專利名稱：Klotho蛋白的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了 KLOTHO蛋白的用途，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌(簡(jiǎn)稱肝癌，HCC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，2007年12月美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)(ACS)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示肝癌年增66. 7萬(wàn)例，死亡59. 8萬(wàn)例，其中約50%的新患病例和死亡病例在中國(guó)，即肝癌對(duì)我國(guó)人民的健康威脅更大，已成為我國(guó)第二位腫瘤殺手，不僅使患者痛苦不堪，生存率低，而且給家庭、社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。Klotho是1997年發(fā)現(xiàn)與衰老相關(guān)的基因，位于人類染色體13ql2，長(zhǎng)度約為50kb，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。Koltho基因的cDNA含有二段不同的片段，分別編碼二種不同的蛋白一為膜型，位于細(xì)胞膜上，其胞外區(qū)的蛋白序列與葡萄糖苷酶相似；二 為分泌型，存在于血液循環(huán)中，被認(rèn)為是一種肽類激素。Klotho基因在小鼠中的表達(dá)缺失導(dǎo)致其出現(xiàn)類似于人類衰老的各種表型，如動(dòng)脈硬化、骨質(zhì)疏松、肺氣腫、壽命縮短、皮膚萎縮、不育癥、運(yùn)動(dòng)失調(diào)等。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)klotho基因可以調(diào)節(jié)IGF、TGF-i3 I、FGF等信號(hào)通路，參與氧化應(yīng)激過(guò)程，并且與機(jī)體的免疫缺陷有關(guān)，提示klotho在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并可進(jìn)一步利用klotho作為腫瘤發(fā)生、分級(jí)的標(biāo)志物以及作為靶點(diǎn)用于抗腫瘤的治療。對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)和專利進(jìn)行檢索，至今未見任何KLOTHO蛋白及其相關(guān)組成成分用于肝細(xì)胞肝癌診斷和治療的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種KLOTHO蛋白在制備肝癌治療藥物中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO. I所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種KLOTHO蛋白在制備肝癌診斷制劑中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO. I所示。本發(fā)明具有如下技術(shù)效果
(1)肝癌患者癌組織中KLOTHO蛋白表達(dá)低于癌旁組織，通過(guò)檢測(cè)個(gè)體肝組織和(或)血液中KLOTHO蛋白及其相關(guān)組成成分的表達(dá)降低預(yù)測(cè)肝癌的發(fā)生；
(2)KL0TH0蛋白對(duì)肝癌生長(zhǎng)具有抑制作用，通過(guò)提高肝癌組織中KLOTHO蛋白及其相關(guān)組成成分的表達(dá)水平治療肝癌；
(3)由于klotho參與了惡性增殖、凋亡、侵襲等細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的病理過(guò)程，因此本發(fā)明對(duì)今后深入探討klotho與其他疾病的關(guān)系提供了經(jīng)驗(yàn)和應(yīng)用基礎(chǔ)。


圖I為肝癌及癌旁組織KLOTHO蛋白免疫組化染色(X 400)結(jié)果(A) KLOTHO蛋白在腎小管上皮細(xì)胞中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，作為KLOTHO蛋白免疫組化染色的陽(yáng)性對(duì)照；(B)KLOTHO蛋白在肝癌癌旁組織中高表達(dá)；(C) KLOTHO蛋白在肝癌組織中低表達(dá)。圖2 為 Kaplan-Meier 生存曲線。圖3為Klotho高表達(dá)載體pCMV6-Entry-KL上調(diào)KLOTHO蛋白的表達(dá)效果；
圖4為轉(zhuǎn)染Klotho高表達(dá)載體pCMV6-Entry-KL抑制肝癌H印G2細(xì)胞的增殖結(jié)果；
圖5為轉(zhuǎn)染Klotho高表達(dá)載體pCMV6-Entry-KL促進(jìn)肝癌H印G2細(xì)胞的凋亡結(jié)果；
圖6為轉(zhuǎn)染klotho基因特異性siRNA抑制KLOTHO蛋白的表達(dá)效果；
圖7為轉(zhuǎn)染klotho基因特異性siRNA促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖結(jié)果；
圖8為轉(zhuǎn)染klotho基因特異性siRNA抑制肝癌!fepG2細(xì)胞的凋亡結(jié)果； 圖9為加入外源性分泌型KLOTHO蛋白抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖結(jié)果；
圖10為腹腔注射外源性分泌型KLOTHO蛋白對(duì)荷瘤裸鼠肝癌組織生長(zhǎng)的影響結(jié)果；
圖11為腹腔注射外源性分泌型KLOTHO蛋白對(duì)荷瘤裸鼠肝癌組織中KLOTHO蛋白表達(dá)的影響結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。需注意的是，以下實(shí)施例只用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中提到的KLOTHO蛋白均為氨基酸序列如SEQ NO. I所示的KLOTHO蛋白。實(shí)施例I肝癌患者癌組織中KLOTHO蛋白表達(dá)低于癌旁組織的臨床意義 采用免疫組化S-P法，檢測(cè)KLOTHO蛋白在由52例肝癌與54例癌旁組織組成的組織芯
片中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果如圖I、圖2、表1、2所示，表明肝癌組織中KLOTHO蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于癌旁組織0°〈0. 05);且肝癌組織中KLOTHO蛋白表達(dá)與肝癌的臨床分期呈負(fù)相關(guān)、與病例分級(jí)呈正相關(guān)0°〈0. 05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小等的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0°>0. 05)。對(duì)納入研究的肝癌患者進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)KLOTHO蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與患者的預(yù)后成正相關(guān)，KLOTHO蛋白陽(yáng)性組的生存時(shí)間(平均生存時(shí)間為28. 132個(gè)月，95%可信區(qū)間Cl為23. 726-32. 538)比KLOTHO蛋白陰性組生存時(shí)間(平均生存時(shí)間為16. 772個(gè)月，95%可信區(qū)間Cl為11. 550-21. 993)長(zhǎng)，Log-rank檢驗(yàn)示兩組生存率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Gd=O. 016)。COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析結(jié)果說(shuō)明KLOTHO可作為獨(dú)立的生存期預(yù)測(cè)因子(TM). 043)。KLOTHO蛋白高表達(dá)可能延緩肝癌病人的死亡，KLOTHO表達(dá)陽(yáng)性的患者比klotho表達(dá)陰性的患者在某時(shí)刻死亡的相對(duì)危險(xiǎn)度較低，為O. 397。這些結(jié)果提示KLOTHO蛋白在肝癌中的表達(dá)降低，可能參與了肝癌的發(fā)生與進(jìn)展，為肝癌的診斷和預(yù)后判斷提供參考依據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種KLOTHO蛋白在制備肝癌治療藥物中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO. I所示。
2.—種KLOTHO蛋白在制備肝癌診斷制劑中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO. I所示。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種KLOTHO蛋白在制備肝癌治療藥物中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種KLOTHO蛋白在制備肝癌診斷制劑中的用途，所述的KLOTHO蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。本發(fā)明具有如下技術(shù)效果(1)由于肝癌患者癌組織中KLOTHO蛋白表達(dá)低于癌旁組織，通過(guò)檢測(cè)個(gè)體肝組織和(或)血液中KLOTHO蛋白及其相關(guān)組成成分的表達(dá)降低預(yù)測(cè)肝癌的發(fā)生；(2)由于KLOTHO蛋白對(duì)肝癌生長(zhǎng)的抑制作用，通過(guò)提高肝癌組織中KLOTHO蛋白及其相關(guān)組成成分的表達(dá)水平治療肝癌；(3)由于klotho參與了惡性增殖、凋亡、侵襲等細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的病理過(guò)程，因此本發(fā)明對(duì)今后深入探討klotho與其他疾病的關(guān)系提供了經(jīng)驗(yàn)和應(yīng)用基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102961739SQ20121053307
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者黃曙, 湯小偉, 季國(guó)忠, 范志寧, 王敏 申請(qǐng)人:黃曙, 南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院