專利名稱：通過在多個單體與特異性結(jié)合單體的粘合體的重復(fù)鏈的復(fù)合物中增加鍵橋的產(chǎn)量以生產(chǎn) ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從基于增加產(chǎn)量的單體中制備二聚體和多聚體的方法。為了達到此目的，通過使用特異性結(jié)合單體的親和域的重復(fù)鏈來生產(chǎn)重復(fù)鏈-多個單體復(fù)合物，并利用復(fù)合物中單體之間很容易形成單體間鍵橋的事實來生產(chǎn)多聚體。即，本發(fā)明涉及，通過使用重復(fù)鏈作為骨架以最大化地形成重復(fù)鏈-多個單體復(fù)合物，以及通過在形成的重復(fù)鏈-多個單體復(fù)合物中的單體之間增加單體間二硫鍵橋的形成，以制造大量二聚物和多聚體的方法。
背景技術(shù)：
抗體毒素是通過將毒素添加到特異性結(jié)合癌細胞的抗體而產(chǎn)生的(Pastan I.等，醫(yī)學(xué)年度評論(Annu Rev Med.) 58 (2007) 221-237)。 單克隆抗體(MAb)、B3結(jié)合在結(jié)腸、胃、卵巢、乳房或肺癌的表面上過度表達的糖類抗原(LeY) (L. H. Pai等，美國科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad Sci U SA) 88 (1991) 3358-3362 ;I. Pastan 等，癌癥研究(Cancer Res.) 51 (1991) 3781-3787)。PE38是假單胞菌屬外毒素(PE)的一種衍生物(J. Hwang等，細胞(Cell). 48 (1987) 129-136 ；V. K. Chaudhary 等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem) 265 (1990) 16306-16310)。Fab, 一種具有抗體的抗原結(jié)合部分的片段，包括Fd鏈(VH和CHl)和輕鏈(VL和CL)。Fab抗體毒素也包括Fd鏈(VH和CHl)和輕鏈(VL和CL)。Fab-毒素與單鏈Fv(scFv)-毒素相比具有兩個優(yōu)勢。第一，F(xiàn)ab-毒素的產(chǎn)量比scFv-毒素高10倍(J. Buchner 等，生物技術(shù)(Biotechnology) (NY). 9 (1991) 157-162 ；J. Buchner 等，生物技術(shù)(Biotechnology) 10 (1992) 682-685)。第二，F(xiàn)ab-毒素的穩(wěn)定性在小鼠血衆(zhòng)中得到改善(M. Choe 等，癌癥研究(Cancer Res.) 54 (1994) 3460-3467)。據(jù)報道由單體間二硫鍵橋形成的二價Fab-毒素二聚體比單價scFv-毒素具有更高的細胞毒性(S. H. Choi等，韓國化學(xué)學(xué)會公報(Bull. Kor. Chem.Soc.) 22 (2001) 1361-1365 ；J. H. Park 等，分子細胞(Mol Cells) 12 (2001) 398-402 ；M. H. Yoo等，微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志(Microbiol. Biotechnol.) 16(2006) 1097-1103)。二硫化二聚體由兩個Fab-毒素單體的單體內(nèi)不配對(counterpartless)半胱氨酸(cys)殘基的二硫鍵來形成。單體內(nèi)不配對半胱氨酸殘基位于Fab-毒素單體的Fab域和PE38之間。預(yù)期二聚體(二價的)抗體-毒素比單體(單價的)抗體-毒素具有更大的優(yōu)勢。例如，其具有更高的活動性，因為二聚體的兩個抗原結(jié)合域提高了結(jié)合強度。而且，因為兩個毒素域同時被二價二聚體的抗體毒素轉(zhuǎn)移到靶細胞，有可能二價二聚體的抗體毒素可以用比單價單體的抗體毒素更高的細胞毒性殺滅祀細胞。并且，F(xiàn)ab-毒素具有比scFv-毒素更高的穩(wěn)定性，后者經(jīng)常用于生產(chǎn)重組抗體-毒素(D. Rothlisberger等，分子生物學(xué)雜志(J Mol Biol)347 (2005)773-789)。[B3 (Fab)-ext_PE38]2，B3 (Fab) _ext_PE38 單體的二硫鍵，可以通過將單克隆抗體B3的Fab域和假單胞菌屬外毒素A的衍生物PE38進行融合來形成(KR10-0566091)，而且據(jù)報道，當在CRL-1739胃癌培養(yǎng)細胞系上檢測時，[B3 (Fab)-ext-PE38]2具有比B3 (Fab)-ext-PE38高11倍的細胞毒性(J. H. Park等.分子細胞(MolCells) 12(2001)398-402)。通常，二硫鍵連接的二聚體在重折疊后純化(S.H.Choi等，韓國化學(xué)學(xué)會公報(Bull. Kor. Chem. Soc. )22(2001) 1361-1365 J. H. Park 等，分子細胞(MolCells) 12 (2001) 398-402 ；M. H. Yoo 等，微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志(J. Microbiol.Biotechnol.) 16(2006) 1097-1103)。在以前的報道中，二硫鍵連接的二聚體的重折疊過程得到約0. 0149T0. 25%的產(chǎn)量。在重折疊過程中，這些二硫化二聚體通過位于兩個單體的抗體-毒素的Fab域和PE38之間的單體內(nèi)不配對半胱氨酸殘基的隨機接近而形成。盡管二硫鍵二聚體的產(chǎn)量通過重折疊過程的改進得到提高，但考慮到Fab-毒素的產(chǎn)量，二聚體的產(chǎn)量非常低，在重折疊過程期間主要生產(chǎn)的分子達到近10%。由于抗體毒素單體不具有在互相之間自身結(jié)合的親和力，鍵橋連接的二聚體通過在重折疊過程期間抗體-毒素單體的單體內(nèi)不配對半胱氨酸殘基之間的隨機碰撞而產(chǎn)生。即，單體內(nèi)不配對半胱氨酸殘基之間碰 撞頻率低導(dǎo)致在重折疊過程期間，在單體的接近的半胱氨酸殘基之間形成單體間二硫鍵橋的效率不高，因此在重折疊過程期間產(chǎn)生的二聚體的產(chǎn)量非常低。因此，發(fā)明人嘗試了各種方法以生產(chǎn)二硫鍵連接的二聚體，其包括用于通過氧化-氧化、氧化-還原的再循環(huán)和化學(xué)交聯(lián)劑由抗體-毒素單體生產(chǎn)二硫鍵二聚體的方法，但是使用這些方法，二聚體的產(chǎn)量沒有改善。因此，在尋找能生產(chǎn)更多[B3 (Fab) -ext_PE38]2，即其中單體B3 (Fab) -ext_PE38為二硫鍵連接的二聚體的方法時，發(fā)明人構(gòu)建了重復(fù)鏈，該重復(fù)鏈為重組蛋白，其中鏈球菌蛋白G的Fab結(jié)合域重復(fù)兩次以上，同時以該鏈為骨架，生產(chǎn)了 Fab-毒素多聚體復(fù)合物，該復(fù)合物上同時結(jié)合有多個單體抗體-毒素。在以前的研究中，據(jù)報道蛋白G的第三域(域III)能夠結(jié)合IgG的Fab片段，而且Fab片段的CHl域?qū)τ诘鞍譍的域具有高的結(jié)合親和力(J.P.等，自然(Nature) 359 (1992) 752-754)。當與重折疊過程比較時，本發(fā)明的重復(fù)鏈具有如下優(yōu)勢單體抗體-毒素顯示出對重復(fù)鏈的域的高結(jié)合親和力。在這方面，單體抗體-毒素的局部濃度在由重復(fù)鏈產(chǎn)生的重復(fù)鏈-多個單體復(fù)合物中很高。提高的局部濃度帶來每個單體抗體-毒素的單體內(nèi)不配對半胱氨酸殘基中的高碰撞頻率且加速了單體之間二硫鍵形成。因此，有可能生產(chǎn)大量的單體間二硫鍵橋連接的二聚體。本發(fā)明重復(fù)鏈類似作用的典型實例為通過酶反應(yīng)動力學(xué)中的鄰近效應(yīng)使酶反應(yīng)速率提高(NicholasC. Price 和 Lewis Stevens,酶學(xué)基礎(chǔ)(Fundamentals of Enzymology),第三版.牛津大學(xué)出版社)。結(jié)果，發(fā)明人通過將重復(fù)鏈與單體抗體-毒素簡單混合能夠容易地制備抗體-毒素多聚體復(fù)合物，并證實通過復(fù)合物中單體抗體-毒素的單體內(nèi)不配對半胱氨酸殘基的氧化和還原更替反應(yīng)，以加速在Fab域和PE38之間的半胱氨酸殘基的二硫鍵形成來生產(chǎn)大量的[B3 (Fab) -ext-PE38]2,從而完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供由單體之間具有單體間鍵橋的單體大量生產(chǎn)多聚體的方法，使用單體-特異性親和域的重復(fù)鏈為骨架以連接單體并以重復(fù)鏈-多個單體復(fù)合物的形式大量生產(chǎn)多聚體復(fù)合物，并且在重復(fù)鏈-多個單體復(fù)合物中的單體之間形成單體間橋鍵，且與生產(chǎn)單體間橋鍵連接的多聚體的低產(chǎn)量常用方法相比，本發(fā)明通過每個單體中的單體內(nèi)不配對半胱氨酸殘基之間提高的碰撞頻率，以及隨后單體之間的單體間二硫鍵橋的有利形成，提供了較高的和最大化的多聚體的生產(chǎn)方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供生產(chǎn)單體間鍵橋連接的多聚體的方法，其包括以下步驟I)制備特異性結(jié)合單體的親和域的重復(fù)鏈；2)通過將步驟I)的重復(fù)鏈與單體混合制備重復(fù)鏈與單體的重復(fù)鏈/多個單體復(fù)合物；和3)分離多聚體，所述多聚體中單體間的鍵橋形成于步驟2)的重復(fù)鏈/多個單體復(fù)合物中的單體之間。
在二聚體形成的該方法的一個實施方案中，其中抗體-毒素單體通過二硫鍵橋連接，抗體-毒素單體的單體間二硫鍵橋二聚體的產(chǎn)量增加至通常報道的重折疊方法的產(chǎn)量的約208倍，因此二聚體的形成產(chǎn)量得到很大提高。本發(fā)明生產(chǎn)的二聚體比以前報道的單體抗體-毒素具有更高的抗原結(jié)合強度、更高的細胞毒性和更高的穩(wěn)定性，并且具體地顯示出比胃癌細胞系高約11倍的細胞毒性。因此，二聚體的大量生產(chǎn)可以有效地用于癌癥治療藥劑的開發(fā)。


圖I示出生產(chǎn)具有本發(fā)明鍵橋的多聚體的方法的示意圖；圖2示出試驗結(jié)果，其中本發(fā)明的純化蛋白使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠確定，其中圖2A示出試驗結(jié)果，其中蛋白G的重組重復(fù)鏈蛋白與SDS-樣品緩沖液混合，混合物在還原的16%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行分析，其中編號1-7的泳道分別為TRf TR7 ;和圖2B示出根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的B3 (Fab)-ext_PE38 (單體)和[B3 (Fab) -ext-PE38]2( 二聚體)抗體-毒素分子的分析結(jié)果，在非還原的8%SDS_聚丙烯酰胺凝膠中，其中每個箭頭從頂端開始依次表示[B3 (Fab) -ext_PE38]2、B3 (Fab) _ext_PE38和B3 (Fd) -ext-PE38 (由于(H6-B3 (L)具有很小的分子量(即約25kDa)，因此在圖中無法看到);和圖3示出通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠，對在B3 (Fab) _ext_PE38和TRl TR7蛋白的復(fù)合物中形成的[B3 (Fab)-ext-PE38]2進行分析的結(jié)果，其中圖3A示出完成以下步驟后得到的結(jié)果將蛋白復(fù)合物樣品(每份IOg)結(jié)合到金屬螯合的瓊脂糖珠(泳道I);在室溫下使用40mM 2-巰基乙醇還原樣品30分鐘(泳道2);在37°〇使用5mM氧化的谷胱甘肽型的GSSG氧化蛋白復(fù)合物2小時(泳道3);用非還原的8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離1/2的樣品，其中從頂端開始每個閉合箭頭表示[B3 (Fab) -ext-PE38]2、B3 (Fab) _ext_PE38 和 B3 (Fd) _ext_PE38，開放箭頭表示來源于復(fù)合物的TR蛋白；和圖3B示出用還原的12%SDS_聚丙烯酰胺凝膠分離其余1/2樣品的結(jié)果，其中兩個箭頭表示B3(Fd)-eXt-PE38(頂部)和H6-B3(L)(底部)。箭頭的頭指示來源于復(fù)合物的TR蛋白(由于TRl蛋白(分子量為8kDa)太小而無法在圖中顯示出來)。
具體實施例方式下面通過參考附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案進行詳細的描述，將會更加清楚地理解本發(fā)明的特點和優(yōu)勢。首先注意的是，基于發(fā)明人可以適當?shù)囟x術(shù)語的概念，從而最好地說明其發(fā)明的這一原則，此處所使用的術(shù)語和單詞應(yīng)理解為對應(yīng)于本發(fā)明技術(shù)主旨的含義或概念。而且，應(yīng)理解與本發(fā)明相關(guān)的熟知的功能和結(jié)構(gòu)的詳細描述將被省略，從而不會不必要地模糊本發(fā)明的重點。下面詳細描述本發(fā)明。本發(fā)明的目的是生產(chǎn)大量的由單體間鍵橋形成的多聚體，以及提供提高鍵橋連接的多聚體產(chǎn)量的方法，其通過使用特異性結(jié)合單體的親和域的重復(fù)鏈為骨架，并產(chǎn)生重復(fù)鏈與單體的復(fù)合物，從而增加復(fù)合物鏈上單體的局部濃度，增加單體之間的碰撞頻率并促進單體間鍵橋的形成。 盡管鍵橋連接的多聚體通過單體間的鍵橋連接多個單體而產(chǎn)生，但是所產(chǎn)生的鍵橋連接的多聚體的量取決于鍵橋如何有效地形成。對于體內(nèi)使用的物質(zhì)，用于形成多聚體的橋鍵優(yōu)選為共價鍵，以使得多聚體不分解為單體并且保持多聚體在體內(nèi)的穩(wěn)定性。為了形成共價鍵橋，需要在形成化學(xué)官能團的橋鍵之間接觸。然而，蛋白中化學(xué)官能團的尺寸與蛋白大分子的總體尺寸相比非常小。因此，當大分子在反應(yīng)溶液中自由移動時，小化學(xué)官能團互相接觸的可能性很低且多聚體的大量形成幾乎是不可能的，除非存在能大大增加官能團接觸的方法。為了增加單體之間鍵橋的形成，本發(fā)明制備特異性結(jié)合單體的親和域的重復(fù)鏈并將多個單體與重復(fù)鏈結(jié)合，使單體之間的距離在幾納米之內(nèi)，或者數(shù)十納米或數(shù)百納米之內(nèi)，其為分子尺寸的規(guī)模。因此，單體不能在溶液中自由移動。即，單體被固定在有限的空間并通過在分子尺寸的空間內(nèi)移動而互相接觸。在這種條件下，在多個單體結(jié)合其上的每個重復(fù)鏈上單體的局部濃度非常高。因此，結(jié)合的單體之間的接觸頻率顯著增加，并且能夠形成鍵橋的化學(xué)官能團之間的接觸也增加。因此，多聚體的形成顯著增加。本發(fā)明的目的不僅包括連接蛋白的二硫共價鍵橋，而且包括連接有機化合物單體、生物分子或蛋白或任何其它蛋白的包括酰胺鍵、酯鍵、糖苷鍵或醚鍵的共價鍵。共價鍵橋可以是最優(yōu)選的鍵橋以增加多聚體穩(wěn)定性，但不限于此。即，當用鍵橋如離子鍵形成多聚體時，仍可以使用本發(fā)明的概念。另外，當通過在單體之間插入連接鏈，從而在單體之間形成橋，從而產(chǎn)生單體-連接鏈-單體結(jié)構(gòu)而形成多聚體時，本發(fā)明的概念可用于改進單體的形成效率(Greg T. Hermanson,生物共軛技術(shù)(Bioconjugate Techniques),學(xué)院出版社公司，1995;Wong S. S.,蛋白共輒和交聯(lián)化學(xué)(Chemistry of Protein Conjugation andCross-Linking). CRC 出版社公司,1991)。更具體地，本發(fā)明的方法可優(yōu)選地包括下面的步驟，但不限于此I)制備特異性結(jié)合單體的親和域的重復(fù)鏈；2)通過將步驟I)的重復(fù)鏈與單體混合制備重復(fù)鏈和單體的重復(fù)鏈/多個單體復(fù)合物；和3)分離多聚體，所述多聚體中鍵橋形成于步驟2)的重復(fù)鏈/多個單體復(fù)合物中的單體之間，但不限于此。根據(jù)所述方法，單體和步驟I)的特異性結(jié)合單體的親和域可優(yōu)選地來源于蛋白，但不限于此。即，在其之間具有特異性結(jié)合親和力的所有種類的分子都可以用作單體和親和域。例如，蛋白和對其具有特異性結(jié)合親和力的小的有機化合物可以用作根據(jù)本發(fā)明方法的單體和親和域。根據(jù)上文所解釋的方法，制備特異性結(jié)合單體的親和域的重復(fù)鏈(步驟I)可包括制備親和域的重復(fù)鏈，其同在鏈上而具有不同的結(jié)合親和力。因此，可以制備異-二聚體和異-多聚體，其中不同單體被特異性結(jié)合至不同的親和域。
根據(jù)上文所解釋的方法，在步驟I)中，蛋白單體和其上的具有特異性結(jié)合單體的親和力的蛋白域可優(yōu)選地來源于蛋白的天然形式，但不限于此。即，如果重組單體對配對物具有特異性結(jié)合的親和力，則所述單體可用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明方法的具有鍵橋的多聚體。編碼蛋白的基因信息的DNA片段可優(yōu)選地通過使用正向和反向引物對，由染色體DNA或由表達蛋白的有機體mRNA進行PCR克隆來制備，但不限于此。根據(jù)上文所解釋的方法，步驟3)中的鍵橋不僅可包括連接蛋白的二硫共價鍵橋，而且包括連接有機化合物單體、生物分子或蛋白的包括酰胺鍵、酯鍵、糖苷鍵或醚鍵的共價鍵。然而，這并不局限于此，并且多聚體可以由離子鍵形成。根據(jù)上文所解釋的方法，步驟I)中的重復(fù)鏈可以通過包括下面步驟的方法制備，但不限于此I)通過重復(fù)克隆DNA片段制備具有重復(fù)的結(jié)合親和力蛋白域的構(gòu)建體(construct),所述DNA片段在表達載體中編碼親和域和與親和域連接的連接子(linker)；2)通過用步驟I)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細胞制備轉(zhuǎn)化體；和3)培養(yǎng)步驟2)的轉(zhuǎn)化體，采用層析法分離和純化所表達的重復(fù)鏈蛋白，但不限于此。所述構(gòu)建體可以優(yōu)選地具有其中親和域在重復(fù)鏈中重復(fù)3次以上的結(jié)構(gòu)，但不限于此。關(guān)于所述構(gòu)建體，親和域可以由連接子連接，并且GGGGS可以用作G4S連接子，但不限于此。連接子可以延伸至,例如GGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS，但不限于此。G4S連接子具有非常靈活的結(jié)構(gòu)(R. Arai等，Protein Eng 14(2001)529-532)。根據(jù)本發(fā)明，通過用NdeI和EcoRI切割編碼親和域和連接子的DNA片段，并在用相同酶切割的PCWl的載體部分上克隆該片段來制備質(zhì)粒pTRl。用NdeI和BspEI再次切割編碼親和域和pTRl的G4S連接子的DNA片段，以制備編碼親和域和作為其連接子的一個G4S的DNA片段的226bp的DNA片段；通過將制備的片段克隆到大的載體片段上而制備質(zhì)粒PTR2，所述大的載體片段是通過用NdeI和AgeI切割質(zhì)粒pTRl而獲得的。重復(fù)7次上述克隆方法，從而制備質(zhì)粒pTR7，其中pTR7具有親和域被重復(fù)7次的構(gòu)建體(見表I)。在轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli)BL21 (DE3)后蛋白被過度表達，使用螯合瓊脂糖凝膠快速流動層析和尺寸-排阻層析進行分離和純化。根據(jù)所述方法，步驟2)的單體具有特異性結(jié)合親和域的結(jié)合序列(B)。關(guān)于步驟2)的重復(fù)鏈-多個單體復(fù)合物的形成，有可能制備由不同單體制成的異二聚體和異多聚體，每個不同單體通過使用具有不同結(jié)合特異性的親和域的重復(fù)鏈，而特異性結(jié)合每個不同的親和域。根據(jù)所述方法，優(yōu)選地，單體間不配對半胱氨酸對于從步驟2)的多個單體的復(fù)合物制備二硫鍵橋多聚體是必需的，但不限于此。即，不同種類的化學(xué)交聯(lián)劑可以用于單體之間的鍵橋，以及不配對半胱氨酸之間的二硫鍵橋。如果單體具有任何用于鍵橋的不配對半胱氨酸，優(yōu)選地，其中包括一個不配對半胱氨酸，但不限于此。根據(jù)所述方法，步驟2)的單體可以用于通過使用擴展序列(Ext)將單體與功能性蛋白連接來制備新的種類的單體。根據(jù)所述方法，功能性蛋白可包括所有生物化合物，如酶、毒素(功能性的)蛋白或病毒、具有藥物活性的藥物化合物、官能團如脂質(zhì)體、生物傳感器或前體藥物。擴展序列(Ext)連接單體和功能性蛋白，以融合單體和功能性蛋白，且擴展序列(Ext)可包括不配對半胱氨酸，但不限于此。不配對半胱氨酸在兩個單體之間被氧化并形成二硫鍵橋；因此，形成了二聚體。而且，擴展序列(Ext)包括二硫鍵橋二聚體形成的最后一 個不配對半胱氨酸與異官能團(F)之間的柔性氨基酸序列(Fix)。優(yōu)選地，柔性序列(Fix)由包括不是大體積氨基酸的GASQEND氨基酸(即甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸)的序列組成，但不限于此。根據(jù)所述方法，優(yōu)選地，步驟2)的混合通過與單體混合并在3飛。C孵育過夜且在35 40°C孵育f 2小時來實施。更優(yōu)選地通過在4°C孵育過夜且在37°C孵育I小時來實施，但不限于此。根據(jù)所述方法，步驟3)的復(fù)合物的固定優(yōu)選地通過將結(jié)合重復(fù)鏈的單體的蛋白復(fù)合物固定在金屬螯合瓊脂糖珠上來實施，但不限于此。當?shù)鞍讖?fù)合物固定在所述珠上時，其優(yōu)選地在10°c實施I小時，但不限于此。根據(jù)所述方法，關(guān)于鍵橋的形成，鍵橋-異多聚體可以通過在異-多個單體的復(fù)合物中的不同單體之間形成鍵橋來制備，所述異-多個單體的復(fù)合物由具有不同結(jié)合特異性的親和域的重復(fù)鏈形成。根據(jù)所述方法，步驟3)的鍵橋可以通過采用各種現(xiàn)有方法形成(GregT. Hermanson,生物共輒技術(shù)(Bioconjugate Techniques).學(xué)院出版社公司，1995;WongS. S.,蛋白共輒和交聯(lián)化學(xué)(Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking),CRC出版社公司，1991)。如果使用二硫鍵橋，不配對半胱氨酸的官能團首先被還原。該還原優(yōu)選地通過將蛋白復(fù)合物添加到含有2-巰基乙醇的還原緩沖溶液中來實施，但不限于此。即，對于所述還原，用于單體的半胱氨酸殘基完全還原的2-巰基乙醇的添加量優(yōu)選為2(T40mM，但不限于此。根據(jù)所述方法，如果使用二硫鍵橋來形成步驟3)的鍵橋，則具有二硫鍵橋的多聚體通過每個單體的還原的半胱氨酸殘基的氧化來產(chǎn)生。單體之間的氧化優(yōu)選地通過將還原的蛋白復(fù)合物添加到含有谷胱苷肽氧化型(GSSG)氧化緩沖溶液中來實施，但不限于此。在本發(fā)明中，蛋白復(fù)合物的還原優(yōu)選地通過在室溫下添加其中加入了 2-巰基乙醇的Tris-HCl (pH8. 2)來實施，但不限于此。還原的蛋白復(fù)合物優(yōu)選地用含有MOPS(pH6. 5)的緩沖溶液洗滌，但不限于此。用Tris-HCl (pH8. 2)再洗滌復(fù)合物3次；加入含有GSSG和Tris-HCl (pH8. 2)的氧化緩沖溶液，用于氧化；將其在37°C下孵育2小時。根據(jù)所述方法，孵育的溫度和時間優(yōu)選地分別為37°C和2小時，但不限于此。
根據(jù)所述方法，優(yōu)選地，采用SDS-PAGE (SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析步驟3)的鍵橋多聚體，但不限于此。通常用于蛋白分離和純化的所有方法都可以使用。根據(jù)所述方法，步驟3)的多聚體優(yōu)選為二聚體，其中單體通過二硫鍵連接，但不限于此。單體可以是以“結(jié)合域(B)-擴展序列(Ext)-功能性蛋白(F) ”形式的融合蛋白分子。如果擴展序列包括不配對半胱氨酸，則在兩個結(jié)合域(B)-擴展序列(Ext)-功能性蛋白(F)分子的不配對半胱氨酸之間形成二硫鍵橋；因此，二聚體以[結(jié)合域(B)-擴展序列(Ext)-功能性蛋白(F)]2的形式形成。為了完成本發(fā)明，發(fā)明人使用具有作為單體靶結(jié)合域⑶的抗體的Fab蛋白片段的抗體-毒素，作為“結(jié)合域(B)-擴展序列(Ext)-功能性蛋白(F) ”形式的單體和鏈球菌蛋白G的Fab結(jié)合域，該結(jié)合域作為與抗體-毒素的Fab域具有特異性結(jié)合親和力的親和域。含有抗體Fab片段作為其部分的所有種類的抗體分子(抗體衍生的分子單體)都可以用作單體以及抗體-毒素形式的單體。為了最大化地形成具有單體間二硫鍵橋的二聚體([抗體 衍生的分子單體]2)，制備重組重復(fù)鏈蛋白，其中鏈球菌蛋白G的Fab結(jié)合域重復(fù)2次以上，并且所制備的蛋白用作制備[抗體衍生的分子單體]2的骨架。更具體地，將重復(fù)鏈和抗體衍生的分子單體蛋白混合，以制備重組重復(fù)鏈-抗體衍生的分子單體的復(fù)合物，其中很多抗體單體結(jié)合到具有非共價鍵的一個重組鏈蛋白上，且抗體單體的半胱氨酸殘基經(jīng)還原和氧化，以形成半胱氨酸殘基的二硫鍵，其位于Fab片段和抗體衍生的分子單體的毒素之間，因此制備了 [抗體衍生的分子單體]2。為了比較基于本發(fā)明和基于以前的重折疊方法的[抗體衍生的分子單體]2的形成水平，本發(fā)明的發(fā)明人采用SDS-PAGE并通過測量SDS-PAGE帶的密度，分析了 [抗體衍生的分子單體]2的產(chǎn)量，結(jié)果是基于本發(fā)明的[抗體衍生分子單體]2的產(chǎn)量明顯高于所報道的基于重折疊方法實施的產(chǎn)量。即，[抗體衍生的分子單體]2的產(chǎn)量范圍為結(jié)合重組重復(fù)鏈蛋白的全部抗體衍生的分子單體的36%-52%，其中鏈球菌蛋白G的Fab結(jié)合域重復(fù)2次以上。因此，可確定該產(chǎn)量范圍比現(xiàn)有重折疊方法所報道的產(chǎn)量高約144-208倍。因此，可確定來源于結(jié)合的抗體衍生的分子單體的二硫鍵橋二聚體可以使用蛋白G的Fab結(jié)合域的重復(fù)鏈來形成，而且重復(fù)鏈的使用大幅度增加了 [抗體衍生的分子單體]2的形成。通過使用蛋白G的Fab結(jié)合域的重復(fù)鏈和其與抗體分子單體的結(jié)合特異性，簡單的還原和氧化能夠產(chǎn)生大量的[抗體衍生的分子單體]2。另外，本發(fā)明提供了編碼特異性結(jié)合單體的親和域的重組重復(fù)鏈蛋白表達的基因構(gòu)建體。本發(fā)明制備了編碼蛋白G的域III (Fab結(jié)合域)的重組重復(fù)鏈蛋白的基因構(gòu)建體。重組重復(fù)鏈蛋白優(yōu)選地包括在兩個Fab結(jié)合域之間的一個連接子，G4S (GGGGS)，但不限于此。重組重復(fù)鏈蛋白優(yōu)選地具有其中蛋白G的域III (Fab結(jié)合域)重復(fù)3_7次的結(jié)構(gòu)，但不限于此。而且，本發(fā)明提供了包括基因構(gòu)建體的表達載體。表達載體優(yōu)選地連接到期望的特定核酸序列的基因上，所述核酸序列具有用于控制基因向mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯為蛋白的信息，以提供所期望的蛋白的良好表達并增加蛋白形成的可能性。
而且，本發(fā)明提供了由宿主細胞中的表達載體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體。將表達載體誘導(dǎo)進入宿主細胞是通過適合的方法之ー實施的，其包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、結(jié)合(conjugation)、原生質(zhì)體融合、電穿孔、磷酸I丐沉淀或直接微注射。宿主細胞可以是原核或真核細胞。優(yōu)選真核細胞。真核細胞是哺乳動物的細胞，如CHO細胞。這些細胞優(yōu)選為在正確位置提供正確折疊的細胞或者為在產(chǎn)生蛋白后包括糖基化的轉(zhuǎn)化蛋白分子的細胞，但不限于此。本發(fā)明證實了使用重組重復(fù)鏈蛋白作為骨架，[抗體衍生的分子単體]2能夠由抗體衍生的分子單體大量生產(chǎn)，其中鏈球菌蛋白G的Fab結(jié)合域在重組重復(fù)鏈蛋白中重復(fù)3-7次。因此，具有特異性結(jié)合親和力的親和域的重復(fù)鏈可以用于改進單體之間ニ聚體和多聚體的形成。而且，編碼這些重復(fù)鏈的基因構(gòu)建體、包括基因構(gòu)建體的表達載體和用表達載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體對于抗體衍生的分子単體之間的鍵橋多聚體的大量形成是非常有用的。 [參考文獻]I. Pastan I.等，醫(yī)學(xué)年度評論(Annu Rev Med. ) 58 (2007) 221-2372. L. H. Pai 等，美國科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A) 88 (1991) 3358-33623. Pastan I.等，癌癥研究(Cancer Res. ) 51 (1991) 3781-37874. J. Hwang 等，細胞(Cell) 48 (1987) 129-1365. V. K. Chaudhary 等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem) 265 (1990) 16306-163106. J. Buchner 等，生物技術(shù)(Biotechnology) (N Y). 9 (1991) 157-1627. J. Buchner 等，生物技術(shù)(Biotechnology) 10 (1992) 682-6858. M. Choe 等，癌癥研究(Cancer Res. ) 54 (1994) 3460-34679. S. H. Choi 等，韓國化學(xué)學(xué)會公報(Bull. Kor. Chem. Soc.) 22 (2001) 1361-136510. J. H. Park 等，分子細胞(Mol Cells) 12 (2001) 398-40211. M. H. Yoo等，微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志(J. Microbiol.Biotechnol.) 16(2006) 1097-1103I2. D. Rothlisberger 等，分子生物學(xué)雜志(J Mol Biol) 347 (2005) 773-78913.韓國專利 No. 10-056609114. Nicholas C. Price 和 Lewis Stevens.酶學(xué)基礎(chǔ)(Fundamentals ofEnzymology),第3版.牛津大學(xué)出版社15. R. Arai 等，Protein Eng 14 (2001) 529-53216. Wong S. S.,蛋白共輒和交聯(lián)化學(xué)(Chemistry of Protein Conjugation andCross-Linking) CRC 出版社公司 1991.17. Greg T. Hermanson,生物共輒技術(shù)(Bioconjugate Techniques).學(xué)院出版社公司199518. T. Brody 等，分析生物化學(xué)(Anal Biochem) 247 (1997) 247-25619. Nienhaus, G. Ulrich.蛋白-配位體的相互作用方法和應(yīng)用(Prote in-ligandinteractions:methods and applicationsノHumana Press, 200520. Farah, R. A 等，Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 8, 321-356，199821. Trail1P. A.等，科學(xué)(Science) 261，212-215，1993
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權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)具有鍵橋的多聚體的方法，所述方法包括以下步驟 1)制備親和域的重復(fù)鏈，所述親和域?qū)误w具有特異性結(jié)合親和力； 2)通過將步驟I)的所述重復(fù)鏈和所述單體混合來制備重復(fù)鏈/多個單體復(fù)合物；和 3)分離多聚體，所述多聚體中鍵橋形成于步驟2)的所述重復(fù)鏈/多個單體復(fù)合物中的所述單體之間。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，包括從特異性結(jié)合單體的親和域的重復(fù)鏈中分離多聚體的步驟，所述多聚體中鍵橋形成于多個結(jié)合在重復(fù)鏈上的單體之間。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，如果所述單體為蛋白，則將重組重復(fù)鏈蛋白與所述單體混合，其中所述重組重復(fù)鏈蛋白中特異性結(jié)合單體的親和域蛋白是重復(fù)連接的，以及分離多聚體，其中所述多聚體中鍵橋形成于所述復(fù)合物中的單體之間，所述復(fù)合物中所述重復(fù)鏈與多個單體相連接。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述重復(fù)鏈為重復(fù)連接的域III的重組重復(fù)鏈蛋白，所述域III為蛋白G的Fab結(jié)合域。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述單體包含抗體、配體、受體或其片段，或其重組體、或其衍生物、或與生物化學(xué)官能團的融合體。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述單體為Fab片段或含有Fab片段。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述生物化學(xué)官能團包括生物化合物，所述生物化合物包括酶、毒素蛋白或病毒，或具有藥物活性的藥物化合物，或包括脂質(zhì)體、生物傳感器或前體藥物的官能團。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述多聚體至少為二聚體。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)多聚體的方法，在多聚體中多個單體通過鍵橋連接，該方法通過制備含有重復(fù)連接的特異性結(jié)合單體的粘合體的重復(fù)鏈，以及通過使用上述物質(zhì)產(chǎn)生重復(fù)鏈/多個單體復(fù)合物(該復(fù)合物由重復(fù)鏈和多個單體產(chǎn)生)，從而有助于復(fù)合物中單體之間鍵橋的形成。更具體地，本發(fā)明涉及生產(chǎn)多聚體的方法，在多聚體中多個單體通過鍵橋連接，該方法通過制備由重復(fù)連接的特異性結(jié)合蛋白單體的粘合蛋白產(chǎn)生的重復(fù)鏈重組蛋白，以及通過使用上述物質(zhì)產(chǎn)生重復(fù)鏈/多個單體復(fù)合物(該復(fù)合物由重復(fù)鏈和多個單體產(chǎn)生)，從而有助于復(fù)合物中單體之間鍵橋的形成。更具體地，本發(fā)明涉及生產(chǎn)多聚體的方法，在多聚體中多個單體通過二硫鍵橋連接，該方法通過制備由重復(fù)連接的特異性結(jié)合蛋白單體的粘合蛋白產(chǎn)生的重復(fù)鏈重組蛋白，以及通過使用上述物質(zhì)產(chǎn)生重復(fù)鏈/多個單體復(fù)合物(該復(fù)合物由重復(fù)鏈和多個單體產(chǎn)生)，從而有助于復(fù)合物中單體之間二硫鍵橋的形成。更具體地，本發(fā)明涉及生產(chǎn)二聚體和多聚體的方法，在二聚體和多聚體中多個單體通過二硫鍵橋連接，該方法通過使用含有由鏈球菌蛋白G的域Ⅲ(Fab結(jié)合域)的重復(fù)連接產(chǎn)生的重組重復(fù)鏈蛋白的骨架，由抗體蛋白的單體產(chǎn)生重復(fù)鏈及其多個單體復(fù)合物，從而有助于復(fù)合物中單體之間二硫鍵橋的形成。本發(fā)明的方法可有利地用于大量生產(chǎn)二硫鍵橋二聚體，因為與現(xiàn)有技術(shù)中已知的重折疊方法相比，其在二硫鍵橋二聚體產(chǎn)量方面提供了高達200倍的改進。
文檔編號C07K1/14GK102770438SQ200980163448
公開日2012年11月7日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月15日
發(fā)明者元哉善, 崔武鉉, 李镕粲 申請人:崔武鉉