專利名稱：一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的制備方法，具體涉及一種雙向電泳烏賊墨囊全 蛋白樣品的制備方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)組分析是研究墨囊中蛋白質(zhì)的自身變化及周圍環(huán)境刺激相應(yīng)的重要技術(shù) 手段，有利于深入了解其對墨囊發(fā)育及功能完善的作用，達到控制墨囊發(fā)生的目的。要順 利開展墨囊蛋白質(zhì)組學(xué)研究，關(guān)鍵技術(shù)之一是墨囊組織中蛋白質(zhì)樣品的制備。公開號為 CN101260146，名稱為一種蘋果屬植物蛋白質(zhì)雙向電泳方法的發(fā)明專利申請，公開了將蘋果 材料在液氮中研碎，加入_20°C預(yù)冷的含10%的三氯乙酸和0. 07%的β巰基乙醇的丙酮溶 液中勻漿，-20°C下放置1小時，然后離心，重復(fù)6次將沉淀物中加入4倍體積的含有0. 07% 的β巰基乙醇的丙酮溶液，-20°C下放置1小時，離心，最后得到蛋白質(zhì)樣品，對蛋白質(zhì)樣品 進行等電聚焦電泳和垂直凝膠電泳的雙向電泳分析。由于烏賊墨囊中雜質(zhì)成份復(fù)雜，如色 素、多糖和核酸等都可干擾雙向電泳過程，因此目前還沒有制備雙向電泳烏賊墨囊全蛋白 樣品的研究報道，所以未發(fā)現(xiàn)烏賊墨囊全蛋白的雙向電泳分析的研究，從而導(dǎo)致烏賊墨囊 相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究滯后。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的制備方 法，該方法可以有效去除烏賊墨囊中色素、多糖和核酸等干擾雙向電泳過程的雜質(zhì)，為烏賊 墨囊全蛋白雙向電泳創(chuàng)造了條件，為烏賊墨囊相關(guān)的蛋白質(zhì)研究打下了基礎(chǔ)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣 品的制備方法，包括下述步驟1)將液氮研磨的墨囊粉末溶于_20°C預(yù)冷的含質(zhì)量百分濃度為10%的三氯乙 酸和0. 02%的二硫蘇糖醇的丙酮溶液中，所述墨囊粉末與所述丙酮溶液的質(zhì)量體積比為 1 10-20，在-20°C條件下靜置1小時，然后在4°C，IOOOOg條件下離心，得到首次沉淀物；2)上述首次沉淀物用質(zhì)量濃度為75%的酒精清洗后，在4°C，IOOOOg條件下再次 離心，得到再次沉淀物；3)將上述再次沉淀物在4°C條件下干燥，然后加入裂解液，所述裂解液含有濃度 為7mo 1 /L的尿素，2mo 1 /L硫脲，40mmo 1 /L三羥甲基氨基甲烷，6mmo 1 /L 二硫蘇糖醇，Immo 1 /L 的苯甲基黃酰氟，lmmol/L的乙二胺四乙酸二鈉，40g/L的3_[3_(膽酰胺丙基)二甲氨基] 丙磺酸內(nèi)鹽，750ug/L的亮肽素，5ml/L的兩性電解質(zhì)，所述裂解液與所述墨囊粉末的體積 質(zhì)量比為2-4 1，在4°C條件下靜置1小時，然后在4°C，10000g條件下離心4小時，收集 上清液得到烏賊墨囊全蛋白粗提液；4)在上述烏賊墨囊全蛋白粗提液中加入水化上樣緩沖液，所述水化上樣緩沖液含 有濃度為7mol/L的尿素，2mol/L硫脲，6mmol/L 二硫蘇糖醇，40g/L的3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，5ml/L的兩性電解質(zhì)，10g/L的溴酚藍，混合均勻得到烏賊墨囊全蛋 白雙向電泳樣品液，其中每300u 1烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液中含有300-350ug烏賊
墨囊全蛋白。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的制備方 法，通過丙酮溶液去除色素、多糖和核酸等雜質(zhì)使墨囊粉末全蛋白沉淀分離，用酒精清洗掉 丙酮，然后用裂解液裂解和提取蛋白，再用水化上樣緩沖液稀釋，得到烏賊墨囊全蛋白雙向 電泳樣品液，且每300ul烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液中含有300-350ug烏賊墨囊全蛋 白；該方法可以有效去除烏賊墨囊中色素、多糖和核酸等干擾雙向電泳過程的雜質(zhì)，為烏賊 墨囊全蛋白雙向電泳創(chuàng)造了條件，為烏賊墨囊相關(guān)的蛋白質(zhì)研究打下了基礎(chǔ)，且該方法簡 單易行，快速，具有較大的實際應(yīng)用價值。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。實施例1一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的制備方法，稱取液氮研磨的墨囊粉末Ig溶 于IOml經(jīng)-20°c預(yù)冷的含質(zhì)量百分濃度為10%的三氯乙酸和0. 02%的二硫蘇糖醇的丙酮 溶液中，在-20°C條件下靜置1小時，然后在4°C，IOOOOg條件下離心，得到首次沉淀物；將 上述首次沉淀物用質(zhì)量濃度為75%的酒精清洗后，在4°C，IOOOOg條件下再次離心，得到再 次沉淀物；將上述再次沉淀物在4°C條件下干燥，然后加入2ml裂解液，裂解液中含有濃度 為7mol/L的尿素，2mol/L硫脲，40mmol/L三羥甲基氨基甲烷，6mmol/L 二硫蘇糖醇，lmmol/ L的苯甲基黃酰氟，lmmol/L的乙二胺四乙酸二鈉，40g/L的3_[3_(膽酰胺丙基)二甲氨 基]丙磺酸內(nèi)鹽，750ug/L的亮肽素，5ml/L的兩性電解質(zhì)，在4°C條件下靜置1小時，然后 在4°C，IOOOOg條件下離心4小時，收集上清液得到烏賊墨囊全蛋白粗提液；在上述烏賊 墨囊全蛋白粗提液中加入水化上樣緩沖液，水化上樣緩沖液中含有濃度為7mol/L的尿素， 2mol/L硫脲，6mmol/L 二硫蘇糖醇，40g/L的3_[3_(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽， 5ml/L的兩性電解質(zhì)，10g/L的溴酚藍，混合均勻得到烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液，其 中每300ul烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液中含有300-350ug烏賊墨囊全蛋白。實施例2一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的制備方法，與實施例1基本相同，所不同的 只是-20°C預(yù)冷的含質(zhì)量百分濃度為10%的三氯乙酸和0. 02%的二硫蘇糖醇的丙酮溶液 為20ml，裂解液為4ml。實施例3一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的制備方法，與實施例1基本相同，所不同的 只是-20°C預(yù)冷的含質(zhì)量百分濃度為10%的三氯乙酸和0. 02%的二硫蘇糖醇的丙酮溶液 為15ml，裂解液為3ml。
權(quán)利要求
一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的制備方法，其特征在于包括下述步驟1)將液氮研磨的墨囊粉末溶于-20℃預(yù)冷的含質(zhì)量百分濃度為10％的三氯乙酸和0.02％的二硫蘇糖醇的丙酮溶液中，所述墨囊粉末與所述丙酮溶液的質(zhì)量體積比為1∶10-20，在-20℃條件下靜置1小時，然后在4℃，10000g條件下離心，得到首次沉淀物；2)上述首次沉淀物用質(zhì)量濃度為75％的酒精清洗后，在4℃，10000g條件下再次離心，得到再次沉淀物；3)將上述再次沉淀物在4℃條件下干燥，然后加入裂解液，所述裂解液含有濃度為7mol/L的尿素，2mol/L硫脲，40mmol/L三羥甲基氨基甲烷，6mmol/L二硫蘇糖醇，1mmol/L的苯甲基黃酰氟，1mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉，40g/L的3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，750ug/L的亮肽素，5ml/L的兩性電解質(zhì)，所述裂解液與所述墨囊粉末的體積質(zhì)量比為2-4∶1，在4℃條件下靜置1小時，然后在4℃，10000g條件下離心4小時，收集上清液得到烏賊墨囊全蛋白粗提液；4)在上述烏賊墨囊全蛋白粗提液中加入水化上樣緩沖液，所述水化上樣緩沖液含有濃度為7mol/L的尿素，2mol/L硫脲，6mmol/L二硫蘇糖醇，40g/L的3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，10g/L的溴酚藍，5ml/L的兩性電解質(zhì)，混合均勻得到烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液，其中每300ul烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液中含有300-350ug烏賊墨囊全蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的制備方法，通過丙酮溶液去除色素、多糖和核酸等雜質(zhì)讓墨囊粉末全蛋白沉淀分離，用酒精清洗掉丙酮，然后用裂解液裂解和提取蛋白，再用水化上樣緩沖液稀釋，得到烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液，且每300ul烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液中含有300-350ug烏賊墨囊全蛋白；該方法可以有效去除烏賊墨囊中色素、多糖和核酸等干擾雙向電泳過程的雜質(zhì)，為烏賊墨囊全蛋白雙向電泳創(chuàng)造了條件，為烏賊墨囊相關(guān)的蛋白質(zhì)研究打下了基礎(chǔ)，且該方法簡單易行，快速，具有較大的實際應(yīng)用價值。
文檔編號C07K14/435GK101886991SQ20101019629
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者宋微微, 母昌考, 王春琳, 詹萍萍 申請人:寧波大學(xué)