專利名稱：高純度混合脫氧核苷酸鈉的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及脫氧核苷酸鈉的制備方法。
背景技術：
將DNA酶解，可獲得含脫氧腺苷酸鈉(dAMP，2Na)、脫氧鳥苷酸鈉(dGMP，2Na)、脫氧胞苷酸鈉(dCMP，2Na)、脫氧胸苷酸鈉(dTMP，2Na)等4種脫氧核苷酸鈉產品(以下簡稱混合脫氧核苷酸鈉)。DNA可從小牛胸腺或魚的精巢中提取?；旌厦撗鹾塑账徕c具有增進骨髓造血功能，對放療、化療過程引起的白細胞減少有良好療效，以及還有提高機體免疫等作用。在工業(yè)生產中，用于酶解DNA的5’-磷酸二酯酶(或核酸酶)，往往含有少量磷酸單酯酶、脫氨酶等雜酶，因此在DNA酶解溶液中會含有少量脫氧核苷以及dAMP、dGMP脫氨后形成的dIMP (脫氧肌苷酸)、dXMP (脫氧黃嘌呤核苷酸)等雜質，以及DNA原料和酶所帶入的蛋白質和色素等雜質。目前，在文獻商業(yè)部臟器生化制藥情報中心站編著的《動物生化制藥學》人民衛(wèi)生出版社1981年2月中，所述的方法是，將酶解液過濾或離心，然后稀釋約1倍，調pH8. 5 左右上陰離子交換柱，水洗后直接用0. 2N鹽酸溶液洗脫，從pH2. 5時開始收集，到pHO. 5為止。此方法缺陷是脫氧核苷和脫氧核苷酸類雜質、蛋白質和色素等未能有效去除，致使其最終成品含量只能達到75%。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種高純度混合脫氧核苷酸鈉的制備方法，以克服現(xiàn)有技術存在的上述缺陷。本發(fā)明的方法，包括如下步驟(1)將酶解液通過裝有經再生處理的兩根串聯(lián)連接的陰離子交換樹脂1號柱和2 號柱上樣，使混合脫氧核苷酸鈉被吸附在陰離子交換樹脂上；所述的陰離子交換樹脂為強堿性陰離子交換樹脂，優(yōu)選的為201X8、711、717、 HZ201、Dowex-U Dowex_2或Amberlite-IRA_400，可采用市售產品，如上海樹脂廠、上海華震公司和美國Dow chemical等公司的產品；所述的酶解液可采用上述文獻商業(yè)部臟器生化制藥情報中心站編著的《動物生化制藥學》人民衛(wèi)生出版社1981年2月中，報道的方法進行制備；其中脫氧腺苷酸鈉(dAMP，2Na)、脫氧鳥苷酸鈉(dGMP，2Na)、脫氧胞苷酸鈉 (dCMP，2Na)、脫氧胸苷酸鈉(dTMP，2Na)等4種脫氧核苷酸鈉產品(以下簡稱混合脫氧核苷酸鈉)的總的重量含量為50 60%，其余為脫氧核苷、dXMP、dIMP、蛋白質、色素和無機鹽等雜質；術語“再生處理”，指的是用酸或堿浸泡并用純水(或去離子水)洗滌，再生處理可采用文獻商業(yè)部臟器生化制藥情報中心站編著的《動物生化制藥學》人民衛(wèi)生出版社1981年2月報道的方法，為一種常規(guī)的方法，也可根據(jù)產品說明書規(guī)定的方法進行處理；(2)然后用蒸餾水通入1號柱，洗至2號柱出口流出液的pH為7. 0 9. 0左右，再用酸通入1號柱，洗柱，洗至2號柱出口流出液的pH為3. 0-3. 5，此時，即可將柱上各種脫氧核苷雜質洗盡；所述的酸為0. 0001 0. 001mol/L的鹽酸、0. 001 0. 01mol/L的甲酸或0. 001 0. 02mol/L 的醋酸；(3)然后用氯化鈉和酸的混合溶液通入1號柱，并將經過2號柱的流出液全部通入裝填有活性炭的3號柱吸附；

所述的活性炭為型號為769或G15，可采用上海活性炭廠等市售的產品；所述的氯化鈉和酸的混合溶液為重量濃度為0. 1 0. 5%的氯化鈉-0. 001 0. 01mol/L甲酸的混合溶液、重量濃度為0. 1 0. 5%的氯化鈉-0. 001 0. 02mol/L醋酸的混合溶液或重量濃度為0. 1 0. 5% -0. 0001 0. 001mol/L鹽酸的混合溶液；當1號柱出口流出液中，dGMP含量低于0. 5g/L時，所述的氯化鈉和酸的混合溶液改用重量濃度為0. 6 1 %的氯化鈉-0. 001 0. 02mol/L的甲酸的混合溶液、重量濃度為0. 6 1 %的氯化鈉-0. 001 0. 02醋酸的混合溶液或重量濃度為0. 6 1 %的氯化鈉-0. 0001 0. OOlmol/L鹽酸的混合溶液直接通入2號柱進行洗脫，2號柱流出液全部上 3號炭柱吸附，直至2號柱流出液中，脫氧核苷酸的濃度濃度低于0. 1 0. 5g/L ；此時dIMP、dXMP等脫氧核苷酸、蛋白質、色素等雜質大都吸附在1號柱上；(4)用蒸餾水洗滌3號柱，水的體積用量為3號柱體積的3 5倍，然后再用氨乙醇溶液洗脫，氨乙醇溶液的體積用量為3號柱體積的3 5倍，收集氨乙醇溶液洗脫液中脫氧核苷酸鈉濃度高于20g/L，且HPLC大于98% (HPLC歸一法)的部分，然后減壓濃縮至混合脫氧核苷酸鈉的重量濃度為15 20%，超濾，冷凍干燥，得到成品；氨乙醇溶液的組分和重量濃度如下氨水4 6%體積濃度為95 %的乙醇 45 55 %水余量由此，便可獲得高純度的幾乎只含dAMP，2Na、dGMP, 2Na、dCMP, 2Na和dTMP，2Na的
混合脫氧核苷酸鈉產品。產品含量檢測，采用高效液相色譜外標法測定，具體操作為精密稱取樣品約 0. 1000g(精確至0. OOOlg)，用蒸餾水溶解并稀釋定容至250mL，搖勻使成為每mL約含 400 μ g的溶液。色譜柱選用Shim-packVP-0DS(4. 6X 150mm)，流動相為0. 05mmol/L乙酸銨溶液(pH 5. 5)，流速lml/min，于254nm波長，用紫外檢測器檢測。計算公式為
含量(%)= 52^lxd-,!) XlQ0%Sl 產品峰面積S2 標準品峰面積Wl 產品重量
W2:標準品重量rl 產品水分r2 標準品水分本發(fā)明采用串聯(lián)組合、階段洗脫等措施，能夠有效的去除脫氧核苷、dIMP、dXMP、蛋白質和色素，提高了層析分離效果，獲得了幾乎只含4中脫氧核苷酸鈉的并具有穩(wěn)定比例高純度產品，其各種脫氧核苷酸鈉的比例為dAMP，2Na 29. 0 士 1 % ；dCMP，2Na 21. 0 士 1 % ； dTMP，2Na :24士 1 % ；dGMP, 2Na :26士 1 %，并接近于文獻J. η.達維生編寫的《核酸的生物化學》科學出版社出版所述天然原料所含比例。
具體實施例方式實施例1將500gDNA溶于50L蒸餾水中，用鹽酸調pH5. 4左右，升溫至90°C加熱10分鐘，冷至71°C，加入5’ -磷酸二酯酶IOg (8000單位/g酶活，酶先用蒸餾水調成糊狀，72°C保溫8 分鐘。反應3小時，即可升溫至90°C保溫10分鐘(滅活5’-磷酸二酯酶)停止反應，將溶液冷卻至40°C以下后調節(jié)pHIO，過濾去除蛋白等雜質，獲得酶解溶液，備用。其中混合脫氧核苷酸鈉的重量含量為50 60% ；準備層析柱3根，分別為1號裝有4L HZ-201陰樹脂、2號裝有4LHZ-201陰樹脂、3 號裝有5L769活性炭，采用文獻商業(yè)部臟器生化制藥情報中心站編著的《動物生化制藥學》 人民衛(wèi)生出版社1981年2月報道的方法，對1號和2號進行再生處理；然后將反應過濾液通過1號和2號串聯(lián)柱，上樣結束后，用2倍柱體積蒸餾水洗柱，洗至2號柱出口流出液的pH為7. 0 8. 0，再用0. 01mol/L醋酸溶液通入1號柱洗柱， 洗至2號柱出口流出液的pH為3. 5，此時，即可將柱上各種脫氧核苷雜質洗盡；然后用氯化鈉和酸的混合溶液通入1號柱洗脫，并將2號柱流出液全部通入裝填有活性炭的3號柱吸附；所述的氯化鈉和酸的混合溶液為重量濃度為0. 5%的氯化鈉-0. 01mol/L醋酸的混合溶液；當1號柱出口流出液中，dGMP含量低于0.5g/L時，改用重量濃度為的氯化鈉-0. 01mol/L的醋酸的混合溶液直接通入2號柱進行洗脫，2號柱流出液全部上3號炭柱吸附，直至2號柱流出液中，脫氧核苷酸鈉的濃度低于0. 5g/L ；斷開2號和3號柱，用4倍體積蒸餾水洗滌3號柱，再用氨乙醇溶液洗脫(3%氨水 50%的體積濃度95%乙醇47%蒸餾水)，收集脫氧核苷酸鈉濃度高于20g/L，且HPLC大于 98% (重量)的部分，合并后脫氧核苷酸鈉用6!1101/1氫氧化鈉調節(jié)？!17.0 8.5，混合后減壓濃縮至脫氧核苷酸鈉重量濃度為20%，超濾，冷凍干燥，得到成品約250克，經HPLC檢測，含量 98. 8%，其中 dAMP，2Na :29. 5% ；dCMP,2Na 20. 7% ；dTMP,2Na 23. 7% ；dGMP,2Na 26. 1%。實施例2與實施例1同樣方法獲得酶解液，備用。其中混合脫氧核苷酸鈉的重量含量為 50 60% ；準備層析柱3根，分別為1號裝有4L 711陰樹脂、2號裝有4L711陰樹脂、3號裝有5L G15活性炭；再生處理同實施例1。 將反應過濾液通過1號和2號串聯(lián)柱上樣；上樣結束后，用2倍柱體積蒸餾水洗柱，洗至2號柱出口流出液的pH為7. 0 8. 0，再用0. OOlmol/L鹽酸溶液通入1號柱洗柱， 洗至2號柱出口流出液的pH為3. 0，此時，即可將柱上各種脫氧核苷雜質洗盡；然后用氯化鈉和酸的混合溶液通入1號柱洗脫，并將2號柱流出液全部通入裝填有活性炭的3號柱吸附；所述的氯化鈉和酸的混合溶液為重量濃度為0. 5%氯化鈉-0. 001mol/L鹽酸溶的混合溶液；當1號柱出口流出液中，dGMP含量低于0.5g/L時，改用重量濃度為氯化鈉-0. 001N鹽酸的混合溶液直接通入2號柱進行洗脫，2號柱流出液全部上3號炭柱吸附， 直至2號柱流出液中，脫氧核苷酸鈉濃度低于0. 5g/L ；斷開2號和3號柱，3號柱用4倍體積蒸餾水洗滌，再用氨乙醇溶液洗脫(3%氨水 50 %的95 %乙醇47 %蒸餾水)，收集脫氧核苷酸鈉的濃度高于20g/L，且HPLC大于98 % (重量)的部分，混合后減壓濃縮至脫氧核苷酸鈉的重量濃度為20%，超濾，冷凍干燥，得到成品約 220 克，經 HPLC 檢測，含量 99. 0%，其中 dAMP，2Na 29. l%;dCMP,2Na 20. 8%;dTMP, 2Na 23. 8% ；dGMP，2Na :26· 3%0
權利要求
1.高純度混合脫氧核苷酸鈉的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將酶解液通過裝有經再生處理的兩根串聯(lián)連接的陰離子交換樹脂1號柱和2號柱上樣；(2)然后用水通入1號柱，洗至2號柱出口流出液的pH為7.O 9. 0，再用酸通入1號柱，洗柱，洗至2號柱出口流出液的pH為3. 0-3. 5 ；(3)然后用氯化鈉和酸的混合溶液通入1號柱，并將2號柱的流出液通入裝填有活性炭的3號柱；(4)用水洗滌3號柱，然后再用氨乙醇溶液洗脫，收集氨乙醇溶液洗脫液中脫氧核苷酸鈉濃度高于20g/L，且HPLC大于98%的部分，然后減壓濃縮，超濾，冷凍干燥，得到成品。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的陰離子交換樹脂為強堿性陰離子交換樹脂。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的陰離子交換樹脂為201X8、711、 717、HZ201、Dowex-l、Dowex-2 或 Amberlite-IRA-400。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的酸為0.0001 0. 001mol/L 的鹽酸、0. 001 0. 01mol/L 的甲酸或 0. 001 0. 02mol/L 的醋酸。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的氯化鈉和酸的混合溶液為重量濃度為0. 1 0. 5%的氯化鈉-0. 001 0. 01mol/L甲酸的混合溶液、重量濃度為0. 1 0.5%的氯化鈉-0. 001 0. 02mol/L醋酸的混合溶液或重量濃度為0. 1 0. 5% -0. 0001 0. 001mol/L鹽酸的混合溶液。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，當1號柱出口流出液中，dGMP含量低于 0. 5g/L時，所述的氯化鈉和酸的混合溶液改用重量濃度為0. 6 1 %的氯化鈉-0. 001 0. 02mol/L的甲酸的混合溶液、重量濃度為0. 6 1 %的氯化鈉-0. 001 0. 02醋酸的混合溶液或重量濃度為0. 6 1 %的氯化鈉-0. 0001 0. 001mol/L鹽酸的混合溶液直接通入2 號柱進行洗脫，2號柱流出液全部上3號炭柱吸附，直至2號柱流出液中，脫氧核苷酸的濃度濃度低于0. 1 0. 5g/L。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，用蒸餾水洗滌3號柱，水的體積用量為3號柱體積的3 5倍，然后再用氨乙醇溶液洗脫，氨乙醇溶液的體積用量為3 號柱體積的3 5倍，收集氨乙醇溶液洗脫液中脫氧核苷酸鈉濃度高于20g/L，且HPLC大于 98%的部分，然后減壓濃縮至混合脫氧核苷酸鈉的重量濃度為15 20%。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，氨乙醇溶液的組分和重量濃度如下氨水4 6%體積濃度為95 %的乙醇 45 55 %水余量。
9.根據(jù)權利要求1 8任一項所述的方法，其特征在于，所述的酶解液中，脫氧腺苷酸鈉、脫氧鳥苷酸鈉、脫氧胞苷酸鈉和脫氧胸苷酸鈉總的重量含量為50 60%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高純度混合脫氧核苷酸鈉的制備方法，包括如下步驟(1)將酶解液通過裝有經再生處理的兩根串聯(lián)連接的陰離子交換樹脂1號柱和2號柱上樣；(2)然后用水通入1號柱，洗至2號柱流出液的pH為7.0～9.0，再用酸通入1號柱，洗至2號柱流出液的pH為3.0-3.5；(3)然后用氯化鈉和酸的混合溶液通入1號柱，并將2號柱的流出液通入裝填有活性炭的3號柱；(4)用水洗滌3號柱，再用氨乙醇溶液洗脫，收集洗脫液中脫氧核苷酸鈉濃度高于20g/L，且HPLC大于98％的部分，濃縮，超濾，冷凍干燥，得到成品。本發(fā)明通過串聯(lián)組合，階段洗脫等手段，可獲得幾乎只含4種脫氧核苷酸鈉的并具有穩(wěn)定比例高純度產品。
文檔編號C07H1/06GK102382150SQ20101027374
公開日2012年3月21日 申請日期2010年9月6日 優(yōu)先權日2010年9月6日
發(fā)明者曹靜, 邱志云, 邱蔚然 申請人:南通秋之友生物科技有限公司, 江蘇秋之友核酸藥物工程技術研究中心有限公司