專利名稱：一種動物磁性鐵蛋白材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及磁性納米材料的仿生合成技術(shù)領(lǐng)域。特別是涉及一種生物蛋白礦化模板合成直徑小于IOnm的動物磁性鐵蛋白材料。本發(fā)明還涉及制備上述材料的方法。
背景技術(shù)：
超順磁磁鐵礦(狗304)或者磁赤鐵礦(Y -Fe2O3)顆粒具有高的飽和磁化強度，納米尺寸效應(yīng)，并有良好的機械性能和化學(xué)穩(wěn)定性。因此被廣泛地應(yīng)用于磁記錄存儲、磁流體、 催化和生物醫(yī)學(xué)，例如磁靶向藥物、磁共振造影增強劑、細(xì)胞標(biāo)記分離、DNA分離、疾病診斷，等技術(shù)領(lǐng)域。然而粒徑分布、礦物相和顆粒間有無相互作用是決定納米磁性顆粒特性和功能的重要因素，因此，如何合成粒徑均一、礦物相單一和單分散性的磁性納米顆粒一直是制備工藝技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點。鐵蛋白是一種重要的鐵礦化蛋白，廣泛分布于微生物、植物和動物體內(nèi)。在生物體內(nèi)的鐵代謝過程中起著貯存和解除二價鐵離子毒性的雙重作用。因此鐵蛋白在鐵的生物礦化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。天然鐵蛋白是聚合體。它由12-M個蛋白亞基高度自組裝形成籠狀的蛋白殼，每個蛋白殼內(nèi)含有一個天然的水合氧化鐵內(nèi)核。其外直徑約為12nm， 內(nèi)直徑約為8nm。相比人工合成的磁性材料來說，天然鐵蛋白的內(nèi)核磁性弱，在材料學(xué)和醫(yī)學(xué)上沒有很強的應(yīng)用優(yōu)勢。然而利用鐵蛋白本身的礦化能力，通過從廉價的肉食動物下水廢料中提純大量的天然鐵蛋白作為原材料，再經(jīng)還原去核后重構(gòu)新核，可以仿生合成一種具有磁鐵礦或者磁赤鐵礦內(nèi)核的磁性鐵蛋白。該磁性鐵蛋白具有粒度均一、形狀一致、礦物相單一和分散性好等很多優(yōu)點，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的理想磁性納米材料。由于中國人的飲食傳統(tǒng)，豬、牛、羊和家禽等肉類是傳統(tǒng)的肉食品。然而這些動物經(jīng)屠宰后剩余大量的下水器官，例如脾臟、肝臟等，常被作為廢料處理。其實這些動物的脾臟等器官含有豐富的鐵蛋白，是提純鐵蛋白的很好原料。相比目前購買商品化的天然鐵蛋白來說，自行純化動物鐵蛋白是很經(jīng)濟環(huán)保的方法，且獲得產(chǎn)量高。目前提純單體鐵蛋白的方法已經(jīng)有報道(申請?zhí)?01010034208. 7)。純化好的天然鐵蛋白首先要在酸性條件和還原劑存在的條件下，經(jīng)過還原去核形成空殼鐵蛋白作為仿生合成磁性鐵蛋白的模板。然后再通過控制體外合成的條件在蛋白殼內(nèi)部形成磁鐵礦或者磁赤鐵礦顆粒。再經(jīng)后期離心和分子篩層析處理可以獲得無任何相互作用的單體磁性鐵蛋白。相比原有的磁性鐵蛋白合成方法(U. S. patent 5491219和Moskowitz et al.，1997)，普遍使用商品化的馬脾鐵蛋白，原材料價格昂貴且種類單一。而且前人實驗中使用空氣作為氧化劑，難以控制實際溶液中的溶解氧和亞鐵離子的比例，因此很難保持產(chǎn)物成分單一，并且無后期分離步驟，無法去除少量的體外礦化副產(chǎn)物和鐵蛋白聚集體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種動物磁性鐵蛋白材料。
3
本發(fā)明的又一目的在于提供一種制備上述材料的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的動物磁性鐵蛋白材料，具有完整的動物鐵蛋白殼和磁性納米顆粒核，核的直徑在1納米到8納米之間，在水以及極性溶劑中具有可分散性和溶解性；核的成分為磁鐵礦或者磁赤鐵礦；通過下述方法得到1)將動物下水磨漿后過濾離心去除雜蛋白，再經(jīng)過鎳柱和分子篩層析分離出單體天然鐵蛋白；幻酸性條件下將天然鐵蛋白還原去核為空殼鐵蛋白；3)以雙氧水為氧化劑加入空殼鐵蛋白的溶液中反應(yīng)，反應(yīng)條件Fe (II)/H2O2的摩爾比例為彡2 1，pH = 7. 1-11，溫度為25_70°C合成動物磁性鐵蛋白；4)將合成的動物磁性動物鐵蛋白進行分離后得到單分散的和無磁相互作用的動物磁性鐵蛋白顆粒。所述的動物磁性鐵蛋白材料，其中每個動物鐵蛋白殼內(nèi)的磁性納米顆粒數(shù)在 100-5000。本發(fā)明提供的制備上述動物磁性鐵蛋白材料的方法，主要步驟為1)將動物下水?dāng)嚢枘{后超聲破碎組織細(xì)胞，熱變性過濾離心去除雜蛋白，再經(jīng)過鎳柱和分子篩層析分離出單體天然鐵蛋白；2)酸性和無氧條件下將天然鐵蛋白還原去核為空殼鐵蛋白，透析后層析分離獲得單體天然空殼鐵蛋白；3)以雙氧水為氧化劑加入空殼鐵蛋白的溶液中反應(yīng)合成動物磁性鐵蛋白，控制亞鐵原子數(shù)與蛋白分子數(shù)比為10-200，F(xiàn)e (II)/H2O2的摩爾比例為彡2 1，pH = 7. 1_11，溫度為 25-700C ；4)將合成后的動物磁性鐵蛋白通過排阻層析進行分離后得到單分散的和無磁相互作用的磁性鐵蛋白顆粒。所述的方法，其中步驟1中的動物下水為家畜或家禽的脾臟和肝臟。所述的方法，其中步驟2中的還原去核采用巰基乙酸為還原劑的乙酸鈉緩沖液。所述的方法，其中步驟3中的pH = 8-8. 5。所述的方法，其中步驟3中的溫度為37_65°C。所述的方法，其中步驟3中的亞鐵是來自硫酸亞鐵銨、硫酸亞鐵、氯化亞鐵中的一種或幾種的水溶性亞鐵鹽。所述的方法，其中排阻層析所用的介質(zhì)是kpharose 4B或者是superose 6，使用的緩沖溶液是 0. 025-0. 045M Tris-HCl,pH = 7. 25 的緩沖溶液，流速為 0. 25-0. 45ml/min。與公知的磁性鐵蛋白及其制備方法相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點1)利用肉食動物的下水獲得大量的天然鐵蛋白原料，經(jīng)濟環(huán)保。提純方法簡單可行，收率高，適合大規(guī)模工業(yè)提純加工。2)改用雙氧水作為氧化劑，排除了傳統(tǒng)使用空氣的難以真正計量的缺點，實現(xiàn)了可控比例的合成礦物相單一的亞鐵磁性內(nèi)核。3)動物來源的磁性鐵蛋白具有完整的鐵蛋白殼，來源于動物用于相應(yīng)的動物體內(nèi)，很大程度上可以避免由于物種差異所對動物體造成的免疫原性，因而在動物的磁靶標(biāo)藥物、細(xì)胞標(biāo)記等動物醫(yī)學(xué)中可能有更廣泛的用途。4)制備的磁性鐵蛋白是單分散的和無磁相互作用的，是研究超順磁性的難得寶貴材料。并且由于磁性顆粒外面有蛋白殼包裹，能夠長期地穩(wěn)定存在。
5)制備的動物磁性鐵蛋白能夠保存在pH = 4-11中保持蛋白結(jié)構(gòu)的完整性，而且可耐高達(dá)70°C的高溫，擴大了將來應(yīng)用的范圍。


圖1是提純分離的單分散性的天然豬脾鐵蛋白的透射電鏡(TEM)負(fù)染照片。圖2是本發(fā)明實施例1-4所制備的單分散性的空殼豬脾鐵蛋白的透射電鏡(TEM) 負(fù)染照片。圖3是本發(fā)明實施例1-4所制備的單分散性的磁性豬脾鐵蛋白的透射電鏡(TEM) 負(fù)染照片。圖4是本發(fā)明實施例1-4所制備的分子篩分離前的磁性豬脾鐵蛋白的透射電鏡 (TEM)負(fù)染照片。圖5是本發(fā)明制備的單分散性的磁性豬脾鐵蛋白的選區(qū)電子衍射(SAED)圖。圖6是本發(fā)明制備的單分散性的磁性豬脾鐵蛋白在漲時的的飽和等溫剩磁獲得曲線和退磁曲線圖以及Wohlfarth-Cisowski檢測和Henkel圖。
具體實施例方式本方法在原材料的獲得和仿生礦化的條件方面大大地改善和提高，而且發(fā)明了非常有效的后期分離技術(shù)可以獲得無磁相互作用的單體磁性鐵蛋白。本發(fā)明使用肉食動物的下水廢料提純大量的天然鐵蛋白作為原料，經(jīng)過還原去核獲得空殼鐵蛋白再作為仿生合成磁性鐵蛋白的模板。然后通過控制體外合成的條件在蛋白殼內(nèi)部形成磁鐵礦或者磁赤鐵礦顆粒。最后經(jīng)過合成后的純化工藝，使得制備的磁性動物鐵蛋白具有粒徑均一、單分散性和無磁相互作用的特點。此外，本發(fā)明的優(yōu)點還在于天然鐵蛋白來源廉價，可以大量提取自肉食動物體內(nèi)，因此具有很好的生物相容性好，且無免疫原性，將來在動物醫(yī)學(xué)中有更重要的用途。本發(fā)明制備的磁性鐵蛋白具有完整的動物鐵蛋白殼和磁性納米顆粒核，核的直徑可在1納米到8納米之間，取決于在合成過程中所加的鐵原子數(shù)，在水以及極性溶劑中具有可分散性和溶解性。核的成分為磁鐵礦(Fe53O4)或者磁赤鐵礦(Y-Fe2O3)。本發(fā)明制備動物磁性鐵蛋白材料的方法，包括純化天然鐵蛋白、還原去核制備空殼鐵蛋白、以空殼鐵蛋白為模板、通過仿生合成的方法，在其內(nèi)部形成磁性納米顆粒，然后經(jīng)過分離純化所得到的單分散和無磁相互作用的磁性動物鐵蛋白。本發(fā)明的技術(shù)方案主要有以下三點1)以提純動物鐵蛋白。其中動物來源為豬、牛、羊和家禽等傳統(tǒng)肉食動物屠宰后剩余的大量下水，例如脾臟、肝臟等。經(jīng)攪拌磨漿后，超聲破碎組織細(xì)胞，在70-75°C熱變性 10-15分鐘，過濾離心去除雜蛋白，再經(jīng)過鎳柱和分子篩層析分離出單體天然鐵蛋白。2)天然鐵蛋白還原去核為空殼鐵蛋白。這一過程需要在酸性條件下，巰基乙酸作為還原劑。緩沖液要事先充分除氧。為避免蛋白聚合體降解，逐步加入還原劑，且以鐵蛋白溶液由黃色全部變?yōu)榘咨磻?yīng)終止。將還原后的鐵蛋白經(jīng)分子篩分離獲得單體鐵蛋白作為合成磁性鐵蛋白的模板。透射電鏡結(jié)果顯示這還原后的鐵蛋白仍保持完整的籠型結(jié)構(gòu)，沒有明顯的鐵核。
3)以亞鐵鹽和合適比例的氧化劑(雙氧水)加入空殼鐵蛋白的溶液中反應(yīng)，通過控制!^e (II)/H2O2的摩爾比例在彡2 1條件下來保證合成礦物相單一(磁鐵礦)，同時控制PH值、溫度、鐵蛋白濃度等反應(yīng)條件，不破壞蛋白殼的籠型結(jié)構(gòu)，在空殼動物鐵蛋白內(nèi)部形成強磁性的納米顆粒。本發(fā)明所采用的亞鐵鹽主要包括硫酸亞鐵銨、硫酸亞鐵、氯化亞鐵等水溶性亞鐵鹽，所采用的氧化劑為雙氧水(H2O2)?？刂芇H值可在7. 1-11之間選擇，優(yōu)選pH = 8-8. 5。 其中控制溫度可在25-70°C之間選擇，其中優(yōu)選37°C-65°C之間溫度。其中反應(yīng)的蛋白濃度可在lmg/ml > P > 0. 25mg/ml之間選擇。依據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物鐵含量的要求來設(shè)置每次加入反應(yīng)溶液后的亞鐵原子數(shù)與蛋白分子數(shù)之比，每個蛋白分子最多可容納5000多個鐵原子。在上述合適的反應(yīng)條件下，空殼鐵蛋白內(nèi)部能形成粒度均一的!^e3O4或者Y -Fe2O3納米顆粒。4)將合成后的磁性動物鐵蛋白通過進一步的排阻層析進行分離后可以得到單分散的和無磁相互作用的磁性鐵蛋白顆粒。其中的排阻層析所用的介質(zhì)可以是^^11虹0^ 4B 或者是superose 6，使用的緩沖溶液是0. 025MTris-HCl (pH = 7. 25)緩沖溶液，流速設(shè)為 0. 25ml/min。通過透射電鏡觀測和能譜分析分離得到的產(chǎn)物為分散性好，無聚集的磁鐵礦顆粒。通過低溫磁學(xué)的剩磁曲線的Wohlfarth-Cisowski檢測顆粒間無磁相互作用。以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述。實施例1在厭氧手套箱中用除去氧氣的水分別配置25mM的硫酸亞鐵銨50ml，8. 34mM的 H2O2 50ml, IOOmM NaCl溶液和50mM的NaOH 100ml，將純化后的空殼豬脾鐵蛋白溶液(圖 2)用IOOmM NaCl溶液稀釋為50ml體積，蛋白終濃度為0. 25mg/ml，放入到反應(yīng)杯中。首先用電熱套將反應(yīng)杯中的蛋白溶液加熱到65°C，加熱時加入攪拌子用磁力快速攪拌保證溶液溫度均勻，溫度恒定15min后用50mM的NaOH通過恒定pH滴定儀將蛋白溶液的pH值調(diào)節(jié)到8. 5，然后通過自動加液器按照97. 6μ Ι/min的速度向蛋白溶液中加入硫酸亞鐵銨和 H2O2各2. M5ml，最終鐵蛋白的含鐵量為2300個鐵原子。然后將合成后的磁性豬脾鐵蛋白通過分子篩層析，電泳檢查各個蛋白峰對應(yīng)的蛋白質(zhì)種類，收集單體鐵蛋白峰，濃縮得到單分散性的磁性豬脾鐵蛋白。圖1為提純獲得的天然豬脾鐵蛋白的透射電鏡(TEM)的負(fù)染照片，由圖1可知天然鐵蛋白由完整的蛋白殼和內(nèi)部鐵核兩部分組成，也存在少量的空殼鐵蛋白。圖3是所得磁性豬脾鐵蛋白核的透射電鏡照片，由圖可知核的平均粒徑為4. Onm。圖 5是磁性豬脾鐵蛋白的選區(qū)電子衍射圖，由圖可知磁性豬脾鐵蛋白核的成分為磁鐵礦。圖6 是該磁性豬脾鐵蛋白在漲時的飽和等溫剩磁獲得曲線和飽和等溫剩磁退磁曲線所建立的 Wohlfarth-Cisowski檢測和Henkel圖，由圖可知通過分離得到的磁性豬脾鐵蛋白不存在磁相互作用，在200mT就能達(dá)到飽和表明磁性豬脾鐵蛋白核的成分為磁鐵礦。實施例2將純化后的空殼豬脾鐵蛋白溶液用除氧后的IOOmM NaCl溶液稀釋到50ml，放入到反應(yīng)杯中。最終蛋白濃度在lmg/ml，首先用電熱套將反應(yīng)杯中的蛋白溶液加熱到37°C， 加熱時加入攪拌子用磁力快速攪拌保證溶液溫度均勻，溫度恒定15min后用50mM的NaOH 通過恒定PH滴定儀將蛋白溶液的pH值調(diào)節(jié)到8. 5，然后通過自動加液器按照97. 6 μ 1/min 的速度向蛋白溶液中加入硫酸亞鐵銨和H2A各2. M5ml，最終鐵蛋白的含鐵量為2300個鐵原子。其余操作均同實施例1。圖4為分子篩分離前的呈聚集狀態(tài)的磁性豬脾鐵蛋白的透射電鏡(TEM)負(fù)染照片。
權(quán)利要求
1.一種動物磁性鐵蛋白材料，具有完整的動物鐵蛋白殼和磁性納米顆粒核，核的直徑在1納米到8納米之間，在水以及極性溶劑中具有可分散性和溶解性；核的成分為磁鐵礦或者磁赤鐵礦；通過下述方法得到1)將動物下水磨漿后過濾離心去除雜蛋白，再經(jīng)過鎳柱和分子篩層析分離出單體天然鐵蛋白；2)酸性條件下將天然鐵蛋白還原去核為空殼鐵蛋白；3)以雙氧水為氧化劑加入空殼鐵蛋白的溶液中反應(yīng)，反應(yīng)條件!^(11)/ 的摩爾比例為彡2 LpH= 7. 1-11，溫度為25-70°C合成動物磁性鐵蛋白；4)將合成的動物磁性動物鐵蛋白進行分離后得到單分散的和無磁相互作用的動物磁性鐵蛋白顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物磁性鐵蛋白材料，其中，每個動物鐵蛋白殼內(nèi)的磁性納米顆粒數(shù)在100-5000。
3.一種制備權(quán)利要求1所述動物磁性鐵蛋白材料的方法，主要步驟為1)將動物下水?dāng)嚢枘{后超聲破碎組織細(xì)胞，熱變性過濾離心去除雜蛋白，再經(jīng)過鎳柱和分子篩層析分離出單體天然鐵蛋白；2)酸性和無氧條件下將天然鐵蛋白還原去核為空殼鐵蛋白，透析后層析分離獲得單體天然空殼鐵蛋白；3)以雙氧水為氧化劑加入空殼鐵蛋白的溶液中反應(yīng)合成動物磁性鐵蛋白，控制亞鐵原子數(shù)與蛋白分子數(shù)比為10-200，i^e(II)/H202的摩爾比例為彡2 1，pH = 7. 1-11，溫度為 25-70 0C ；4)將合成后的動物磁性鐵蛋白通過排阻層析進行分離后得到單分散的和無磁相互作用的磁性鐵蛋白顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟1中的動物下水為家畜和家禽的脾臟和肝臟。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟2中的還原去核采用巰基乙酸為還原劑的乙酸鈉緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟3中的pH= 8-8. 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟3中的溫度為37-65°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟3中的亞鐵是來自硫酸亞鐵銨、硫酸亞鐵、氯化亞鐵中的一種或幾種的水溶性亞鐵鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，排阻層析所用的介質(zhì)是^^1!虹0^4B或者是 superose 6，使用的緩沖溶液是0. 025-0· 045M Tris-HCl，pH = 7. 25的緩沖溶液，流速為 0.25-0. 45ml/min。
全文摘要
一種動物磁性鐵蛋白材料，具有完整的動物鐵蛋白殼和磁性納米顆粒核，核的直徑在1納米到8納米之間，在水以及極性溶劑中具有可分散性和溶解性；核的成分為磁鐵礦或者磁赤鐵礦；通過下述方法得到1)將動物下水磨漿后過濾離心去除雜蛋白，再經(jīng)過鎳柱和分子篩層析分離出單體天然鐵蛋白；2)酸性條件下將天然鐵蛋白還原去核為空殼鐵蛋白；3)以雙氧水為氧化劑加入空殼鐵蛋白的溶液中反應(yīng)，反應(yīng)條件Fe(II)/H2O2的摩爾比例為≥2∶1，pH＝7.1-11，溫度為25-70℃合成動物磁性鐵蛋白；4)將合成的動物磁性動物鐵蛋白進行分離后得到單分散的和無磁相互作用的動物磁性鐵蛋白顆粒。本發(fā)明還提供了制備方法。
文檔編號C07K14/79GK102464715SQ201010541069
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月10日
發(fā)明者曹長乾, 潘永信, 田蘭香 申請人:中國科學(xué)院地質(zhì)與地球物理研究所