專利名稱：新的gpcr蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)蛋白和編碼該蛋白的基因，以及所述蛋白和基因的新用途。具體而言，本發(fā)明涉及新的GPCR多肽、編碼所述多肽的多核苷酸、攜帶所述多核苷酸或者其片段的重組載體、用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明還涉及用于檢測癌癥標(biāo)志物的組合物，所述組合物包含，能測量本發(fā)明GPCR多核苷酸的mRNA或者蛋白表達(dá)水平的試劑；包含所述組合物的、用于診斷癌癥的試劑盒；以及檢測本發(fā)明的GPCR多肽及編碼所述GPCR多肽的基因的方法。此外，本發(fā)明涉及用于治療及預(yù)防癌癥的組合物，其包含抑制編碼本發(fā)明的GPCR多肽的基因表達(dá)的寡核苷酸或抗本發(fā)明GPCR蛋白的抗體；以及篩選本發(fā)明的GPCR的調(diào)節(jié)劑或者癌癥治療劑的方法。
背景技術(shù)：
人類細(xì)胞在其表面存在多種受體。特別是，G-蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled rec印tor，下文簡稱為“GPCR”或者“GPCRs”)是最大的跨膜受體蛋白家族之一。人類基因組內(nèi)存在約30，000個(gè)人類基因，發(fā)現(xiàn)其中多達(dá)1，000個(gè)基因編碼GPCRs。最近，基于對脊椎動(dòng)物基因組所進(jìn)行的研究，已將GPCR分為5類。第一類包含視紫紅質(zhì)受體家族，其包含670種受體蛋白。視紫紅質(zhì)受體家族可以與各種配體反應(yīng)，包括胺(α基團(tuán))、肽(β基團(tuán))、脂類樣物質(zhì)(Y類)、核苷酸和糖蛋白(δ基團(tuán))，并且包含多個(gè)藥物靶受體。第二類為胰泌素受體家族，并具有肽激素的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該家族的受體與穩(wěn)態(tài)有關(guān)，從而成為藥物開發(fā)的重要靶標(biāo)。第三類稱為粘著受體家族，其特征在于具有GPCR蛋白水解位點(diǎn)(GPCR Proteolytic site, GPS)。該家族的GPCR成員的N-末端部分有很多種，人們對其配體的了解非常少，因此還沒開發(fā)靶向該家族GPCR成員的藥物。第四類為谷氨酸(Glutamate)受體家族，其中已經(jīng)鑒定了 22個(gè)GPCR成員。關(guān)于各個(gè)蛋白特異性，了解的相對很少。最后一類為Frizzled/Taste2家族，其包括將Wnt糖蛋白作為配體的10個(gè)Frizzled ；不需要配體的5個(gè)SMO(光滑的)；以及感知各種味道所需的25個(gè)Taste2受體。還基于內(nèi)源配體的鑒定，對包括GPCRs在內(nèi)的受體進(jìn)行分類。受體與已知的內(nèi)源化合物結(jié)合，或者被分類為內(nèi)源配體還未得到鑒定的孤兒受體(orphan receptor)。多種組織及細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)了 GPCRs，并且其與多種不同的生理機(jī)制有聯(lián)系。它們被多種配體激活，例如，諸如促甲狀腺刺激激素(PTH)、促腎上腺皮質(zhì)激素、胰高血糖素以及后葉加壓素等的激素；諸如5-HT、乙酰膽堿(毒蕈堿性AchR)、組織胺等的胺；諸如LPA和 SlP等的脂質(zhì)；以及諸如氨基酸、Ca2+、核酸、肽和光等的信號(hào)遞質(zhì)。GPCRs所發(fā)揮作用的廣泛分布與多樣性，是GPCRs在多種病理學(xué)疾病中發(fā)揮重要的作用證據(jù)。實(shí)際上，已知GPCRs 與多種疾病有關(guān)，包括支氣管收縮、高血壓、糖尿病、炎癥、激素失調(diào)、細(xì)胞死亡、癌癥、神經(jīng)傳遞障礙以及行為障礙等。從而，對于目前而言，GPCRs屬于研發(fā)藥物產(chǎn)品的重要領(lǐng)域。目前可用于藥物研發(fā)的GPCR大約有360多種，其中46種已用于藥物開發(fā)，而可探討剩余的約 320種基因的藥物開發(fā)。推測有約150種孤兒GPCRs (orphan GPCRs，oGPCRs)。在新藥開發(fā)領(lǐng)域中，細(xì)胞膜受體充當(dāng)藥物的選擇性位點(diǎn)，并且占所有藥物靶標(biāo)的50% (Nature Reviews Drug Discovery, 2004. 2008)，尤其是GPCR活性調(diào)控藥物在最頻繁使用的前100名藥物中占30% GOO億美元，總藥物市場的9%)。因此GPCR為新藥開發(fā)的最重要的目標(biāo)(Nature Reviews Drug Discovery,2004,2008) GPCRs具有共同的結(jié)構(gòu)特征。所有的這些受體都具有七個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域的長度為20 30個(gè)氨基酸，并且所述7個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域通過多種長度的氨基酸序列連接。受體具有細(xì)胞外N末端，而C末端則位于細(xì)胞質(zhì)中。GTP-結(jié)合蛋白(G蛋白) 起到下述的媒介作用將通過結(jié)合激素和刺激GPCR的其他化學(xué)配體所生成的信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)子傳遞。配體與GPCR結(jié)合之后，受體的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)域經(jīng)歷能夠使受體與G蛋白相互作用的構(gòu)象變化，這反過來激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)遞質(zhì)，如腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase), 磷脂酶Cbhospholipase C)或者離子通道(ion channel)。這種系統(tǒng)對于一個(gè)配體結(jié)合于GPCR的情況做出反應(yīng)，使得原來的信號(hào)放大至能夠產(chǎn)生較多的次級(jí)遞質(zhì)。細(xì)胞能夠通過該機(jī)制探測它們的外部環(huán)境的變化，并對此做出適當(dāng)反應(yīng)。通常，受體被內(nèi)源配體激活，同時(shí)伴隨構(gòu)像變化，并且能夠?qū)崿F(xiàn)受體和G-蛋白之間的結(jié)合。最近幾年通過研究蛋白之間的相互作用，了解了下述的事實(shí)，即，GPCR與各種蛋白相關(guān)，如含有GRK或者SH2結(jié)構(gòu)域(src homology 2 domain, src同源性2結(jié)構(gòu)域)的蛋白、連接子GA2 (adaptor Grb2)以及參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的G蛋白。在正常條件下，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最終帶來細(xì)胞激活或者細(xì)胞抑制的結(jié)果。在生理環(huán)境下， GPCRs以非活性和活性狀態(tài)的平衡狀態(tài)存在于細(xì)胞膜中。非活性狀態(tài)的受體不能聯(lián)合細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)揮生物反應(yīng)。只有當(dāng)受體的結(jié)構(gòu)變?yōu)榛钚孕问綍r(shí)，受體才能通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(通過G-蛋白)，顯示生物反應(yīng)。通過諸如內(nèi)源配體或者藥物等化合物，受體可以穩(wěn)定為活性形式。從而，關(guān)于克隆這類基因家族以及鑒定它們的新的配體等的功能研究，具有與開發(fā)新的候選藥物相同的意義，其中，新的候選藥物是指如siRNA、抗體、多肽、效應(yīng)子、激動(dòng)劑以及拮抗劑等物質(zhì)。對于生命體而言，生長、分化、穩(wěn)態(tài)、對刺激的反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控、老化以及凋亡等，主要是細(xì)胞內(nèi)選擇特定基因并表達(dá)的結(jié)果，這對于與疾病相關(guān)的細(xì)胞機(jī)制而言是真實(shí)的。尤其，如腫瘤發(fā)生等病理學(xué)現(xiàn)象，是由最終導(dǎo)致基因表達(dá)發(fā)生變化的基因突變誘導(dǎo)的。根據(jù)腫瘤發(fā)生的多種研究，得出下述現(xiàn)象，S卩，諸如染色體雜合性缺失(loss of chromosomal heterozygosity)、癌基因的激活以及包括p53基因在內(nèi)的腫瘤抑制基因的失活等多種基因變化的積累，其結(jié)果就是產(chǎn)生腫瘤(Bishop，J.M.，Cell,64 249-270(1991))。進(jìn)而，報(bào)告指出，10-30%的癌癥是因下述原因發(fā)生的，即癌基因的擴(kuò)增導(dǎo)致癌基因激活，從而發(fā)生癌癥。從而，癌基因的激活對于多種癌癥的病理學(xué)研究而言都是重要的。由此亟需鑒定癌基因并研發(fā)調(diào)控癌基因的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人為鑒定癌基因而付出了努力，結(jié)果導(dǎo)致下述內(nèi)容，從而完成本發(fā)明克隆推斷的孤兒GPCR基因，并且發(fā)現(xiàn)所述基因的超表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。本發(fā)明的目的在于提供由SEQ ID N0:1或者2的氨基酸序列構(gòu)成的GPCR(G Protein Coupled Receptor，G 蛋白偶聯(lián)受體)多肽。
本發(fā)明的另一目的在于提供編碼所述多肽的多核苷酸。本發(fā)明的再一目的在于提供攜帶所述多核苷酸或者其片段的重組載體。本發(fā)明的再一目的在于提供用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的再一目的在于提供代孕母體分娩的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在所述代孕母體的子宮中，植入了所述載體。本發(fā)明的再一目的在于提供用于檢測癌癥標(biāo)志物的組合物，所述組合物包含能測量本發(fā)明GPCR多核苷酸的mRNA或者蛋白表達(dá)水平的試劑。本發(fā)明的再一目的在于提供包含所述組合物的、用于診斷癌癥的試劑盒。本發(fā)明的再一目的在于提供檢測本發(fā)明的GPCR多肽及編碼該GPCR多肽的基因的方法。本發(fā)明的再一目的在于提供用于治療及預(yù)防癌癥的組合物，所述組合物包含抑制編碼本發(fā)明的GPCR多肽的基因表達(dá)的寡核苷酸或者抗本發(fā)明的GPCR蛋白的抗體。本發(fā)明的再一目的在于提供篩選本發(fā)明的GPCR蛋白調(diào)控劑或者癌癥治療劑的方法，所述方法包括用候選化合物處理表達(dá)本發(fā)明的GPCR蛋白的細(xì)胞，并測定GPCR介導(dǎo)的所述蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的增加或者減少。本發(fā)明的新的GPCR基因和GPCR蛋白的功能最初是由本發(fā)明人鑒定的，其可用作抑制癌癥轉(zhuǎn)移或者癌癥自身的靶標(biāo)。并且，通過檢測所述基因或者所述基因編碼的多肽，從而可以診斷是否發(fā)生癌癥疾病。因此，通過使用反義、siRNA或者shRNA來抑制本發(fā)明的新的GPCR基因，從而可望治療或者預(yù)防癌癥的發(fā)作或者轉(zhuǎn)移。進(jìn)而，通過使用攜帶所述基因的載體和容納所述載體的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、具有所述基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從而可以更加具體地確認(rèn)GPCR基因的功能，同時(shí)還可以用作癌癥模型。


在圖1顯示新的GPCR基因(人的hstml基因)同種型1 (isoform 1)和2的可選的轉(zhuǎn)錄變體(A)；通過RT-PCR所測量的新的GPCR基因(hstml基因)在各種人類組織中的表達(dá)水平(B)；新的GPCR基因(hstml基因)在各種人類組織中的相對表達(dá)水平(C)。圖2表示通過RT-PCR (A)和實(shí)時(shí)PCR(B)所測量的GPCR基因(hstml基因)在代表性消化器官和相關(guān)器官的細(xì)胞系中的相對表達(dá)水平；圖2C是通過實(shí)時(shí)PCR所測量的GPCR 基因(hstml基因)在胃癌患者的非腫瘤和腫瘤組織中的表達(dá)水平。在圖3A表示超表達(dá)GPCR基因(hstml基因)的正常細(xì)胞的聚集體的形成以及所述細(xì)胞對接觸抑制(contact inhibition)不敏感性；圖3B表示顯示與對照相比，不同細(xì)胞濃度下，超表達(dá)GPCR基因(hstml基因)的正常細(xì)胞的生長和聚集體形成；圖3C表示與對照相比，超表達(dá)GPCR基因(hstml基因)的正常細(xì)胞的生長速度更快；圖3D表示超表達(dá)GPCR 基因(hstml基因)的正常細(xì)胞的細(xì)胞周期；圖3E表示超表達(dá)GPCR基因(hstml基因)的正常細(xì)胞的錨定非依賴性生長(anchorage-ind印endent growth)的圖片和圖表；圖3F表示在免疫缺陷小鼠的皮下注射超表達(dá)GPCR基因(hstml基因)的正常細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞后， 所述免疫缺陷小鼠中的腫瘤形成。圖4是參與以下途徑的蛋白的蛋白印跡與細(xì)胞生長和腫瘤形成有關(guān)的MAP激酶途徑(A)；和超表達(dá)GPCR基因(hstml基因)的正常細(xì)胞中的抗凋亡途徑(B)。
在圖5A表示根據(jù)cAMP激活劑即毛喉素(forskolin)的濃度，超表達(dá)本GPCR基因(hstml基因)的正常細(xì)胞中cAMP濃度的變化；圖5B是顯示在存在或不存在毛喉素的情況下，在具有或不具有超表達(dá)GPCR基因(hstml基因)的細(xì)胞中的相對CRE (cAMP反應(yīng)元件，cAMPresponse element) -Luc報(bào)告基因分析結(jié)果；圖5C表示p_raf 1基因在瞬時(shí)超表達(dá) GPCR基因(hstml基因)的正常細(xì)胞中的磷酸化；圖5D表示p_raf 1基因在穩(wěn)定地超表達(dá) GPCR基因(hstml基因)的正常細(xì)胞中的磷酸化。在圖6A表示當(dāng)用或不用PTX處理穩(wěn)定地超表達(dá)GPCR基因(hstml基因)的正常細(xì)胞后，所述細(xì)胞的血清反應(yīng)；圖6B表示在存在或不存在PTX的情況下，超表達(dá)GPCR基因 (hstml基因)的正常細(xì)胞對各種生長因子和已知的GPCR配體的反應(yīng)。在圖7A表示IGFI和IGFII的轉(zhuǎn)錄水平以及下游因子即細(xì)胞周期蛋白Dl的表達(dá)水平，IGFI和IGFII在超表達(dá)GPCR基因(hstml基因)的正常細(xì)胞中比在對照中誘導(dǎo)更高的細(xì)胞生長反應(yīng)；圖7B表示在確定細(xì)胞生長的免疫保護(hù)分析之后的蛋白印跡，其中用抗IGFI 和/或抗IGFII抗體處理超表達(dá)GPCR基因(hstml基因)的正常細(xì)胞，以抑制生長因子IFG 所誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；圖7C表示用抗IGFI和/或抗IGFII抗體處理后的細(xì)胞生長的圖片；圖 7D表示用抗IGFI和/或抗IGFII抗體處理之后的細(xì)胞生長的定量WST分析(WST assay) 結(jié)果。在圖8A表示體外結(jié)合分析結(jié)果，其中利用在E. coli中超表達(dá)的His標(biāo)記的GPCR 蛋白(His標(biāo)記的hstml蛋白)，鑒定與GPCR蛋白偶聯(lián)的G蛋白；圖8B表示在瞬時(shí)超表達(dá) GPCR基因(hstml基因)的細(xì)胞中，利用flag標(biāo)記的GPCR(flag-標(biāo)記的hstml)的免疫共沉淀分析(co-immunoprecipitation assay)；圖 8C 表示通過 RNA 干擾(Gail、2、3)所測量的細(xì)胞周期蛋白Dl和SPl/Egrl蛋白與IGFI和IGFII mRNAs量的變化。圖9是顯示GPCR siRNA(hstml siRNA)對胃癌細(xì)胞(A)和肝癌細(xì)胞⑶細(xì)胞細(xì)胞生長的抑制作用；圖9C變示GPCR siRNA (hstml siRNA)對胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞細(xì)胞生長的抑制作用的圖表；在圖10A表示穩(wěn)定地超表達(dá)GPCR基因(hstml基因)的正常細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性；圖10B 表示超表達(dá)GPCR基因(hstml基因)的正常細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力的圖表，是顯示其定量結(jié)果的圖表。
具體實(shí)施例方式由此，作為實(shí)現(xiàn)上述目的的一優(yōu)選形態(tài)，本發(fā)明涉及由SEQ ID NO :3的氨基酸序列構(gòu)成的GPCR(G Protein Coupled Rec印tor，G蛋白偶聯(lián)受體)多肽。本發(fā)明的新的GPCR多肽(下文稱為“本發(fā)明的GPCR多肽”或者“本發(fā)明的GPCR蛋白”)由SEQ ID N0:1或者2的氨基酸序列構(gòu)成，所述氨基酸序列可以由具有SEQ ID NO :3、 4或者5的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄物翻譯。本發(fā)明人研究出了下述內(nèi)容，S卩，所述多肽為GPCR，并且存在兩個(gè)同種型(isoform)，由其三個(gè)轉(zhuǎn)錄變體翻譯而來。并且還觀察到，本發(fā)明的GPCR 多肽的異常超表達(dá)誘導(dǎo)癌癥，從而本發(fā)明的多肽能夠用作治療癌癥或者抑制癌癥轉(zhuǎn)移的靶標(biāo)。優(yōu)選地，本發(fā)明的GPCR蛋白包含所述多肽整體或者一部分片段。優(yōu)選地，所述片段包含至少10個(gè)、20個(gè)、30個(gè)或者40個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少75個(gè)氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選至少100個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選至少150個(gè)氨基酸殘基， 并且所述片段與SEQ ID NO 3的氨基酸序列具有至少50%、優(yōu)選至少60%、70%、80%、更優(yōu)選至少90 %、甚至更優(yōu)選至少95 %、最優(yōu)選至少98 %的同源性。并且，優(yōu)選地，本發(fā)明的 GPCR蛋白由SEQ ID NO :1或者2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白。這些蛋白在人正常組織內(nèi)的表達(dá)水平相當(dāng)不同。同種型1大量存在于睪丸和肺，而在胸腺、骨髓、胰腺等中減少，而與其他組織相比在小腸、心臟、前列腺等中則更少?？梢钥闯觯c其他組織相比，同種型2的表達(dá)水平在睪丸、胰臟、小腸、前列腺中較高(圖1B、1C)。另一方面，本發(fā)明涉及編碼GPCR多肽的多核苷酸。編碼本發(fā)明的GPCR蛋白的多核苷酸(下文稱為“本發(fā)明的GPCR多核苷酸”、“本發(fā)明GPCR基因”)是在人類基因組中存在的基因，其功能最初是由本發(fā)明人鑒定的。所述多核苷酸位于人的一號(hào)染色體的1ρ36. 13中，并且具有多個(gè)可變轉(zhuǎn)錄物(alternative transcript)。轉(zhuǎn)錄物的序列公開于SEQ ID NO :3、4以及5中。SEQ ID NO :3、4或者5的多核苷酸是具有非翻譯區(qū)的cDNA，且最長的轉(zhuǎn)錄物具有約2279個(gè)核苷酸構(gòu)成，同種型1和 2由三種轉(zhuǎn)錄物翻譯而來，在翻譯后修飾之前為分別約30kDa和約23kDa的蛋白。同種型2 缺少同種型1的65個(gè)N-末端氨基酸。所述多核苷酸是編碼發(fā)揮GPCR(G-protein coupled receptor)功能的這兩種蛋白同種型的新基因。所述蛋白不屬于目前所知的任何GPCR類另Ij，換而言之，是孤兒GPCRs。這些受體含有PQ基序(對于將胱氨酸病蛋白(cystinosin) 定位于溶酶體非常關(guān)鍵)。本發(fā)明的GPCR多核苷酸包括能夠編碼本發(fā)明的新的GPCR多肽的所有多核苷酸序列。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠明白下述內(nèi)容考慮到在遺傳密碼的簡并性或者考慮到想要表達(dá)所述多核苷酸的生物中優(yōu)選的密碼子，可以在本發(fā)明多核苷酸的序列內(nèi)進(jìn)行各種修飾，只要所述修飾不改變由編碼區(qū)翻譯的多肽的氨基酸序列。并且，甚至可以在處理編碼區(qū)以外的區(qū)域中，引入各種修飾或改變，至少它們不影響基因的表達(dá)即可。換而言之，可以修飾本發(fā)明的多核苷酸，至少所得多核苷酸具有相同的或功能等同的生物活性，并且它們也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明所包括的本發(fā)明GPCR多核苷酸的變體，與SEQ ID NO 1、2或3的核苷酸序列具有至少70 %、優(yōu)選至少80 %、更優(yōu)選至少90 %、最優(yōu)選至少95 %的核苷酸序列同源性。作為再一優(yōu)選形態(tài)，本發(fā)明涉及攜帶所述多核苷酸或者其片段的重組載體。就本發(fā)明而言，術(shù)語“載體”是指在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中能夠表達(dá)目的蛋白的表達(dá)載體，是包含可操作地連接的基本調(diào)控元件的基因構(gòu)建體，其中，可操作地連接的基本調(diào)控元件使插入的基因得以表達(dá)。優(yōu)選地，將重組載體構(gòu)造為，攜帶編碼本發(fā)明的GPCR蛋白的多核苷酸或者其片段。可以將所述重組載體轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞。并且，本發(fā)明的重組載體還可以通過將本發(fā)明的基因連接(插入)于適當(dāng)?shù)妮d體而獲得。只要能夠在宿主內(nèi)復(fù)制，則對將會(huì)插入本發(fā)明的基因的載體并無特別的限制。例如，可以使用質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA等。具體地，可以用于本發(fā)明的質(zhì)粒DNA的實(shí)例包括如 pcDNA3. 1+(Invitrogen)等商業(yè)質(zhì)粒，除此之外可以使用 pYG601BR322、pBR325、pUC118、 pUC119、pUBllO、pTP5、YEpl3、YEp24、YCp50、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、gtlO、 gtll、ZAP等，另外可以使用如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和痘苗病毒等動(dòng)物病毒和如桿狀病毒等昆蟲病毒，但是能夠用于本發(fā)明的質(zhì)粒并不限于所述實(shí)例。
另外，為了將本發(fā)明的基因?qū)胼d體，可以使用適當(dāng)?shù)南拗泼赶兓腄NA，并插入載體DNA的限制位點(diǎn)或者克隆位點(diǎn)。為了將本發(fā)明的基因可操作地連接于載體，本發(fā)明的載體除了啟動(dòng)子以及本發(fā)明的基因之外，還可以包含順式元件，如增強(qiáng)子、剪接信號(hào)、 Poly A(聚A)添加信號(hào)(poly A addition signal)、選擇標(biāo)記，和核糖體結(jié)合序列。作為另一優(yōu)選形態(tài)，本發(fā)明涉及用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞?？蓪?gòu)造的載體通過轉(zhuǎn)化(或者轉(zhuǎn)染)導(dǎo)入宿主細(xì)胞?？梢允褂萌魏畏椒ㄟM(jìn)行轉(zhuǎn)化。通常，轉(zhuǎn)化方法有以下幾種=CaCl2沉淀法；Hanahan方法，其中聯(lián)合DMSO (dimethyl sulfoxide，二甲基亞砜)，提高CaCl2沉淀法的效率；電穿孔法；磷酸鈣沉淀法；原生質(zhì)融合法；碳化硅纖維介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法；土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法；PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法；硫酸葡聚糖、陽離子脂質(zhì)體(lipofectamine)和干燥/抑制的轉(zhuǎn)化法等。通過如上所述的載體以及采用該載體的轉(zhuǎn)染，能夠?qū)⒕幋a本發(fā)明的GPCR蛋白的基因?qū)胨拗骷?xì)胞內(nèi)。只要能夠表達(dá)本發(fā)明的基因，則對于在本發(fā)明中使用的宿主細(xì)胞沒有特別的限制。并且，對于所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，利用本發(fā)明的癌基因能夠建立可持續(xù)增殖的癌細(xì)胞系是顯而易見的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，將攜帶本發(fā)明的新GPCR基因的載體轉(zhuǎn)染到OTH3T3細(xì)胞中，從而建立瞬間或者穩(wěn)定地超表達(dá)本發(fā)明的GPCR蛋白的細(xì)胞系。作為再一優(yōu)選形態(tài)，本發(fā)明涉及通過將轉(zhuǎn)化有所述載體的宿主細(xì)胞植入代孕母體的子宮所得到的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明的“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”是指，通過重組將編碼新的GPCR多肽的外源多核苷酸序列以人工方式插入動(dòng)物的基因組，從而其至少一部分特征發(fā)生變化的動(dòng)物?？捎糜诋a(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的動(dòng)物的實(shí)例，包括例如有小鼠、大鼠、兔子、豬等哺乳類以及鳥類等，但并不限于所述實(shí)例。優(yōu)選地，可以在受精卵到達(dá)至少8細(xì)胞胚胎之前階段，將編碼本發(fā)明的GPCR蛋白的多肽導(dǎo)入所述受精卵。所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用作表達(dá)所述基因的動(dòng)物模型，例如，可以有效地用作用于篩選調(diào)控、促進(jìn)或者抑制癌基因表達(dá)的試劑或者抗癌劑的疾病模型。只要在所屬技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，任何方法都可以用于制備可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的受精卵。所述方法的實(shí)例包括，顯微注射技術(shù)(microinjection technique)、干細(xì)胞插入技術(shù)(Stem cell insertion technique)、逆轉(zhuǎn)錄病毒插入技術(shù)(retrovirus insertion technique)以及精子介導(dǎo)白勺基因轉(zhuǎn)移技術(shù)(sperm-mediated gene tranfer technique) 等，但并不限于所述實(shí)例。隨后，將轉(zhuǎn)化的受精卵植入代孕母體的子宮，從而可以得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。作為再一優(yōu)選形態(tài)，本發(fā)明涉及用于檢測癌癥標(biāo)志物的組合物，其包含能測量本發(fā)明的GPCR基因在mRNA水平或者蛋白水平上的表達(dá)的試劑。在本發(fā)明中，術(shù)語“標(biāo)志物或者診斷標(biāo)志物”是指，能通過區(qū)分癌細(xì)胞或者患有癌癥疾病的個(gè)體與正常細(xì)胞或者正常個(gè)體而診斷癌癥的物質(zhì)，包括與正常細(xì)胞相比在癌細(xì)胞或者個(gè)體內(nèi)量顯示增加或者減少的有機(jī)生物分子，如多肽、蛋白或者核酸(例如，mRNA等)、 脂質(zhì)、糖脂、糖蛋白或者糖(單糖、二糖、寡糖等)等。就本發(fā)明的目的而言，本發(fā)明的癌癥診斷標(biāo)志物是指如下所述的物質(zhì)，即，與正常細(xì)胞或者組織細(xì)胞相比，在癌細(xì)胞內(nèi)以高水平特異性表達(dá)的新的GPCR多肽或者編碼該新的GPCR多肽的多核苷酸。在本發(fā)明中“測量mRNA表達(dá)水平”活性相應(yīng)的措詞是指，為了診斷癌癥而評(píng)估生物樣品中癌癥標(biāo)志物基因mRNA的存成和表達(dá)水平的過程，其可以通過測量mRNA的量來評(píng)估。對此的分析方法有逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、競爭性RT-PCR(Competitive RT-PCR)、實(shí)時(shí) RT-PCR (Real-time RT-PCR)、RNA 酶保護(hù)分析(RNase protection assay，簡稱為RPA)、Northern印跡(Northern blotting)、DNA芯片分析等，但是并不限于此。在本發(fā)明中“測量蛋白表達(dá)水平”是指，為了診斷癌癥而評(píng)估生物樣品中癌癥標(biāo)志物基因所表達(dá)的蛋白的存在和表達(dá)水平的過程，通過利用與所述蛋白特異性結(jié)合的抗體來測量標(biāo)志物基因的蛋白產(chǎn)物的量。對此的分析方法有蛋白印跡、ELISA(enzyme linked immunosorbent asay,酶聯(lián)免疫吸附測定)、放射免疫分析(Radioimmunoassay，簡稱為 RIA)、放射免疫擴(kuò)散法(radioimmunodiffusion)、奧克特洛尼免疫擴(kuò)散法(Ouchterlony immunodiffusion)(rocket Immunoelectrophoresis)
沉淀分析法、補(bǔ)足物固定分析法(Complement Fixation Assay)、FACS、蛋白芯片等，但是并不限于此。優(yōu)選地，測量所述mRNA水平的試劑為對應(yīng)于本發(fā)明的GPCR多核苷酸或者其片段的引物對、探針或者反義核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸序列，所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地設(shè)計(jì)引物、探針或者反義核苷酸序列。優(yōu)選地，引物序列公開于SEQ ID N0:8和9中。在本發(fā)明中，術(shù)語“引物”表示具有游離的3’羥基的短核酸鏈，其與互補(bǔ)模板形成堿基對，從而充當(dāng)模板鏈復(fù)制的起點(diǎn)。除了引物，DNA的合成或復(fù)制還需要適當(dāng)?shù)木彌_溶液、 合適的溫度、聚合酶(即，DNA聚合酶或者逆轉(zhuǎn)錄酶)和四種不同的三磷酸核苷。在本發(fā)明中，GPCR多核苷酸的特異性有義和反義引物，可用于PCR擴(kuò)增，從而可以用PCR產(chǎn)物來診斷癌癥?；谒鶎偌夹g(shù)領(lǐng)域的公知常識(shí)，可適當(dāng)?shù)馗淖働CR條件、有義和反義引物的長度。在本發(fā)明中，術(shù)語“探針”表示能夠與mRAN特異性結(jié)合并且已被檢測目的mRNA的標(biāo)記標(biāo)記、長度短則小于10個(gè)堿基長則數(shù)百個(gè)堿基的寡核苷酸，如RNA或者DNA。能夠以下述形態(tài)構(gòu)造用于本發(fā)明的探針寡核苷酸探針、單鏈DNA探針、雙鏈DNA探針或RNA探針。 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，通過確定與本發(fā)明的GPCR多核苷酸互補(bǔ)的探針是否與目的核苷酸雜交，從而實(shí)現(xiàn)癌癥的診斷?；谒鶎偌夹g(shù)領(lǐng)域的公知常識(shí)，可選擇適當(dāng)?shù)奶结槻⑶铱筛淖冸s交條件。采用亞磷酰胺固體支持體方法或者其他已公知的方法，能夠化學(xué)合成可用于本發(fā)明的引物或者探針。它們的核苷酸序列亦可以使用本領(lǐng)域公知的多種手段來修飾。這種修飾的非限制性實(shí)例有甲基化、加帽、用一個(gè)或多個(gè)同系物取代天然核苷酸以及核苷酸之間的改變，例如未帶電的連接體(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯 (phosphoroamidate)、氨基甲酸酯等)，或者帶電的連接體(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。優(yōu)選地，所述引物或者探針包含八個(gè)或者更多個(gè)核苷酸，雜交方法可通過下述方式實(shí)現(xiàn)使所述引物或者探針暴露于或者接觸本發(fā)明的GPCR多核苷酸。優(yōu)選地，這些序列在已適當(dāng)調(diào)控以便使非特異性結(jié)合最小化的條件下雜交，例如，為了檢測與本發(fā)明的 GPCR多核苷酸具有約80% -90%同源性的序列，適當(dāng)?shù)碾s交條件包括在含有0. 25M的 Na2HPO4,pH7. 2、6. 5%的SDS、10%的硫酸葡聚糖的緩沖液內(nèi)，在42°C下雜交過夜；最后在含有0. lxSSC、0. 1% SDS的溶液內(nèi)，在55°C下洗滌。另外，適合檢測與本發(fā)明的GPCR多核苷酸具有約90%以上同源性的序列的適當(dāng)?shù)臈l件可以包括在0. 25M的Na2HP04、pH7. 2、6. 5% 的SDS、10%的硫酸葡聚糖內(nèi)，在65°C下雜交過夜；最后在含有0. IxSSC和0. 的SDS的溶液內(nèi)，在60°C下洗滌。優(yōu)選地，能測量本發(fā)明的GPCR蛋白水平的試劑為抗體。在本發(fā)明中，術(shù)語“抗體” 為本領(lǐng)域中公知的術(shù)語，表示指向抗原區(qū)域的特異性蛋白分子。就本發(fā)明的目的而言，抗體是指與本發(fā)明的標(biāo)志物即GPCR多肽特異性結(jié)合的抗體，這種抗體可通過下述方法產(chǎn)生， 艮口，根據(jù)常規(guī)方法將各個(gè)基因克隆至表達(dá)載體，從而得到被所述標(biāo)志物基因得以編碼的蛋白，通過通常方法，由得到的蛋白產(chǎn)生這種抗體。由標(biāo)志物基因所編碼的擔(dān)保所產(chǎn)生的部分肽，也落在抗體的范圍內(nèi)。為了發(fā)揮抗體功能，所述部分肽可以含有至少七個(gè)氨基酸殘基， 優(yōu)選地九個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選地十二個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基。對于本發(fā)明的抗體形態(tài)并沒有特別的限制，只要是多克隆抗體、單克隆抗體或者其具有抗原結(jié)合部位的片段，并且包括所有免疫球蛋白抗體。此外，本發(fā)明的抗體還包含人化抗體等特殊抗體。這種本發(fā)明的 GPCR蛋白抗體包括能夠以所屬技術(shù)領(lǐng)域的公知方法制備的所有抗體。優(yōu)選地，抗體肽具有 SEQ ID NO 6或者7的序列。本發(fā)明的用于檢測診斷癌癥的標(biāo)志物的抗體不僅包括具有兩個(gè)全長輕鏈和兩個(gè)全長重鏈的完整形態(tài)，還包括抗體分子的功能片段。抗體分子的功能片段是指至少保持抗原結(jié)合功能的片段，有Fab、F(ab' )、F(ab' )2以及Fv等。本發(fā)明的術(shù)語“癌癥(cancer) ”是與細(xì)胞死亡調(diào)控相關(guān)的一類疾病，是指由正常的凋亡平衡被破壞時(shí)細(xì)胞會(huì)并不受控地過度增長而導(dǎo)致的疾病。這種非正常的過于增殖的細(xì)胞根據(jù)情況浸潤到周圍的組織和器官以形成腫瘤塊，從而破壞或者體內(nèi)的正常結(jié)構(gòu)或使之變形，將這種狀態(tài)稱為癌癥。通常，腫瘤是細(xì)胞的異常過度生長而形成的瘤或?qū)嵸|(zhì)性病變。 腫瘤可分為良性腫瘤和惡性腫瘤。與良性腫瘤相比，惡性腫瘤的生長速度非?？?，并且浸潤周圍組織且經(jīng)常發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而威脅生命。將這種惡性腫瘤通常稱為“癌癥”，可用本發(fā)明檢測癌癥標(biāo)志物的組合物檢測的癌癥的實(shí)例包括髓樣癌、頭頸癌、肺癌、乳腺癌、胸腺瘤、間皮瘤、食道癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、肝小膽管癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、睪丸癌、精原細(xì)胞瘤、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸直腸癌、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、肉瘤、惡性黑素瘤以及皮膚癌，但是癌癥的種類并不限于所述實(shí)例。本發(fā)明的用于檢測癌癥標(biāo)志物的組合物可用作用于診斷所述癌癥。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，以胃癌、結(jié)腸癌、肝癌細(xì)胞系以及患有這些癌癥的個(gè)體為對象觀察了本發(fā)明的新GPCR蛋白的表達(dá)結(jié)果，確認(rèn)了其表達(dá)量與正常細(xì)胞和正常個(gè)體即對照相比顯著增加。“轉(zhuǎn)移性癌”意圖描述癌癥的性質(zhì)，并表示從初次生長的癌癥部位通過血管、淋巴管向其他部位轉(zhuǎn)移所生成的癌癥。為了根治癌癥，不僅要治療原發(fā)性癌癥，還需要控制癌癥的轉(zhuǎn)移部位。轉(zhuǎn)移性癌的實(shí)例有通過血流轉(zhuǎn)移的癌癥，如結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、婦科癌、胃癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、腎癌、肝小膽管癌、膽囊癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤以及霍杰金淋巴瘤等。并且，已知尤其是婦科癌之一的乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌是易于向骨骼和肝等中轉(zhuǎn)移的癌癥。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移性包括所述實(shí)例，并且，只要腫瘤是具有轉(zhuǎn)移性質(zhì)的癌癥，則并不限于此。本發(fā)明的GPC蛋白的同種型2的表達(dá)在轉(zhuǎn)移性癌中尤其增加。因此，同種型2可用作診斷轉(zhuǎn)移性癌的標(biāo)志物。當(dāng)抑制同種型2的表達(dá)時(shí)，不僅可以有效地預(yù)防或者治療原發(fā)性癌癥，還可以有效地預(yù)防或者治療轉(zhuǎn)移性癌。
作為再一優(yōu)選形態(tài)，本發(fā)明涉及包含所述組合物的用于診斷癌癥的試劑盒。在本發(fā)明中使用的術(shù)語“診斷”是指，通過確定生物樣品或者組織樣品中本發(fā)明的 GPCR多肽或編碼該GPCR多肽的多核苷酸的有無來確認(rèn)與所述基因的表達(dá)相關(guān)的疾病的存在或者特征。本發(fā)明的試劑盒可以通過測定癌癥診斷標(biāo)志物即新的GPCR多肽或者編碼該新的 GPCR多肽的多核苷酸的表達(dá)水平來檢測該標(biāo)志物。本發(fā)明的試劑盒不僅包含用于測量癌癥診斷標(biāo)志物表達(dá)水平的引物或探針，選擇性地識(shí)別癌癥標(biāo)志物的抗體或者其保留抗原結(jié)合功能的片段，而且可以包含適合分析所述多肽或者多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)其他試劑、裝置或組合物。例如，用于定量分析本發(fā)明的多核苷酸或者基因的診斷試劑盒可以包含與編碼 GPCR多肽的多核苷酸特異性結(jié)合的至少一種寡核苷酸。優(yōu)選地，用于定量檢測本發(fā)明的基因的診斷試劑盒可以包含SEQ ID NO :3、4或者5的特異性引物對、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶、 PCR引物以及dNTP。在“測量mRNA表達(dá)水平”的背景下，只要利用已知的分析方法，可以使用任何試劑盒而無限制。優(yōu)選地，測定本發(fā)明的新的GPCR蛋白水平的癌癥診斷試劑盒可以包含與本發(fā)明的GPCR蛋白特異地結(jié)合的抗體。在“測量蛋白表達(dá)水平”的背景下，只要利用了已知的分析方法，可以使用任何試劑盒而無限制。ELISA試劑盒或者蛋白芯片試劑盒是優(yōu)選的。利用抗體測量蛋白表達(dá)，是通過在GPCR蛋白和其抗體之間形成抗原-抗體復(fù)合體來實(shí)現(xiàn)的，并且通過多種方法測量所述復(fù)合體的量，從而可以實(shí)現(xiàn)蛋白表達(dá)水平的測定。本發(fā)明中術(shù)語“抗原-抗體復(fù)合體”是指癌癥標(biāo)志物蛋白與該癌癥標(biāo)志物蛋白的特異性抗體結(jié)合所形成的產(chǎn)物，可通過測量檢測標(biāo)記的信號(hào)大小來定量測定抗原-抗體復(fù)合體的形成。例如，通過比較癌癥疑似個(gè)體和正常對照之間的抗原-抗體復(fù)合體的量來測定 GPCR蛋白表達(dá)水平的顯著增加，從而可以診斷癌癥。若對疑似患有癌癥的個(gè)體樣品用本發(fā)明的GPCR蛋白的特異性抗體進(jìn)行處理，則GPCR蛋白和抗體形成抗原-抗體復(fù)合體，通過基于下述方法的試劑盒可以定量分析所述復(fù)合體ELISA、RIA、夾心分析、蛋白印跡、放射免疫擴(kuò)散法、奧克特洛尼免疫擴(kuò)散法、火箭免疫電泳、組織免疫染色、免疫沉淀分析法、補(bǔ)體固定分析、FACS、蛋白芯片以及蛋白印跡方法。另外，比較分析所述分析結(jié)果與正常個(gè)體的結(jié)果， 從而可以診斷是否發(fā)生由本發(fā)明的GPCR蛋白表達(dá)增加誘導(dǎo)的癌癥。作為再一優(yōu)選形態(tài)，本發(fā)明涉及檢測本發(fā)明的GPCR多肽和編碼該GPCR多肽的多核苷酸的方法。更具體而言，可以在mRNA水平或者蛋白水平檢測基因的表達(dá)，并且可以采用公知方法實(shí)現(xiàn)mRNA或者蛋白在生物樣品中的分離。本發(fā)明中，術(shù)語“生物樣品”是指能夠測量GPCR基因或者蛋白表達(dá)水平的樣品，可用于本發(fā)明的生物樣品的實(shí)例包括如組織、細(xì)胞、全血、血清、血漿、唾液、痰、腦脊髓液或者尿等，但是并不限于此。本發(fā)明的檢測方法可以通過比較正常對照中的基因表達(dá)水平與疑似患有癌癥的個(gè)體中的基因表達(dá)水平，來確認(rèn)疑似患有癌癥的個(gè)體中是否實(shí)際發(fā)生癌癥疾病。更具體而言，測量存在于來自疑似患有癌癥的個(gè)體的樣品中的本發(fā)明標(biāo)志物的表達(dá)水平。將所述水平與來自正常對照的生物樣品中所測量的水平進(jìn)行比較。當(dāng)本發(fā)明標(biāo)志物的表達(dá)水平在所
12述個(gè)體中比在所述正常對照中高時(shí)，則確定所述個(gè)體受到癌癥的侵襲。優(yōu)選地，當(dāng)將編碼本發(fā)明的GPCR多肽的多核苷酸用作標(biāo)志物時(shí)，所述方法可以包括(a)制備生物樣品；(b)用測量GPCR的mRNA水平所用的試劑處理所述生物樣品；(c)檢測所述試劑和與所述試劑互補(bǔ)的多核苷酸之間的復(fù)合體；以及(d)將檢測的量與正常對照進(jìn)行比較。另外，當(dāng)使用本發(fā)明的GPCR多肽作為標(biāo)志物時(shí)，所述方法可以包括(a)制備生物樣品；(b)用本發(fā)明的GPCR蛋白的特異性抗體處理所述生物樣品；(c)檢測所述抗體和與其互補(bǔ)的蛋白之間的復(fù)合體；以及(d)將檢測的量與正常對照進(jìn)行比較；利用所述方法可以檢測本發(fā)明的GPCR蛋白。作為再一優(yōu)選形態(tài)，本發(fā)明涉及用于治療及預(yù)防癌癥的組合物，其包含抑制本發(fā)明的GPCR基因表達(dá)的寡核苷酸或抑制本發(fā)明的GPCR蛋白活性的抗體，作為活性成分。為了確定本發(fā)明的新的GPCR基因或者蛋白的致癌性，本發(fā)明人觀察表達(dá)該基因的細(xì)胞系NIH3T3中的接觸抑制(contact inhibition)，和非停泊性生長(anchorage independent growth)，結(jié)果確認(rèn)了在穩(wěn)定地表達(dá)本發(fā)明GPCR基因的細(xì)胞系中所述抑制和生長都增加的情況。并且向沒有免疫力的裸鼠注射攜帶本發(fā)明GPCR基因的載體，誘導(dǎo)癌癥的形成。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物可以包含抑制本發(fā)明的GPCR多核苷酸表達(dá)的物質(zhì)，抑制所述多核苷酸表達(dá)的物質(zhì)可選自siRNA、shRNA、適體以及反義寡核苷酸。優(yōu)選地，寡核苷酸選自 SEQ ID NO :20-23, SEQ ID NO :36-51 和其組合。本發(fā)明的術(shù)語“siRNA(small interfering RNA，小干擾RNA) ”是指能夠介導(dǎo)RNA 干擾或者基因沉默的約20個(gè)核苷酸大小的小核酸分子。當(dāng)將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，則其被 Dicer蛋白識(shí)別，從而降解編碼所述GPCR多肽的基因，結(jié)果特異性抑制GPCR基因的表達(dá)。"shRNA (short hairpin RNA)，，是指短發(fā)夾 RNA (short hairpin RNA)，其中 siRNA 靶序列的有義和反義序列被5-9個(gè)堿基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(loop structuce)隔開。最近，作為用于在基因水平上調(diào)控蛋白的表達(dá)的方法，研究了 RNA干擾 (RNAinterference，RNAi)現(xiàn)象。通常，siRNA特異性結(jié)合具有與靶基因互補(bǔ)的序列的mRNA， 從而抑制蛋白的表達(dá)。按照基于這些RNA的基因療法所采用的典型方法，將包含本發(fā)明的siRNA或者 shRNA的組合物給予個(gè)體，從而可以抑制癌基因或者轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)。例如，根據(jù)Filleur et al. ,Cancer Res. ,63(14) :3919_22，2003所述方法，通過少量靜脈內(nèi)注射siRNA，能夠調(diào)控基因表達(dá)。并且，為了增加siRNA的細(xì)胞吸收和穩(wěn)定性，根據(jù)Chien et al. ,Cancer Gene Ther. ,12(3)321-8,2005等文獻(xiàn)，還可以注射綴合物形式的siRNA。制造本發(fā)明的組合物所包含的siRNA的方法有直接化學(xué)合成(Sui G et al., (2002)Proc Natl Acad Sci USA 99 :5515-5520)、體外轉(zhuǎn)錄(Brummelkamp et al. , (2002) Science 296 =550-553)等，但是并不限于此。另外，shRNA用于克服由siRNA的高生物合成成本、低轉(zhuǎn)染效率所引起的、RNA干擾效果的保持時(shí)間短等缺點(diǎn)，其可以由通過腺病毒、慢病毒或質(zhì)粒表達(dá)載體系統(tǒng)所含的基于RNA聚合酶的啟動(dòng)子表達(dá)，所述表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)。利用細(xì)胞內(nèi)的siRNA加工酶(Dicer或RNA酶(foiase))，將所述shRNA加工成功能 siRNA分子，從而誘導(dǎo)靶基因沉默。術(shù)語“反義”是指，具有核苷酸堿基序列和亞基與亞基主鏈的寡聚體，所述主鏈允許反義寡聚體與RNA中的靶序列、通常與mRNA通過沃森-克里克堿基配對雜交，在靶序列中形成RNA 寡聚體異源雙鏈。寡聚體可具有對靶序列的準(zhǔn)確序列互補(bǔ)性或者近似互補(bǔ)性。這些反義寡聚體可以使阻滯或者抑制mRNA的翻譯和/或修飾mRNA的加工以產(chǎn)生所述mRNA的剪接變體。從而，本發(fā)明的反義寡聚體為與編碼GPCR多肽的多核苷酸互補(bǔ)的反義寡聚體。對于基因療法，可以將本發(fā)明的反義寡核苷酸通過通常方法給予。組合物的給藥，可以預(yù)防或抑制癌基因表達(dá)。例如，按照J(rèn).S.kim et al.，J controlled Release 53， 175-182(1998)所述，通過靜電引力，將混合反義寡聚脫氧核苷酸裝載到基于聚-L-賴氨酸的微粒上，并靜脈內(nèi)注射裝載了寡核苷酸的微粒，但是將本發(fā)明的反義基因給予個(gè)體的方法并不限于所述實(shí)例。優(yōu)選地，可將公知的治療劑直接或者間接地綴合于本發(fā)明的組合物中或者使其一并包含于本發(fā)明的組合物中。能夠與抗體結(jié)合的治療劑包括放射性核素、藥物、淋巴因子、 毒素以及雙特異性抗體等，但是本發(fā)明的組合物所包含的治療劑并不限于此，只要是能夠與抗體綴合后發(fā)揮癌癥治療效果或者可以與抗體、siRNA, shRNA以及反義寡核苷酸聯(lián)合給藥，任何已知的治療劑都可以用于本發(fā)明中。上述放射性核素有3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57C0、58C0、59i^e、9°Y、125I、131I 以及 186Re 等，但是并不限于此?？捎糜诒景l(fā)明的藥物以及毒素有依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素、柔紅霉素、洋紅霉素、氨蝶呤、放線菌素、絲裂霉素、順鉬以及順鉬類似物、博萊霉素、埃斯培拉霉素、5-氟尿嘧啶、美法侖以及氮芥等，但是并不限于此。另外，優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物可以是包含抑制GPCR蛋白的活性或者表達(dá)的物質(zhì)的、抑制癌癥的生長或者轉(zhuǎn)移的組合物。優(yōu)選地，所述活性抑制物質(zhì)為特異性地識(shí)別GPCR 蛋白的抗體。這種抗體包括所有單克隆抗體和嵌合抗體、人源化抗體以及其人類抗體。并且，只要所述抗體具有特異性地識(shí)別GPCR蛋白的結(jié)合特性，則其不僅包含具有兩個(gè)全長重鏈和兩個(gè)全長輕鏈的完整形式，而且可以是抗體分子功能片段的形式。抗體分子的功能片段是指至少具有抗原結(jié)合功能的片段，有Fab、F(ab' )、F(ab' )2以及Fv等。優(yōu)選地，根據(jù)給藥方式，本發(fā)明的組合物可包含可接受的載體。活性成分可以與藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或者添加劑一并混合?？捎糜诒景l(fā)明的藥學(xué)可接受的載體種類包括，生理鹽水、無菌水、林格氏溶液、緩沖鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂質(zhì)體。它們可以單獨(dú)使用或組合使用。根據(jù)需求，組合物還可以進(jìn)一步包含如抗氧化劑、緩沖液等通常使用的其他添加劑。另外，根據(jù)給藥模式，可以將組合物與稀釋劑、分散劑、表面活性劑、結(jié)合劑以及潤滑劑一起配制成注射劑量形式，如水溶液、懸浮液、乳液等，或配制成口服劑量形式，如藥丸、膠囊、顆粒或者片劑。與所述載體綴合后，靶器官、組織特異性抗體或者配體，可以將活性成分引導(dǎo)向所述器官或組織。本領(lǐng)域已知的通常載體、賦形劑或者添加劑都可以用于本發(fā)明中，并且可使用的載體、賦形劑或者添加劑的種類并不限于所述實(shí)例。根據(jù)目的或者需求，按照所屬技術(shù)領(lǐng)域中所使用的通常方法、給藥途徑、治療有效量可以將如上所述的組合物或者制劑適當(dāng)?shù)亟o予個(gè)體。給藥途徑例如可以有口服、非腸道、 皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)以及鼻腔內(nèi)給藥。對于局部免疫抑制治療，必要時(shí)通過包含病變內(nèi)給藥的適當(dāng)?shù)姆椒ńo予所述組合物。非腸道注射包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或者皮下途徑。包含本發(fā)明的反義寡核苷酸、siRNA或者shRNA的組合物的治療有效量和給藥次數(shù)， 可根據(jù)多種因素適當(dāng)?shù)貨Q定，如要預(yù)防或者治療的癥狀的種類、給藥途徑、性別、健康狀態(tài)、 食餌、個(gè)體年齡和體重以及疾病的嚴(yán)重程度等。作為再一優(yōu)選形態(tài)，本發(fā)明涉及篩選本發(fā)明GPCR蛋白的調(diào)控劑的方法，所述篩選方法包括用候選化合物處理表達(dá)本發(fā)明的GPCR蛋白的細(xì)胞，并測量細(xì)胞中GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。根據(jù)需求，可采用上述的重組載體、用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或者容納所述基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來適當(dāng)?shù)剡x擇表達(dá)本發(fā)明的GPCR蛋白的細(xì)胞。將與GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性相關(guān)的候選化合物應(yīng)用于細(xì)胞，從而可以確定候選化合物是否發(fā)揮本發(fā)明的GPCR蛋白調(diào)控劑的功能。更具體而言，如果候選化合物誘導(dǎo)GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性增加，則確定其為本發(fā)明PGCR蛋白的激動(dòng)劑。相反，如果GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性因此減少，則確定候選化合物為拮抗劑。本發(fā)明的術(shù)語“激動(dòng)劑”是指，與受體結(jié)合從而能夠直接或者間接地誘導(dǎo)、改善或者增強(qiáng)受體對配體的生物學(xué)活性或者激活的分子。就本發(fā)明的目的而言，激動(dòng)劑是指與本發(fā)明的GPCR蛋白結(jié)合從而能夠誘導(dǎo)或者改善受體的生物學(xué)活性或者激活的物質(zhì)。本發(fā)明的術(shù)語“拮抗劑”是指顯示拮抗作用的物質(zhì)。當(dāng)一起使用兩種以上的物質(zhì)時(shí)，如果一種物質(zhì)減少另一種物質(zhì)的效果則稱其為拮抗劑。就本發(fā)明的目的而言，拮抗劑是指與GPCR蛋白的配體互相作用以減少配體的效果的物質(zhì)。另外，為了確定所述GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性是否增加或者減少，可以使用多種方法，包括如測量參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的各種蛋白或者化合物中的一個(gè)多個(gè)的水平的方法。 優(yōu)選地，可通過監(jiān)測cAMP的水平來判斷GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的增加或者減少。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，為了驗(yàn)證對新的GPCR蛋白產(chǎn)生影響的外部刺激因子，用一些已知為GPCR配體的物質(zhì)檢查細(xì)胞生長是否根據(jù)本發(fā)明的新的GPCR蛋白的超表達(dá)而得以促進(jìn)。 具體為，用EGF、PDGF、胰島素、IGF-I、HGF、VEGF、血管緊張肽II、緩激肽、LPA以及PTX處理細(xì)胞，結(jié)果觀察到PDGF、胰島素、IGF-1、VEGF、血管緊張肽II、緩激肽、LPA促進(jìn)細(xì)胞生長，而 PTX抑制細(xì)胞生長。作為再一優(yōu)選形態(tài)，本發(fā)明涉及篩選癌癥治療劑的方法，所述篩選方法包括用候選化合物處理表達(dá)本發(fā)明的GPCR蛋白的細(xì)胞，并測量細(xì)胞中GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性?？梢砸耘c上述調(diào)控劑的篩選方法類似的方法，進(jìn)行本發(fā)明的癌癥治療劑的篩選方法。即，當(dāng)候選化合物誘導(dǎo)GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性增加時(shí)，作為致癌蛋白和基因的本發(fā)明的GPCR蛋白和基因的表達(dá)是增加的，因此可將所述候選化合物判斷為促進(jìn)腫瘤發(fā)生的化合物。另外，若候選化合物減少GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，則可通過該化合物抑制癌基因和蛋白的表達(dá)，確定候選化合物是癌癥的可能治療劑。對于這種篩選方法而言，可根據(jù) cAMP的表達(dá)水平而容易地判斷所述候選化合物的活性。下面通過實(shí)施例更加詳細(xì)地說明本發(fā)明。但是這些實(shí)施例僅用于示例性地說明本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1 新的GPCR的分析將在胃、結(jié)腸直腸、肝癌細(xì)胞系中超表達(dá)的新的孤兒GPCR命名為hstml (human seven transmembrane protein 1，人類七次跨膜蛋白)(在下文中，將本發(fā)明的新的GPCR基因命名為“hstml”、將本發(fā)明的新的GPCR蛋白命名為“hstml蛋白”或者“hSTMl”，并且與本發(fā)明的“新的GPCR”互換使用)。用表達(dá)量根據(jù)外部脅迫和氮或者糖的量而發(fā)生變化的裂殖酵母粟酒裂殖酵母(S. pombe)基因Stml+來檢測鑒定為新的孤兒GPCR并且命名為hstml 的人類同源基因。該新的受體基因位于一號(hào)染色體的1ρ36. 13位置處，并且具有多個(gè)可變轉(zhuǎn)錄物。轉(zhuǎn)錄變體1 (hstmla)是包含完整N末端的全長基因，其編碼2種hstml同種型中的一個(gè)。hstml的同種型1可由兩個(gè)不同的可變剪接變體(SEQ ID N0:l、2)形成，所述剪接變體亦屬于本發(fā)明的一部分。hstml的同種型2來源于可變剪接變體3 (SEQ ID NO 3), 并且編碼缺少65個(gè)N末端氨基酸的蛋白。實(shí)施例2.人類ιΗ常細(xì)胞組織中新的GPCR的mRNA水平從Clontech. Co.購買正?？偧?xì)胞組織的總RNA。使用人類胃(目錄號(hào)(cat. No) 636578)、睪丸(目錄號(hào)636533)、胸腺(目錄號(hào)636549)、骨髓(目錄號(hào)636548)、腦(目錄號(hào)636530)、肝(目錄號(hào)636531)、大腸(目錄號(hào)636553)、腎臟(目錄號(hào)6365 )、肺(目錄號(hào)636524)、乳腺(目錄號(hào)636570)、卵巢(目錄號(hào)636555)、心臟(目錄號(hào)636532)、甲狀腺 (目錄號(hào)636530)、胰腺(目錄號(hào)636577)、小腸(目錄號(hào)636539)、前列腺(目錄號(hào)636539) 總RNA。向1 μ g每一總RNA (total RNA)中添加1 μ 1 oligo (dT) 15。并且在65度下煮沸十分鐘之后再冷卻。將混合物與Ιμ RNA酶抑制劑、4 μ 1 5Χ RT緩沖液、2 μ 1 dNTP,2y 1 DTT、0. 5 μ 1 RT酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)混合，并使用蒸餾水將總體積調(diào)整為20 μ 1，之后42°C下孵育60分鐘，隨后70°C下孵育5分鐘，從而制備c-DNA (iNtRON Biotech)。接著混合2 μ 1制備的C-DNA和30pmole每一 GAPDH引物，并使用蒸餾水將最終體積調(diào)整為 10 μ 1 之后添加 10 μ 1 2Χ Taq premix (Hot start)，進(jìn)行 RT-PCR0 進(jìn)行 PCR, 94°C 下30秒、在55°C下30秒、在72°C下一分鐘，22個(gè)循環(huán)，并將制備的PCR產(chǎn)物裝載至瓊脂糖凝膠上從而測量產(chǎn)物的量。進(jìn)行校準(zhǔn)，從而使所有樣品中的GAPDH PCR產(chǎn)物的量相同。使用校準(zhǔn)的c-DNA相同的量、采用hstml引物，以如上所述的條件進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，將由此獲得的PCR產(chǎn)物裝載至瓊脂糖凝膠上，從而可視地測定在各個(gè)組織中的mRNA水平。通過實(shí)時(shí) PCR(Corbrtt Research公司的RG-6000)定量在各個(gè)組織中hstml的mRNA量。試劑使用了 Qiagen公司的2X Quantitect SYBR Green PCR試劑盒。其結(jié)果可知下述內(nèi)容，即，以在胃中的mRNA水平為基準(zhǔn)，在心臟、胰腺、胸腺、前列腺、小腸觀察到了相對更小水平的mRNA， 而與對照相比在肺、睪丸中有更高水平的mRNA表達(dá)。尤其是與其他組織相比，在睪丸的表達(dá)水平表現(xiàn)出顯著的差別。實(shí)時(shí)PCR中所用的引物如表1所示，用作對照所用的GAPDH的引物購自QiagenΟΠ 0079Μ7)。以95°C下5秒、55°C下15秒、72°C下20秒，40 45個(gè)循環(huán)，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。表權(quán)利要求
1.GPCR(G蛋白偶聯(lián)受體)多肽，由SEQ ID NO :1或2的氨基酸序列構(gòu)成。
2.編碼權(quán)利要求1所述的GPCR多肽的多核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸，由SEQID NO :3、4或者5的核苷酸序列構(gòu)成。
4.重組載體，攜帶權(quán)利要求2所述的多核苷酸或者其片段。
5.用權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
6.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，通過在代孕母體的子宮中植入權(quán)利要求5所述的細(xì)胞而產(chǎn)生。
7.用于檢測癌癥標(biāo)志物的組合物，包含能測量權(quán)利要求2所述多核苷酸的mRNA或者蛋白表達(dá)水平的試劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中，所述能測量所述多核苷酸的mRNA表達(dá)水平的試劑為與所述多核苷酸特異性結(jié)合的引物對、探針和反義核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述能測量蛋白表達(dá)水平的試劑為抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述癌癥為胃癌、結(jié)腸直腸癌或者肝癌。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述癌癥為轉(zhuǎn)移性癌。
12.用于診斷癌癥的試劑盒，包含權(quán)利要求7-11中任意一項(xiàng)所述的組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用于診斷癌癥的試劑盒，所述試劑盒為逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒、競爭性RT-PCR試劑盒、實(shí)時(shí)RT-PCR試劑盒、DNA芯片試劑盒或者蛋白芯片試劑盒。
14.檢測權(quán)利要求2所述的多核苷酸的方法，包括a.制備生物樣品；b.用權(quán)利要求8所述的試劑處理所述生物樣品；c.檢測所述試劑和與所述試劑互補(bǔ)的多核苷酸之間的復(fù)合體；以及d.將檢測的量與正常對照進(jìn)行比較。
15.檢測權(quán)利要求1所述的蛋白的方法，包括a.制備生物樣品；b.用權(quán)利要求1所述的蛋白的特異性抗體處理所述生物樣品；c.檢測所述抗體和與其互補(bǔ)的蛋白之間的復(fù)合體；以及d.將檢測的量與正常對照進(jìn)行比較。
16.用于治療及預(yù)防癌癥的組合物，包含抑制權(quán)利要求2所述的多核苷酸表達(dá)的寡核苷酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述寡核苷酸為針對權(quán)利要求2所述基因的反義寡核苷酸、siRNA或者shRNA。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述siRNA的核苷酸序列選自SEQID NO 20-23、SEQ ID NO :36-51 和其組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述癌癥為胃癌、結(jié)腸直腸癌或者肝癌。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述癌癥為轉(zhuǎn)移性癌。
21.用于治療及預(yù)防癌癥的組合物，包含抑制權(quán)利要求1所述多肽的活性的抗體或者其抗原結(jié)合片段。
22.篩選權(quán)利要求1所述多肽的調(diào)控劑的方法，包括 用候選化合物處理表達(dá)權(quán)利要求1所述的多肽的細(xì)胞；以及測定所述多肽的GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的增加或者減少。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，通過監(jiān)測cAMP水平的增加或者減少來測定所述GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的增加或者減少。
24.篩選癌癥治療劑的方法，包括用候選化合物處理表達(dá)權(quán)利要求1所述的多肽的細(xì)胞；以及測定所述多肽的GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的增加或者減少。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的GPCR(G Protein Coupled Receptor，G蛋白偶聯(lián)受體)蛋白和編碼該蛋白的基因，以及所述蛋白和基因的新用途。具體而言，本發(fā)明涉及新的GPCR多肽、編碼所述多肽的多核苷酸、攜帶所述多核苷酸或者其片段的重組載體、用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。此外，本發(fā)明涉及用于檢測癌癥標(biāo)志物的組合物，其包含能測量所述新的GPCR基因的mRNA或者蛋白水平的試劑；包含所述組合物的、用于診斷癌癥的試劑盒；以及檢測新的GPCR多肽及編碼該新的GPCR多肽的基因的方法。并且，本發(fā)明涉及用于治療及預(yù)防癌癥的組合物以及篩選新的GPCR調(diào)節(jié)劑或者癌癥治療劑的方法，所述組合物包含，抑制GPCR的表達(dá)或者活性的試劑。
文檔編號(hào)C07K14/705GK102459326SQ200980160087
公開日2012年5月16日 申請日期2009年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月25日
發(fā)明者俞香淑, 元美善, 姜彰模, 安智苑, 宋銀永, 崔晸海, 廉榮一, 李熙龜, 鄭璟淑, 鄭載勛 申請人:韓國生命工學(xué)研究院