專利名稱：雙特異性抗-her抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗HER抗體，包括多特異性抗HER抗體，其具有對(duì)于至少兩種不同HER 受體的結(jié)合特異性，以及所述抗體治療疾病或病癥的用途。
背景技術(shù)：
受體酪氨酸激酶的HER家族是細(xì)胞生長、分化和存活的重要介質(zhì)。該受體家族包括四個(gè)獨(dú)特的成員，包括表皮生長因子受體(EGFR、ErbBl或HER1)、HER2 (ErbB2或pl85neu)、 HER3(ErbB3)和 HER4(ErbB4 或 tyro2)。由erbBl基因編碼的EGFR已被認(rèn)為是人類惡性腫瘤的病因。具體而言，在乳腺癌、 膀胱癌、肺癌、頭癌、頸癌和胃癌以及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中已經(jīng)觀察到EGFR表達(dá)的升高。EGFR受體表達(dá)的升高常常與由同樣的腫瘤細(xì)胞的EGFR配體，轉(zhuǎn)化生長因子α (TGF-α)的產(chǎn)量增加有關(guān)，其通過自分泌刺激途徑導(dǎo)致受體活化。Baselga和Mendelsohn Pharmac. Ther.(藥學(xué)理論)64 127-154 (1994)。針對(duì)EGFR或其配體TGF-α和EGF的單克隆抗體已經(jīng)作為治療此類惡性腫瘤的治療劑進(jìn)行了評(píng)估。參見例如Baselga和Mendelsohn，見上文；Masui等， Cancer Research (癌癥研究)44 1002-1007 (1984)；和 Wu 等，J. Clin. Invest.(臨床研究雜志)95 1897-1905 (1995)。HER家族的第二個(gè)成員HER2(pl85neu)最初被鑒定成轉(zhuǎn)化基因的產(chǎn)物，來自經(jīng)化學(xué)處理的大鼠的成神經(jīng)細(xì)胞瘤。neu原癌基因的活化形式產(chǎn)生自所編碼蛋白質(zhì)跨膜區(qū)中的點(diǎn)突變(纈氨酸變成谷氨酸)。在乳腺癌和卵巢癌中觀察到neu的人同系物的擴(kuò)增， 而且這與預(yù)后不良有關(guān)(Slamon 等，Science (科學(xué))，235 177-182 (1987) ；Slamon 等， Science (科學(xué))，244 :707-712 (1989)；和美國專利4，968，603)。在其它癌瘤中也已觀察到HER2的過表達(dá)(頻繁但不均一，原因在于基因擴(kuò)增)，所述癌瘤包括胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰和膀胱的癌瘤。參見King等，Science (科學(xué))，229 974 (1985)； Yokota 等，Lancet (柳葉刀)1 :765_767 (1986) ；Fukushige 等，Mol Cell Biol.(分子細(xì)胞生物學(xué))，6 :955-958(1986) ；Guerin 等，Oncogene Res.(癌基因研究)，3 :21_31 (1988)； Cohen 等，Oncogene (癌基因)，4 :81_88 (1989) ；Yonemura 等，Cancer Res.(癌癥研究)， 51 1034 (1991) ；Borst 等，Gynecol. Oncol. ,38 364(1990) ；Weiner 等，Cancer Res.(癌癥研究)，50 :421-425(1990) ；Kern 等，Cancer Res.(癌癥研究)，50 :5184(1990) ；Park 等，Cancer Res.(癌癥研究)，49 6605 (1989) ；Zhau 等，Mol. Carcinog.(分子致癌作用)，3 254-257 (1990) ；Aasland 等，Br. J. Cancer (英國癌癥雜志)57 :358_363 (1988)； Williams 等，Pathobiology (病理學(xué))59 46-52 (1991)；和 McCann 等，Cancer (癌癥)， 65 =88-92(1990)等。HER2可在前列腺癌中過表達(dá)(Gu等，Cancer Lett.(癌癥通訊)99 185-9(1996) ；Ross 等，Hum. Pathol.(人類病理學(xué))28 :827_33 (1997) ；Ross 等，Cancer (癌癥)79 :2162-70(1997)；和 Sadasivan 等，J. Urol.(泌尿?qū)W雜志)150 126-31 (1993)) 已經(jīng)描述了針對(duì)大鼠pl85neu和人HER2蛋白質(zhì)產(chǎn)物的抗體。Drebin及其同事制備了針對(duì)大鼠neu基因產(chǎn)物，pl85neu的抗體。參見例如Drebin等，Cell (細(xì)胞)41 695-706(1985) ；Myers 等，Meth. Enzym.(酶學(xué)方法)198 :277-290 (1991)；和 W094/22478。 Drebin等，Oncogene (癌基因)2 :273-277 (1988)報(bào)道了與pl85neu的兩個(gè)獨(dú)特區(qū)域有反應(yīng)性的抗體混合物對(duì)植入裸鼠的neu轉(zhuǎn)化NIH-3T3細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤作用。還可參見 1998年10月20日頒發(fā)的美國專利5，824，311。Hudziak 等，Mol. Cell. Biol.(分子細(xì)胞生物學(xué))9 (3) :1165-1172(1989)描述了一組HER2抗體的生成，并利用人乳房腫瘤細(xì)胞系SK-BR-3鑒定。通過72小時(shí)后單層細(xì)胞的結(jié)晶紫染色測定了暴露于抗體后SK-BR-3細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞增殖。利用此測定法，用稱作4D5的抗體獲得了最大抑制，它抑制細(xì)胞增殖達(dá)56%。該組其它抗體在此測定法中將細(xì)胞增殖降低至較低程度。還發(fā)現(xiàn)抗體4D5使過表達(dá)HER2的乳房腫瘤細(xì)胞系對(duì)TNF-α的細(xì)胞毒性作用變得敏感。還可參見1997年10月14日頒發(fā)的美國專利 5,677, 171。Hudziak等人的文章中討論的HER2抗體還在以下文獻(xiàn)中進(jìn)行了表征Jendly 等，Cancer Research (癌癥研究)50 1550-1558 (1990) ；Kotts 等，In Vitro (體外)洸(3) 59A(1990) ；Sarup 等，Growth Regulation(生長調(diào)節(jié))1 :72-82(1991) ；Shepard 等， J.Clin· Immunol.(臨床免疫學(xué))11 (3) :117-127(1991) ；Kumar 等，Mol. Cell. Biol.(分子細(xì)胞生物學(xué))11(2) :979-986(1991) ；Lewis 等，Cancer Immunol. Immunother.(癌癥免疫學(xué)和免疫療法)37 :255-263(1993) ；Pietras 等，Oncogene (癌基因)9 1829-1838 (1994)； Vitetta 等，Cancer Research (癌癥研究)54 :5301-5309 (1994) ；Sliwkowski 等，J.Biol· Chem.(生物化學(xué)雜志)269 00) :14661-14665(1994) ；Scott 等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)266 :14300-5(1991) ；D ‘ souza 等，Proc. Natl. Acad. ki.(美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))91 :7202-7206(1994) ；Lewis 等，Cancer Research (癌癥研究)56 1457-1465 (1996)； 和 khaefer 等，Oncogene (癌基因)I5 :1385-1394(1997)。鼠HER2抗體4D5的重組人源化型式((huMAb4D5_8，rhuMAb HER2，曲妥珠單抗 (trastuzumab)或HERCEPTIN 丨美國專利5，821，337)在臨床上對(duì)患有HER2過表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌并已接受廣泛的早期抗癌療法的患者起作用(Baselga等，J. Clin. Oncol.(臨床腫瘤學(xué)雜志)14 :737-744(1996))。曲妥珠單抗在1998年9月25日得到了食品和藥品管理局的銷售許可，可用于治療所患腫瘤過表達(dá)HER2蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。以下文獻(xiàn)中描述了具有各種特性的其它HER2抗體=Tagliabue等，ht. J. Cancer (國際癌癥雜志)47 :933-937(1991) ；McKenzie 等，Oncogene (癌基因)4 543-548(1989) ；Maier 等，Cancer Res.(癌癥研究)51 :5361-5369(1991) ；Bacus 等，Molecular Carcinogenesis(分子致癌作 M )3 :350-362(1990) ；Stancovski 等，PNAS (USA) 88 :8691-8695(1991) ；Bacus 等，Cancer Research (癌癥研究)52 2580-2589(1992) ；Xu 等，ht. J. Cancer (國際癌癥雜志)53 :401-408(1993) ；W094/00136 ； Kasprzyk 等，Cancer Research (癌癥研究)52 :2771-2776(1992) ；Hancock 等，Cancer Res.(癌癥研究)51 :4575-4580(1991) ； Shawver 等，Cancer Res.(癌癥研究)54 1367-1373(1994) ；Arteaga 等，Cancer Res.(癌癥研究)54 :3758-3765 (1994) ；Harwerth 等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)267 :15160-15167(1992)；美國專利 5，783，186 ；禾口Klapper 等，Oncogene (癌基因)14 2099-2109 (1997)。同源性篩選使得HER受體家族的兩個(gè)其它成員得以鑒定HER3(美國專利 5，968，511，5，183，884 和 5，480，968 以及 Kraus 等，PNAS (USA) 86 :9193_9197 (1989))和 HER4(歐洲專利申請(qǐng)599，274 ；Plowman等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,(美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))，90 1746-1750 (1993)；和 Plowman 等，Nature (自然)，366 :473_475 (1993))。這兩種受體均在至少有些乳腺癌細(xì)胞系中展示出表達(dá)升高。通常發(fā)現(xiàn)HER受體在細(xì)胞中有多種組合，而且認(rèn)為它的異二聚化增加了對(duì)各種 HER配體的細(xì)胞應(yīng)答的多樣性(Earp等，Breast Cancer Research and Treatment (乳腺癌研究和治療)35 115-132 (1995))。EGFR受到6種不同配體的結(jié)合表皮生長因子(EGF)、 轉(zhuǎn)化生長因子α (TGF-α)、雙調(diào)蛋白、肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)、β動(dòng)物纖維素和印iregulin (Groenen 等，Growth Factors (生長因子)11 :235_257 (1994))。由單一基因的可變剪接產(chǎn)生的一個(gè)調(diào)蛋白蛋白質(zhì)家族是HER3和HER4的配體。調(diào)蛋白(heregulin) 家族包括 α、β 和 Y 調(diào)蛋白(Holmes 等，Science (科學(xué))，256 1205-1210 (1992)；美國專利 5，641，869 ；和 Schaefer 等，Oncogene (癌基因)15 1385-1394 (1997)) ；neu 分化因子(NDFs)；神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGFs)乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA)；及感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元衍生因子(SMDF)。有關(guān)綜述參見Groenen等，Growth Factors (生長因子)11 :235-257(1994) ；Lemke，G. Molec. & Cell. Neurosci.(分子和細(xì)胞神經(jīng)科學(xué))7 247-262(1996)和 Lee 等，Pharm. Rev.(藥學(xué)綜述)47 :51_85(1995)。還鑒定了另外三種HER配體神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2 (NRG-2)，據(jù)報(bào)道它結(jié)合HER3或HER4 (Chang等，Nature (自然)387509-512 (1997)；和 Carraway 等，Nature (自然)387 :512_516 (1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3，它結(jié)合 HER4(Zhang 等，PNAS (USA) 94 (18) :9562_7 (1997))；和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白 _4，它結(jié)合 HER4 (Harari 等，Oncogene (癌基因)18 :2681_89 (1999))。HB-EGF, β 動(dòng)物纖維素和印iregulin 也結(jié)合 HER4。盡管EGF和TGF α不結(jié)合HER2，但是EGF刺激EGFR和HER2形成異二聚體，它活化 EGFR并導(dǎo)致異二聚體中HER2的轉(zhuǎn)磷酸作用。二聚化作用和/或轉(zhuǎn)磷酸作用似乎活化HER2 酪氨酸激酶。參見Earp等，見上文。同樣，當(dāng)HER3與HER2共表達(dá)時(shí)，形成有活性的信號(hào)復(fù)合物，而針對(duì)HER2的抗體能破壞此復(fù)合物(Sliwkowski等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)， 269(20) 14661-14665 (1994))。此外，在與HER2共表達(dá)時(shí)，HER3對(duì)調(diào)蛋白(HRG)的親和力提高到了更高的親和力狀態(tài)。關(guān)于HER2-HER3蛋白質(zhì)復(fù)合物還可參見Levi等，Journal of Neuroscience (神經(jīng)科學(xué)雜志)15 1329-1340 (1995) ；Morrissey 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))92 1431-1435 (1995)；和Lewis等，Cancer Res.(癌癥研究)， 56 1457-1465 (1996)。HER4，與HER3類似，與HER2形成有活性的信號(hào)復(fù)合物(Carraway和 Cantley，Cell (細(xì)胞)78 :5_8(1994))。目前靶向HER途徑的治療劑用于治療疾病諸如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸直腸癌、頭和頸癌和胰腺癌。盡管這些治療劑具有一些成功，存在涉及天然和誘導(dǎo)抗性和毒性的問題。Arteaga CL. J Clin Oncol (臨床腫瘤學(xué)雜志)21 289-9Is (2003)； Hoshi S，等，Gan To Kagaku Ryoho 31 1209-13 (2004) ；Viloria-Petit AM，和 Kerbel RS. Int J Radiat Oncol Biol Phys 58:914-26(2004) ；Bianco R,等，Endocr Relat Cancer 12 :S159_71 (2005) ；Engelman JA，禾口 Janne PA. , Clin Cancer Res(臨床癌癥研究)14 J895-9Q008) ；Davoli A,等，Cancer Chemother Pharmacol.(癌癥化療藥學(xué))65(4) :611-23(2010) ；Pohlmann PR，等，Clin Cancer Res (臨床癌癥研究)· 15 Q4) 7479-7491(2009)。具體地，靶向HERl (EGFR)的治療劑常常與不希望的副作用相關(guān)，諸如顯著水平的皮膚毒性。Robert，等，Lancet Oncology (柳葉刀腫瘤學(xué))6 :491-500(2005).因此，存在開發(fā)靶向HER途徑的改善的治療劑的需要。發(fā)明概述本發(fā)明提供多特異性抗體，其包含特異性結(jié)合至少兩個(gè)HER受體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述HER受體選自由(a) EGFR和HER2, (b) EGFR和HER3，禾口 (c) EGFR和HER4組成的組。 所述抗體抑制至少一個(gè)所述HER受體的生物學(xué)活性。在具體的實(shí)施方案中，所述多特異性抗體特異性結(jié)合其靶標(biāo)HER受體并且不特異性結(jié)合非靶標(biāo)HER受體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合EGFR和HER3但是不特異性結(jié)合HER2或HER4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合EGFR和HER2但是不特異性結(jié)合HER3或HER4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合EGFR和HER4但是不特異性結(jié)合HER2或HER3。本發(fā)明也提供特異性結(jié)合靶標(biāo)HER受體的單特異性抗體。本發(fā)明一方面提供能夠特異性結(jié)合EGFR和另一個(gè)HER受體的多特異性抗體，其比傳統(tǒng)EGFR拮抗劑，諸如西妥昔單抗(cetuximab)毒性更低。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述毒性是皮膚病學(xué)毒性。在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性HER抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一方面，本發(fā)明提供多特異性抗體，其包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體比EGFR拮抗劑毒性更低。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體抑制EGFR和HER3中至少一個(gè)的生物學(xué)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體抑制EGF結(jié)合EGFR。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體抑制TGF-α誘導(dǎo)的EGFR磷酸化。在一些實(shí)施方案中，所述抗體抑制腫瘤細(xì)胞生長。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體特異性結(jié)合EGFR和HER3但是不特異性結(jié)合HER2或HER4。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含以低于10_6Μ的Kd特異性結(jié)合EGFR和 HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含以低于KTfiM的Kd特異性結(jié)合EGFR并且以低于IO-7M的Kd特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多特異性抗體包含(a) HVR-Hl，其包含氨基酸序列LSGDffIH (SEQ ID NO 48) ； (b) HVR-H2， 其包含氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO :51);和(c)HVR_H3，其包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY (SEQ ID NO 53)；和(d) HVR-Ll，其包含氨基酸序列 NIATDVA (SEQ ID N0: 55) ； (e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SASF(SEQ ID NO :56)；和(f) HVR-L3，其包含氨基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO 57)。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多特異性抗體包含(a)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其與氨基酸序列SEQ ID NO :30具有至少95%的序列同一性；(b)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其與氨基酸序列SEQ ID NO 29具有至少95%的序列同一性；或 (c)如(a)中的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列和如(b)中的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多特異性抗體包含SEQ ID NO 30的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多特異性抗體包含SEQ ID NO :29的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多特異性抗體包含SEQ ID NO 30的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列和SEQ ID NO :29的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。在一些實(shí)施方案中，包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多特異性抗體是全長IgGl抗體。本發(fā)明的一方面提供編碼所述多特異性HER抗體的分離的核酸。另一方面提供包含編碼所述多特異性HER抗體的核酸的宿主細(xì)胞。還一方面提供產(chǎn)生多特異性HER抗體的方法，包括培養(yǎng)包含編碼所述多特異性HER抗體的核酸的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生所述的抗體。本發(fā)明一方面提供包含多特異性HER抗體和細(xì)胞毒性劑的免疫綴合物。另一方面提供包含多特異性HER抗體和藥用載體的藥物制劑。本發(fā)明一方面提供治療患有癌癥的個(gè)體的方法，包括向所述個(gè)體施用有效量的多特異性HER抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性HER抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3 的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過所述多特異性HER抗體治療的癌癥包含表達(dá) EGFR和HER3的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過所述多特異性HER抗體治療的癌癥是乳腺
(breast cancer) ^^MiMMi^ (colorectal cancer)、月夷—(pancreatic cancer) 禾口頸癌(head and neck cancer)、黑素瘤(melanoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、前列腺癌 (prostate cancer)或非小細(xì)胞月市癌(non-small lung cell cancer)。本發(fā)明另一方面提供抑制個(gè)體中HER受體生物學(xué)活性的方法，包括向所述個(gè)體施用有效量的多特異性HER抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性HER抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明一方面提供用作藥物的多特異性HER抗體。另一方面提供用于治療癌癥， 諸如乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、頭和頸癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌或非小細(xì)胞肺癌的多特異性HER抗體。另一方面提供用于抑制HER受體的生物學(xué)活性的多特異性HER抗體。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性HER抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明另一方面提供用于制備藥物的多特異性HER抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物可用于治療癌癥，諸如乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、頭和頸癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌或非小細(xì)胞肺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物用于抑制HER受體的生物學(xué)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性HER抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性HER抗體比傳統(tǒng)EGFR拮抗劑，諸如西妥昔單抗毒性更低。附圖簡述

圖1顯示在A431異種移植模型中通過抗EGFR抗體Dl. 5抑制腫瘤生長。圖2顯示具有雙重特異性的克隆的結(jié)合特異性。圖3顯示使用選擇的具有雙重特異性(抗EGFR/HER3和抗EGFR/HER2抗體)的抗體抑制TGF- α -誘導(dǎo)的EGFR磷酸化。圖4顯示抗-EGFR/HER3抗體阻斷調(diào)蛋白結(jié)合HER3-ECD_Fc。圖5顯示在MCF7細(xì)胞中通過抗EGFR/HER3雙特異性抗體抑制HRG誘導(dǎo)的受體磷酸化。圖6顯示通過抗EGFR/HER3抗體抑制MDA-175細(xì)胞的細(xì)胞增殖。
圖7是顯示在4D5-Fv結(jié)構(gòu)上定位的Dl. 5-100熱點(diǎn)的圖。圖8概述了使用鳥槍文庫對(duì)于Dl. 5-100EGFR-HER3抗體親和力成熟的策略。圖9顯示兩個(gè)選擇的親和力成熟的抗體(DL7和DL11)對(duì)于EGFR和HER3兩者是特異性的。圖10 =A)顯示親和力成熟的抗體DL7和DLll與母體抗體Dl. 5對(duì)于EGFR的抑制功能的比較。B)顯示親和力成熟的抗體DL7和DLll與單特異性抗HER3抗體DL3. 6對(duì)于 HER3反式激活的抑制功能的比較。圖11A)提供圖顯示DLll與培妥珠單抗(pertuzumab)，抗EGFR抗體，和抗HER3抗體，或DL3. 6，Dl. 5，或Dl. 5+DL3. 6的組合相比對(duì)于H1666細(xì)胞生長抑制功能的比較，所述細(xì)胞是NSCLC細(xì)胞系，表達(dá)HER2，HER3，EGFR和EGFR配體，生長用HRG刺激。B)提供圖顯示DLll與培妥珠單抗，抗EGFR抗體和抗HER3抗體，或DL3. 6，Dl. 5或Dl. 5+DL3. 6的組合相比對(duì)于H1666HSCLC系生長抑制功能的比較，生長用HRG和TGF α刺激。圖12Α)提供圖顯示通過DLll與pMab，抗EGFR抗體，和抗HER3抗體相比較抑制 HCA-7細(xì)胞的增殖，該細(xì)胞是結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系，表達(dá)HER2，HER3和EGFR。細(xì)胞生長用HRG 刺激。B)提供圖顯示如圖12A中的HCA-7細(xì)胞生長的抑制，除了細(xì)胞生長用HRG+TGF α刺激。圖13顯示Calu-3細(xì)胞增殖的抑制，所述細(xì)胞是NSCLC系，過表達(dá)HER2并且具有正常水平的HER3和EGFR。細(xì)胞生長用HRG刺激，抗體以劑量依賴方式測試。圖14概述了對(duì)于Dl. 5-201親和力成熟的分選策略。圖15顯示通過DLll，DLlIb和DLlIf抑制MDA-175細(xì)胞增殖。圖16顯示DLllf抑制調(diào)蛋白誘導(dǎo)的HER3磷酸化和TGF- α誘導(dǎo)的EGFR磷酸化。圖17是顯示在HCA-7腫瘤移植模型中通過DLll和DLllf抑制腫瘤生長的圖。圖18是顯示在H358NSCLC異種移植模型中通過DLllf抑制腫瘤生長的圖。圖19顯示通過DL3-llb，DL3. 6b和DL3. 6抑制HRG誘導(dǎo)的HER3磷酸化。圖 20 通過 DL3-llb, DL3. 6b 和 DL3. 6 抑制 MDA-175 細(xì)胞增殖。圖21是顯示在FaDu癌癥模型中通過DLl If抑制腫瘤生長的圖。圖22是顯示在BxPC3胰腺癌模型中通過DLllf抑制腫瘤生長的圖。圖23是顯示在Calu-3非小細(xì)胞肺癌模型中通過DLllf抑制腫瘤生長的圖。圖24是顯示在A431上皮癌模型中通過DLllf抑制腫瘤生長的圖。圖25是顯示在MAXF44乳腺癌模型中通過DLllf抑制腫瘤生長的圖。圖26是顯示在DU145前列腺癌模型中通過DLllf抑制腫瘤生長的圖。圖27是顯示在0VXF550卵巢癌模型中通過DLllf抑制腫瘤生長的圖。圖28顯示在數(shù)個(gè)細(xì)胞系中DLllf誘導(dǎo)ADCC。圖 29 顯示 DLllf-N297A 缺少 ADCC 活性。圖30顯示在H292NSCLC癌癥模型中通過DLllf和DLllf_N297A抑制腫瘤生長。圖31A-C是提供關(guān)于EGFR拮抗劑療法觀察到的非臨床和臨床毒性信息的表。圖32是提供關(guān)于疹/脫屑和痤瘡/痤瘡樣疹分級(jí)信息的表。圖33提供具有Kabat編號(hào)的數(shù)個(gè)抗HER抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸比對(duì)。圖33A顯示下述抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域Dl (SEQ ID NO 58) ；Dl. 5 (SEQID NO 24) ；Dl. 5-100(SEQ ID NO 40) ；DLll(SEQ ID NO 27) ；DLllb(SEQ ID NO 29)； DLllf (SEQ ID NO :29)。圖3!3B顯示下述抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域Dl (SEQ ID NO 25)； Dl. 5 (SEQ ID NO 25) ；Dl. 5-100 (SEQ ID NO 25) ；DLll (SEQ ID NO 28) ；DLl lb (SEQ ID NO: 28) ；DLlIf(SEQ ID NO :30)。發(fā)明詳述I.定義除非另有定義，本文使用的所有專門術(shù)語、符號(hào)和其它科學(xué)術(shù)語意圖具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的含義。在一些情況下，為了清楚和/或易于引用，本文定義了具有普遍理解含義的術(shù)語，并且本文包含此類定義沒有必要解釋為其代表了與本領(lǐng)域通常理解的實(shí)質(zhì)上的差異。本文中描述或提到的技術(shù)和程序一般得到了本領(lǐng)域技術(shù)人員的充分理解，而且利用常規(guī)方法得以普遍采用，諸如例如下列文獻(xiàn)中記載的廣泛應(yīng)用的分子克隆的方法=Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南)第二版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.。 如果合適，涉及使用市售的試劑盒和試劑的程序一般根據(jù)制造商規(guī)定的方案和/或參數(shù)進(jìn)行，除非另有說明。在描述本發(fā)明的方法、試劑盒及其用途之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述具體方法、方案、細(xì)胞系、動(dòng)物種或?qū)佟?gòu)建物和試劑，因?yàn)樗鼈儺?dāng)然可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施方案，并非意圖限制本發(fā)明的范圍，只有所附權(quán)利要求才對(duì)本發(fā)明范圍進(jìn)行了限制。必須注意的是，在用于本文及所附權(quán)利要求時(shí)，除非上下文另有明確規(guī)定，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述"包括復(fù)數(shù)所指物。在本說明書和權(quán)利要求書全文中，詞語“包括”或變體諸如“包含”或“含有”，應(yīng)當(dāng)理解為意指包括所述的整數(shù)(整體)或整數(shù)(整體)的組，但是不排除任何其它整數(shù)(整體)或整數(shù)(整體)的組。本文中術(shù)語“抗體”以其最廣義使用，特別是涵蓋單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出所希望的生物學(xué)活性。術(shù)語“多特異性抗體”以最廣義使用，具體涵蓋包含這樣的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有多表位特異性(即，能夠特異性結(jié)合一種生物分子上的兩個(gè)或多個(gè)不同表位或能夠特異性結(jié)合在兩種或多種不同生物分子上的表位)?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)具體實(shí)例是％\單元，其由重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。此類多特異性抗體包括但不限于全長抗體、具有兩個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的抗體、抗體片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、雙抗體(diabodies)、 雙特異性雙抗體和三鏈抗體(triabodies)、已被共價(jià)或非共價(jià)連接的抗體片段?！半p特異性抗體”是包含這樣的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多特異性抗體，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠特異性結(jié)合一個(gè)生物分子上的兩個(gè)不同表位，或能夠特異性結(jié)合兩個(gè)不同生物分子上的表位。雙特異性抗體在本文中也稱為具有“雙特異性”或是“雙特異性的”。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體對(duì)于其靶標(biāo)HER或HERs具有的解離常數(shù) (Kd)彡 1 μ M，彡 IOOnM, ( IOnM, ( InM, ( 0. InM, ( 0. OlnM,或彡 0. OOlnM(例如 KT8M 以下，例如 KT8M 至 1(Γ"Μ，例如，KT9M 至 IO^13M)?；镜?鏈抗體單元是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成的異四聚體糖蛋白(IgM抗體由5個(gè)基本的異四聚體單元及稱作J鏈的另外多肽組成，因此包含10 個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)；而分泌型IgA抗體可聚合形成包含2-5個(gè)基本的4鏈單元及J鏈的多價(jià)裝配物)。在IgG的情況中，4鏈單元通常約150，000道爾頓。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而取決于重鏈的同種型，通過一個(gè)或多個(gè)二硫鍵彼此連接兩條重鏈。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈在N-末端具有一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，接著是三個(gè)(對(duì)于每種α和Y鏈)和四個(gè)(對(duì)于μ和ε同種型)恒定結(jié)構(gòu)域(Ch)。每條輕鏈在N-末端具有一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(VJ，接著是其另一端的一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CJ。八與Vh 排列在一起，而Q與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(ChI)排列在一起。特定的氨基酸殘基被認(rèn)為在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間形成界面。成對(duì)的V1^nt —起形成一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。關(guān)于不同類別抗體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，參見如Basic and Clinical Immunology (基本和臨床酶學(xué)),第八版,Daniel P. Stites, Abba I. Terr 禾口 Tristram G. Parslow(編輯)，Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994，第 71 頁和第 6 章。來自任何脊椎動(dòng)物物種的輕鏈，根據(jù)其恒定結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，可歸入兩種稱作 κ和λ的截然不同型中的一種。根據(jù)其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(Ch)氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類或同種型。有五類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分別具有稱作α、 δ、Y、ε和μ的重鏈。根據(jù)Ch序列和功能的相對(duì)較小差異，Y和α類可進(jìn)一步分為亞類，例如人表達(dá)下列亞類=IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。術(shù)語“可變的”指可變結(jié)構(gòu)域中的某些區(qū)段在抗體序列中差異廣泛的情況。V結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)抗原結(jié)合并限定特定抗體對(duì)其特定抗原的特異性。然而，變異性并非均勻分布于可變結(jié)構(gòu)域跨越的110個(gè)氨基酸。而V區(qū)由15-30個(gè)氨基酸，稱作構(gòu)架區(qū)(FR)的相對(duì)不變異的區(qū)段及將構(gòu)架區(qū)分開的稱作“高變區(qū)”或HVR的極度變異的較短區(qū)域組成。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包含四個(gè)FRs，它們大多采取β -折疊構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成折疊結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過FR 非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列)，第五版.Public Health Service (公共衛(wèi)生署)，National Institutes of Health(國立衛(wèi)生研究所)，Bethesda, MD. (1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)子功能，如在抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)中抗體的參與。術(shù)語“高變區(qū)”、“HVR”或“HV”在用于本文時(shí)指抗體可變結(jié)構(gòu)域中序列上高度可變和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個(gè)HVR:三個(gè)在VH中(HVR-H1、 HVR-H2、HVR-H3)，三個(gè)在 VL 中(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)。在天然抗體中，H3 和 L3 展示這六個(gè)HVR的最大多樣性，而且認(rèn)為特別是H3在賦予抗體以精細(xì)特異性中發(fā)揮獨(dú)特作用。參見例如Xu等，免疫性(Immunity) 13 :37_45 (2000) Johnson和Wu于分子生物學(xué)中的方法 (Methods in Molecular Biology) 248 1~25 (Lo JM^, Human 出片反 土， Totowa, NJ，2003)。 事實(shí)上，僅由重鏈組成的天然存在駱駝科動(dòng)物(camelid)抗體在缺乏輕鏈時(shí)是有功能的且穩(wěn)定的。參見例如 Hamers-Casterman 等，自然(Nature) 363 :446_448 (1993) ；Sheriff 等， 自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)(Nature Struct. Biol.) 3 :733_736 (1996)。HVRs 一般包含來自高變環(huán)和/或“互補(bǔ)決定區(qū)”(⑶Rs)的氨基酸殘基，后者具有最高的序列變異性和/或參與抗原識(shí)別。本文中使用且涵蓋許多HVR的敘述。Kabat互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)是以序列變異性為基礎(chǔ)的，而且是最常用的(Kabat等，免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版·公共衛(wèi)生署(Public Health Service)，國立衛(wèi)生研究所(National Institutes of Health), Bethesda，MD. (1991))。Chothia改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia和Lesk分子生物學(xué)雜志 (J. Mol. Biol. ) 196 :901-917 (1987))。AbM HVR 代表 Kabat HVR 與 Chothia 結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，而且由Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件使用?！癱ontact” HVR是以對(duì)可獲得的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)的。下文記錄了這些HVR中每一個(gè)的殘基。
環(huán) KafcatAbMChothiaContactHVR 可包括如下“延伸的 HVR" :VL 中的 24-36 或 24-34 (Li)、46-56 或 50-56 (L2) 和 89-97 或 89-96 (L3)及 VH 中的 26-35 (Hl) ,50-65 或 47-65 (H2)和 93-102,94-102 或 95-102 (H3)。對(duì)于這些定義中的每一個(gè)，可變結(jié)構(gòu)域殘基是依照Kabat等，見上文編號(hào)的?！皹?gòu)架”或“FR”殘基指除本文中所定義的HVR殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。術(shù)語“依照Kabat的可變結(jié)構(gòu)域殘基編號(hào)方式”或“依照Kabat的氨基酸位置編號(hào)方式”及其變化形式指Kabat等，見上文中的用于抗體編制的重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域編輯的編號(hào)系統(tǒng)。使用此編號(hào)系統(tǒng)，實(shí)際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對(duì)應(yīng)于可變結(jié)構(gòu)域FR或HVR的縮短或插入。例如，重鏈可變結(jié)構(gòu)域可包含H2的殘基 52后的單一氨基酸插入(依照Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat為殘基82a、82b和82c等)。給定抗體的殘基Kabat編號(hào)方式可通過將抗體序列與“標(biāo)準(zhǔn)”Kabat編號(hào)序列對(duì)比同源區(qū)來確定。Kabat編號(hào)系統(tǒng)一般在提及可變結(jié)構(gòu)域中的殘基(大約是輕鏈的殘基1-107 和重鏈的殘基1-11 時(shí)使用(例如Kabat等，免疫學(xué)感興趣的序列(kquences of Immunological Interest).第 5 版.公共衛(wèi)生署(Public Health Service)，國立衛(wèi)生研究所(National Institutes of Health) ,Bethesda,Md. (1991))?！癊U 編號(hào)系統(tǒng)”或"EU 索引”一般在提及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時(shí)使用(例如在Kabat等中報(bào)道的EU索引， 見上文)?！叭缭贙abat中所述的EU索引”指人IgGlEU抗體的殘基編號(hào)。除非本文中另有說明，提及抗體可變結(jié)構(gòu)域中的殘基編號(hào)指根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)的殘基編號(hào)方式。除非本文中另有說明，提及抗體恒定結(jié)構(gòu)域中的殘基編號(hào)指根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)的殘基編號(hào)方式(例如參見 WO 2006/073941)?！坝H和力”是指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間全部非共價(jià)相互作用總和的強(qiáng)度。除非另有說明，在用于本文時(shí)，“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對(duì)的成員(例如抗體與抗原)之間1 1相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子X對(duì)其配偶體Y的親和力通?？捎媒怆x常數(shù)(Kd)來表述。親和力可通過本領(lǐng)域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的。“親和力成熟的”抗體指這樣的抗體，在該抗體的一個(gè)或多個(gè)HVRs或構(gòu)架區(qū)中具有一處或多處改變、導(dǎo)致該抗體對(duì)抗原的親和力與沒有這些改變的母體抗體相比有所提高。在一個(gè)實(shí)施方案中，親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級(jí)的對(duì)靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可使用本領(lǐng)域已知的某些方法來生成。例如，Marks等，生物 /技術(shù)(Bio/Technology) 10 =779-783 (1992)記載了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組進(jìn)行的親和力成熟。以下文獻(xiàn)記載了 HVR和/或構(gòu)架殘基的隨機(jī)誘變例如=Barbas等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Nat. Acad. Sci. USA) 91 3809-3813 (1994) ；Schier 等，基因(Gene) 169 147-155(1995) ；Yelton 等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 155 1994-2004 (1995) Jackson 等， 免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 154 (7) =3310-9(1995)；及 Hawkins 等，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 226 889-896(1992)?？贵w的“種類”是指其重鏈具有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。存在五種主要種類的抗體IgA，IgD, IgE, IgGjP IgM，并且這些中的一些可以進(jìn)一步分為亞類(同種型)， 例如IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1,和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同種類的免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別被稱為α，δ，ε，Y禾口 μ。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體中獲得的抗體，即除了可能的變體(該變體可在產(chǎn)生單克隆抗體的過程中出現(xiàn)，此類變體通常少量存在)之外， 構(gòu)成群體的各個(gè)抗體基本上相似并結(jié)合相同的表位。此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶標(biāo)的可變區(qū)的抗體，其中該抗體是通過包括從眾多抗體中選擇該抗體在內(nèi)的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨(dú)特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，所選擇的抗體可進(jìn)一步改變，例如為了提高對(duì)靶標(biāo)的親和力、 將抗體人源化、提高其在細(xì)胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的可變區(qū)序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。除它們的特異性外， 單克隆抗體制備物的優(yōu)勢在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆” 表明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，將根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)來生成，包括雜交瘤法(例如， Kohler 等，Nature (自然)，256 :495 (1975) ；Harlow 等，抗體A Laboratory Manual (抗體實(shí)驗(yàn)室指南)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版· 1988) ；Hammer ling 等，在Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (單克隆抗體和 T 細(xì)胞雜交瘤)563-681，(Elsevier, N. Y.，1981)中、重組 DNA 法(參見例如，美國專利 4，816，567)、 噬菌體展示技術(shù)(參見例如，Clackson 等，Nature (自然)，352 :624_628 (1991) ；Marks 等，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，222 :581_597 (1991) ；Sidhu 等，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)338 ) =299-310(2004) ；Lee 等，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)340 (5) 1073-1093(2004) ；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci.USA(美國科學(xué)院學(xué)報(bào))101(34) 12467-12472(2004)；和 Lee 等 J. Immunol. Methods (免疫學(xué)方法雜志)沘4(1_2) 119-132(2004)、及用于從具有部分或整個(gè)人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動(dòng)物生成人或人樣抗體的技術(shù)(參見例如，W098/M893，W0/9634096, W0/9633735 和 W0/9110741，Jakobovits 等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA(美國科學(xué)院學(xué)報(bào))，90 2551 (1993) Jakobovits 等，Nature (自然)，362 :255-258(1993) ；Bruggemann 等，Year in Immuno.(免疫學(xué)年鑒)，7 :33 (1993)；美國專利 5，545，806、5，569，825、5，591，669 (均為 GenPharm 的)；5，545，807 ；WO 97/17852、美國專利 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ； 5，625，126 ；5，633，425 ；和 5，661，016，和 Marks 等，Bio/Technology (生物 / 技術(shù))，10 779-783(1992) ；Lonberg 等，Nature (自然)，368 :856-859(1994) ；Morrison, Nature (自然)，368 :812-813(1994) ；Fishwild 等，Nature Biotechnology (自然生物技術(shù))，14: 845-851(1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology (自然生物技術(shù))，14 :擬6 (1996)；和 Lonberg 和 Huszar，Intern. Rev. Immunol.(國際免疫學(xué)綜述)，13 :65-93 (1995)?！巴暾笨贵w是包含抗原結(jié)合位點(diǎn)和Q以及至少重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3的抗體。該恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，該完整抗體具有一種或多種效應(yīng)子功能?！翱贵w片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2、Fab，-SH ；雙抗體；線性抗體(參見美國專利 5，641，870，實(shí)施例2;2& 3丨3等，Protein Eng.(蛋白質(zhì)工程)8(10) :1057-1062(1995))； 單鏈抗體分子(例如scFv)。在本說明書中以及在說明書全文中，提及抗體和抗體的多種性質(zhì)，同樣的內(nèi)容也適用于功能性抗體片段，例如雙重作用Fab片段?！熬€性抗體”的表述通常是指Zapata等，Protein Eng.(蛋白質(zhì)工程)，8(10) 1057-1062(1995)描述的抗體。這些抗體包含一對(duì)串聯(lián)的Fd片段(Vh-ChI-Vh-ChI)，其與互補(bǔ)的輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述片段是“功能性的”，即在性質(zhì)上保留相應(yīng)完整抗體結(jié)合靶標(biāo)HER受體的能力，并且如果完整抗體還抑制HER的活化或功能，在性質(zhì)上也保留此類抑制特性。在性質(zhì)上保留意指以同樣的方法活性被保留，但是結(jié)合親和力和/或活性的程度可能不同。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生稱作“Fab”片段的兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，和一個(gè)殘余“Fe”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。Fab片段由完整輕鏈及重鏈可變結(jié)構(gòu)域 (Vh)和一條重鏈第一恒定結(jié)構(gòu)域(ChI)組成。胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生一個(gè)較大？(油’)2片段，它粗略相當(dāng)于兩個(gè)通過二硫鍵相連的Fab片段，具有二價(jià)抗原結(jié)合活性且仍能夠交聯(lián)抗原。Fab’片段因在ChI結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基(包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸)而與Fab片段有所不同。Fab’_SH是本文中對(duì)其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基攜帶一個(gè)游離硫醇基的Fab’的稱謂。F(ab’)2抗體片段最初是作為成對(duì)Fab’片段生成的，在Fab’片段之間具有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。Fc片段包含通過二硫鍵保持在一起的兩條重鏈的羧基末端部分?？贵w的效應(yīng)子功能是由Fc區(qū)中的序列決定的，該區(qū)還是由在某些類型細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的Fc受體(FcR)所識(shí)別的部分。
“Fv”由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。從這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊中突出了六個(gè)高變環(huán)(重鏈和輕鏈各3個(gè)環(huán))，貢獻(xiàn)出抗原結(jié)合的氨基酸殘基并賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或只包含對(duì)抗原特異的三個(gè)HVRs的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力通常低于完整結(jié)合位點(diǎn)?！皢捂淔v”也可縮寫為“sFv”或“scFv”，是包含連接成一條多肽鏈的抗體Vh和八結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選的是，sFv多肽在Vh和八結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得 sFv形成期望的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜沭參見Pluckthun于.The Pharmacology of Monoclonal Antibodies (單克隆抗體藥理學(xué))，vol. 113, Rosenburg 和 Moore 編輯， Springer-Verlag, New York,pp.269-315(1994) ；Borrebaeck 1995。術(shù)語“雙抗體(diabodies)”是指如下制備的小抗體片段，通過使用短接頭(大約5-10個(gè)殘基)在Vh和\結(jié)構(gòu)域之間構(gòu)建sFv片段(見前段)從而獲得該V結(jié)構(gòu)域的鏈間而非鏈內(nèi)配對(duì)而產(chǎn)生二價(jià)片段，即具有兩種抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段。雙抗體在例如EP 404,097 ；WO 93/11161 ；和 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國科學(xué)院學(xué)報(bào))， 90:6444-6448(1993)中有更充分的描述。與參照抗體“結(jié)合相同表位的抗體”是指這樣的抗體，其在競爭測定中阻斷50%以上的所述參照抗體與其抗原的結(jié)合，反之，參照抗體在競爭測定中阻斷50%以上的該抗體與其抗原的結(jié)合。術(shù)語“嵌合”抗體是指這樣的抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈來源于特定來源或物種，而剩余的重鏈和/或輕鏈來源于不同來源或物種?！叭丝贵w”指具有這樣的氨基酸序列的抗體，所述氨基酸序列對(duì)應(yīng)于這樣抗體的氨基酸序列，所述抗體由人或人細(xì)胞生成或來源于非人來源，其利用人抗體庫或其它人抗體編碼序列。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體?！叭斯灿袠?gòu)架”是指這樣的構(gòu)架，即在選擇人免疫球蛋白VL或VH構(gòu)架序列中，其代表最常出現(xiàn)的氨基酸殘基。一般而言，對(duì)人免疫球蛋白VL或VH序列的選擇是從可變結(jié)構(gòu)域序列的亞型中選擇。一般而言，該序列的亞型是如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列)，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD (1991)，1_3卷中的亞型。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于VL，該亞型是如 Kabat等(見上文)中的亞型κ I。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于VH，該亞型是如Kabat等(見上文)中的亞型III。非人(例如嚙齒動(dòng)物)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗體的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的受體的高變區(qū)殘基用具有期望抗體特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動(dòng)物的高變區(qū)殘基替換的人免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上全部的至少一個(gè)、通常兩個(gè)如下可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FRs是人免疫球蛋白序列的FRs。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見 Jones 等，Nature (自然)321 :522-525 (1986) ；Riechmann 等， Nature (自然)332 :323-3 (1988)；和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol.(結(jié)構(gòu)生物學(xué)新觀點(diǎn))2 :593-596(1992)。 “結(jié)合”目的抗原的本發(fā)明的抗體是這樣的抗體，其與抗原以足夠的親和力結(jié)合， 從而該抗體可用作靶向蛋白質(zhì)或表達(dá)該抗原的細(xì)胞或組織的診斷和/或治療劑。關(guān)于抗體與靶標(biāo)分子的結(jié)合，術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異性結(jié)合至”或“特異于”特定多肽或特定多肽靶標(biāo)上的表位指可測量出不同于非特異性相互作用的結(jié)合。特異性結(jié)合可通過例如測定分子的結(jié)合并與對(duì)照分子的結(jié)合比較來確定。例如，特異性結(jié)合可通過與對(duì)照分子的競爭來測定，所述對(duì)照分子與靶標(biāo)相似，例如與過量的未標(biāo)記靶標(biāo)競爭。在這種情況中，若經(jīng)標(biāo)記靶標(biāo)與探針的結(jié)合受到過量未標(biāo)記靶標(biāo)的競爭性抑制，則指示特異性結(jié)合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，“特異性”結(jié)合是指抗體與其特定的靶標(biāo)HER受體的結(jié)合，并且不與其它特定的非-靶標(biāo)HER受體結(jié)合。例如，抗體特異性結(jié)合EGFR和HER3但是不特異性結(jié)合HER2或 HER4，或抗體特異性結(jié)合EGFR和HER2但是不特異性結(jié)合HER3或HER4，或抗體特異性結(jié)合 EGFR和HER4但是不特異性結(jié)合HER2或HER3。 "HER受體”是屬于HER受體家族的受體蛋白酪氨酸激酶，包括EGFR (ErbBl，HER1)， HER2 (ErbB2)，HER3 (ErbB3)和HER4 (ErbB4)受體。HER受體通常將包含胞外結(jié)構(gòu)域，它可結(jié)合HER配體和/或與另一個(gè)HER受體分子二聚化；親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域；保守的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和含有幾個(gè)可被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基末端信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。HER受體可以是“天然序列” HER受體或其“氨基酸序列變體”。優(yōu)選的，HER受體是天然序列人HER受體?！癏ER途徑”是指由HER受體家族介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。術(shù)語“ErbBl”、“HERl”、“表皮生長因子受體”和“EGFR”在本文中可互換使用，指例如 Carpenter 等，Ann. Rev. Biochem. 56 :881-914(1987)公開的 EGFR，包括其天然存在的突變體形式(如 Ullrich 等，Nature (自然)(1984)309 :418425 和 Humphrey 等，PNAS (USA) 87 4207-4211(1990)中的缺失突變體EGFR)及其變體，諸如EGFRvIII。EGFR的變體也包括缺失的、置換的和插入的變體，例如在Lynch等，(New England Journal of Medicine(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志)2004，350 2129)，Paez 等，(Science (科學(xué))2004，304 1497)，和 Pao 等， (PNAS 2004，101 :13306)中描述的那些。在本文中，“EGFR胞外結(jié)構(gòu)域”或“EGFR E⑶”是指EGFR在細(xì)胞外的結(jié)構(gòu)域，錨定到細(xì)胞膜或在循環(huán)中，包括其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域可包括四個(gè)結(jié)構(gòu)域“結(jié)構(gòu)域I”(氨基酸殘基從約1-158)，“結(jié)構(gòu)域II”(氨基酸殘基159-336)，“結(jié)構(gòu)域 III”(氨基酸殘基337-470)，和“結(jié)構(gòu)域IV”(氨基酸殘基471-645)，其中邊界是近似的， 可有大約1-3個(gè)氨基酸的變化。表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互換使用，指例如kmba等，PNAS(USA)82 6497-6501(1985)和 Yamamoto 等，Nature (自然)319 :230_2；34 (1986)中描述的人 HER2 蛋白(GenBank編號(hào)X03363)。術(shù)語“erbB2”指編碼人HER2的基因，“neu”指編碼大鼠pl85neu 的基因。優(yōu)選的HER2是天然序列人HER2。在本文中，“HER2胞外結(jié)構(gòu)域”或“HER2E⑶”是指HER2在細(xì)胞外的結(jié)構(gòu)域，錨定到細(xì)胞膜或在循環(huán)中，包括其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，HER2的胞外結(jié)構(gòu)域可包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域“結(jié)構(gòu)域I”(氨基酸殘基從約1-195，“結(jié)構(gòu)域II”(氨基酸殘基從約196-319)， “結(jié)構(gòu)域III” (氨基酸殘基從約320-488)，和“結(jié)構(gòu)域IV” (氨基酸殘基從約489-630) (殘基編號(hào)不含信號(hào)肽)。參見Garrett等，Mol. Cell.(分子細(xì)胞).11 :495_505 (2003)， Cho 等，Nature (自然)421 :756_760 (2003)，F(xiàn)ranklin 等，Cancer Cell(癌細(xì)胞)5 317-328(2004)，和 Plowman 等，Proc. Natl. Acad. Sci.(美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))90 1746-1750(1993)。“ErbB3” 和 “HER3” 指例如美國專利 5，183，884 和 5，480，968 以及 Kraus 等， PNAS (USA) 86 :9193_9197 (1989)中公開的受體多肽。在本文中，“HER3胞外結(jié)構(gòu)域”或“HER3E⑶”是指HER3在細(xì)胞外的結(jié)構(gòu)域，錨定到細(xì)胞膜或在循環(huán)中，包括其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，HER3的胞外結(jié)構(gòu)域可包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域I，結(jié)構(gòu)域II，結(jié)構(gòu)域III，和結(jié)構(gòu)域IV。在一個(gè)實(shí)施方案中，HER3ECD包含氨基酸 1-636 (編號(hào)包括信號(hào)肽)。在一個(gè)實(shí)施方案中，HER3結(jié)構(gòu)域III包含氨基酸328-532 (編號(hào)包括信號(hào)肽)。術(shù)語“ErbB4〃和“HER4”在本文中是指例如在歐洲專利申請(qǐng)599，274 ；Plowman等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)),90 1746-1750 (1993)；和 Plowman 等， Nature (自然)，366 :473_475 (1993)中公開的受體多肽，包括其同種型，例如在1999年4月 22日公布的W099/19488中所公開的。“HER配體”指結(jié)合和/或活化HER受體的多肽。本文中特別感興趣的HER配體是天然序列人HER配體，諸如表皮生長因子(EGF) (Savage等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)247 :7612_7621 (1972))；轉(zhuǎn)化生長因子 α (TGF-α ) (Marquardt 等，Science(科學(xué))223 1079-1082 (1984))；雙調(diào)蛋白，又稱為神經(jīng)鞘瘤(schwanoma)或角質(zhì)形成細(xì)胞自分泌生長因子(Shoyab 等，Science (科學(xué))243 1074-1076 (1989) ；Kimura 等， Nature (自然)348 257-260 (1990)；和 Cook 等，Mol. Cell. Biol.(分子細(xì)胞生物學(xué))11 2547-2557(1991)) ； β 動(dòng)物纖維素(Shing 等，Science (科學(xué))259 1604-1607 (1993)； 和 Sasada 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 190 1173(1993))；肝素結(jié)合表皮生長因子 (HB-EGF) (Higashiyama 等，Science (科學(xué))251 :936_939 (1991))；印iregulin (Toyoda 等， J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)270 :7495_7500 (1995)；和 Komurasaki 等，Oncogene (癌基因)15 :2841-2848(1997))；調(diào)蛋白(見下文)；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2 (NRG-2) (Carraway等， Nature (自然)387 512-516 (1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白 _3 (NRG-3) (Zhang 等，Proc. Natl. Acad. Sci.(美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))94 =9562-9567 (1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白_4 (NRG-4) (Harari 等，Oncogene (癌基因)I8 2681-89 (1999))；和 cripto (CR-I) (Kannan 等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)272 (6) :3330_3335 (1997))。結(jié)合EGFR 的 HER配體包括EGF，TGF-α， 雙調(diào)蛋白，β動(dòng)物纖維素，HB-EGF和印iregulin。結(jié)合HER3的HER配體包括調(diào)蛋白和 NRG-2。能夠結(jié)合 HER4 的 HER 配體包括 β 動(dòng)物纖維素，epiregulin, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4，和調(diào)蛋白?！罢{(diào)蛋白”(HRG)在用于本文時(shí)指由調(diào)蛋白基因產(chǎn)物編碼的多肽，如美國專利 5，641，869，或 Marchionni 等，Nature (自然)，362 :312_318 (1993)所公開的。調(diào)蛋白的例子包括調(diào)蛋白-α、調(diào)蛋白-β 1、調(diào)蛋白-0 2和調(diào)蛋白-0 30101111^等，Science(科學(xué))，256 1205-1210(1992)；及美國專利 5，641，869) ；neu 分化因子(NDF) (Peles 等，Cell (細(xì)胞)69 =205-216(1992))；乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA) (Falls等，Cell (細(xì)胞)72 801-815 (1993))；神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGFs) (Marchionni 等，Nature (自然)， 362:312-318(1993))；感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元衍生因子(SMDF) (Ho等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)270 14523-14532(1995)) ； γ-調(diào)蛋白(Schaefer 等，0ncogene(癌基因)15 1385-1394(1997))?！癏ER 二聚體”在本文中指包含至少兩個(gè)HER受體的非共價(jià)結(jié)合二聚體。當(dāng)表達(dá)兩種或多種HER受體的細(xì)胞暴露于HER配體時(shí)可形成此類復(fù)合物，可通過免疫沉淀進(jìn)行分離并通過SDS-PAGE進(jìn)行分析，如例如Sliwkowski等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)， 269(20) 14661-14665 (1994)所述。其它蛋白質(zhì)，諸如細(xì)胞因子受體亞基(如gpl30)可與
所述二聚體結(jié)合?！癏ER異二聚體”在本文中是指包含至少兩個(gè)不同HER受體的非共價(jià)結(jié)合異二聚體，諸如 EGFR-HER2，EGFR-HER3, EGFR-HER4, HER2-HER3 或 HER2-HER4 異二聚體?！癏ER抑制劑”是干擾HER活化或功能的試劑。HER抑制劑的實(shí)例包括HER抗體(例如EGFR，HER2，HER3，或HER4抗體)；EGFR-靶向藥物；小分子HER拮抗劑；HER酪氨酸激酶抑制劑；HER2和EGFR雙重酪氨酸激酶抑制劑諸如拉帕替尼(Iapatinib)/GW572016 ；反義分子(參見例如W02004/87207)；和/或結(jié)合下游信號(hào)傳導(dǎo)分子諸如MAPK或AKt或干擾它們的功能的試劑。優(yōu)選地，HER抑制劑是結(jié)合HER受體的抗體。"HER 二聚化抑制劑”或“HDI”是抑制HER同二聚體或HER異二聚體形成的試劑。 優(yōu)選地，HER二聚化抑制劑是抗體。然而，HER二聚化抑制劑也包括肽和非肽小分子，和抑制 HER同二聚體或異二聚體形成的其它化學(xué)實(shí)體。“抑制HER 二聚化”的抗體是這樣的抗體，其抑制或干擾HER 二聚體的形成，而不論其根本機(jī)制。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類抗體在HER2的異二聚化結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合HER2。二聚化抑制抗體的一個(gè)特別實(shí)例是培妥珠單抗(Pmab)或MAb 2C4。HER 二聚化抑制劑的其它實(shí)例包括結(jié)合EGFR并抑制其與一個(gè)或多個(gè)其它HER受體二聚化的抗體(例如EGFR單克隆抗體806，MAb 806，其結(jié)合活化的或“未束縛的” EGFR，參見Johns等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)279 (29) =30375-30384(2004))；結(jié)合HER3并抑制其與一個(gè)或多個(gè)其它HER受體二聚化的抗體；結(jié)合HER4并抑制其與一個(gè)或多個(gè)其它HER受體二聚化的抗體；肽二聚化抑制劑(美國專利6，417，168)；反義二聚化抑制劑等。用于本文中時(shí)，"EGFR拮抗劑”或“EGFR抑制劑”是指特異性結(jié)合EGFR并阻止或降低其信號(hào)傳導(dǎo)活性，并且不特異性結(jié)合HER2，HER3，或HER4的那些化合物。這類試劑的實(shí)例包括結(jié)合EGFR的抗體和小分子。結(jié)合EGFR的抗體的實(shí)例包括MAb 579 (ATCC CRL HB 8506)，MAb 455 (ATCC CRL HB8507)，MAb 225 (ATCC CRL 8508)，MAb 528 (ATCC CRL 8509) (參見，美國專利4，943，533，Mendelsohn等)及其變體，如嵌合化225 (C225或西妥昔單抗(Cetuximab)；愛必妥 (ERBITUX ))和改型的人 225 (H225)(參見，WO 96/40210， Imclone Systems Inc.) ；IMC-11F8，一種全長人的 EGFR 靶向抗體(Imclone)；結(jié)合 II 型突變體EGFR的抗體(美國專利5，212，290)；結(jié)合EGFR的人源化和嵌合抗體，如美國專利5，891，996中所描述的；及結(jié)合EGFR的人抗體，如ABX-EGF或帕尼單抗(Panitumumab) (參見 W098/50433，Abgenix/Amgen) ；EMD 55900 (Stragliotto 等 Eur. J. Cancer (歐洲癌癥雜志)32A 636-640 (1996)) ；EMD7200 (馬妥珠單抗(matuzumab))，一種針對(duì) EGFR 的人源化EGFR抗體，其與EGF和TGF- α 二者競爭EGFR結(jié)合；(EMD/Merck)；人EGFR抗體， HuMax-EGFR(GenMab)；已知為 El. 1，E2. 4，E2. 5，E6. 2，E6. 4，E2. 11，E6. 3 和 E7. 6. 3 并且在US 6，235，883中描述的完整人抗體；MDX-447 (Medarex Inc)；和mAb 806或人源化mAb 806 (Johns 等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 279 (29) :30375-30384 (2004))。抗-EGFR 抗體可綴合細(xì)胞毒性劑，從而產(chǎn)生免疫綴合物(參見，例如EP659，439A2，Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗劑包括小分子，諸如在下述各項(xiàng)中描述的化合物美國專利5，616，582， 5，457，105,5，475，001,5，654，307,5，679，683,6，084，095,6，265，410,6，455，534, 6，521，620,6，596，726,6，713，484,5，770，599,6，140，332,5，866，572,6，399，602, 6，344，459，6，602，863，6，391，874，6，344，455，5，760，041，6，002，008，和 5,747,498，以及下述 PCT 公布W098/14451，W098/50038, W099/09016，和 W099/24037。具體的小分子 EGFR 拮抗劑包括 0SI_774(CP_358774，厄洛替尼(erlotinib)，它賽瓦 (TARCEVA ) Genentech/OSI 制藥公司(OSI Pharmaceuticals)) ；PD 183805 (Cl 1033,2-丙烯酰胺，N44-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-嗎啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二鹽酸鹽，輝瑞公司(Pfizer Inc.)) ；ZD1839，吉非替尼(gefitinib)易瑞沙(IRESSA)
4_(3’ -氯-4’ -氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉，阿斯利康 (AstraZeneca)) ；ZM105180 ((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)； BIBX-1382 (N8- (3-氯 _4_ 氟-苯基)-N2- (1-甲基-哌啶 _4_ 基)-嘧啶并[5，4_d]嘧啶-2， 8-二胺，Boehringer Ingelheim) ；PKI-166 ((R) K4_[ (1-苯基乙基)氨基]-IH-吡咯并 [2，3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羥基苯基)-4-[(I-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2, 3-d]嘧啶)；CL-387785(N44-[(3-溴苯基)氨基]_6_喹唑啉基]-2-丁炔酰胺 (butynamide)) ；EKB-569 (N- W- [ (3_ 氯 _4_ 氟苯基)氨基]_3_ 氰基 _7_ 乙氧基 _6_ 喹啉基]-4-( 二甲基氨基)_2_ 丁烯酰胺)(Wyeth) ；AG1478 (Sugen)；和 AGl57KSU 5271 ； Sugen)."HER抗體”是結(jié)合HER受體的抗體。任選地，HER抗體還干擾HER活化或功能。 具體的HER2抗體包括培妥珠單抗和曲妥珠單抗。具體EGFR抗體的實(shí)例包括西妥昔單抗 (cetuximab)禾口中白/B單(panitumumab)。涉及HER 抗體的專利公開包括US 5，677，171，US 5，720，937，US 5，720，954，US 5，725，856，US 5，770，195，US 5，772，997，US 6，165，464，US 6，387，371，US 6，399，063， US2002/0192211A1, US 6，015，567，US 6，333，169，US 4，968，603，US 5,821,337， US 6，054，297， US 6，407，213， US 6，719，971， US 6，800，738， US2004/0236078A1， US 5，648，237，US 6，267，958，US 6，685，940，US 6，821，515，W098/17797, US 6，333，398，US 6，797，814，US 6,339，142，US 6，417，335，US 6, 489, 447, W099/31140,US2003/0147884A1, US2003/0170234A1, US2005/0002928A1，US 6,573,043，US2003/0152987A1， W099/48527, US2002/0141993A1， W001/00245, US2003/0086924, US2004/0013667A1， W000/69460, W001/00238, W001/15730, US 6，627，196B1, US 6, 632,979B1, W001/00244, US2002/0090662A1, W001/89566, US2002/0064785, US2003/0134344, WO 04/24866， US2004/0082047, US2003/0175845A1, W003/087131, US2003/0228663, W02004/008099A2, US2004/0106161, W02004/048525, US2004/0258685A1，US 5,985,553，US 5,747,261， US 4,935,341， US 5，401，638，US 5，604， 107， WO 87/07646， WO 89/10412， WO 91/05264，EP 412，116 Bi, EP 494,135 Bi, US 5，824，311，EP 444,181 Bi, EP 1, 006, 194 A2, US 2002/0155527A1, WO 91/02062， US 5，571，894， US 5，939，531， EP 502,812 Bi, WO 93/03741，EP 554,441 Bi, EP 656,367 Al, US 5，288，477，US 5，514，554，US 5, 587, 458, WO 93/12220, WO 93/16185，US 5, 877, 305, WO 93/21319, WO 93/21232，US 5, 856, 089, WO 94/22478，US 5，910，486，US 6, 028, 059, WO 96/07321，US 5,804,396， US 5,846,749，EP 711，565，WO 96/16673，US 5，783，404，US 5，977，322，US 6,512,097， WO 97/00271，US 6，270，765，US 6，395，272，US 5，837，243，WO 96/40789，US 5，783，186， US 6,458,356， WO 97/20858， WO 97/38731， US 6，214，388， US 5，925，519， WO 98/02463， US 5, 922, 845, WO 98/18489, WO 98/33914，US 5, 994,071, WO 98/45479，US 6，358，682 Bi, US 2003/0059790, WO 99/55367，WO 01/20033, US 2002/0076695A1, WO 00/78347, WO 01/09187，W001/21192, W001/32155, W001/53354, W001/56604, WO 01/76630，W002/05791, WO 02/11677， US 6，582，919， US2002/0192652A1， US 2003/0211530A1, WO 02/44413， US 2002/0142328，US 6, 602,670 B2, WO 02/45653, WO 02/055106，US 2003/0152572， US 2003/0165840， W002/087619, W003/006509, W003/012072, WO 03/028638， US 2003/0068318，WO 03/041736，EPl, 357,132，US 2003/0202973，US 2004/0138160，US 5，705， 157， US 6， 123，939， EP 616,812 Bi, US 2003/0103973， US 2003/0108545， US 6,403, 630 Bi, WO 00/61145, WO 00/61185, US 6, 333, 348B1, WO 01/05425, WO 01/64246, US 2003/0022918， US 2002/0051785A1, US 6,767,541， WO 01/76586， US 2003/0144252, WO 01/87336， US 2002/0031515A1， WO 01/87334， WO 02/05791， WO 02/09754， US 2003/0157097, US 2002/0076408, WO 02/055106, WO 02/070008, WO 02/089842 和 WO 03/86467。"HER活化”是指任一種或多種HER受體的活化或磷酸化。一般而言，HER活化導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如由HER受體胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化HER受體或底物多肽中的酪氨酸殘基所導(dǎo)致)。HER活化可由HER配體結(jié)合包含目的HER受體的HER 二聚體介導(dǎo)。結(jié)合HER 二聚體的HER配體可活化二聚體中一種或多種HER受體的激酶結(jié)構(gòu)域，從而導(dǎo)致一種或多種 HER受體中酪氨酸殘基的磷酸化和/或另外的底物多肽(諸如Akt或MAPK胞內(nèi)激酶)中酪氨酸殘基的磷酸化。“磷酸化”是指向蛋白質(zhì)(諸如HER受體或其底物)添加一個(gè)或多個(gè)磷酸基。HER2上的“異二聚化結(jié)合位點(diǎn)”是指HER2的胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)，其在與EGFR，HER3 或HER4形成二聚體時(shí)接觸EGFR，HER3或HER4的胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)或與其相互作用。發(fā)現(xiàn)所述區(qū)在 HER2 的結(jié)構(gòu)域 II 中。Franklin 等，Cancer Cell (癌細(xì)胞)5 :317_328 (2004)?！敖Y(jié)合HER2的異二聚化結(jié)合位點(diǎn)”的HER2抗體與結(jié)構(gòu)域II中的殘基結(jié)合(并且任選地也結(jié)合HER2胞外結(jié)構(gòu)域的其它結(jié)構(gòu)域如結(jié)構(gòu)域I和III中的殘基)，能夠至少在一定程度上在空間上阻礙HER2-EGFR，HER2-HER3,或HER2-HER4異二聚體的形成。Franklin 等，Cancer Cell (癌細(xì)胞)5 :317_328 (2004)表征了 HER2-培妥珠單抗晶體結(jié)構(gòu)，其存放在 RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(RCSB Protein Data Bank) (ID編號(hào)IS78)中，描述了結(jié)合HER2的異二聚化結(jié)合位點(diǎn)的示例性抗體?！敖Y(jié)合HER2的結(jié)構(gòu)域II”的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域II中的殘基，并且任選地結(jié)合HER2 的其它結(jié)構(gòu)域如結(jié)構(gòu)域I和III中的殘基。
在用于描述本文中所公開的各種抗體時(shí)，“分離的”指已經(jīng)鑒定且從其表達(dá)所在的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物中分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指通常會(huì)干擾該多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將該抗體純化至(1)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或( 根據(jù)使用考馬斯藍(lán)(或優(yōu)選銀染)非還原性或還原性條件下的SDS-PAGE達(dá)到同質(zhì)。由于多肽天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，因此分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的多肽通常通過至少一個(gè)純化步驟來制備。在一些實(shí)施方案中，多特異性抗HER抗體是分離的抗體。術(shù)語“控制序列”指在特定宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的DNA 序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動(dòng)子、任選的操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞能利用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)、和增強(qiáng)子。若核酸與另一核酸序列處于功能性關(guān)系中，則該核酸是“可操作連接”的。例如， 若前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA表達(dá)成參與多肽分泌的前蛋白，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置促進(jìn)翻譯，則它與編碼序列可操作連接。通常，“可操作連接"指相連的 DNA序列是鄰接的，而且在分泌前導(dǎo)序列的情況中指鄰接且處于閱讀框中。然而，增強(qiáng)子不必鄰接。連接可通過在方便的限制性位點(diǎn)處的連接反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。如果沒有此類位點(diǎn)，那么可依照常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。關(guān)于參照多肽序列的“百分比(％ )氨基酸序列同一性”，定義為將候選序列與參照多肽序列在進(jìn)行序列比對(duì)(并在必要時(shí)導(dǎo)入空隙)以獲取最大百分比序列同一性，且不將任何保守置換視為序列同一性的部分之后，候選序列中的氨基酸殘基與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的百分?jǐn)?shù)?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的各種方法進(jìn)行序列比對(duì)以便測定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以決定比對(duì)序列的適宜參數(shù)，包括對(duì)所比較的序列全長獲得最大比對(duì)所需的任何算法。然而，為此目的，氨基酸序列同一性％值使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2產(chǎn)生。ALIGN-2序列比對(duì)計(jì)算機(jī)程序的作者是Genentech，Inc.， 該源代碼已經(jīng)隨用戶文檔提交至美國版權(quán)局(Washington D. C.，20559)，其美國版權(quán)注冊(cè)登記號(hào)為 TXU510087。公眾可通過 Genentech，Inc. (South San Francisco，加利福尼亞) 得到ALIGN-2程序，或者可以從該源代碼進(jìn)行編譯。ALIGN-2程序應(yīng)當(dāng)為在UNIX操作系統(tǒng)， 包括在數(shù)字UNIXV4. OD上使用而進(jìn)行編譯。ALIGN-2程序設(shè)定了所有序列比對(duì)參數(shù)并且不變。在ALIGN-2應(yīng)用于氨基酸序列比較的情況中，給定氨基酸序列A相對(duì)于(to)、與 (with)、或針對(duì)(against)給定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％ (或者這樣說給定氨基酸序列A具有或含有相對(duì)于、與或針對(duì)給定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性) 如下計(jì)算X/Y 比值乘以 100，其中X是用序列比對(duì)程序ALIGN-2在該程序的A和B比對(duì)中評(píng)分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)?？梢岳斫?，當(dāng)氨基酸序列A與氨基酸序列 B的長度不相等時(shí)，A相對(duì)于B的氨基酸序列同一性％將不等于B相對(duì)于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特別指出，如在緊前面的段落中所述，使用ALIGN-2計(jì)算機(jī)程序獲得在本文中所用的所有的％氨基酸序列同一性的值。雜交反應(yīng)的“嚴(yán)格性”可以容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定，而且通常憑經(jīng)驗(yàn)根據(jù)探針長度、洗滌溫度、和鹽濃度來計(jì)算。通常，較長的探針要求較高的溫度以正確退火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于互補(bǔ)鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán)境中時(shí)變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間所期望的同源性程度越高，可使用的相對(duì)溫度也越高。因此可以認(rèn)為，較高相對(duì)溫度將趨向于使反應(yīng)條件更為嚴(yán)格，而較低溫度也就較不嚴(yán)格。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的其它細(xì)節(jié)和解釋，參見Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology (珊,代,分子牛物學(xué)實(shí)驗(yàn)方案)，Wiley Interscience Publishers, (1995)。本文中所定義的“嚴(yán)格條件”或“高嚴(yán)格性條件”可如下確定(1)采用低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行洗滌，例如0. 015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. 1 %十二烷基硫酸鈉， 500C ； (2)在雜交過程中采用變性劑，諸如甲酰胺，例如50% (ν/ν)甲酰胺及0.1%牛血清白蛋白/0. Ficoll/0. 聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH 6. 5，其含750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉，42°C ；或(3)在采用50 %甲酰胺、5XSSC (0. 75M NaCl，0. 075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0. 焦磷酸鈉、5X Denhardt氏溶液、超聲波處理的鮭魚精 DNA(50yg/ml),0. 1% SDSjP 10%硫酸右旋糖苷的溶液中于42°C雜交過夜，并在42°C于 0. 2XSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中洗滌10分鐘，接著在含EDTA的0. IXSSC中于55°C進(jìn)行10 分鐘高嚴(yán)格性洗滌。“中等嚴(yán)格條件"可以如Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克降實(shí)驗(yàn)室指南),New York =Cold Spring Harbor Press，1989所述來鑒定，包括使用比上文所述較不嚴(yán)格的洗滌溶液和雜交條件(例如溫度、離子強(qiáng)度和％ SDS)。中等嚴(yán)格條件的一個(gè)例子是于37°C在含20%甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl, 15mM檸檬酸三鈉)、50mM 磷酸鈉(pH 7.6)、5X Denhardt氏溶液、10%硫酸右旋糖苷、和20mg/ml變性剪切的鮭魚精 DNA的溶液中溫育過夜，接著在IXSSC中于約37-50°C洗滌濾膜。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到如何根據(jù)需要來調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)諸如探針長度等因素?？贵w“效應(yīng)子功能”指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體 Fc區(qū))的生物學(xué)活性，且其隨抗體同種型而變化?？贵w效應(yīng)子功能的例子包括Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；吞噬作用； 細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)的下調(diào)；和B細(xì)胞活化?！翱贵w依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或“ADCC”指如下細(xì)胞毒性形式，其中某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的Fc受體(FcRs) 所結(jié)合的分泌型Ig使這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細(xì)胞，隨后用細(xì)胞毒素殺死該靶細(xì)胞。所述抗體“武裝”細(xì)胞毒性細(xì)胞，而且絕對(duì)是這類殺傷所必需的。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞(NK細(xì)胞)只表達(dá)Fc YRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)Fc γ RI、FcyRII和 Fc YRIIIo Ravetch 和 Kinet，Annu. Rev. Immunol.(免疫學(xué)年度評(píng)論)9 :457_92 (1991)的 464頁表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC 測定法，諸如美國專利5，500, 362或5，821，337中所記載的?？捎糜诖祟悳y定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。備選地或額外地，可在體內(nèi)評(píng)估目的分子的ADCC活性，例如在動(dòng)物模型中，諸如Clynes等(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.(美國科學(xué)院學(xué)報(bào)))95 =652-656(1998)所披露的。"Fe受體”或“FcR”描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人 FcR0此外，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié)合的FcR( γ受體)，而且其包括Fc γ RI，F(xiàn)c γ RII 和Fc γ RIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括 Fc y RIIA ( “活化受體”)和FcyRIIB( “抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?；罨荏wFc y RIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fc γ RIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見綜述M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol.(免疫學(xué)年度評(píng)論)15 203-234(1997)) ο FcR 的綜述參見 Ravetch 和 Kinet，Annu. Rev. Immunol.(免疫學(xué)年度評(píng)論)9 :457-492(1991) ；Capel 等，Immunomethods (免疫方法)4 :25_；34(1994)；和 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med.(實(shí)驗(yàn)室臨床醫(yī)學(xué)雜志)126 :330-41 (1995)。術(shù)語“FcR”在本文中涵蓋其它FcR，包括未來將會(huì)鑒定的FcR。該術(shù)語還包括新生兒受體(Fcfoi)，它負(fù)責(zé)將母體的 IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer 等，J. Immunol.(免疫學(xué)雜志)117 :587(1976)和Kim等，J. Immunol. (免疫學(xué)雜志)24 :249 (1994))?！叭诵?yīng)細(xì)胞”指表達(dá)一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。優(yōu)選的是，該細(xì)胞至少表達(dá)Fc y RIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單核細(xì)胞(PBMc)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；其中優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從天然來源，例如從血液分離?！把a(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“CDC”指存在補(bǔ)體時(shí)靶細(xì)胞的溶解作用。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合與其同族抗原結(jié)合的(適當(dāng)子類的)抗體起始的。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行⑶C測定法，例如feizzano-Santoro等，J. Immunol. Methods (免疫學(xué)方法雜志)202 :163(1996)所記載的。用于本文時(shí)，“治療(treatment) ”(及其語法變體，諸如“treat”或“treating”) 指在嘗試改變待治療的個(gè)體的天然進(jìn)程中的臨床介入，并且可以為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的進(jìn)程中進(jìn)行。治療的理想效果包括但不限于防止疾病發(fā)生或復(fù)發(fā)，緩和癥狀，消除疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果，預(yù)防轉(zhuǎn)移，減少疾病進(jìn)展速率，改善或減輕疾病狀態(tài)和癥狀緩解或改善的預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于延遲疾病的發(fā)生或延緩疾病的進(jìn)展。術(shù)語“治療有效量”指治療受試者中疾病或病癥的抗體或抗體片段的量。對(duì)于腫瘤(例如癌性腫瘤)，抗體或抗體片段的治療有效量可減少癌細(xì)胞數(shù)量；減小原發(fā)性腫瘤大?。灰种?即減慢到一定程度并優(yōu)選停止)癌細(xì)胞浸潤到周圍器官中；抑制(即減慢到一定程度并優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在一定程度抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上緩解一或多種與病癥相關(guān)的癥狀?？贵w或抗體片段在達(dá)到可以預(yù)防現(xiàn)存癌細(xì)胞生長和/或殺死現(xiàn)存癌細(xì)胞的程度時(shí)，其可為細(xì)胞生長抑制性和/或細(xì)胞毒性的。對(duì)于癌癥治療，體內(nèi)效力可以通過，例如評(píng)價(jià)存活期、疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP)、應(yīng)答率(RR)、應(yīng)答期、和/或生活質(zhì)量來測量?！皽p小或抑制”的意思是導(dǎo)致優(yōu)選地20%或更高、更優(yōu)選地50%或更高、并且最優(yōu)選地了日^力日^^卯^力日^^或更高的總體降低。減小或抑制可以涉及在治療的病癥的癥狀、轉(zhuǎn)移灶的存在或大小、原發(fā)性腫瘤的大小、或血管源性病癥中血管的大小或數(shù)目。
術(shù)語“癌癥”和“癌性”是指或者描述哺乳動(dòng)物中一般特征在于細(xì)胞生長不受調(diào)控的生理學(xué)狀態(tài)。這種定義包含良性和惡性癌癥?！鞍┌Y早期”的意思是無侵襲性或轉(zhuǎn)移性的癌癥，或分類為0、I、或II期的癌癥。術(shù)語“癌前”是指一般在癌癥之前或發(fā)展成癌癥的狀態(tài)或生長?！胺寝D(zhuǎn)移性”是指癌癥是良性的，或保持在原發(fā)位點(diǎn)并且未侵入淋巴或血管系統(tǒng)或原發(fā)位點(diǎn)以外的其它組織。一般而言，非轉(zhuǎn)移性癌癥是0、1、或II期癌癥中的任何癌癥，并且有時(shí)是III期癌癥?！八幱幂d體”是指藥物制劑中不同于活性成分的成分，其對(duì)受試者是無毒的。藥用載體包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。術(shù)語“抗癌治療”是指有效用于治療癌癥的治療?？拱┲委焺┑膶?shí)例包括，但不限于，例如，化療劑、生長抑制劑、細(xì)胞毒性劑、放射性治療中所用的試劑、抗血管發(fā)生劑、細(xì)胞凋亡劑、抗微管蛋白劑和其它治療癌癥的試劑，抗-CD20抗體，血小板來源的生長因子抑制劑(例如，GleeveC (甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate)))，C0X-2抑制劑(例如，塞來考昔(celecoxib))，干擾素，細(xì)胞因子，結(jié)合下述一種或多種靶標(biāo)的拮抗劑(例如，中和抗體):EGFR，ErbB2，ErbB3，ErbB4，PDGFR-beta，BlyS，APRIL，BCMA 或 VEGF 受體，TRAIL/Apo2， 和其它生物活性和有機(jī)化學(xué)劑等。它們的組合也包含在本發(fā)明中?！盎焺笔怯行в糜谥委煱┌Y的化合物?；焺┑膶?shí)例包括烷基化試劑，如塞替哌(thiot印a)和環(huán)磷酰胺(cyclosphosphamide) (CYTOXAN );烷基磺酸酯(alkyl sulfonates)如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶類(aziridines)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺類 (ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亞乙基憐酉先胺(triethylenephosphoramide)、三乙烯硫代磷酸胺(triethylenethiophosphoramide)禾口三輕甲蜜胺(trimethylomelamine)； 聚乙酸類(acetogenins)(特別是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮 (bullatacinone)) ； Δ _9_ 四 M1 大麻 ) (delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈大麻 ) (dronabinol)、MARIN0L ) ； β _ 拉帕醌(beta-lapachone)；拉巾S 醇(Iapachol)； 秋 /K 仙堿(colchicines)；樺木酸(betulinic acid)；喜樹堿(camptothecin)(包括合成的類似物托泊替康(topotecan) (HYCAMTIN )、CPT-Il (伊立替康 (irinotecan) CAMPTOSAR )、乙酰喜樹堿(acetylcamptothecin)、scopolectin 禾口 9-氨基喜樹堿(9-aminocamptothecin))；苔蘚抑素(bryostatin) ；callystatin ； CC_1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin) 合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成的類似物、Kff-2189和 CB1-TM1)；艾槽素(eleutherobin) ；pancratistatin ；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酉先胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、 異環(huán)磷酉先胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法倉(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽留酉享 (phenesterine)、撥尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracil mustard)；亞硝基服類(nitrosoureas)如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素如烯二炔類(enediyne)抗生素 (例如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素Y II和加利車霉素ω Il (參見例如 Nicolaou 等，Angew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33 183-186 (1994)) ；CDP323( 一種口服α-4整合素抑制劑)；烯二炔蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括烯二炔蒽環(huán)類抗生素A ；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色團(tuán)和相關(guān)色素蛋白烯二炔類抗生素生色團(tuán))、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、蒽霉素(authramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素 (bleomycins) > 放線菌素 C (cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、 嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放線菌素 D (dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸 (6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、多柔比星(doxorubicin)(包括 ADRIAMYCIN 、 嗎啉代-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基嗎啉代-多柔比星 (cyanomorpho 1 ino-doxorubicin)、2_ 口比口各啉-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)、 鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射劑(DOXIL )、脂質(zhì)體多柔比星TLC D-99 (MYOCET )、 聚乙二醇化脂質(zhì)體多柔比星(CAELYX )和脫氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、馬塞羅霉素 (marcellomycin)、絲裂霄素類(mitomycins)如絲裂霄素 C、麥考酷酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycins)、培洛霉素(ρ 印 lomycin)、 紫菜霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑霉素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素 (tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)； 抗代謝物如甲氨喋呤(methotrexate)、吉西他濱(gemcitabine) (GEMZAR )、替加氟(tegafur) (UFTORAL )、卡培他濱(capecitabine) (XELODA )、印othilone 和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil) (5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)、 甲氨喋呤、喋羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6_ 巰嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、 6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、 氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、環(huán)硫雄酉享(epitiostanol)、美雄燒(mepitiostane)、睪內(nèi)酉旨(testolactone)；抗腎上腺藥(anti-adrenals)如氛魯米特(aminoglutethimide)、 米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)償劑如亞葉酸(frolinic acid)； 醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)；羥醛磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside) ；5-氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼唆(eniluracil)；安口丫唆(amsacrine)；bestrabucil ；比生群(bisantrene) ； {衣達(dá)曲夕少(edatraxate) ；defofamine ； 7K il\i 月安(demecolcine) ； i也口丫酉昆(diaziquone) ；elfornithine ；依禾醋 安(elliptinium acetate -,i^i^UM (epothilone) ；(etoglucid) -MW^t (gallium nitrate)；
羥基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(Ientinan)；氯尼達(dá)明(Ionidainine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)如美登素(maytansine)禾口安絲菌素(ansamitocins)；米托月瓜月宗(mitoguazone)；米托惠酉昆(mitoxantrone)；莫喊達(dá)酉享(mopidanmol)；尼曲口丫 Pg (nitraerine)；噴司他丁 (pentostatin)；異丙嚷(phenamet) ；口比柔比星(pirarubicin)； 洛索蒽醌(Iosoxantrone) ；2-乙基酰胼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine)； PSK 多糖復(fù)合物(JHS Natural Products (JHS 天然產(chǎn)品)，Eugene, OR)；雷佐生 (razoxane)；禾[I索新(rhizoxin)；西佐口南(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone) ；2，2，，2，-三氯三乙胺(2，2，， 2，，-trichlorotriethylamine)；單端孢霉烯族化合物(trichothecenes)(特別是 T-2 毒素、verracurin Α、桿孢菌素 A (roridin A)禾口蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)； 長春地辛(vindesine) (ELDISINE 、FILDESIN )；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine) ；二溴甘露酉享(mitobronitol) ；二溴衛(wèi)矛酉享(mitolactol)； 哌泊溴燒(pipobroman) ；gacytosine ；阿糖胞苷(arabinoside) ( “Ara-C")；塞替哌 (thiotepa)；紫杉烷類化合物(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel) (TAXOL )、紫杉醇的白蛋白改造的納米顆粒制劑(ABRAXANE )和多西他塞(docetaxel) (TAXOTERE ))； STSIM^f (chloranbucil) ；6- ρτ -SjBltl^ (6-thioguanine) ；^ftpIΠφ (mercaptopurine)； 甲氨喋呤；鉬藥劑如順鉬(cisplatin)，奧沙利鉬(oxaliplatin)(例如， ELOXATIN ),和卡鉬(carboplatin)；防止微管蛋白聚合形成微管的vincas，包括長春堿(vinblastine) (VELBAN ),長春新堿(vincristine) (ONCOVIN ), Vindesine (ELDISINE , FILDESIN ),和長春瑞濱(vinorelbine) (NAVELBINE ); 依托泊苷(etoposide) (VP-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)； leucovorin -,I^i ^fb (novantrone)；依達(dá)曲沙(edatrexate)；道 i若 β 素(daunomycin)； 氨基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000 ； 二氟甲基鳥氨酸(difluoromethylornithine) (DMFO)；類視黃酸類(retinoids)，諸如視黃酸(retinoic acid)，包括貝沙羅汀(bexarotene) (TARGRETIN );二膦酸鹽類 (bisphosphonates)如氯膦酸鹽(clodronate)(例如，BONEFOS 或OSTAC )、依替膦酸鹽(etidronate) (DIDROCAL )、NE-58095、唑來膦酸(zoledronic acid)/唑來膦酸鹽(zoledronate)丨(ZOMETA )、阿侖膦酸鹽(alendronate) (FOSAMAX )、 帕米膦酸鹽(pamidronate) (AREDIA )、替魯膦酸鹽(tiludronate) (SKELID )、或利塞膦酸鹽(risedronate) ACTONEL ；曲沙他濱(troxacitabine) (1，3_ 二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制在涉及異常細(xì)胞增殖的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中基因的表達(dá)的那些，諸如例如，PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗諸如 THERATOPE 疫苗和基因治療疫苗、例如，ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑(例如LURTOTECAN ) ； rmRH (例如，ABARELIX );BAY439006(索拉非尼(sorafenib) ；Bayer) ；SU-11248 (舒尼替尼(sunitinib), SUTENT , Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，C0X-2 抑制劑(例如塞來考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白體抑制劑(例如PS341)；硼替佐米 (bortezomib) (VELCADE )； CCI-779 ；替匹法尼(tipifarnib) (Rl 1577) ；orafenib, ABT5IO ；Bcl-2 抑制劑諸如奧利美生鈉(oblimersensodium) (GENASENSE );匹蒽醌(pixantrone) ；EGFR抑制劑(參見下文定義)；酪氨酸激酶抑制劑(參見下文定義)；絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑諸如雷帕霉素(rapamycin)(西羅莫司(sirolimus), RAPAMUNE )；法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑諸如氯那法尼(Ionafarnib) (SCH 6636， SARASAR )；和以上任一種的藥用鹽、酸或衍生物；以及以上兩種以上的組合，諸如CHOP， 即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、和潑尼松龍(prednisolone)的組合療法的縮寫； 和F0LF0X，即關(guān)于與5-FU和亞葉酸(Ieucovorin)組合的奧沙利鉬(oxaliplatin) (EL0XATIN )的治療方案的縮寫。本文定義的化療劑包括“抗激素劑”或“內(nèi)分泌治療劑”，其作用為調(diào)節(jié)、降低、 阻斷或抑制可促進(jìn)癌生長的激素效果。它們自身可以是激素。包括，但不限于具有混合的激動(dòng)劑/拮抗劑模式的抗雌激素類，包括他莫昔芬(tamoxifen) (NOLVADEX ), 4-羥基他莫西芬，托瑞米芬(toremifene) (FARESTON ),艾多昔芬(idoxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，雷洛昔芬(raloxifene) (EVISTA ),曲沃昔芬(trioxifene), keoxifene，和選擇性雌激素受體調(diào)控物類(SERM)如SERM3，不具有激動(dòng)劑性質(zhì)的純的抗雌激素類，如氟維司群(fulvestrant) (FASLODEX ),和EM800 (所述藥劑可以阻斷雌激素受體(ER) 二聚化，抑制DNA結(jié)合，增加ER更新和/或抑制ER水平)；芳香酶抑制劑包括類固醇芳香酶抑制劑如福美坦(formestane)和益西美坦(exemestane) (AROMASIN ), 和非類固醇芳香酶抑制劑如阿那曲唑(anastrazole) (ARIMIDEX ),來曲唑 (Ietrozole) (FEMARA )和氨魯米特(aminoglutethimide)，和其它芳香酶抑制劑包括伏氯唑(vorozole) (RIVISOR ),醋酸甲地孕酮(megestrol acetate) (MEGASE ), 法倔唑(fadrozole)，和4 (5)-咪唑；促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑，包括亮丙立德(leuprolide) (LUPRON 和 ELIGARD ),戈舍瑞林(goserelin)，布舍瑞林 (buserelin)，和曲普瑞林(tripterelin)；性類固醇，包括黃體酮(progestines)如醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)禾口醋酸甲輕孕酮(medroxyprogesterone acetate),雌激素如己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普羅馬林(premarin)，和雄激素/類視黃醇如氟甲睪酮(fluoxymesterone)，所有的反式視黃酸(transretionic acid)和芬維A胺 (fenretinide)；奧那司酮(onapristone)；抗黃體酮(anti-progesterones)；雌激素受體下調(diào)劑(ERDs)；抗雄激素如氟他胺(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)和比卡魯胺 (bicalutamide)；上述任一種的藥用鹽、酸或衍生物，以及上述兩種以上的組合?！笆茉囌摺笔羌棺祫?dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人。哺乳動(dòng)物包括但不限于人、非人高等靈長類動(dòng)物、靈長類動(dòng)物、家畜(如牛)、競技動(dòng)物、寵物(如貓、狗和馬)和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(如小鼠和大鼠)。II.詳細(xì)描述本發(fā)明提供抗體和功能性抗體片段，其包含至少一個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)χ辽賰煞N不同HER受體，特別是EGFR和HER2，EGFR和HER3，或EGFR和HER4具有結(jié)合特異性。這些多特異性抗體不同于傳統(tǒng)多特異性抗體，后者具有帶有不同結(jié)合特異性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(通常兩個(gè))。在某些實(shí)施方案中，本文描述的多特異性抗體具有 IgG(或Fab)的分子結(jié)構(gòu)，因此保留了 IgG對(duì)于治療開發(fā)有利的屬性，諸如可預(yù)測的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，充分確立的制備方案，F(xiàn)c介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的選擇，和二價(jià)或單價(jià)。在通過組裝兩個(gè)不同抗體片段成一個(gè)分子獲得的傳統(tǒng)多特異性抗體中，這些有利屬性常常是缺失的。在本文中描述的多特異性抗體及其功能性抗體片段有效用于治療與HER受體途徑相關(guān)的疾病或病癥，諸如癌癥。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，多特異性抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合EGFR和HER3兩者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合EGFR 和HER2兩者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合EGFR和HER4兩者。本發(fā)明的一個(gè)特別方面提供包含兩個(gè)(或多個(gè))抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體，其中每個(gè)具有相同的結(jié)合特異性。一個(gè)實(shí)施方案提供包含兩個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多特異性抗體，其中每個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有相同的特異性，并且特異性結(jié)合兩個(gè)不同HER受體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中， 每個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合EGFR和HER3兩者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合EGFR和HER2兩者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合EGFR和HER4兩者。在又一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合EGFR的結(jié)構(gòu)域III。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合HER3的結(jié)構(gòu)域III。在又一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合EGFR的結(jié)構(gòu)域III和HER3的結(jié)構(gòu)域III。在具體的實(shí)施方案中，多特異性抗體特異性結(jié)合其一個(gè)靶標(biāo)HER受體或多個(gè)HER 受體，并且不特異性結(jié)合非靶標(biāo)HER受體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體特異性結(jié)合EGFR和HER3但是不特異性結(jié)合HER2或HER4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體特異性結(jié)合EGFR和HER2但是不特異性結(jié)合HER3或HER4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體特異性結(jié)合EGFR和HER4但是不特異性結(jié)合HER2或HER3。在某些實(shí)施方案中，每個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(\)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述V1A單元特異性結(jié)合兩種不同HER受體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述VhVl單元特異性結(jié)合EGFR和HER3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述單元特異性結(jié)合EGFR和HER2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述單元特異性結(jié)合EGFR和HER4。在具體的實(shí)施方案中，多特異性抗體對(duì)于其一個(gè)靶標(biāo)HER受體或多個(gè)受體的親和力通過下述Kd表示，所述Kd低于10_5M，低于10_6M，低于10_7M，低于10_8M，低于10_9M，低于 ΙΟ,Μ，低于10_"Μ，或低于10_12Μ。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體對(duì)于其靶標(biāo)受體之一的Kd低于 1(Γ7Μ，低于10_8Μ，低于10、，低于10_1QM，低于IO-11M,或低于10_12M。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 多特異性抗體對(duì)于其所有靶標(biāo)受體的Kd低于10_7M，低于10_8M，低于10_9M，低于ΙΟ,Μ，低于 IO-11M,或低于 IO-12M0在一些實(shí)施方案中，多特異性抗體對(duì)于其靶標(biāo)HER受體之一的親和力大于對(duì)于其另外一個(gè)靶標(biāo)HER受體或多個(gè)受體的親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體對(duì)于一個(gè)靶標(biāo)HER受體的親和力比其對(duì)于另一個(gè)靶標(biāo)HER受體的親和力高至少2，3,4, 5,8,10， 12，15，18，20，22，25，30，35，40，50，100-倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體特異性結(jié)合 EGFR和另一個(gè)HER受體，并且其對(duì)于另一個(gè)HER受體的結(jié)合親和力比其對(duì)于EGFR的親和力高至少 2，3，4，5，8，10，12，15，18，20，22，25，30，35，40，50，或 100-倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，
多特異性抗體特異性結(jié)合EGFR和HER3，并且其對(duì)于HER3的結(jié)合親和力比其對(duì)于EGFR的結(jié)合親和力高至少 2，3，4，5，8，10，12，15，18，20，22，25，30，35，40，50，或 100-倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體特異性結(jié)合EGFR和HER2，并且其對(duì)于HER2的結(jié)合親和力比其對(duì)于 EGFR 的結(jié)合親和力高至少 2，3，4，5，8，10，12，15，18，20，22，25，30，35，40，50，或 100-倍。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體特異性結(jié)合EGFR和HER4，并且其對(duì)于HER4的結(jié)合親和力比其對(duì)于 EGFR 的親和力高至少 2，3，4，5，8，10，12，15，18，20，22，25，30，35，40，50，或 100-倍。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性抗體抑制它們特異性結(jié)合的HER受體中的至少一個(gè)的生物學(xué)活性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性抗體抑制它們特異性結(jié)合的兩個(gè)HER受體的生物學(xué)活性。因此，例如，本發(fā)明的多特異性抗體抑制EGFR和/或HER2 和/或HER3和/或HER4受體的生物學(xué)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體特異性結(jié)合人EGFR和人HER3，并且抑制至少 EGFR的生物學(xué)活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體特異性結(jié)合人EGFR和人HER3，并且抑制至少HER3的生物學(xué)活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體特異性結(jié)合人EGFR 和人HER3，并且抑制EGFR和HER3兩者的生物學(xué)活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性抗體特異性結(jié)合人EGFR和人HER2，并且抑制至少 EGFR的生物學(xué)活性。在又一個(gè)實(shí)施方案中，抗體特異性結(jié)合人EGFR和人HER2，并且抑制至少HER2的生物學(xué)活性。在又一個(gè)實(shí)施方案中，抗體特異性結(jié)合人EGFR和人HER2，并且抑制 EGFR和HER2兩者的生物學(xué)活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體特異性結(jié)合人EGFR和人HER4，并且抑制至少EGFR的生物學(xué)活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體特異性結(jié)合人EGFR和人HER4，并且抑制至少HER4 的生物學(xué)活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體特異性結(jié)合人EGFR和人HER4，并且抑制EGFR和 HER4兩者的生物學(xué)活性。在某些實(shí)施方案中，本文的抗體抑制至少部分地由它們不結(jié)合的HER受體驅(qū)動(dòng)的生物學(xué)活性。例如，結(jié)合EGFR和HER3的抗體可能仍然能夠抑制HER2驅(qū)動(dòng)的生物學(xué)活性。生物學(xué)活性的抑制可在本領(lǐng)域熟知的測定法中測量。因此，例如，本文的抗體可抑制一個(gè)或多個(gè)HER受體的磷酸化，和/或可抑制HER配體結(jié)合其受體，和/或可抑制配體誘導(dǎo)的HER受體表達(dá)細(xì)胞的增殖和/或可抑制通過HER受體活化的下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑。應(yīng)答EGFR磷酸化活化的兩個(gè)主要下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑是Ras/MAPK和磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)/Akt途徑。因此，本文的抗體抑制HER受體的生物學(xué)活性的能力可通過，例如在NR6細(xì)胞中，評(píng)估其是否能夠阻斷這些途徑的活化來測量。因此，可測量抗體阻斷配體誘導(dǎo)的P44/42MAPK，pAKT或其它下游信號(hào)傳導(dǎo)分子的磷酸化的能力。HER3信號(hào)傳導(dǎo)也參與數(shù)個(gè)其它途徑，包括c-met和FGFR。本文的抗體抑制HER受體的生物學(xué)活性的能力可通過評(píng)估其是否能夠阻斷這些途徑的活化來測量。本發(fā)明一方面提供多特異性抗體，其如下產(chǎn)生，即使對(duì)一個(gè)HER受體具有特異性的抗體多樣化，從而該抗體對(duì)第二個(gè)HER受體產(chǎn)生特異性，同時(shí)保留對(duì)所述第一個(gè)HER受體的特異性?？傮w而言，這種方法包括步驟(1)使抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列多樣化，其中在所述多樣化之前，所述抗體包含\和能夠結(jié)合第一 HER受體上的表位的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，和(2)選擇能夠結(jié)合第一 HER受體上的表位和第二 HER受體上的表位的多樣化的抗體。這些步驟可重復(fù)，以便產(chǎn)生多特異性抗體。在美國專利申請(qǐng)20080069820 中提供了這種方法的詳細(xì)描述，其全文通過引用明確并入本文。這種方法在實(shí)施例中進(jìn)一步說明。在實(shí)施例中描述的方法中，抗EGFR抗體用作進(jìn)行多樣化的模板，并且因此用于制備多特異性抗HER抗體，然而，其它抗HER抗體，諸如抗HER2，抗HER3或抗HER4抗體也可用作模板。本發(fā)明還提供單特異性抗體，其能夠特異性結(jié)合一個(gè)HER受體但不特異性結(jié)合其它HER受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合EGFR。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合EGFR的結(jié)構(gòu)域III。在一些實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合EGFR并且抑制EGFR的生物學(xué)活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合HER3。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合HER3的結(jié)構(gòu)域III。在一些實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合 HER3并且抑制HER3的生物學(xué)活性。所述單特異性抗體可用作模板抗體，用于進(jìn)一步多樣化，以便添加對(duì)其它HER受體或?qū)ζ渌锌乖慕Y(jié)合特異性。毒性EGFR拮抗劑的毒性在臨床前和臨床研究中均有許多文件記載。例如，在治療有效水平，抗EGFR抗體西妥昔單抗顯示多種形式的毒性。西妥昔單抗(愛必妥 (ERBITUX ), Imclone)最常見的副反應(yīng)(發(fā)病率彡25%)是皮膚的副反應(yīng)(包括疹，瘙癢和指甲改變)，頭痛，腹瀉和感染。西妥昔單抗治療相關(guān)的最嚴(yán)重有害反應(yīng)是輸液反應(yīng)(infusion reactions)，心月市功能停止(cardiopulmonary arrest),皮膚病學(xué)毒性(dermatologic toxicity)禾口放射性皮炎(radiation dermatitis)，月農(nóng)毒癥 (sepsis), WMM (renal failure)，生月市(interstitial lung disease)禾口月市 (pulmonary embolus)。參見，對(duì)于西妥昔單抗的生物制品許可協(xié)議(Biologies License Agreement(BLA))(申請(qǐng)?zhí)?25084)(通過引用并入本文)。對(duì)于帕尼單抗(VECTIBIX Amgen)觀察到類似的毒性問題，其中在89%的施用這種抗體的患者中發(fā)生皮膚病學(xué)毒性。 這些毒性是嚴(yán)重的，CTC 3級(jí)以及更高。(VECTIBIX FDA標(biāo)簽。)已經(jīng)報(bào)道在一些例子中抗EGFR化療劑厄洛替尼(erlotinib)導(dǎo)致急性腎衰竭(acute renal failure) W l/l ft ^· ^ (renal insufficiency)，月干 L (hepatic failure)禾口 / 或肝腎綜合征(hepatorenal syndrome),胃腸穿孑L (gastrointestinal perforations), (bullous)禾口表皮月兌落皮月夫病癥(exfoliative skin disorders)禾口角膜潰瘍形成和穿孔(corneal ulceration and perforation)。參見，F(xiàn)DA關(guān)于厄洛替尼 (它賽瓦 (TARCEVA ),Genentech，OSI Pharmaceuticals)的警告和預(yù)防(Warnings and Precautions)安全標(biāo)簽(2009)?！岸拘缘摹被颉岸拘浴笔侵甘┯媒o受試者的藥劑導(dǎo)致的任何副作用。毒性的測量包括但不限于死亡率(mortality)、體重減輕(loss of body weight)、器官衰竭(organ failure)、改變器官功能(altered organ function)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性(central nervous system toxicity)、胃腸毒性(gastrointestinal toxicity)(例如，表現(xiàn)為腹瀉(diarrhea))、皮膚病學(xué)毒性(dermatologic toxicity)(例如，表現(xiàn)為出現(xiàn)疹(rash)、 皮膚損害(skin lesion)、脫屑(desquamation)或瘙癢(pruritus))，心臟毒性(cardiactoxicity)、感染(infection)、膿毒癥(sepsis)和細(xì)胞毒性(cytotoxicity)。毒性可通過本領(lǐng)域已知的方法確定，諸如監(jiān)測臨床護(hù)架旁觀察(clinical cageside observation)、體重、食物消耗、呼吸率、脈搏血氧定量法測量、體格檢查、眼評(píng)價(jià)、神經(jīng)病學(xué)評(píng)價(jià)、代謝參數(shù)、心血管參數(shù)、臨床病理學(xué)(包括臨床化學(xué)、血液學(xué)、尿分析和凝固參數(shù))和肉眼檢查病理學(xué)和顯微鏡病理學(xué)。國家癌癥研究所(National Cancer Institute)制作的不良事件常用術(shù)語標(biāo)準(zhǔn) (The Common Terminology Criteria for Adverse Events) ν3· 0 (CTCAE)(其全文通過弓 | 用并入本文)提供了關(guān)于在人受試者中具體可接受的毒性指標(biāo)的信息。圖31提供了關(guān)于 EGn 拮抗劑療法觀察到的非臨床和臨床毒性的信息。毒性可根據(jù)總毒性事件或一個(gè)毒性事件/多個(gè)毒性事件的嚴(yán)重性進(jìn)行測量。事件的嚴(yán)重性可使用CTCAE中建立的分級(jí)系統(tǒng)來描述。對(duì)每個(gè)不良事件使用唯一的嚴(yán)重性臨床描述進(jìn)行分級(jí)，這是基于下述一般準(zhǔn)則1級(jí)是指輕度事件。2級(jí)是指中度事件，3級(jí)是指嚴(yán)重事件，4級(jí)是指威脅生命或致殘事件，5級(jí)是指死亡相關(guān)的事件。CTCAE提供了對(duì)于毒性事件的具體臨床描述。對(duì)皮膚病學(xué)毒性的描述詞從CTCAE，v. 3第14頁開始提供。作為實(shí)例，圖32顯示對(duì)于疹/脫屑和痤瘡/痤瘡樣疹的分級(jí)。(CTCAE，v. 3)。存在本領(lǐng)域已知的許多模型用于監(jiān)測毒性的可能指標(biāo)，包括但不限于體外基于細(xì)胞的模型和體內(nèi)非人動(dòng)物模型。毒性也在人受試者在臨床試驗(yàn)研究中進(jìn)行監(jiān)測。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，毒性在食蟹猴(cynomolgus monkeys)中進(jìn)行測量。EGFR 拮抗劑在食蟹猴中的毒性效應(yīng)有許多文件記載。如在關(guān)于西妥昔單抗的生物制品許可協(xié)議(Biologies License Agreement) (BLA)(申請(qǐng)?zhí)?25084)(通過引用并入本文)中所記載，所有接受西妥昔單抗的猴子顯示在皮膚上的輕度至嚴(yán)重?fù)p害，由鱗屑形成(scale formation)、變紅(reddening)、紅斑(erythema)、皮炎(dermatitis)、裂隙(fissures)、傷口(wounds)和疹病(exanthema)和/或毛發(fā)稀疏或脫失(hair thinning or loss)組成。 皮膚病學(xué)毒性在嚴(yán)重性和發(fā)生事件中均是劑量依賴的，其中對(duì)于高、中和低劑量的嚴(yán)重性分別為嚴(yán)重、中度和輕度，以及發(fā)病時(shí)間分別在研究的第15，22和64天。嚴(yán)重皮膚損傷的繼發(fā)并發(fā)癥是細(xì)菌感染或膿毒癥，在高劑量組中50%的動(dòng)物隨后死亡或進(jìn)行安樂死。其它劑量相關(guān)毒性包括在某些臨床病理學(xué)參數(shù)中的改變，所述參數(shù)與肝、骨髓、脾和淋巴樣器官中的細(xì)胞和組織損傷的肉眼檢查和顯微鏡證據(jù)相關(guān)。如實(shí)施例中所描述的，與用同樣量的EGFR拮抗劑西妥昔單抗給藥食蟹猴相比較， 用特異性結(jié)合EGFR和HER3的雙特異性抗體給藥的食蟹猴顯示更少的毒性發(fā)生率，如通過皮膚損害所顯示的。用25mg/kg的雙特異性抗體給藥的三只食蟹猴中的一只發(fā)生皮膚損害，而用25mg/kg的西妥昔單抗給藥的3只食蟹猴中的3只發(fā)生皮膚損害。在雙特異性抗體給藥的猴子中發(fā)生的損害比西妥昔單抗給藥的猴子中的損害嚴(yán)重性更低，并且延緩了損害的發(fā)病。與其中在所有動(dòng)物中皮膚損害的發(fā)病發(fā)生在第三次給藥之后的用西妥昔單抗給藥的猴子相比較，用雙特異性抗體給藥的動(dòng)物在最后一次(第六次)給藥之后的一周發(fā)生皮膚損害。在西妥昔單抗的臨床研究中，觀察到了皮膚病學(xué)毒性，包括痤瘡樣疹、皮膚干燥和裂隙和炎癥和感染性后遺癥(infectious sequelae) 0報(bào)道的皮膚病學(xué)毒性的發(fā)生率高達(dá) 89% (對(duì)于患有晚期結(jié)腸直腸癌的那些患者)。
皮膚毒性的模型是已知的并且可用于確定抗體的皮膚病學(xué)毒性。此類模型的實(shí)例包括人表皮角質(zhì)化細(xì)胞(NHEK(Clonetics，San Diego, CA ；Lonza Bioscience, ffalkersville, MD) ；HEKa(Cascade Biologies, Portland, OR ；Invitrogen, Carlsbad, CA)和重建人表皮(EpiDerm cultures (MatTek, Ashland, MA)。這些模型可用于檢查抗體對(duì)細(xì)胞增殖、基因表達(dá)、蛋白表達(dá)、受體磷酸化、細(xì)胞活力和組織病理學(xué)中改變的效應(yīng)。 Lacouture, Μ. Ε. , Nature Rev. Cancer (自然綜述癌癥)，6 :803-812 (2006)。希望提供靶向EGFR途徑的更低毒性的抗體。EGFR拮抗劑諸如西妥昔單抗的劑量被毒性(主要是皮膚病學(xué)毒性和輸液反應(yīng))所限制。更低毒性的抗體可以比更高毒性的 EGFR拮抗劑更高的劑量施用，這可產(chǎn)生增加的抗腫瘤效應(yīng)。因此，本發(fā)明一方面提供多特異性抗體，其特異性結(jié)合EGFR和至少一個(gè)其它HER受體，(HER2，HER3，和/或HER4)，其中當(dāng)所述抗體和EGFR拮抗劑以同等劑量施用時(shí)，所述抗體比EGFR拮抗劑毒性更低。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合EGFR和HER3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合 EGFR和HER2。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合EGFR和HER4。在一些實(shí)施方案中，在體內(nèi)模型中與EGFR拮抗劑相比較，所述多特異性抗體誘導(dǎo)更低的毒性發(fā)生率，更低嚴(yán)重性的毒性或延緩毒性的發(fā)病。本發(fā)明一方面提供多特異性抗體，其特異性結(jié)合EGFR和至少一個(gè)其它HER受體(HER2，HER3，和/或HER4)，其中與在施用EGFR拮抗劑的受試者中的毒性事件相比較，在施用所述抗體的受試者中所述抗體誘發(fā)更少的毒性事件。在具體實(shí)施方案中，在施用所述抗體的受試者中毒性事件的數(shù)目比施用EGFR拮抗劑的受試者中的毒性事件的數(shù)目低至少10%，20%，30%，40%，50%，60%， 70%，80%，或 90%。在其它實(shí)施方案中，使用所述抗體的受試者中毒性事件的比率低于80%，70%， 60%，50%，40%，30%，20%，10%，5%，2%，或 1%。在具體實(shí)施方案中，與EGFR拮抗劑相比較，所述多特異性抗體在體內(nèi)模型中誘發(fā)更低發(fā)生率的皮膚病學(xué)毒性、更低嚴(yán)重性的皮膚病學(xué)毒性或延緩皮膚病學(xué)毒性的發(fā)病。本發(fā)明一方面提供多特異性抗體，其特異性結(jié)合EGFR和至少一個(gè)其它HER受體(HER2，HER3， 和/或HER4)，其中與施用EGFR拮抗劑的受試者中的總皮膚病學(xué)毒性事件相比較，在施用所述抗體的受試者中所述抗體誘發(fā)更少的總皮膚病學(xué)毒性事件。在具體實(shí)施方案中，施用所述抗體的受試者中總皮膚病學(xué)毒性事件的數(shù)目比施用EGFR拮抗劑的受試者中總皮膚病學(xué)毒性事件的數(shù)目低至少 10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，或 90%。在其它實(shí)施方案中，施用所述抗體的受試者中總皮膚病學(xué)毒性事件的比率低于 80%，70%，60%，50%，40%，30%，20%，10%，5%，2%，或 1%。本發(fā)明另一方面提供多特異性抗體，其特異性結(jié)合EGFR和至少一個(gè)其它HER受體 (HER2，HER3，和/或HER4)，其中與施用EGFR拮抗劑的受試者中的3級(jí)或更高等級(jí)的毒性事件相比較，施用所述抗體的受試者中所述抗體誘發(fā)更少的3級(jí)或更等級(jí)的毒性事件。在具體實(shí)施方案中，與施用EGFR拮抗劑的受試者中的3級(jí)或更高等級(jí)的毒性事件相比，施用所述抗體的受試者中3級(jí)或更高等級(jí)的毒性事件的數(shù)目低至少10^,20^,30^,40^,50%, 60%，70%，80%，或 90%。在其它實(shí)施方案中，在施用所述多特異性抗體的受試者中3級(jí)或更高等級(jí)的毒性事件的比率低于 70%,60%, 50%,40%, 30%, 20%, 15%, 12%, 11%, 10%,9%,8%, 7%,6%，5%，4%，3%，2%，或 1%。在具體實(shí)施方案中，與施用EGFR拮抗劑的受試者中的3級(jí)或更高等級(jí)的皮膚病學(xué)毒性事件相比較，施用雙特異性抗體的受試者中所述多特異性抗體誘發(fā)更少的3級(jí)或更高等級(jí)的皮膚病學(xué)毒性事件。在具體實(shí)施方案中，與施用EGFR拮抗劑的受試者中的3級(jí)或更高等級(jí)的皮膚病學(xué)毒性事件的數(shù)目相比，施用所述多特異性抗體的受試者中3級(jí)或更高等級(jí)的皮膚病學(xué)毒性事件的數(shù)目低至少10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，或 90%。在其它實(shí)施方案中，施用所述多特異性抗體的受試者中3級(jí)或更高等級(jí)的皮膚病學(xué)毒性事件的比率低于 70%,60%, 50%,40%, 30%, 20%, 15%, 12%, 11%, 10%,9%, 8%，7%，6%，5%，4%，3%，2%，或1%。在其它實(shí)施方案中，與EGFR拮抗劑相比較，所述抗體在體內(nèi)模型中誘發(fā)更少發(fā)病率的改變的器官功能。在其它實(shí)施方案中，與EGFR拮抗劑相比較，所述抗體在體內(nèi)模型中誘發(fā)更少或更低嚴(yán)重性的胃腸毒性。 在一些實(shí)施方案中，所述EGFR拮抗劑是抗EGFR抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 EGFR拮抗劑是西妥昔單抗。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述EGFR拮抗劑是帕尼單抗。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述EGFR拮抗劑是小分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述EGFR拮抗劑是厄洛替尼。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述體內(nèi)模型是猴，諸如食蟹猴。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述體內(nèi)模型是人。抗體和抗體變體在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多特異性抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域不特異性結(jié)合其它靶標(biāo)，包括其它HER受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh (重鏈可變結(jié)構(gòu)域)，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID N0:25。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含VJ輕鏈可變結(jié)構(gòu)域)，該&包含氨基酸序列SEQ ID N0:40。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和Vl,該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :25，該Vl包含氨基酸序列SEQ ID NO :40。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID N0:25的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，該&包含氨基酸序列SEQ ID N0:40的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\’該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 25的一個(gè)、兩個(gè)和/ 或三個(gè)HVRs，該\包含氨基酸序列SEQ ID NO 40的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\’該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 25的所有三個(gè)HVRs，該\包含氨基酸序列SEQ ID NO 40的所有三個(gè)HVRs。在一些實(shí)施方案中，所述HVRs是擴(kuò)展的HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :64。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，該八包含氨基酸序列SEQ ID N0:26。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合 EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 64,該Vl包含氨基酸序列SEQ ID NO :26。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID N0:64的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，該&包含氨基酸序列SEQ ID N0:26的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\’該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 64的一個(gè)、兩個(gè)和/ 或三個(gè)HVRs，該\包含氨基酸序列SEQ ID NO 26的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\’該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 64的所有三個(gè)HVRs，該\包含氨基酸序列SEQ ID NO 26的所有三個(gè)HVRs。在一些實(shí)施方案中，所述HVRs是擴(kuò)展的HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :28。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，該八包含氨基酸序列SEQ ID N0:27。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合 EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 28,該Vl包含氨基酸序列SEQ ID NO :27。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID N0:28的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，該&包含氨基酸序列SEQ ID N0:27的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\’該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 28的一個(gè)、兩個(gè)和/ 或三個(gè)HVRs，該&包含氨基酸序列SEQ ID NO :27的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\’該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 28的所有三個(gè)HVRs，該\包含氨基酸序列SEQ ID NO 27的所有三個(gè)HVRs。在一些實(shí)施方案中，所述HVRs是擴(kuò)展的HVRs。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，HVR-Hl包含氨基酸序列LSGDWIH(SEQ ID NO 48)，HVR-H2包含氨基酸序列 LGEISAAGGYTD(SEQ ID NO :50)，HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY (SEQ ID NO: 53)，HVR-Ll 包含氨基酸序列 DLATDVA (SEQ ID NO 54)，HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF (SEQ ID NO 56)和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT (SEQ ID NO 57)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，該\包含氨基酸序列SEQ ID NO :29。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和 Vl,該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 28,該Vl包含氨基酸序列SEQ ID NO :29。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，該&包含氨基酸序列SEQ ID N0:29的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\’該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 28的一個(gè)、兩個(gè)和/ 或三個(gè)HVRs，該&包含氨基酸序列SEQ ID NO :29的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\’該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 28的所有三個(gè)HVRs，該\包含氨基酸序列SEQ ID NO 29的所有三個(gè)HVRs。在一些實(shí)施方案中，所述HVRs是擴(kuò)展的HVRs。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，HVR-Hl包含氨基酸序列LSGDWIH(SEQ ID NO 48)，HVR-H2包含氨基酸序列 LGEISAAGGYTD(SEQ ID NO :50)，HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY (SEQ ID NO: 53)，HVR-Ll 包含氨基酸序列 NIATDVA (SEQ ID NO 55)，HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO :56)，禾口 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT (SEQ ID NO 57)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :30。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和 Vl,該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :30，該Vl包含氨基酸序列SEQ ID NO :29。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID N0:30的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\’該VH包含氨基酸序列SEQ ID NO 30的一個(gè)、兩個(gè)和/ 或三個(gè)HVRs，該&包含氨基酸序列SEQ ID NO :29的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\’該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 30的所有三個(gè)HVRs，該\包含氨基酸序列SEQ ID NO 29的所有三個(gè)HVRs。在一些實(shí)施方案中，所述HVRs是擴(kuò)展的HVRs。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，HVR-Hl包含氨基酸序列LSGDWIH (SEQ ID NO 48)，HVR-H2包含氨基酸序列 VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO 51)，HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSFEAAMDY (SEQ ID NO: 53)，HVR-Ll 包含氨基酸序列 NIATDVA (SEQ ID NO 55)，HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF (SEQ ID NO :56)，禾口 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT (SEQ ID NO 57)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，該Vl包含氨基酸序列SEQ ID NOs :40，41，42，43，44，45或 46。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :25，該&包含氨基酸序列 SEQ ID NOs :40，41，42，43，44，45 或 46。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，該\包含氨基酸序列SEQ ID NOs :40，41，42，43，44，45或46 的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR 和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 25的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs，該Vl包含氨基酸序列SEQ IDNOs :40，41，42，43，44，45或 46的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 25的所有三個(gè)HVRs，該Vl包含氨基酸序列SEQ ID NOs :40，41，42，43，44，45或46的所有三個(gè)HVRs。在一些實(shí)施方案中，所述HVRs是擴(kuò)展的HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，該輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NOs 36,37或38。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，該重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO :25，該輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NOs 36,37 或38。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID N0:25的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，該\包含氨基酸序列SEQ ID NOs 36, 37或38的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和八，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID N0:25的一個(gè)、 兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs，該\包含氨基酸序列SEQ ID NOs :36，37或38的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vi^PVl,該Vh包含氨基酸序列SEQID NO :25的所有三個(gè)HVRs， 該八包含氨基酸序列SEQ ID NOs :36，37或38的所有三個(gè)HVRs。在一些實(shí)施方案中，所述 HVRs是擴(kuò)展的HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :25。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，該八包含氨基酸序列SEQ ID N0:39。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合 EGFR和HER4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，該重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO :25，該輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列SEQ ID NO :39。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，該&包含氨基酸序列SEQ ID N0:39的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\’該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 25的一個(gè)、兩個(gè)和/ 或三個(gè)HVRs，該\包含氨基酸序列SEQ ID NO 39的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\’該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 25的所有三個(gè)HVRs，該\包含氨基酸序列SEQ ID NO 39的所有三個(gè)HVRs。在一些實(shí)施方案中，所述HVRs是擴(kuò)展的HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供單特異性抗體，其包含特異性結(jié)合EGFR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :25。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含該\包含氨基酸序列SEQ ID N0:58或SEQ ID NO :24。在一個(gè)實(shí)施方案中，單特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :25，該 Vl 包含氨基酸序列 SEQ ID NO 58 或 SEQ ID NO :24。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供單特異性抗體，其包含特異性結(jié)合EGFR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含VH，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID N0:25的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 其中所述抗體包含\，該\包含氨基酸序列SEQ ID NO 24的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 25的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs，該\ 包含氨基酸序列SEQ ID NO :24的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 25的所有三個(gè)HVRs，該Vl包含氨基酸序列SEQ ID N0:24的所有三個(gè)HVRs。在一些實(shí)施方案中，所述HVRs是擴(kuò)展的HVRs。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，HVR-Hl 包含氨基酸序列 FTGNWIH(SEQ ID NO :47)，HVR-H2 包含氨基酸序列 VGEISPSGGYTD (SEQ ID NO 49)，HVR-H3 包含氨基酸序列 ARESRVSYEAAMDY (SEQ ID NO 52)，HVR-Ll 包含氨基酸序列 DVSTAVA (SEQ ID NO 78) ,HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF (SEQ ID NO :56)，和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SYPTPYT (SEQ ID NO 79)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供單特異性抗體，其包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :29。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含該\包含氨基酸序列SEQ ID NOs :33，34或35。在一個(gè)實(shí)施方案中，單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 29，該Vl包含氨基酸序列SEQ ID NOs 33，34或35。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供單特異性抗體，其包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含VH，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID N0:29的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 其中所述抗體包含\，該Vl包含氨基酸序列SEQ ID NOs :33，34或35的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 29的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè) HVRs,該\包含氨基酸序列SEQ ID NOs :33，34或35的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\’該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 29的所有三個(gè)HVRs，該\包含氨基酸序列 SEQ ID NOs 33，34或35的所有三個(gè)HVRs。在一些實(shí)施方案中，所述HVRs是擴(kuò)展的HVRs。 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，HVR-Hl包含氨基酸序列FTGDWIH(SEQ ID NO 62)，HVR-H2包含氨基酸序列 VGEISPAGAYTD(SEQ ID NO 60)，HVR-H3 包含氨基酸序列 AREAKVSFEAAMDY (SEQ ID NO 61)，HVR-Ll包含氨基酸序列NIATDVA(SEQ ID NO 55)，HVR-L2包含氨基酸序列 SASF(SEQ ID NO :56)，和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT(SEQ ID NO 57)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供單特異性抗體，其包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :32。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，該\包含氨基酸序列SEQ ID N0:31。在一個(gè)實(shí)施方案中，單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :32，該\包含氨基酸序列SEQ ID NO :31ο在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供單特異性抗體，其包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含VH，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID N0:32的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 其中所述抗體包含\，該\包含氨基酸序列SEQ ID NO 31的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO 32的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs，該\ 包含氨基酸序列SEQ ID NO :31的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)HVRs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :32的所有三個(gè)HVRs，該八包含氨基酸序列SEQ ID NO :31的所有三個(gè)HVRs。在一些實(shí)施方案中，所述HVRs是擴(kuò)展的HVRs。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，HVR-Hl 包含氨基酸序列 FSGDWIH(SEQ ID NO :59)，HVR-H2 包含氨基酸序列 VGEISPAGAYTD (SEQ ID NO 60)，HVR-H3 包含氨基酸序列 AREAKVSFEAAMDY (SEQ ID NO 61)，HVR-Ll 包含氨基酸序列 DLATDVA (SEQ ID NO 54)，HVR-L2 包含氨基酸序列 SASF (SEQ ID NO 56)和 HVR-L3 包含氨基酸序列 SEPEPYT (SEQ ID NO 57)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈，所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NOs :2，12或14。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含輕鏈，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NOs :4，5，6，7，8，9，10，11或13。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :2，所述輕鏈包含氨基酸序列 SEQ ID NO :4。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID N0:12，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO=Il0在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO: 12，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :13。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈， 所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO: 14，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :13。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供多特異性抗體，其包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域不特異性結(jié)合其它靶標(biāo)，包括其它HER受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈，所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含輕鏈，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NOs :21，22或23。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供多特異性抗體，其包含特異性結(jié)合EGFR和HER4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域不特異性結(jié)合其它靶標(biāo)，包括其它HER受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈，所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含輕鏈，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID N0:18o在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合EGFR的單特異性抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域不特異性結(jié)合其它靶標(biāo)，包括其它HER受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈， 所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含輕鏈，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NOs 1或3。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :2，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :1。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :2， 所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :3。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合HER3的單特異性抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域不特異性結(jié)合其它靶標(biāo)，包括其它HER受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈， 所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NOs :16，17，19或20。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含輕鏈，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID N0s:13或15。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3 的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NOs 16，17，19或20，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NOs 13或15。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :16，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID N0:15。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID N0:17, 所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID N0:13。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 19，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID N0:13。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :20，所述輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :13。在一些實(shí)施方案中，考慮了本文所述的抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能需要提高抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)性質(zhì)?？梢酝ㄟ^將適合的變化引入編碼抗體的核苷酸序列或通過肽合成來制備抗體的氨基酸序列變體。所述修飾包括，例如在抗體的氨基酸序列中缺失殘基和/或插入殘基，和/或置換殘基?？梢赃M(jìn)行缺失、插入和置換的任何組合從而得到最終的構(gòu)建體，條件是最終的構(gòu)建體具有需要的特征。氨基酸改變可以在制備序列的時(shí)候弓I入主題抗體氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于參照序列具有至少80 %，85 %，90 %，91 %，92 %，93 %， 94%，95%，96%，97 %，98 %或99 %的序列同一性的氨基酸序列含有置換、插入或缺失，但是包含所述氨基酸序列的抗體保留了結(jié)合所述參照序列的最初一個(gè)靶標(biāo)或多個(gè)靶標(biāo)的能力。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于參照序列具有至少80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%， 95 %，96 %，97 %，98 %或99 %的序列同一性的氨基酸序列含有置換、插入或缺失，但是包含所述氨基酸序列的抗體保留了結(jié)合所述參照序列的最初一個(gè)靶標(biāo)或多個(gè)靶標(biāo)的能力，并且不特異性結(jié)合任何其它靶標(biāo)，包括其它HER受體。在一些實(shí)施方案中，參照序列的氨基酸序列中總計(jì)1至10個(gè)氨基酸被置換、插入或缺失。在一些實(shí)施方案中，所述置換、插入或缺失發(fā)生在HVRs外部的區(qū)(S卩，在FRs中)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID NO: 25具有至少80^,85%, 90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，所述\與氨基酸序列SEQ ID NO :40具有至少80^,85%, 90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含 Vh 和 Vl，所述 Vh 與氨基酸序列 SEQ ID NO :25 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%， 94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性，所述Vl與氨基酸序列SEQ ID NO :40具有至少 80 %，85 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 %或 99 % 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID NO :64具有至少80^,85%, 90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含八，所述 Vl 與氨基酸序列 SEQ ID NO :26 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%， 95 %，96 %，97 %，98 %或99 %的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含V1^P \，所述Vh與氨基酸序列 SEQ ID NO :64 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%的序列同一性，所述Vl與氨基酸序列SEQ ID NO :26具有至少80%，85%，90%，91 %， 92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99% 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，所述Vl具有與SEQ ID而29至少80%，85%，90%，91%， 92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 %或99 %的序列同一性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和Vl，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID NO :28具有至少80%，85%，90%，91%，92%， 93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性，所述Vl與氨基酸序列SEQ ID NO: 29 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99% 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID NO :30具有至少80^,85%, 90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh 和 Vl，所述 Vh 與氨基酸序列 SEQ ID NO :30 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%， 94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性，所述Vl與氨基酸序列SEQ ID NO :29具有至少 80 %，85 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 %或 99 % 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，所述\與氨基酸序列SEQ ID NOs :40，41，42，43，44，45或46 中的任意一條具有至少 80 %，85 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 % 或 99 %的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和八，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID N0:25具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99% 的序列同一性，所述八與氨基酸序列 SEQ ID NOs :40，41，42，43，44，45 或 46 具有至少 80%，85%，90%，91%， 92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID N0:25具有至少80%，85%， 90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含八，所述 Vl 與氨基酸序列 SEQ ID NO :36 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%， 95 %，96 %，97 %，98 %或99 %的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，所述Vh與氨基酸序列 SEQ ID NO :25 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%， 98%或99%的序列同一性，所述Vl與氨基酸序列SEQ ID NO 36具有至少80%，85%，90%， 91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，所述 Vl 與氨基酸序列 SEQ ID NO :37 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%， 96%，97%，98%或99%的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh結(jié)構(gòu)域和\，所述Vh結(jié)構(gòu)域與氨基酸序列 SEQ ID NO :25 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%， 97%，98%或99%的序列同一性，所述八具有氨基酸序列SEQ ID NO :37。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含八，所述&具有氨基酸序列SEQ ID NO :38。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER2的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，所述Vh與氨基酸序列 SEQ ID NO :25 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%的序列同一性，所述Vl與氨基酸序列SEQ ID NO :38具有至少80%，85%，90%，91 %， 92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID N0:25具有至少80%，85%， 90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含八，所述 Vl 與氨基酸序列 SEQ ID NO :39 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96 %，97 %，98 %或99 %的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER4的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含V1^P \，所述Vh與氨基酸序列 SEQ ID NO :25 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%的序列同一性，所述Vl與氨基酸序列SEQ ID NO :39具有至少80%，85%，90%，91 %， 92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供單特異性抗體，其包含特異性結(jié)合EGFR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含VH，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID NO :25具有至少80^,85%, 90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 % 或 99 % 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含所述 Vl 與氨基酸序列 SEQ ID NO :24 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，
96%，97 %，98 %或99 %的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含V1^PVp所述Vh與氨基酸序列SEQ ID NO 25 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99% 的序列同一性，所述八與氨基酸序列SEQ ID NO :24具有至少80%，85%，90%，91%，92%，93%， 94%，95%，96%，97%，98%或 99% 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供單特異性抗體，其包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID NO :32具有至少80^,85%, 90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 % 或 99 % 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含所述 Vl 與氨基酸序列 SEQ ID NO :31 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%， 96 %，97 %，98 %或99 %的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和八，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID NO 32 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99% 的序列同一性，所述八與氨基酸序列SEQ ID NO :31具有至少80%，85%，90%，91%，92%，93%， 94%，95%，96%，97%，98%或 99% 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 其中所述抗體包含Vh，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID NO :33具有至少80%，85%，90%， 91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含所述\與氨基酸序列 SEQ ID NO :29 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%， 97%，98%或99%的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合 HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和八，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID N0:33具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98% 或 99% 的序列同一性，所述八與氨基酸序列SEQ ID NO :29具有至少80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%， 95 %，96 %，97 %，98 %或99 %的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID NO 34 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99% 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 其中所述抗體包含Vh *Vl，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID NO 34具有至少80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性，所述Vl與氨基酸序列 SEQ ID NO :29 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，所述Vh與氨基酸序列SEQ ID NO :35具有至少80^,85%, 90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 % 或 99 % 的序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單特異性抗體包含特異性結(jié)合HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和八，所述 Vh 與氨基酸序列 SEQ ID NO :35 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%， 95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性，所述Vl與氨基酸序列SEQ ID NO : 具有至少 80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或 99%的序列同一性。圖33中顯示了示例性比對(duì)，該比對(duì)顯示數(shù)個(gè)抗HER抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的Kabat編號(hào)。本發(fā)明的另一方面提供多特異性抗體，其包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID N0:25，其中SEQ ID NO 25 的 Vh 包含在 F29 (Vh)，T30 (Vh)，N32 (Vh)，V48 (Vh)，P52a (Vh)，S53 (Vh)，T57 (Vh)，S96 (Vh)或 YIOO(Vh)的氨基酸置換，根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含多于一個(gè)這些置換。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含所有這些置換。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含VH， 該Vh包含氨基酸序列SEQ ID N0:25，其中SEQ ID NO :25的Vh包含一個(gè)或多個(gè)選自由下述各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換:F29(Vh)L;T30(Vh)S;N32(Vh)D, V48 (Vh)L, P52a(VH)A, S53 (Vh) A, T57(Vh)S，S96 (Vh) A和YlOO (Vh)F，根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含VH， 該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :25，其中SEQ ID NO 25的Vh包含氨基酸置換M9 (Vh) L， T30 (Vh) S，N32 (Vh)D, P52a(VH)A 和 S53 (Vh)A 和 YlOO (Vh) F，根據(jù) Kabat 編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)。本發(fā)明的另一方面提供多特異性抗體，其包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其中所述抗體包含\，該Vl包含氨基酸序列SEQ ID N0:58，其中SEQ ID NO: 58 的 Vl 包含在 D28 (Vl)，V29 (Vl)，S30 (Vl)，T31 (Vl)，A32 (Vl)，V33 (Vl)，S50 (Vl)，A51 (Vl)， F53 (Vl)，S91 (Vl)，Y92 (Vl)，T93 (Vl)，T94 (Vl)或 P96 (Vl)的氨基酸置換，根據(jù) Kabat 編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含多于一個(gè)這些置換。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含所有這些置換。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含在氨基酸31和氨基酸32之間的氨基酸插入。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含八，該Vl包含氨基酸序列SEQ ID N0:58，其中SEQ ID NO :58的 Vl包含一個(gè)或多個(gè)選自由下述各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換擬8 (Vl) N, V29 (Vl) I，V29 (Vl) L， S30 (Vl)A, A32 (Vl)D, Y92 (Vl)E, T93(Vl)P, T94 (V) E 和 P96 (V) Y，根據(jù) Kabat 編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含\，該Vl包含氨基酸序列SEQ ID N0:58，其中SEQ ID NO :58的Vl 包含氨基酸置換 D28 (Vl) N，V29 (Vl) I，S30 (Vl) A，A32 (Vl)D, Y92 (Vl)E, T93 (Vl)P, T94 (Vl) E 和 P96(Vl)Y，根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID N0:25，該\包含氨基酸序歹Ij SEQ ID NO :58，其中 SEQ ID NO 25 的 Vh 包含在 F29 (Vh)，T30 (Vh)，N32 (Vh)，V48 (Vh)， P52a (Vh) , S53 (Vh) , T57 (Vh) , S96 (Vh)或 YIOO(Vh)的氨基酸置換，并且其中 SEQ ID NO :58 的 Vl 包含在 D28 (Vl)，V29 (Vl)，S30 (Vl)，T31 (Vl)，A32 (Vl)，V33 (Vl)，S50 (Vl)，A51 (Vl)，F(xiàn)53 (Vl)， S91 (Vl)，Y92 (Vl)，T93 (Vl)，T94 (Vl)或P96 (Vl)的氨基酸置換，根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含多于一個(gè)這些置換。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含所有這些置換。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID N0:25，該\包含氨基酸序列SEQ ID N0:58，其中SEQ ID NO :25的Vh包含一個(gè)或多個(gè)選自由下述各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換M9(Vh)L ;T30(Vh)S ;N32(Vh)D，V48 (Vh)L, P52a(VH)A，S53(VH)A，T57(VH)S， S96 (Vh)A和YlOO (Vh) F，SEQ ID NO :58的\包含一個(gè)或多個(gè)選自由下述各項(xiàng)組成的組的氨基酸置換擬8 (Vl) N，V29 (Vl) I，V29 (Vl) L，S30 (Vl) A，A32 (Vl)D, Y92 (Vl)E, T93 (Vl)P, T94 (Vl) E和P96(Vl)Y，根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含Vh和\，該Vh包含氨基酸序列SEQ ID NO :25，其中SEQ ID NO 25 的 Vh 包含氨基酸置換擬9 (Vh) L，T30 (Vh) S，N32 (Vh)D, P52a (Vh) A 和 S53 (Vh) A 和 YlOO (Vh) F，該\包含氨基酸序列SEQ ID NO :58，其中SEQ ID NO 58的\包含氨基酸置換擬8 (Vl) N, V29 (Vl) I，S30 (Vl) A, A32 (Vl)D, Y92 (Vl)E, T93 (Vl)P, T94 (Vl) E 和 P96 (Vl) Y,根據(jù) Kabat 編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)。用于鑒定對(duì)于突變發(fā)生是優(yōu)選位置的抗體的某些殘基或區(qū)域的有用方法被稱為 “丙氨酸分區(qū)誘變法”，如 Cunningham 和 Wells 在科學(xué)(1989) (Science)，244 :1081-1085 中所述。在此處，鑒定了一種或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基如arg，asp，his，lys*glu)， 并且用中性或帶負(fù)電荷氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)置換從而影響氨基酸與抗原的相互作用。然后，通過在或關(guān)于置換位點(diǎn)引入另外的或其它變體來精選顯示對(duì)置換的功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，當(dāng)預(yù)先確定引入氨基酸序列變化的位點(diǎn)時(shí)，突變本身的性質(zhì)不需要被預(yù)先確定。例如，為了分析突變?cè)诮o定位點(diǎn)的性能，在靶密碼子或靶區(qū)進(jìn)行丙氨酸分區(qū)誘變或隨機(jī)誘變并且關(guān)于需要的活性篩選表達(dá)的免疫球蛋白。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基端融合，長度范圍在1個(gè)殘基到包含一百以上殘基的多肽，以及單一氨基酸殘基或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的實(shí)例包括具有N-端甲硫氨酰殘基的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括抗體的N端或C端與增加抗體的血清半衰期的酶(例如關(guān)于ADEPT)或多肽的融合。糖基化變體在某些實(shí)施方案中，改變本發(fā)明的抗體從而增加或減少抗體被糖基化的程度。多肽的糖基化典型地是N-連接或0-連接的。N-連接指碳水化合物結(jié)構(gòu)部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈的連接。其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺-χ-絲氨酸和天冬酰胺-χ-蘇氨酸，是關(guān)于將碳水化合物結(jié)構(gòu)部分酶促連接于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。因此，在多肽中這些三肽序列的存在產(chǎn)生可能的糖基化位點(diǎn)。0-連接的糖基化指將糖 N-乙?；肴樘前?、半乳糖或木糖之一連接于羥基氨基酸，最常見連接于絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。常規(guī)情況下，在抗體上加入或缺失糖基化位點(diǎn)通過改變氨基酸序列完成，從而產(chǎn)生或去除一個(gè)或多個(gè)上述三肽序列(對(duì)于N-連接的糖基化位點(diǎn))。還可以通過將一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基在起始抗體序列加入、缺失或置換進(jìn)行改變(對(duì)于0-連接的糖基化位點(diǎn))O如果抗體包含F(xiàn)c區(qū)，那么可以改變其連接的碳水化合物。由哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的天然抗體典型地包含支化的，雙觸角寡糖，其通常通過N-連接連接于Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域的 Asn297。見，例如，Wright等(1997)TIBTECH 15丨6-32。寡糖可以包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在雙觸角的寡糖結(jié)構(gòu)的“莖” 中連接于GIcNAC的巖藻糖。在一些實(shí)施方案中，可以在本發(fā)明的抗體中修飾寡糖從而產(chǎn)生具有一定提高性質(zhì)的抗體變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有這樣的碳水化合物結(jié)構(gòu)的抗體變體，所述碳水化合物結(jié)構(gòu)缺乏連接(直接或間接)于Fc區(qū)的巖藻糖。例如，在此類抗體中巖藻糖的量可以是從至80%，從至65%，從5%至65%或從20%至40%。巖藻糖的量通過 MALDI-T0F質(zhì)譜測定法如下確定計(jì)算在Asn297的糖鏈內(nèi)的巖藻糖相對(duì)于附著到Asn 297 的所有糖結(jié)構(gòu)(例如，復(fù)合的，雜合的和高甘露糖結(jié)構(gòu))的總和的平均量，例如，如在WO 2008/077546中所描述的。Asn297是指Fc區(qū)中位于大約位置四7的天冬酰胺殘基(Fe區(qū)殘基的Eu編號(hào))；然而，由于抗體中小的序列變異，Asn297也可位于大約位置297的上游或下游士3個(gè)氨基酸，即在位置294和300之間。所述巖藻糖基化變體可以具有提高的ADCC 功能。見例如，美國專利公開號(hào) US 2003/0157108 (Presta，L.) ；US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。與“去巖藻糖基化(defucosylated) ”或“巖藻糖缺陷的”抗體變體相關(guān)的出版物的實(shí)例包括US 2003/0157108 ；WO 2000/61739 ；WO 2001/29246 ； US 2003/0115614 ；US 2002/0164328 ；US 2004/0093621 ；US 2004/0132140 ；US 2004/0110704 ；US 2004/0110282；US 2004/0109865 ；WO 2003/085119 ；WO 2003/084570 ； WO 2005/035586 ；WO 2005/035778 ；W02005/053742 ；W02002/031140 ；Okazaki 等，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol. )336 :1239-1249(2004) ；Yamane-Ohnuki 等，生物技術(shù)生物工程 (Biotech. Bioeng.)87 :614(2004)。能夠產(chǎn)生去巖藻糖基化的抗體的細(xì)胞系的實(shí)例包括缺乏蛋白巖藻糖基化的Lecl3 CHO細(xì)胞(Ripka等生物化學(xué)生物物理進(jìn)展(Arch. Biochem. Biophys. )249 :533-545(1986)；美國專利申請(qǐng)?zhí)?US 2003/0157108A1, Presta, LjPWO 2004/056312A1, Adams等，尤其在實(shí)施例11中)，和敲除細(xì)胞系，如α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，F(xiàn)UT8，敲除CHO細(xì)胞(見，例如，Yamane-Ohnuki等生物技術(shù)生物工程(Biotech. Bioeng). 87 :614(2004) ；Kanda, Y.等，生物技術(shù)生物工程(Biotechnol. Bioeng.),94(4) 680-688 (2006)；和 W02003/085107)。還提供具有等分寡糖的抗體變體，例如其中連接于抗體的Fc區(qū)的雙觸角寡糖被GlcNAc等分。所述抗體變體可以具有減少的巖藻糖基化和/或可以具有提高的ADCC 功能。所述抗體變體的實(shí)例例如在WO 2003/011878 (Jean-Mairet等)；美國專利號(hào) 6，602，684 (Umana等)；和US 2005/012；3546 (Umana等)中進(jìn)行描述。還提供在連接于Fc區(qū)的寡糖中具有至少一個(gè)半乳糖殘基的抗體變體。所述抗體變體可以具有提高的CDC功能。 例如在 WO 1997/30087 (Patel 等)；TO 1998/58964 (Raju, S.)；和 WO 1999/22764 (Raju,S.)中描述所述抗體變體。Fc區(qū)變體在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾可引入本文提供的抗體的Fc區(qū)中，由此產(chǎn)生Fc區(qū)變體。Fc區(qū)變體可包含人Fc區(qū)序列(例如，人IgGl，IgG2，IgG3或IgG4Fc 區(qū))，所述人Fc區(qū)序列包含在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置的氨基酸修飾(例如，置換)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋具有一些但不是全部的效應(yīng)子功能的抗體變體， 所述效應(yīng)子功能使所述抗體變體成為對(duì)于下述應(yīng)用是理想的候選物，在所述應(yīng)用中抗體在體內(nèi)的半衰期是重要的，而某些效應(yīng)子功能(如補(bǔ)體和ADCC)是不必要的或有害的。可以進(jìn)行體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性測定法從而證實(shí)CDC和/或ADCC活性的減少/消耗。 例如，可以進(jìn)行Fc受體(FcR)結(jié)合測定法從而確保抗體缺乏FcyR結(jié)合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是維持Fcfoi結(jié)合能力。用于介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，即NK細(xì)胞僅表達(dá) Fc y RIII,而單核細(xì)胞表達(dá) Fc γ RI，F(xiàn)c γ RII 和 Fc y RIII。在 Ravetch 和 Kinet，免疫學(xué)年度綜述(Annu. Rev. Immunol.) 9 :457-492 (1991)的第464頁上的表3中總結(jié)在造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。評(píng)估目的分子的ADCC活性的體外測定法的非限制性實(shí)例描述在美國專利號(hào)5，500，362中(見例如Hellstrom，I.，等美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Nat，1 Acad. Sci. USA) 83 :7059-7063 (1986))和 Hellstrom，I 等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Nat，1 Acad. Sci.USA)82 :1499-1502(1985) ；5，擬1，337 (見 Bruggemann，Μ.等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志 (J. Exp. Med.) 166 :1351-1361 (1987))中。備選地，可以使用非放射性測定法(見，例如用于流式細(xì)胞術(shù)的ACTI 非放射性細(xì)胞毒性測定法(CellTechnology，Inc. Mountain View, CA ；和CytoTox 96 非放射性細(xì)胞毒性測定法(ftOmega，Madison, WI)。用于所述測定法的有用效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。備選地或另外地， 目的分子的ADCC活性可以在體內(nèi)評(píng)估，例如如在Clynes等美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Nat，l Acad. Sci. USA) 95 :652-656(1998)中公開的動(dòng)物模型中評(píng)估。還可以進(jìn)行Clq結(jié)合測定法從而證實(shí)抗體不能結(jié)合Clq并且因此缺乏⑶C活性。參見例如在WO 2006/029879 和TO 2005/100402中的Clq和C3c結(jié)合ELISA。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行CDC測定 (見，例如，Gazzano-Santoro 等，免疫學(xué)方法雜志(J. Immunol. Methods) 202 163 (1996)； Cragg, M. S.等，血液(Blood) 101 1045-1052 (2003)；禾口 Cragg，M.S.和 Μ· J. Glennie，血液(Blood) 103 :2738-2743(2004)) ο還可以使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行Fcfoi結(jié)合和體內(nèi)清除/半衰期測定(見，例如，Petkova, S. B.等，國際免疫學(xué)Qnt’ 1. Immunol.) 18 (12) 1759-1769(2006))ο具有降低的效應(yīng)子功能的抗體包括具有Fc區(qū)殘基238，265, 269, 270，297, 327和 329的一個(gè)或多個(gè)置換的那些(美國專利6，737，056)。此類Fc突變體包括在氨基酸位置 265,269,270,297和327中的兩個(gè)或多個(gè)具有置換的Fc突變體，包括所謂的“DANA”Fc突變體，其具有殘基265和297變?yōu)楸彼岬闹脫Q(美國專利7，332，581)。描述了某些具有提高或減少結(jié)合FcRs的抗體變體。(參見，例如，美國專利 6，737，056 ；WO 2004/056312 和 Shields 等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)9 ) 6591-6604 U001)。)在某些實(shí)施方案中，抗體變體包含提高ADCC的具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換的Fc 區(qū)，例如，在Fc區(qū)的位置四8，333和/或334(殘基的EU編號(hào))的置換。
在一些實(shí)施方案中，在Fc區(qū)進(jìn)行改變，其導(dǎo)致改變的(即，提高的或減少的)Clq 結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C)，例如如在美國專利6，194,551，WO 99/51642和 Idusogie 等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 164 =4178-4184(2000)中所描述的。在US2005/0014934Al(HintOn等)中描述了具有增加的半衰期并且對(duì)于新生兒 Fc受體(Fcfoi)具有提高的結(jié)合的抗體，所述Fcfoi負(fù)責(zé)將母體Ig(iS轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer 等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol. ) 117 :587(1976)和 Kim 等，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 24 ^9(1994))。那些抗體其中包含具有一個(gè)或多個(gè)置換的Fc區(qū)，所述置換提高Fc區(qū)與Fcfoi 的結(jié)合。此類Fc變體包括在下述一個(gè)或多個(gè)Fc區(qū)殘基具有置換的那些238，256，265，272， 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382,413,424 或 434，例如Fc區(qū)殘基434的置換(美國專利7，371，826)。涉及Fc區(qū)變體的其它實(shí)例也參見Duncan & Winter，Nature (自然)322 738-40(1988)；美國專利 5，648，260 ；美國專利 5，624，821 ；和 WO 94/29351。半胱氨酸改造的抗體變體在某些實(shí)施方案中，可能需要產(chǎn)生半胱氨酸改造的抗體，例如“thioMAbs”，其中抗體的一個(gè)或多個(gè)殘基被半胱氨酸殘基置換。在具體的實(shí)施方案中，在抗體可及的位點(diǎn)存在置換的殘基。通過用半胱氨酸置換那些殘基，反應(yīng)性硫醇基由此定位在抗體的可及位點(diǎn)， 并且可以用于將抗體綴合于其它結(jié)構(gòu)部分，如藥物結(jié)構(gòu)部分或接頭-藥物結(jié)構(gòu)部分，從而產(chǎn)生免疫綴合物，如本文進(jìn)一步所述。在某些實(shí)施方案中，下面的殘基的任何一個(gè)或多個(gè)可以用半胱氨酸置換輕鏈的V205 (Kabat編號(hào))；重鏈的A118 (EU編號(hào))；和重鏈Fc區(qū)的 S400 (EU編號(hào))。半胱氨酸改造的抗體可以如，例如在美國專利7，521，541中所描述的產(chǎn)生?？贵w衍生物在某些實(shí)施方案中，可以對(duì)本文提供的抗體進(jìn)一步修飾以包含本領(lǐng)域已知并且容易獲得的另外的非蛋白質(zhì)性的結(jié)構(gòu)部分。適合抗體的衍生作用的結(jié)構(gòu)部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實(shí)例包括，但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二噁烷，聚-1， 3，6-三噁烷，乙烯/馬來酸酐共聚物，聚氨基酸(同聚物或隨機(jī)共聚物)和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇同聚物(propropylene glycol homopolymers)，聚環(huán)氧丙烷/氧化乙烯共聚物，聚氧乙烯化的多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的穩(wěn)定性，聚乙二醇丙醛可以在生產(chǎn)中具有優(yōu)勢。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支或不分支的。與抗體連接的聚合物的數(shù)目可以變化，并且如果連接多于一個(gè)聚合物，它們可以是相同或不同的分子。一般地，用于衍生化的聚合物的數(shù)目和/或類型可以基于這樣的考慮來確定，包括，但不限于，待提高的抗體的具體性質(zhì)或功能，抗體衍生物是否將在限定的條件下用于治療中，等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供可以通過暴露于輻射而被選擇性加熱的抗體和非蛋白質(zhì)性結(jié)構(gòu)部分的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，非蛋白質(zhì)性的結(jié)構(gòu)部分是碳納米管(nanotube) (Kam 等，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 102 11600-11605(2005))。輻射可以以任何波長進(jìn)行，并且包括，但不限于這樣的波長，所述波長不傷害正常細(xì)胞，但是其將非蛋白質(zhì)性結(jié)構(gòu)部分加熱到殺死接近抗體-非蛋白質(zhì)性結(jié)構(gòu)部分的細(xì)胞的溫度。參見，例如Petkova，S. B.等，國際免疫學(xué)(Int' 1. Immunol.) 18 (12)
權(quán)利要求
1.多特異性抗體，其包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體的毒性低于EGFR拮抗劑的毒性。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述毒性是皮膚病學(xué)毒性。
3.權(quán)利要求1的抗體，其中所述EGFR拮抗劑是西妥昔單抗。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體抑制EGFR和HER3中至少一個(gè)的生物學(xué)活性。
5.權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體抑制EGF結(jié)合EGFR。
6.權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體抑制TGF-α誘導(dǎo)的EGFR磷酸化。
7.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體抑制腫瘤細(xì)胞生長。
8.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體結(jié)合EGFR的結(jié)構(gòu)域III。
9.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體以低于ICT6M的Kd結(jié)合EGFR和HER3。
10.權(quán)利要求9的抗體，其中所述抗體以低于10_6Μ的Kd結(jié)合EGFR并且以低于10_7Μ 的Kd結(jié)合HER3。
11.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體包含(a)HVR-Hl，其包含氨基酸序列 LSGDWIH (SEQ ID NO 48)；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO 51)；禾口(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO 53)；禾口(d)HVR-Ll，其包含氨基酸序列 NIATDVA (SEQ ID NO 55)；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SASF(SEQID NO 56)；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEPEPYT (SEQ ID NO 57)。
12.權(quán)利要求1的抗體，包含(a)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其與氨基酸序列SEQID NO 30具有至少95%的序列同一性；(b)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其與氨基酸序列SEQID NO 29具有至少95%的序列同一性；或(c)如(a)中的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和如(b)中的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
13.權(quán)利要求12的抗體，包含SEQID NO 30的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
14.權(quán)利要求12的抗體，包含SEQID NO 29的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。
15.多特異性抗體，其包含SEQID NO 30的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列和SEQ ID NO 29的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。
16.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是全長IgGl抗體。
17.分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1的抗體。
18.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求17的核酸。
19.多特異性抗體，其包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含(a)HVR-Hl，其包含氨基酸序列 LSGDWIH (SEQ ID NO 48)；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQ ID NO 51)；禾口(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID NO 53)；禾口(d)HVR-Ll，其包含氨基酸序列 NIATDVA (SEQ ID NO 55)；(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SASF(SEQID NO 56)；和(f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEPEPYT (SEQ ID NO 57)。
20.多特異性抗體，其包含特異性結(jié)合EGFR和HER3的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述抗體包含(a)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其與氨基酸序列SEQID NO 30具有至少95%的序列同一性；(b)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其與氨基酸序列SEQID NO 29具有至少95%的序列同一性；或(c)如(a)中的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和如(b)中的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
21.權(quán)利要求20的抗體，其包含SEQID NO 30的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
22.權(quán)利要求20的抗體，其包含SEQID NO 29的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。
23.產(chǎn)生抗體的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生所述抗體。
24.免疫綴合物，其包含權(quán)利要求1的抗體和細(xì)胞毒性劑。
25.藥物制劑，其包含權(quán)利要求1的抗體和藥用載體。
26.治療患有癌癥的個(gè)體的方法，包括向所述個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1的抗體。
27.權(quán)利要求沈的抗體，其中所述癌癥包含表達(dá)EGFR和HER3的細(xì)胞。
28.權(quán)利要求沈的抗體，其中所述癌癥選自由乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，胰腺癌，頭和頸癌， 黑素瘤，卵巢癌，前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌組成的組。
29.抑制個(gè)體中HER受體的生物學(xué)活性的方法，包括向所述個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求1的抗體以抑制HER受體的生物學(xué)活性。
30.權(quán)利要求1的抗體，其用作藥物。
31.權(quán)利要求1的抗體，其用于治療癌癥。
32.權(quán)利要求31的抗體，其中所述癌癥是乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、頭和頸癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌或非小細(xì)胞肺癌。
33.權(quán)利要求1的抗體，其用于抑制HER受體的生物學(xué)活性。
34.權(quán)利要求1的抗體在制備藥物中的用途。
35.權(quán)利要求34的用途，其中所述藥物用于治療癌癥。
36.權(quán)利要求35的用途，其中所述癌癥是乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、頭和頸癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌或非小細(xì)胞肺癌。
37.權(quán)利要求34的用途，其中所述藥物用于抑制HER受體的生物學(xué)活性。
全文摘要
本發(fā)明提供抗HER抗體，包括多特異性抗HER抗體，包含這些抗體的組合物和使用這些抗體的方法。本文還提供比傳統(tǒng)EGFR拮抗劑更低毒性的EGFR/HER3多特異性抗體。
文檔編號(hào)C07K16/32GK102356092SQ201080012374
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者加布里埃萊·謝弗, 勞里奇·哈貝, 吉曼·福, 馬克·X·斯利沃克斯基 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司