專利名稱：一種日本血吸蟲23kDa膜蛋白大親水肽段融合蛋白及其在血吸蟲感染免疫診斷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種日本血吸蟲23kDa膜蛋白大親水肽段融合蛋白抗原制備及基于免疫印漬方法對血吸蟲感染進行早期診斷的試劑盒及檢測方法，屬于寄生蟲病免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是嚴重危害我國及世界上熱帶與亞熱帶地區(qū)人民身體健康的嚴重公共衛(wèi)生問題。中國仍有449個縣有血吸蟲病流行，近44萬血吸蟲病人，約2. 3億人口受到血吸蟲感染的威脅。對血吸蟲感染的病人、家畜、野生動物等傳染源進行診斷，及時給予治療， 消滅傳染源，阻斷血吸蟲病的傳播是血吸蟲病防治的關(guān)鍵措施。血吸蟲感染診斷常用技術(shù)包括如下幾種
病原學(xué)檢測
采用ΚΑΤ0-ΚΑΤΖ法檢測血吸蟲感染病人糞便中的血吸蟲蟲卵，或通過毛蚴孵化法檢測糞便樣本中是否有蟲卵并能孵化出血吸蟲幼蟲毛蚴。病原學(xué)診斷是血吸蟲感染診斷的金標準，缺點是必須是在血吸蟲在宿主體內(nèi)發(fā)育成熟產(chǎn)卵后并排出體外之后才能做出診斷，時間上滯后，不能進行早期診斷。該方法操作煩瑣，不易被接受，容易漏診。核酸檢測
采用DNA探針雜交，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或環(huán)介導(dǎo)同溫DNA擴增技術(shù)(LAMP法)檢測血吸蟲感染病人、動物血清樣本，糞便樣本中的血吸蟲特異性DNA片段，來確定宿主體內(nèi)是否有血吸蟲感染。此類方法的檢測效果與病原學(xué)檢測效果相似，具有血吸蟲活動性感染的診斷價值，缺點是操作煩瑣，成本高，難以在血吸蟲病防治基層機構(gòu)推廣應(yīng)用。免疫學(xué)檢測
免疫學(xué)檢測方法包括皮試、循環(huán)抗原檢測和血清抗體檢測三類方法。皮試是將血吸蟲成蟲抗原接種到人體的皮內(nèi)，通過觀察其在一定時間范圍內(nèi)的致敏效果來判斷受試者是否感染血吸蟲。該方法的特點是操作簡便，在20世紀60-80年代被廣泛用于血吸蟲病的篩查，缺點是對人體有損害和副作用，結(jié)果特異性差，并受到受試者的遺傳及身體狀況的影響，目前該方法已被棄用。循環(huán)抗原檢測循環(huán)抗原是指進入宿主血液循環(huán)的血吸蟲蟲體蛋白成分，是體內(nèi)存在血吸蟲的標志，檢測血吸蟲的循環(huán)抗原具有病原學(xué)診斷價值。該方法的建立必須制備抗循環(huán)抗原的特異性單克隆抗體，建立以單克隆抗體檢測循環(huán)抗原酶聯(lián)免疫學(xué)方法或其它檢測方法。由于目前對血吸蟲循環(huán)抗原的成分不清楚，難以獲得非常好的特異性單克隆抗體，雖然國內(nèi)外均報道了一些血吸蟲循環(huán)抗原的檢測方法，但是敏感性都比較低，不能滿足現(xiàn)場血吸蟲感染查病的需要。循環(huán)抗體的檢測循環(huán)抗體是指血吸蟲進入人體后其抗原成分刺激機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)物的抗血吸蟲循環(huán)抗原特異性抗體，特異性抗體的出現(xiàn)一般在血吸蟲感染宿主后1-2周，出現(xiàn)比較早，有早期診斷價值。針對某些特定抗原的抗體在治療后能快速轉(zhuǎn)陰，具有療效考核價值。常用檢測抗體的方法有很多，包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，免疫層析法(試紙條法)，免疫滲濾法，間接血凝法(IHA)，環(huán)卵沉淀法(C0PT)，免疫磁珠法等。它們的共同特點是以血吸蟲的抗原與被試者血清進行反應(yīng)，觀察被試者體內(nèi)是否有抗血吸蟲抗原的特異性抗體存在。其共同的缺點是所用的抗原均為血吸蟲可溶性蟲卵抗原或成蟲抗原，這種抗原為混合抗原。由于蟲卵或成蟲可溶性抗原的成分十分復(fù)雜，有一些成分可能與其它物種的成分有同源性，易與其它寄生蟲感染血清發(fā)生交叉反應(yīng)，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。使用重組血吸蟲抗原理論上可以避免上述交叉反應(yīng)的產(chǎn)生，但是由于重組血吸蟲抗原多數(shù)是從大腸桿菌中制備，純化的重組血吸蟲抗原難免會混雜有大腸桿菌抗原成分，而大腸桿菌是人體及動物的體內(nèi)的正常菌群，因而會引起假陽性結(jié)果。交叉反應(yīng)與假陽性問題是當前抗體檢測所必須解決的問題。循環(huán)抗體檢測的另一方法就是免疫印漬法。它的原理是采用聚丙烯凝膠電泳能按分子量的大小將混合抗原各種成分分開，形成分子量大小不同的蛋白質(zhì)條帶，將這些蛋白質(zhì)條帶通過電轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上，再與血吸蟲感染患者血清反應(yīng)，通過觀察血吸蟲抗原蛋白條帶是否與受試者血清發(fā)生反應(yīng)即可判斷受試者是否感染過血吸蟲。該方法的特點是特異性好，不易產(chǎn)生交叉反應(yīng)及假陽性結(jié)果；敏感性高于常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附方法；如果使用血吸蟲童蟲期的抗原作為檢測抗原，則具有早期診斷價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種以重組融合蛋白為檢測抗原檢測宿主血清中抗日本血吸蟲23kDa膜蛋白分子特異性抗體IgG或IgM免疫印漬方法，可以解決當前血吸蟲抗體檢測方法特異性和早期診斷價值不足的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案為達到上述目的，本發(fā)明選擇日本血吸蟲23kDa膜蛋白分子的大親水肽段與人血清白蛋白的融合蛋白，記為Sj23HD-HSA融合蛋白，作為抗血吸蟲抗原特異性抗體的檢測抗原。所述的Sj23HD-HSA融合蛋白由2個多肽區(qū)組成，1區(qū)為日本血吸蟲23kDa膜蛋白大親水肽段(Sj23HD)，其2區(qū)為人血清白蛋白(HSA)。1區(qū)通過C未端與2區(qū)的N未端直接連接，中間不加任何連接肽。其結(jié)構(gòu)式是Sj23HD-HSA。所述的23kDa膜蛋白大親水肽段(Sj23HD)為日本血吸蟲23kDa膜蛋白分子氨基酸序列的第110到163位氨基酸，與Sj23HD的氨基酸序列SEQ ID NO 1保持有至少90%的同源性。所述的Sj23HD_HSA融合蛋白，2區(qū)多肽選自人血清白蛋白HSA，2區(qū)多肽的氨基酸序列與人血清白蛋白HSA的氨基酸序列SEQ ID NO 2保持有至少90%的同源性。所述的Sj23HD-HSA融合蛋白，其基因核苷酸序列編碼為SEQ ID NO :3。所述的Sj23HD-HSA融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO :4。所述的Sj23HD-HSA融合蛋白的表達，在于將編碼Sj23HD_HSA融合蛋白的重組核苷酸片段SEQ ID N0:3插入到一種表達載體中構(gòu)建重組表達載體Sj23HD-HSA/pEI^8a(+)， 然后將重組表達載體Sj23HD-HSA/pEI^8a(+)轉(zhuǎn)化入一種宿主細胞大腸桿菌BL21 (DE3)中表達該Sj23HD-HSA融合蛋白。
所述的Sj23HD_HSA融合蛋白的制備方法，包括轉(zhuǎn)錄，翻譯，蛋白分離和純化，以及
鑒定步驟。所述Sj23HD_HSA融合蛋白的特征是能使Sj23HD多肽趨于穩(wěn)定，不易被降解，并提高Sj23HD肽段作為血吸蟲特異性抗體檢測抗原的敏感性與特異性。所述Sj23HD_HSA融合蛋白的應(yīng)用，是用于通過免疫學(xué)方法檢測血吸蟲特異性抗體的抗原，用于血吸蟲感染患者的篩查與診斷。包括但不局限于酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)， 免疫印漬法(I mmunοb 1 ο t)，免疫層析法，免疫滲濾法，放射免疫法，時間分辯熒光法 (TRFIA)，免疫磁珠法，等等。本發(fā)明為了使獲得表達的S j23HD_HSA融合蛋白能夠有效地被純化，在 SJ23HD-HSA融合蛋白的C未端人工加上一個5個組氨酸(His)標簽，可使之經(jīng)鎳螯合膠進行親和純化。本發(fā)明優(yōu)選的表達質(zhì)粒是pET28a(+)(美國MERCK公司產(chǎn)品)，適合在大腸桿菌工程菌中表達。但是，本發(fā)明中的Sj23HD-HSA融合蛋白也可選擇利用其它質(zhì)粒來表達， 這些表達質(zhì)粒包括但是不局限于原核、真核表達系統(tǒng)常用的質(zhì)粒。具體地，該表達質(zhì)粒含有適當?shù)膯幼樱靡钥刂迫诤系鞍椎谋磉_。這些啟動子包括但是不局限于以下所述的T7啟動子，優(yōu)選的啟動子為T7。本發(fā)明提供構(gòu)建Sj23HD_HSA融合蛋白的表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法及工程菌構(gòu)建方法。首先克隆獲得一重組多聚核苷酸序列，該序列含有編碼Sj23HD多肽區(qū)的核苷酸序列區(qū)和編碼HSA多肽區(qū)的核苷酸序列區(qū)。編碼Sj23HD多肽區(qū)的氨基酸序列與序列SEQ ID NO :1保持有至少90%的同源性。編碼HSA多肽區(qū)的氨基酸序列與序列SEQ ID NO 2保持有至少90%的同源性。具體地，通過PCR技術(shù)，從人胎肝來源的RNA中反轉(zhuǎn)錄PCR獲得編碼HSA多肽區(qū)的核苷酸片段，并使HSA片段的3'端帶有損ol的酶切位點。編碼Sj23HD多肽區(qū)的核苷酸片段是通過人工合成獲得的，并使其5'端帶有Afcol酶切位點，3'端帶有HSA基因序列的部分核苷酸序列。將編碼Sj23HD多肽區(qū)的核苷酸片段與編碼HSA多肽區(qū)的核苷酸片段混合，采用重疊聚合酶鏈反應(yīng)方法將此二基因片段融合成一個編碼Sj23HD-HSA融合蛋白的完整基因片段。將Sj23HD-HSA融合基因片段克隆到TA克隆載體pGEM_T中構(gòu)建重組質(zhì)粒 Sj23HD-HSA/pGEM-T進行DNA序列分析，確定其基因序列的正確性。然后將此Sj23HD_HSA 基因片段通過Afcol，損ol酶切位點插入到表達質(zhì)粒pET28a(+)中構(gòu)建重組表達質(zhì)粒 Sj23HD-HSA/pEI^8a(+)。將該重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α，再轉(zhuǎn)種到含有氨芐青霉素(AMP)的LB平板(1%的蛋白胨，0. 5%的酵母抽提物，1%氯化鈉，瓊脂粉1. 2%，氨卞青霉素 100 μ g/mL)進行繁殖和保種。本發(fā)明表達Sj23HD_HSA融合蛋白的重組質(zhì)粒Sj23HD_HSA/pEI^8a (+)可在多種大腸桿菌中表達，其優(yōu)選的菌株是大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明提供一種工程菌大規(guī)模表達Sj23HD_HSA融合蛋白的方法。具體地，將含有重組表達質(zhì)粒Sj23HD-HSA/pEI^8a(+)的單個菌落接種到選擇性培養(yǎng)基LB (1%的蛋白胨， 0.5%的酵母抽提物，1%氯化鈉，氨卞青霉素100yg/mL)中，37°C振搖過夜。第二天按1 10稀釋接種到新鮮的LB培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)4h(0D_ 0. 4)，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達融合蛋白Sj23HD-HSA。融合蛋白的表達，可以通過一般的蛋白生化手段檢測，包括但不局限于 SDS-PAGE, Western blotting 等。本發(fā)明也提供一種Sj23HD_HSA融合蛋白的分離純化方法。具體地，該分離純化方法利用了 Sj23HD_HSA的C未端帶有5個His標簽，可以與鎳螯合膠結(jié)合的特點，選用鎳螯合親和層析柱進行親和純化，成功地捕獲了表達產(chǎn)物中的 SJ23HD-HSA融合蛋白，目標蛋白質(zhì)的純度可以達95%以上。本發(fā)明也提供了一種鑒定Sj23HD_HSA融合蛋白免疫反應(yīng)性的方法。具體地，以純化的重組Sj23HD_HSA融合蛋白與福氏佐劑混合，免疫C57BL/6J小鼠，連續(xù)加強免疫2次后，通過酶聯(lián)免疫吸咐法測定小鼠血清中是否有抗Sj23HD特異性抗體產(chǎn)生。本發(fā)明提供一種以重組Sj23HD_HSA融合蛋白檢測血吸蟲感染動物的體內(nèi)特異性抗血吸蟲抗原抗體的血吸蟲病診斷的免疫印漬方法或試劑盒。具體地，將Sj23HD_HSA融合蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后采用電轉(zhuǎn)移方法將Sj23HD-HSA融合蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上，將含有Sj23HD_HSA融合蛋白條帶的NC膜與受試者血清反應(yīng)，加入酶標記抗IgG 二抗后，用底物3，3- 二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色，觀察受試者血清中是否有抗Sj23HD分子特異性抗體存在，對受試者是否被血吸蟲感染過做出判斷。本發(fā)明的有益效果血吸蟲23kDa膜蛋白分子存在于除蟲卵以外的血吸蟲發(fā)育各個階段，該23kDa膜蛋白分子大親水肽段具有很好的血吸蟲病診斷價值。本發(fā)明采用基因重組技術(shù)制備Sj23HD-HSA融合蛋白可以提高Sj23HD分子大親水肽段的穩(wěn)定性，采用免疫印漬法檢測抗Sj23HD分子大親水肽段的特異性抗體可以提高該抗原分子診斷血吸蟲感染的敏感性與特異性，尤其是對初次感染血吸蟲的病人與動物保蟲宿主的診斷，具有血吸蟲感染的早期診斷價值，將有良好的應(yīng)用前景。


圖1表達Sj23HD_HSA融合蛋白的重組質(zhì)粒構(gòu)建流程2 Sj23HD-HSA融合蛋白基因片段
Ulkb DNA分子量標志物
2、純化的Sj23HD-HSA融合蛋白基因片段
圖3重組表達質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果
1、重組表達質(zhì)粒Sj23HD-HSA/pEI^8a(+)
2、表達質(zhì)粒pET28a(+)
3Ukb DNA分子量標志物
圖4重組質(zhì)粒Sj23HD-HSA/pEI^8a(+)酶切分析結(jié)果(Afco 1+損ο 1) Ulkb DNA分子量標志物
2、未被酶切的重組表達質(zhì)粒Sj23HD-HSA/pEI^8a (+)
3、經(jīng)Afcol，損ol 雙酶切的 Sj23HD-HSA/pET28a(+)質(zhì)粒 DNA 產(chǎn)物圖5、重組Sj23HD-HSA融合蛋白誘導(dǎo)表達結(jié)果1、含重組表達質(zhì)粒Sj23HD-HSA/pEI^8a(+)轉(zhuǎn)化子細菌的表達產(chǎn)物
2、含表達質(zhì)粒pET28a(+)轉(zhuǎn)化子細菌的表達產(chǎn)物
3、不含任何質(zhì)粒的宿主菌Ecoli.BL21(DE3)的表達產(chǎn)物
4、蛋白質(zhì)分子量標志物
圖6重組Sj23HD-HSA融合蛋白純化產(chǎn)物
1、蛋白質(zhì)分子量標志物
2、純化的Sj23HD-HSA融合蛋白
圖7重組Sj23HD-HSA融合蛋白免疫反應(yīng)特異性
1、蛋白質(zhì)分子量標志物
2、重組Sj23HD-HSA融合蛋白與健康人血清反應(yīng)
3、重組Sj23HD-HSA融合蛋白與血吸蟲病人血清反應(yīng)
4、重組Sj23HD-HSA融合蛋白與肺吸蟲病人血清反應(yīng)
5、重組Sj23HD-HSA融合蛋白與肝吸蟲病人血清反應(yīng)。
具體實施例方式下面提供的實施例可以詳細地解釋本發(fā)明的主要內(nèi)容，但不局限于以下這些內(nèi)容。實施例1 人血清白蛋白基因克隆
人血清白蛋白基因通過RT-PCR技術(shù)，從人胎肝組織的mRNA中反轉(zhuǎn)錄合成而來，具體制備方法如下
1、人胎肝mRNA的制備
取新鮮分離的人胎肝組織0. 5g，在液氮中冷凍后，在陶瓷研缽中粉碎，再用GE Healthcare 公司的 mRNA 純化試劑盒(Illustra QuickPrep mRNA purification kit)制備純化mRNA，操作方法嚴格按試劑盒的操作說明書。用紫外分光光度計測mRNA的純度與含量。2、HSA基因擴增 2.1引物設(shè)計
HSAl 5' -GATGCACACAAGAGTGAGGT-3‘
HSA2: 5' -AACTCGAGTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC-3'。2. 2 第一鏈 cDNA 合成
采用Phusion RT-PCR Kit (購自NEB北京分公司)，在一個0. 2mL的PCR管中，加入 mRNA 2 μ L (約 IOng)，10 mM dNTP 混合物 1 yL，01igo(dT) primer 1 μ L，加無離子水至終體積10 UL0混勻，離心收集于管底。65°C水浴預(yù)變性5min，置冰上冷卻。加入IOX 反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μ L，反轉(zhuǎn)錄酶混合物2 μ L，無核糖核酸酶水(無foiase水)6 μ L，混勻，離心收集于管底。25°C保溫lOmin，再在40°C保溫30min以合成第一鏈cDNA。80°C保溫5min以終止反應(yīng)。2.3目的基因擴增
在一個 0. 2mL 的 PCR 管中，加入 2 XPhusionMaster Mix 25μ ，第一鏈 cDNA 3μ ，引物 HSAl 0. 5μ (25μΜ)，HSA2 0. 5μ (25μΜ)，加無核糖核酸酶水到終體積 50μ 。PCR 條件98V 30 Sec ；然后 98°C變性 10 Sec;65°C、30 Sec，72°C、50 Sec，一共 30個循環(huán)；最后，72°C、 保溫5min。采用低融點瓊脂糖凝膠電泳方法回收純的HSA基因片段。具體是用0. 5%的 agarose膠電泳PCR擴增產(chǎn)物，切下分子量約1800bp左右的目的DNA條帶，再用Promega公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化HSA基因DNA片段。實施例2 :Sj23HD基因合成
Sj23HD基因是利用人工合成方法制備。為了便于將Sj23HD基因與HSA基因融合，以及便于基因克隆，在合成的過程中在Sj23HD的5’端帶上了一個Afcol的酶切位點，在其3’ 端帶上部分HSA基因的5，端DNA序列。合成后的Sj23HD基因如SEQ ID NO :5?；蛐蛄械暮铣墒怯缮虾Ｓ⒖∩锛夹g(shù)有限公司完成。實施例3 :Sj23HD-HSA融合蛋白基因的構(gòu)建與序列分析 SJ23HD-HSA融合蛋白基因的制備是根據(jù)Overlapping PCR的原理進行的。引物設(shè)計
Sj23HDl: 5' -CATGGATGACTGGTGCTCT-3‘，
HSA2: 5' -AACTCGAGTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC-3'。基因擴增
在一個0.2mL的PCR管中，加入2 XPhusion Master Mix 25μ ，合成的Sj23HD基因片段2PL，純化的HSA基因片段2PL (此2個基因片段的分子比例盡可能調(diào)節(jié)到1 1)，加無離子水到終體積48PL，98°C 30 kc ;65°C退火30 kc，72°C延伸2 min，在冰上冷卻反應(yīng)管。 加入引物Sj23HDl，HSA2各WL，混勻，離心收集反應(yīng)物于管底。然后按以下條件進行基因擴增98°C、10 Sec;65°C、20 Sec, 72°C >50 Sec，一共 30 個循環(huán)；最后，72°C、保溫 5min。采用!Iomega公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒，純化合成的Sj23HD_HSA基因片段，如圖2所示。TA克隆與序列分析
SJ23HD-HSA的3'端加腺嘌呤(A)尾巴將純化的Sj23HD_HSA片段置于PCR反應(yīng)管中，加入 IOX Taq DNA 聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液 ΙΟμ ，MgCl2 ΙΟμ (25 mmol/L),dATP μ (10 mmol/L),Taq DNA聚合酶 μ (5 U/μ ，加滅菌無離子水至100μ ，在PCR儀上72 °C保溫 30 min，使Sj23HD-HSA的3'端加上“A”尾巴。用!Iomega公司的酶切產(chǎn)物純化試劑盒純化加A尾后的Sj23HD-HSA基因DNA片段。再用!Iomega公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化 HSA基因DNA片段。將Sj23HD-HSA片段與TA clone載體pGEM_T (美國I3ROMEGA公司產(chǎn)品)按照3 1的比例混合，在T4 DNA連接酶的作用下連接，反應(yīng)體系如下2X Iigase buffer 5 μ L, pGEM-T vector μ (50ng)，Sj23HD_HSA基因片段 3μ ，Τ4 DNA Iigase μ , 總體積10μ ?；靹蚝螅虝弘x心，16°C水浴連接過夜，形成重組質(zhì)粒Sj23HD-HSA/pGEM-T。電轉(zhuǎn)化步驟為1)取5μ 連接產(chǎn)物加入到50μ 感受態(tài)細胞E. coli DH5 α中，小心混勻，勿使有氣泡產(chǎn)生，放置冰浴上30 min。2)將連接產(chǎn)物與Ε. coli DH5 α的混合物轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的狹縫為0. Icm的電擊杯中，勿使有氣泡產(chǎn)生，小心拭去電擊杯外的冷凝水。 3)設(shè)置電脈沖儀(BIO-RAD)脈沖參數(shù)電壓2. 5 kV，電容25 PF，電阻200 Ω。將電擊杯插入電脈沖儀電擊槽內(nèi)，同時按住兩個脈沖電極保持至放電為止。4)取出電擊杯，加入0.5 mL 37°C預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，混勻后將電擊后的菌液轉(zhuǎn)移到一無菌玻璃試管中，37°C、200 rpm 振蕩培養(yǎng)40 min。5)取200μ 菌液均勻涂布于表面預(yù)先涂有40μ X-gal (40 mg/mL)的 LB平板上(含Amp 10(^g/mL)。室溫下放置待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板于37°C培養(yǎng)箱過夜。在LB平板上出現(xiàn)白色菌落可初步判定為陽性克隆，藍色菌落為陰性克隆。將白色菌落細菌送到上海英俊公司進行DNA序列分析。實施例4 :Sj23HD-HSA融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建以下以Sj23HD-HSA融合基因為例，說明表達載體質(zhì)粒的構(gòu)建。本發(fā)明采用pET28a(+)為表達載體質(zhì)粒，其制備方法為常用分子生物學(xué)方法。即通過培養(yǎng)含有表達載體的菌種，提取獲得該質(zhì)粒。制備質(zhì)粒后-20°C保存待用。具體如下，對表達載體質(zhì)粒pET28a(+)及重組質(zhì)粒Sj23HD-HSA/pGEM_T分別進行 Afcol、損ol雙酶切。具體條件如下。質(zhì)粒DNA ΙΟμ , Afcol Ιμ , Xhol μ ，10Χ酶切緩沖液；ddH20 33μ ,總體積為50μ 。37°C恒溫水浴鍋內(nèi)溫浴3小時，通過瓊脂糖凝膠電泳回收線性化的pET28a (+)質(zhì)粒DNA和Sj23HD_HSA DNA片段，通過瓊脂糖凝膠電泳回收分子量約2000 bp的Sj23HD-HAS DNA片段和分子量約5000bp的pED8a(+)質(zhì)粒DNA片段。將回收的Sj23HD-HSA DNA片段與表達質(zhì)粒pET28a (+) DNA片段連接，構(gòu)建融合蛋白表達質(zhì)粒 Sj23HD-HSA/pEI^8a(+)。連接體系為10uL，雙酶切的pED8a (+)質(zhì)粒與雙酶切Sj23HD_HSA DNA 的摩爾比為 1 2-10，10XT4 DNA Iigase 緩沖液 μ ，Τ4 DNA Iigase μ ，加無菌水至總體積為ΙΟμ 。連接反應(yīng)16°C恒溫水浴內(nèi)溫浴16小時。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 感受態(tài)細胞。陽性克隆的鑒定是通過含Ampicilin的LB平板挑選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，并通過雙酶切分析確定目的基因是否被插入到表達載體中(圖3，4所示)。實施例5 :Sj23HD-HSA融合蛋白表達工程菌的構(gòu)建
本發(fā)明利用電轉(zhuǎn)化方法和Sj23HD-HSA融合基因為例，說明Sj23HD_HSA融合蛋白表達工程菌構(gòu)建的方法。具體方法如下。首先挑選含有Sj23HD-HSA/pEI^8a(+)重組質(zhì)粒的細菌克隆，提取質(zhì)粒DNA。然后， 用電轉(zhuǎn)化的方法把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中。質(zhì)粒DNA提取方法按Promega公司質(zhì)粒DNA純化試劑盒操作說明進行。電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌具體如下。先進行感受態(tài)細胞的準備。挑取新鮮的BL21 (DE3)單菌落，接種至含有3mL LB 液體培養(yǎng)基的試管中，37°C、200r/min培養(yǎng)過夜。然后取ImL的培養(yǎng)物接種至含有500mL新鮮LB培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，37°C、250-300r/min培養(yǎng)過夜，至OD6tltl小于0. 4。將細菌培養(yǎng)物置于冰上冷卻，2500g離心20min，去上清，用500mL的冰預(yù)冷的ddH20將菌體沉淀重懸。 離心后，再用250mL的冰預(yù)冷的10%的甘油溶液將菌體沉淀重懸。再離心，用IOmL的冰預(yù)冷的10%的甘油溶液將菌體沉淀重懸。再離心，用冰預(yù)冷的10%的甘油溶液將菌體沉淀重懸，調(diào)節(jié)菌液OD6tltlnm=IO. O。以每管100 μ L的體積分裝感受態(tài)細胞，_70°C保存?zhèn)溆?。電擊轉(zhuǎn)化，具體如下。將S j23HD_HSA/pEI^8a (+)重組質(zhì)粒DNA溶解在5 ΙΟμ TE溶液中，與80μ 的上述感受態(tài)菌體混勻，轉(zhuǎn)至0. Icm狹縫的預(yù)冷電轉(zhuǎn)化杯中，冰浴lOmin。然用1. 8kv電壓、25PF 電容、200 Ω電阻的條件進行電擊。電擊完畢后，加入ImL 37°C預(yù)溫的LB液體培養(yǎng)基懸浮， 并轉(zhuǎn)至無菌的玻璃試管中，37°C、250-300r/min培養(yǎng)40min。將菌液涂布到含有卡那霉素的 LB平板上，置于37°C培養(yǎng)過夜。實施例6 :Sj23HD-HSA融合蛋白表達和純化重組Sj23HD-HSA融合蛋白的表達
9將表達菌株接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中(Kan，100 μ g/mL)，37°C、200 rpm過夜培養(yǎng)。 取IOmL過夜培養(yǎng)菌液，按照1 100分別轉(zhuǎn)種于1，000 mL LB肉湯培養(yǎng)基中(Kan，IOOyg/ mL)中，37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)3 4 h至菌液
0D6QQnm約為0. 5。加入IPTG至終濃度為1 mM，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4°C、5，000 rpm離心10 min，收集所有細菌。取少量的細菌進行SDS-PAG電泳，觀察目的蛋白的表達情況(圖5)，用 100 mL PBS重懸浮細菌沉淀。-30°C反復(fù)凍融2 3次，冰浴中超聲破碎細菌7次(功率 200W)，每次20 sec，間隔20 sec。裂解液以14，000Xg、4 °C離心10 min，收集沉淀。重組Sj23HD_HSA融合蛋白的純化
上柱樣本的準備將上述裂解物沉淀用去離子水懸浮，再以12，000 g離心10 min, 去上清，再加入去離子水懸浮，如此洗滌3次。沉淀物用Buffer A (IOOmM NaH2PO4,10 mM Tris-HCl，8M尿素，pH 8.0)溶解，再以同樣的條件超聲4次，打碎其中的DNA ；再以12，000 g離心，上清液經(jīng)0. 45 μ m孔徑的微孔濾膜過濾。輕輕混勻M樹脂，取2mL裝入試劑盒提供的層析柱中，使M樹脂自然沉降于底部。待液體流盡后，加入IOmL的Buffer A預(yù)平衡。將Buffer A處理好的樣本加入柱中，控制流速在15mL/h。上樣完畢，用20mL Buffer A洗柱，直至流出液的A28tlnm接近于零。 再用 20mL Buffer B (IOOmM NaH2PO4,10 mM Tris-HCl，8M 尿素，pH 6. 3)洗柱，洗去雜蛋白。然后用 Buffer C (IOOmM NaH2PO4,10 mM Tris-HCl，8M 尿素，pH 4.5)洗脫目的蛋白。 SDS-PAGE電泳觀察目的蛋白的純度。如圖6所示。實施例7 重組Sj23HD_HSA融合蛋白免疫反應(yīng)性分析
將100 μ g融合蛋白Sj23HD-HSA進行12%SDS_PAGE，電泳結(jié)束后立即用半干轉(zhuǎn)印緩沖液 (Tris 5. 82g, glycine 2. 93g,methanol 200mL，用雙蒸水定容至 1L)平衡膠 15min。準備預(yù)先切割好的厚濾紙和硝酸纖維素膜(切割至與電泳凝膠大小一致)，使用前放置于半干轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡15-30min。將轉(zhuǎn)膜裝置的各組件從下至上依次按陽極、濾紙、NC膜、凝膠、濾紙、陰極的順序放好，濾紙、NC膜、凝膠精確對齊，每一步都要去除氣泡。在室溫，恒電壓20V 條件下電轉(zhuǎn)化30min。硝酸纖維素(NC)膜用5%脫脂牛奶PBST (PBS含0. 05%Tween-20)封閉， 室溫1 h或4°C過夜；將NC膜縱切成0.3cm寬的長條，編上號碼，分別放入含ImL (1:500 稀釋)血吸蟲病人血清的水化盤槽內(nèi)，置室溫搖床上反應(yīng)1 h。用TBST洗滌NC膜條3次， 每次lOmin，加入用PBS作1 10000稀釋的IgG-HRP或1 1000稀釋的IgM-HRP，室溫反應(yīng)1 h。再用TBST洗滌3次后用3，3- 二氨基聯(lián)苯胺鈉鹽(DAB)底物液(6mg DAB溶于IOmL PBS 中，用前加IOyL H2O2)顯色2 min，用蒸餾水漂洗NC膜條終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。顯示重組 Sj23HD-HSA融合蛋白可以與血吸蟲感染病人血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而與肺吸蟲，肝吸蟲病人血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，與健康人血清亦不發(fā)生反應(yīng)，顯示出良好的特異性。如圖7的2、3、 4、5所示。實施例8 重組Sj23HD_HSA融合蛋白檢測血吸蟲感染小鼠
按實施例7的方法，將重組Sj23HD-HSA融合蛋白進行SDS-PAG電泳，采用電轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)移到NC膜上。被切成膜條后分別與感染后的7、10、14、18、21、觀天小鼠血清反應(yīng)，同時以常規(guī)酶聯(lián)免疫法做對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫印漬法的敏感性比常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附法高。感染后21天常規(guī)酶聯(lián)免疫法的陽性率為60%，而免疫印漬法的陽性率為80%，兩者有顯著的差異性。如表1所示。
表1兩種方法檢測血吸蟲感染后不同時間小鼠血清抗Sj23HD抗體IgG陽性率的比較
權(quán)利要求
1.一種日本血吸蟲23kDa膜蛋白大親水肽段與人血清白蛋白的融合蛋白，其稱之為 SJ23HD-HSA融合蛋白，其特征在于所述的Sj23HD_HSA融合蛋白由2個多肽區(qū)組成，1區(qū)為日本血吸蟲23kDa膜蛋白大親水肽段Sj23HD，其2區(qū)為人血清白蛋白HSA ；1區(qū)通過C未端與2區(qū)的N未端直接連接，中間不加任何連接肽，其結(jié)構(gòu)式是Sj23HD-HSA ；所述的23kDa膜蛋白大親水肽段Sj23HD為日本血吸蟲23kDa膜蛋白氨基酸序列的第 110到163位氨基酸，與Sj23HD的氨基酸序列SEQ ID NO 1保持有至少90%的同源性；所述的Sj23HD-HSA融合蛋白，2區(qū)多肽選自人血清白蛋白HSA，2區(qū)多肽的氨基酸序列與人血清白蛋白HSA的氨基酸序列SEQ ID NO 2保持有至少90%的同源性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sj23HD-HSA融合蛋白，其基因的核苷酸序列編碼為SEQID NO :3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sj23HD-HSA融合蛋白，其氨基酸序列為SEQID NO :4。
4.權(quán)利要求1所述的Sj23HD-HSA融合蛋白的表達，其特征在于將編碼Sj23HD_HSA 融合蛋白的重組核苷酸片段SEQ ID NO :3插入到一種表達載體中構(gòu)建重組表達載體 Sj23HD-HSA/pET28a(+)，然后將重組表達載體Sj23HD_HSA/pEI^8a (+)轉(zhuǎn)化入一種宿主細胞大腸桿菌BL21 (DE3)中表達該Sj23HD-HSA融合蛋白。
5.權(quán)利要求1所述的Sj23HD-HSA融合蛋白的制備方法，其特征在于包括轉(zhuǎn)錄，翻譯，蛋白分離和純化，以及鑒定步驟。
6.權(quán)利要求1所述的Sj23HD-HSA融合蛋白的應(yīng)用，其特征在于在血吸蟲感染免疫診斷中所使用的檢測血吸蟲特異性抗體的抗原。
全文摘要
一種日本血吸蟲23kDa膜蛋白大親水肽段融合蛋白及其在血吸蟲感染免疫診斷中的應(yīng)用，屬于寄生蟲病的免疫學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及日本血吸蟲23kDa膜蛋白大親水肽段(Sj23HD)與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白，它含有兩個多肽區(qū)，第1區(qū)為日本血吸蟲23kDa膜蛋白大親水肽段，第2區(qū)為人血清白蛋白，第1區(qū)的C未端與第2區(qū)的N未端直接相連，中間不加任何連接肽，其結(jié)構(gòu)式是Sj23HD-HSA。所述的Sj23HD-HSA融合蛋白保留了Sj23HD的反應(yīng)原性，同時具有更高的穩(wěn)定性。該Sj23HD-HSA融合蛋白作為檢測抗原通過免疫印漬法對血吸蟲感染進行診斷具有更高的敏感性與特異性。
文檔編號C07K19/00GK102167748SQ20111003737
公開日2011年8月31日 申請日期2011年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月14日
發(fā)明者余傳信, 宋麗君, 張偉, 梁幼生, 殷旭仁, 王玠, 錢春艷, 高琪 申請人:無錫賽德科技開發(fā)有限公司, 江蘇省血吸蟲病防治研究所