求3所述的大豆凝集素提取純化方法，其特征在于使用多次的 D-GalN-FF-sepharose4B用鹽酸胍、氫氧化鈉洗滌后，再生。
6.根據(jù)權利要求5所述的大豆凝集素提取純化方法，其特征在于所述的再生，是用6M 鹽酸胍洗脫2-3個柱體積，0. 9 % NaCl平衡3個柱體積，然后用0. 5 1. 5 %的NaOH洗脫 2 3個柱體積，然后用0. 9% NaCl平衡，直到洗脫液pH不再變化為止。
全文摘要
本發(fā)明公開了親和層析填料D-GalN-FF-sepharose4B，成本低、機械強度好，能夠耐受較高的純化壓力，流動相的流速加快，純化周期短，化學性質(zhì)穩(wěn)定，能夠耐受較高濃度的強堿，使用過的填料可以再生使用，再生方法簡單；本發(fā)明大豆凝集素純化方法，純化工藝比以往的純化工藝簡單、省時，只需一步離心，避免了過量硫酸銨的使用，遭成環(huán)境的污染。一個純化周期內(nèi)產(chǎn)量(＞100mg)高于其他方法一個周期內(nèi)的純化產(chǎn)量(＜45mg)；可實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。對本發(fā)明制得的純化大豆凝集素，進行了大豆凝集素分子量及純度的測定、Western blot鑒定、兔紅細胞凝集效價的比較，與標準品相同，無差異。
文檔編號C07K14/42GK102212105SQ20111011490
公開日2011年10月12日 申請日期2011年5月5日 優(yōu)先權日2011年5月5日
發(fā)明者劉飛飛, 盧加成, 孫澤威, 張春, 張海全, 楊連玉, 秦貴信, 程傳鋒, 穆成龍, 趙元, 趙晗, 車東升, 鮑男 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學