專利名稱：：重組人腎臟損傷分子1(kim-1)的原核表達(dá)、純化及其檢測方法的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種腎臟損傷相關(guān)蛋白的原核表達(dá)、純化及其在體液樣本中濃度的免疫學(xué)檢測方法的建立。具體的來講，本發(fā)明提供了腎臟損傷分子KKIM-1)的原核表達(dá)及純化的方法，該方法的建立為得到高純度的KIM-1提供了強(qiáng)有力的實驗基礎(chǔ)；另外本發(fā)明涉及的KIM-1作為抗原，通過免疫學(xué)方法或基因工程原理有效的獲得了，特異性針對KIM-1蛋白的抗體，通過反復(fù)的實驗驗證，該發(fā)明涉及的抗原抗體可以有效利用于人體液中人KIM-1的濃度檢測。
背景技術(shù)：
：腎臟損傷分子-UKIM-l)是一種跨膜蛋白，在正常腎臟中并不表達(dá)，而在腎臟損傷的動物模型中表達(dá)明顯增加。動物研究表明，KIM-1的外功能區(qū)斷裂后產(chǎn)物能夠通過尿中排出，因此檢測尿中KIM-1水平可以間接評價腎臟損傷的情況，但尚來證實這一理論在人類腎臟損傷中同樣成立。荷蘭學(xué)者Timmeren等對102例不同腎臟疾病病理標(biāo)本及正常對照標(biāo)本的腎小管中KIM-1表達(dá)的差異進(jìn)行了分析，并對尿中KIM-1水平與腎臟損傷程度進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，與正常對照組相比，在所有腎臟疾病中腎組織KIM-1的表達(dá)和尿中KIM-l水平均明顯增高。免疫組化檢測顯示，腎臟損傷時KIM-l在發(fā)生纖維化及炎癥反應(yīng)部位的腎小管彌漫性表達(dá)，集中在靠近管腔一側(cè)，與鈣粘蛋白分離，與波形蛋白緊密結(jié)合。另一個鮮明的特點(diǎn)是，不管造成腎臟損傷的原發(fā)疾病是否相同，KIM-1的表達(dá)與腎臟損傷的程度呈現(xiàn)正向相關(guān)，而與腎臟功能呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)，與蛋白尿的水平之間并沒有相關(guān)關(guān)系。尿中KIM-1水平與局部組織中KIM-1表達(dá)水平具有密切的正相關(guān)關(guān)系，同時局部組織中的炎癥情況也會影響尿中KIM-l的水平，尿中KIM-l排泄增多提示腎臟功能的下降，這種相關(guān)關(guān)系同樣具有統(tǒng)計學(xué)差異，尿中KIM-l水平與蛋白尿水平間同樣沒有明確的相關(guān)關(guān)系。因此Ti腿eren等認(rèn)為，在腎臟疾病患者中，KIM-1在腎小管細(xì)胞表達(dá)增加并與腎臟損傷程度密切相關(guān)。尿中KIM-l水平能夠反映組織中KIM-1表達(dá)情況及炎癥反應(yīng)程度，并與腎臟功能密切相關(guān)，因此可將KIM-l作為監(jiān)測腎臟病損傷狀態(tài)的非侵入性生物標(biāo)志。從蛋白一級結(jié)構(gòu)分析，人KIM-1共包括364個氨基酸，其中1-20為信號肽，表達(dá)時被切除成為成熟狀態(tài)；21-290位為胞外部分；291位-311位為一段具有21個氨基酸的跨膜序列；最后48個氨基酸則構(gòu)成了該蛋白的胞內(nèi)'域。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了重組人KIM-1的原核表達(dá)、純化及其檢測方法的建立，包括以下步驟將KIM-l編碼胞外域的基因擴(kuò)增獲得后插入表達(dá)載體PET28a,得到PET28a-KIM-1。所述表達(dá)是在將質(zhì)粒HIS-KIM-1在大腸桿菌中表達(dá)和培養(yǎng)。所述純化是指將大腸桿菌破碎，然后離心或過濾分離出融和蛋白。破碎可采用電動搗碎機(jī)或勻漿機(jī)破碎或用超聲波處理破碎，也可以用溶菌酶處理?？捎帽绢I(lǐng)域內(nèi)常用的層析法或電泳法進(jìn)行，優(yōu)選凝膠層析法進(jìn)行。所述檢測方法是指利用上述方法得到蛋白作為抗原通過免疫學(xué)方法或基因工程原理獲得的抗體，利用免疫學(xué)方法檢測樣品中的濃度的方法具體的說上述步驟如下進(jìn)行-.1)PCR擴(kuò)增表達(dá)KIM-l的基因片段，兩端帶有NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)，酶切消化后插入Ndel和XhoI消化后的Pet28a,得到質(zhì)粒PET28a-KIM-1;2)HIS-KIM-l在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)，克隆接種至3ml含有100ug/mlkana的LB緩沖液，37°C,過夜，220rpm;將過夜培養(yǎng)物l:100稀釋至lL含有100ug/mlkana的LB緩沖液，37°C,220rpm,培養(yǎng)5h;加入終濃度為0.lmM的IPTG，22°C,180rpm，繼續(xù)培養(yǎng)22h;以8000g，15min，4。C離心收菌；菌體用50mMTris-Cl,200mMNaClpH8.0懸起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT,0.5h;用超聲破碎儀超聲至溶液澄清，12000rpm,20min離心3次;3)將上清液使用GEhealthcare的chelatingsepHaroseFastFlow柱料純化，得到純化融合蛋白。4)凝血酶酶切HIS標(biāo)簽，Ni柱純化，得到除去標(biāo)簽的KIM-1蛋白。實驗證明，純化后KIM-l可溶性極高，20mg/mlKIM-l在50mMTris，500mMNaCl中保存，于4"C幾個月內(nèi)未見明顯沉淀未有降解，F(xiàn)PLC表明KIM-1為單體，一年內(nèi)未有聚合物出現(xiàn)。本發(fā)明提供的利用PET28a系統(tǒng)融合表達(dá)再經(jīng)酶切處理去掉標(biāo)簽制得的KIM-1蛋白，可以在大腸桿菌中成功表達(dá)，衷達(dá)躉與前人的結(jié)果類似，相對于真核表達(dá)，原核表達(dá)制備工程化抗體技術(shù)相對簡單，成本更低；5)將純化后重組KIM-1蛋白作為抗原分別免疫家兔和小鼠，獲得高特異性針對KIM-l蛋白的多克隆抗體及單克隆抗體；6)利用獲得的抗體及高純度的重組KIM-l蛋白，利用包括但不限于雙夾心EL工SA法、免疫比濁法等方法檢測人體液中的KIM-1的含量。圖l:圖中顯示內(nèi)容為本發(fā)明中使用的蛋白表達(dá)載體PET28a的載體圖譜。圖2:圖中顯示內(nèi)容為本發(fā)明中HIS-KIM-1融和蛋白小量表達(dá)蛋白電泳圖片。圖中1、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，由上至下分子量標(biāo)準(zhǔn)為llSkd、6"ci、4SH、35kd、25kd、18.4kck14,4kd2、未加IPTG誘導(dǎo)的菌株；3、加IPTG誘導(dǎo)的菌株。圖3:圖中顯示內(nèi)容為本發(fā)明中純化后的KIM-1蛋白電泳圖片。圖中l(wèi)和2、純化后的KIM-l蛋白M、蛋白分子量標(biāo)逸，由上至下分汙量標(biāo)準(zhǔn)為115kd、66kd、45kd、35kd、25kd、18.4kd、14.4kd。圖4:圖中顯示內(nèi)容為本發(fā)明中純化后KIM-]蛋白Superdex200凝膠過濾層析洗脫曲線。圖中最高的峰為純化后KIM-1蛋白的峰。圖5:圖中顯示內(nèi)容為本發(fā)明中純化KIM-1多克隆抗體親和層析柱洗脫曲線。圖6:利用竟?fàn)幏‥LISA檢測人尿液中KIM-1含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1:利用免疫比濁法檢測人尿液中KIM-1的回收率。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例lKIM-1的制備KIM-l蛋白廣泛存在于多種生物體中，其編碼基因一般可以通過RT-PCR從生物體cDNA中獲得，本發(fā)明中，以質(zhì)粒PCDNA3.1-KIM-l為模板擴(kuò)增得到。1.克隆PET28a-KIM-1:選擇表達(dá)載體PET28a為克隆載體(見圖l)，根據(jù)其多克隆位點(diǎn)及KIM-l序列特點(diǎn)，設(shè)計兩端引物PCR擴(kuò)增表達(dá)KIM-l的基因片段，兩端帶有MeI和XhoI酶切位點(diǎn)，酶切消化后插入Ndel和XhoI消化后的Pet28a,得到質(zhì)粒PET28a-KIM-1;2.表達(dá)純化PET28a-KIM-1:將質(zhì)粒HIS-KIM-l在大腸桿菌Rossetta中表達(dá)。首先通過小量表達(dá)鑒定，誘導(dǎo)株與未誘導(dǎo)株相比，在60KD左右處有明顯特異條帶(見圖2),大量培養(yǎng)后，通過SDS-PAGE分析上清沉淀，結(jié)果顯示，該蛋白在上清中存在，利用其所帶HIS標(biāo)簽，通過IMAC的方法，可獲得純度為99%以上的目的蛋白(見圖3)。HIS-KIM-l在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)，克隆接種至3ml含有100ug/mlkana的LB緩沖液，37°C,過夜，220rpm;將過夜培養(yǎng)物l:100稀釋至lL含有100ug/mlkana的LB緩沖液，37°C,220rpm，培養(yǎng)5h;加入終濃度為0.lmM的IPTG，22°C,180rpm，繼續(xù)培養(yǎng)22h;以8000g,15min,4。C離心收菌；菌體用50mMTris-Cl，200mMNaClpH8.0懸起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT，0.5h;用超聲破碎儀超聲至溶液澄清，12000rpm，20min離心3次；上清使用GEhealthcare的chelatingsepHaroseFastFlow柱料純化，步驟參照其廠家提供的說明書。HIS-KIM-l于咪唑濃度為60mM時被洗脫。產(chǎn)量高達(dá)50-100亳克每升培養(yǎng)物。凝血酶酶切HIS標(biāo)簽，Ni柱純化，得到除去標(biāo)簽的KIM-l蛋白。為分析KIM-l在溶液中是否均一，將2mgKIM-l換至20mMTris-Cl,pH8.0,50mMNaCl的緩沖液中。樣品通過20mMTris-Cl，pH8.0,50mMNaCl平衡好的s叩erdex200柱子。整個操作參考AKTAPurifier提供的手冊。結(jié)果顯示純化好的KIM-l于咪唑濃度為60mM時被洗脫。產(chǎn)量高達(dá)50-100毫克每升培養(yǎng)物。通過superdex200柱子時未見明顯的多聚體，主要以一個均一的峰出現(xiàn)(見圖4)。8實施例2KIM-l多克隆抗體及單克隆抗體的制備1.多克隆抗體的制備取蛋白lml(0.5mg左右)，與弗式完全佐劑l:1(V/V)充分混合乳化，乳化物滴于冰水上幾分鐘內(nèi)完全不擴(kuò)散為好。選取2.5-3kg的健康雌兔一只，初次免疫在兔后足足墊和背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射量約100ul。兩周后，再取lml,與不完全佐劑l:l混合，兔背部皮下多點(diǎn)注射。兩周后，同樣加強(qiáng)免疫一次。IO天后，加強(qiáng)免疫一次，IO天后再加強(qiáng)免疫一次。若測效價高(雙擴(kuò)散，1/8以上)，三天后頸動脈放血，血液于4度凝固后，于5000rpm離心5min得到抗血清，用親和層析方法純化抗體。2.單克隆抗體制備2.1免疫6周齡雌性BALB/C小鼠5只，劑量為每只O.2mL(含50ugKIM-1蛋白)，背部皮下分點(diǎn)注射。首免與等量弗式完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫與等量弗式完全佐劑混合乳化，共免5次，每次間隔4周，最后1次免疫后10天斷尾釆血分離血清，間接ELISA檢測效價，操作程序參照TIJSSEN的方法。2.2融合、雜交瘤篩選1)細(xì)胞融合融合前2d用RPMI-1640傳代培養(yǎng)NS0細(xì)胞，前l(fā)d用HAT培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞；小鼠摘除眼球釆血，分離陽性血清，脫頸致死小鼠，無菌取脾臟制備脾細(xì)胞，在50%PEG4000作用下與NS0細(xì)胞融合，將融合后的細(xì)胞懸液加到已鋪有滋養(yǎng)細(xì)胞層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，HAT培養(yǎng)。2)融合細(xì)胞的培養(yǎng)及陽性雜交瘤的篩選與克隆融合細(xì)胞共培養(yǎng)14d,分別于第4，7，10d用HAT換液，第14d起用RPMI-1640培養(yǎng)并篩選；間接ELISA進(jìn)行陽性孔篩選，選擇強(qiáng)陽性、抑制率高、細(xì)胞生長旺盛的孔有限稀釋克隆化，而后擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存和鑒定。3)mAb的制備采用體內(nèi)誘生腹水法。并用親和層析純化抗體。實施例3用夾心法ELISA確定病人尿液KIM-1濃度具體步驟是包被KIM-1抗體A;配制系列KIM-1標(biāo)準(zhǔn)品；準(zhǔn)備病人尿液；將系列標(biāo)準(zhǔn)品或待定值的病人尿液加入96微孔板孔內(nèi)，再使已標(biāo)記的、結(jié)合位點(diǎn)不同于包被在96微孔板上抗體A的抗體B結(jié)合，用基質(zhì)液顯色20-30分鐘后終止顯色，10分鐘后測定上述系列標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測的病人尿液中KIM-1反應(yīng)后的吸光度；建立系列標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線并從曲線中查出待定值的病人尿液的KIM-1的濃度。實施例4用竟?fàn)幏‥LISA確定病人尿液KIM-1濃度具體步驟是包被KIM-1多克隆抗體；配制系列KIM-1標(biāo)準(zhǔn)品；準(zhǔn)備病人尿液；使系列標(biāo)準(zhǔn)品或待定值的病人尿液和已標(biāo)記的KIM-1標(biāo)準(zhǔn)品混合；用基質(zhì)液顯色20-30分鐘后終止顯色，IO分鐘后測定上述系列標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測的病人尿液中UM-1反應(yīng)后的吸光度；建立系列標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線并從曲線中查出待定值的病人尿液的KIM-1的濃度。實施例5乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測病人尿液中的KIM-1含量實現(xiàn)本實例的技術(shù)方案一種檢測人KIM-1的免疫比濁法，用抗KIM-l的多克隆抗體首先與乳膠交聯(lián)，然后用交聯(lián)后的乳膠溶液與待檢標(biāo)本的KIM-1反應(yīng)，所形成的復(fù)合物引起濁度變化；用光投射強(qiáng)度或光散射強(qiáng)度表征這種變化；從KIM-1標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與相應(yīng)光散射強(qiáng)度或光投射強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待檢樣本的KIM-l含量；其中所用的KIM-l的多克隆抗體效價至少為1:500,不含雜抗體，具有識別KM-1多種抗原決定簇；待檢標(biāo)本用稀釋劑做l:200-1:1000稀釋。上述方法中，所述KIM-l標(biāo)準(zhǔn)品是純KIM-l,其濃度為Q.2mg/mi，先用稀釋劑做l:200倍稀釋，再做倍比稀釋，做成系列標(biāo)準(zhǔn)品，供作標(biāo)準(zhǔn)曲線用。權(quán)利要求1、重組人腎臟損傷分子1(KIM-1)的原核表達(dá)、純化及其檢測方法的建立。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的原核表達(dá)，其特征是，使用裝載有包含人KIM-1基因的原核表達(dá)載體在原核宿主大腸桿菌中表達(dá)蛋白產(chǎn)物。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的純化，其特征是，將宿主表達(dá)出的帶有標(biāo)簽的重組人KIM-l蛋白利用親和層析、分子篩、離子交換等方法提高重組蛋白純度。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的重組人KIM-1，其特征是，與天然人KIM-l具有相同或相似的免疫原性。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的重組人KIM-1,其特征是，該蛋白包括整個胞外域部分。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測方法，其特征是，使用重組人KIM-1，通過免疫小鼠、家兔或通過噬菌體庫，獲得高特異性人KIM-1的單抗、多抗、基因工程抗體，并通過獲得的抗體及重組蛋白，基于免疫學(xué)方法建立包括但不限于免疫比濁法以及酶聯(lián)免疫(ELISA)法的免疫學(xué)方法檢測樣品中人KIM-1的濃度的方法。全文摘要本發(fā)明涉及一種腎臟損傷相關(guān)蛋白的原核表達(dá)、純化及其在體液樣本中濃度的免疫學(xué)檢測方法的建立。本發(fā)明提供了腎臟損傷分子1(KIM-1)的原核表達(dá)及純化的方法，該方法的建立為得到高純度的KIM-1提供了強(qiáng)有力的實驗基礎(chǔ)；另外本發(fā)明涉及的重組KIM-1作為抗原，通過免疫學(xué)方法或基因工程原理有效的獲得了，特異性針對KIM-1蛋白的抗體，通過反復(fù)的實驗驗證，該發(fā)明涉及的抗原抗體可以有效利用于人體液中KIM-1的濃度檢測；該發(fā)明為腎病病人尿液或血漿中KIM-1確定了一個簡便、重現(xiàn)性好、適應(yīng)性強(qiáng)的檢測手段，并使KIM-1對臨床的指導(dǎo)作用及進(jìn)一步研究其功能提供了可能。文檔編號C07K14/435GK101603047SQ20091006249公開日2009年12月16日申請日期2009年6月10日優(yōu)先權(quán)日2009年6月10日發(fā)明者華權(quán)高申請人:武漢華美生物工程有限公司