專利名稱：重組或轉(zhuǎn)基因因子vii合成物,每個(gè)因子vii分子有兩個(gè)帶有定義了聚糖單元的n-糖基化位點(diǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以因子VII合成物形式獲得的重組的或轉(zhuǎn)基因的因子VII，因子VII的每個(gè)分子具有兩個(gè)帶有所定義聚糖部分的N-糖基化位點(diǎn)，以及其作為藥物的使用。

背景技術(shù)：
因子VII(FVII)是一種依賴于維他命K的糖蛋白，在其活化形態(tài)(FVIIa)下參與凝血過(guò)程，在存在鈣和組織因子的情況下活化因子X和因子IX。FVII以具有406個(gè)氨基酸殘基的單肽鏈形態(tài)分泌，其分子量約為50kDa。FVII包含四個(gè)特別的結(jié)構(gòu)域N端γ-羧基域(Gla)，兩個(gè)“類表皮生長(zhǎng)因子(EGF)”域，以及絲氨酸蛋白酶域。將FVII活化為FVIIa是以精氨酸152-異亮氨酸153域(精氨酸152-異亮氨酸153)連接的裂解為特征的。因此，F(xiàn)VIIa是具有分子量約為20kDa，具有152個(gè)氨基酸的輕鏈，和分子量約為30kDa，具有254個(gè)氨基酸的重鏈的化合物，兩條鏈通過(guò)單二硫鍵相互連接(半胱氨酸135-半胱氨酸262)。
血漿FVIIa包含幾種翻譯后修飾前十個(gè)谷氨酸是γ-羧基化的，天冬酰胺63部分羥化，絲氨酸52(絲氨酸52)和絲氨酸60(絲氨酸60)被氧-糖基化，并攜帶葡萄糖(木糖)0-2和巖藻糖模型，分別地，天冬酰胺145(天冬酰胺145)和天冬酰胺322(天冬酰胺322)主要通過(guò)二天線的二唾液酸化(bisialylated)的復(fù)合結(jié)構(gòu)而N-糖基化。
FVII是用于治療血友病病人的，表現(xiàn)為因子VIII(A型血友病)或因子IX(B型血友病)的缺失，對(duì)于病人表現(xiàn)出凝血因子的其他缺失，例如，F(xiàn)VII的先天性缺失。因此獲得可注射的FVIIa濃縮物是必需的。
獲取FVIIa濃縮物的最古老的方法包含從血漿蛋白質(zhì)中提純由分餾所產(chǎn)生的FVIIa。
出于那個(gè)目的，文件EP0346241描述了FVIIa富集部分的制備，其在吸附后獲得，接著洗提血漿蛋白質(zhì)分餾第二產(chǎn)物，其包含F(xiàn)VII和FVIIa以及其他蛋白質(zhì)，例如因子IX(FIX)，X(FX)和II(FII)，尤其是PPSB(P＝凝血素或FII，P＝轉(zhuǎn)變加速因子前體或FVII，S＝司徒(Stuart)因子或FX，以及B＝抗血友病因子B或FIX)的預(yù)洗提液。這種方法的缺點(diǎn)是獲取的FVII仍然含有痕量的其他凝血因子。
同樣的，文件EP0547932描述了基本上無(wú)維他命K依賴因子的高純度FVIIa濃縮物和FVIII的制造方法。通過(guò)這種過(guò)程獲得的FVII，不管其純度，仍表現(xiàn)出殘留的凝血酶原活性。
這樣一來(lái)，這些方法的主要缺點(diǎn)之一是它們只產(chǎn)生少量的產(chǎn)品。此外，還難以獲得完全無(wú)血漿中存在的其他蛋白質(zhì)的產(chǎn)品。最后，雖然已在制備血漿凝血因子的每個(gè)階段都采取了一系列措施來(lái)保證其病毒和細(xì)菌安全性(追蹤獻(xiàn)血者，為探測(cè)已知病毒性和細(xì)菌性污染物進(jìn)行測(cè)試，嚴(yán)格純化以及病毒失活處理來(lái)盡量減少血液起源的病原體的危害)，然而，病原體污染的風(fēng)險(xiǎn)并沒有完全被排除。另外，克-雅病新變體的出現(xiàn)引發(fā)了對(duì)通過(guò)血液產(chǎn)品中非傳統(tǒng)病原體傳播的恐懼。而且，從獻(xiàn)血者那所獲得血漿的體積仍然受限。
因此，自從二十世紀(jì)八十年代，編碼人體因子VII的DNA被分離(Hagen etal.(1986)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；Apr 83(8)2412-6)，并在哺乳動(dòng)物BHK細(xì)胞(幼倉(cāng)鼠腎)中進(jìn)行表達(dá)(文件EP0200421)。即使這種制造FVII的方法具有控制感興趣蛋白質(zhì)生產(chǎn)媒介的優(yōu)勢(shì)，已知倉(cāng)鼠細(xì)胞告知了其表達(dá)的Galα1，3Gal部分的蛋白質(zhì)(Spiro RG et al，J.Biol.Chem，1984，vol.259，N°15，9858 and Furukawa K.et al.，J.Biol.Chem，1992，vol.267，N°12，8012)，其免疫原性已經(jīng)被證實(shí)。
發(fā)現(xiàn)1％循環(huán)著的人體B淋巴細(xì)胞針對(duì)抗原表位(epitope)Galα1，3Gal產(chǎn)生抗體(Galili et al，Blood，1993，vol.82，2485)。該抗原表位與抗體形成復(fù)合物激活補(bǔ)體，并導(dǎo)致劇烈的免疫反應(yīng)，例如異種移植產(chǎn)生的急性移植排異反應(yīng)。15％到20％的使用由倉(cāng)鼠細(xì)胞生產(chǎn)的FVII治療的血友病患者產(chǎn)生免疫反應(yīng)(Prowse C.V et al，Blood Reviews，1998，vol.12，99)。這種免疫反應(yīng)對(duì)血友病患者而言是不幸的，因?yàn)樽兊妹庖咴缘腇VII和FVIII將導(dǎo)致出血，而這是非常難以治療的。
因此，仍然需要獲得具有較少免疫原性的重組的或轉(zhuǎn)基因的FVIIa合成物，免疫原性盡可能的低，同時(shí)優(yōu)選具有更大的病毒安全性。


發(fā)明內(nèi)容
因此，申請(qǐng)人以發(fā)展優(yōu)選的具有更大病毒安全性，展現(xiàn)出非常小的免疫原性的FVII合成物為目標(biāo)進(jìn)行了研究。
這樣一來(lái)，本發(fā)明涉及因子VII的重組的或轉(zhuǎn)基因的合成物，合成物中每個(gè)因子VII分子均表現(xiàn)出兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，其特征在于在合成物所有FVII分子中，所包含的Galα1，3Gal聚糖部分比例在0到4％之間。
令人驚訝的是，申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在FVII合成物中這樣的比例聚糖Galα1，3Gal部分在用于治療病患時(shí)是非免疫原性的。
本發(fā)明的FVII是以合成物為形式的。實(shí)際上，任何FVII，血漿的，重組的或轉(zhuǎn)基因的，都以幾種FVII蛋白的混合物為形式，這些蛋白質(zhì)特定地區(qū)別于它們不顯示相同的翻譯后修飾。該翻譯后的處理由細(xì)胞單元對(duì)FVII蛋白在不同細(xì)胞分區(qū)間轉(zhuǎn)移實(shí)施的。這些生化修飾深深地改變了蛋白質(zhì)，最終蛋白質(zhì)與直接由基因編碼的分子有相當(dāng)?shù)牟煌＿@些化學(xué)的修飾幫助調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性，以及定位。這樣，為了本發(fā)明的目的，《FVII》的表達(dá)和《FVII合成物》的表達(dá)是相同的。
《重組的或轉(zhuǎn)基因的FVII》是指由基因工程產(chǎn)生并具有翻譯后修飾特征的任何FVII，特別是前面提到的糖基化，即在FVII合成物中具有零或非常低比例的或足夠低從而是非免疫原性的Galα1，3Gal的兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。不同的是，本發(fā)明的FVII不是血漿FVII，不是從人體或動(dòng)物體血漿中提純的產(chǎn)品。
更特定的，活化的FVII是指由基因工程產(chǎn)生的任何活化FVII，其具有前面提到的翻譯后修飾特征，以及帶有確定的聚糖部分、γ-羧化和特異性二硫鍵的兩個(gè)氧-糖基化位點(diǎn)。
Galα1，3Gal部分具有含有兩個(gè)α1，3-連接半乳糖的結(jié)構(gòu)。其定位于氮-連接結(jié)構(gòu)的寡糖天線的端部。這一部分已知是具有免疫原性的。實(shí)際上，該聚糖部分在人體以及一些猴子體內(nèi)是缺乏的，因?yàn)榫幋a誘導(dǎo)其合成的酶(α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)的基因是非活化的。因此，具有這樣部分的蛋白質(zhì)施用至人體會(huì)誘導(dǎo)針對(duì)如此糖基化蛋白質(zhì)的抗體的產(chǎn)生。
因此非常需要在藥物用蛋白質(zhì)中沒有這樣的免疫原性部分。
優(yōu)選的，該合成物的特征在于在出現(xiàn)的所有因子VII分子中缺少聚糖部分Galα1，3Gal。
可以理解，對(duì)于FVII，其Galα1，3Gal結(jié)構(gòu)的比例是零或如此低以至于使用現(xiàn)有的分析設(shè)備無(wú)法從背景中區(qū)分，或者其比例特別的無(wú)法通過(guò)用4-氯-1-萘酚著色的凝集素-印跡檢測(cè)方法檢測(cè)出來(lái)。該量化方法在《實(shí)施例》部分進(jìn)行闡述。該表達(dá)表示，以相同的方式，對(duì)于任何重組的或轉(zhuǎn)基因的FVII，其Galα1，3Gal的比例接近于血漿FVII。無(wú)論何種情況，本發(fā)明的FVII合成物中Galα1，3Gal的比例對(duì)人體都是非免疫原性的。
相反的，可購(gòu)得的重組FVII表現(xiàn)出可檢測(cè)比例的Galα1，3Gal，也因此可以使用分析設(shè)備從背景噪音中區(qū)分出來(lái)。
因此，根據(jù)所使用的量化方法，Galα1，3Gal部分可以是完全沒有的，或以小于4％，或小于3.5％的量或小于3％的量出現(xiàn)，這樣的量不可能從背景噪音中區(qū)分。有利的是，Galα1，3Gal部分以與血漿FVII同樣的或接近同樣的比例存在。
本發(fā)明的FVII是一種多肽，其肽序列可以是天然人體中FVII的，即人體中出現(xiàn)的序列結(jié)合到FVII時(shí)不表現(xiàn)出混亂。這樣的序列可以通過(guò)例如在文件EP0200421中所述的序列1b編碼。
有利的是，本發(fā)明FVII的序列是序列SEQ ID NO1。
在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明的FVII可以是在其免疫原性不大于天然FVII的范圍內(nèi)的天然人類FVII的變體。這樣，這種變體的肽序列表現(xiàn)出至少70％的同一性，并有利地，至少80％或90％，更有利的與天然人類FVII序列具有至少99％的同一性，這樣的變體具有與天然FVII基本相同的生物活性。
此外，本發(fā)明的FVII也指任何FVII，其生物活性與天然FVII相比被修飾或降低了。通過(guò)例子，重組的人類失活FVII，F(xiàn)FR-FVIIa，用于治療或預(yù)防血栓(Holst et al，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.，1998 Jun，15(6)515-520)可以被提及。這樣的FVII是具有通過(guò)插入、刪除或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸而不同于天然FVII序列的氨基酸序列的多肽。
最終，在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的FVII可以被活化(FVIIa)。當(dāng)FVII代表FVIIa與組織因子(TF)相互作用時(shí)，F(xiàn)VIIa表現(xiàn)出比FVII大25到100倍的凝血活性。FVII的活化產(chǎn)生于不同蛋白酶(FIXa，F(xiàn)xa，F(xiàn)VIIa)在兩條由雙硫鍵連接的鏈中對(duì)酶原的切除。FVIIa是負(fù)責(zé)在例如帶有循環(huán)抗體的血友病患者中止血的凝血因子。一種特別有利的方法是，本發(fā)明的FVII被全部活化。
本發(fā)明的FVIIa可以包括幾種翻譯后修飾前九或十個(gè)N-端谷氨酸被γ-羧化，Asp63部分羥化，Ser52和Ser60被氧-糖基化并分別攜帶葡萄糖(木糖)0-2以及巖藻糖部分，Asn145和Asn32主要通過(guò)二天線單唾液酸化的復(fù)合結(jié)構(gòu)被N-糖基化 本發(fā)明FVII的生物活性可以通過(guò)使用FVII-缺失血漿和例如美國(guó)專利5,997,864中所述的促凝血酶原激酶來(lái)測(cè)量FVII合成物觸發(fā)血液凝結(jié)的能力而進(jìn)行量化。在該專利描述的分析中，生物活性由相對(duì)于對(duì)照組的凝結(jié)時(shí)間的減少來(lái)表達(dá)，并通過(guò)與含有1單位/mlFVII活性的標(biāo)準(zhǔn)人體血漿比較，而被轉(zhuǎn)換為《FVII單位》。
本發(fā)明的重組FVII可以通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)而獲得，蛋白在生物學(xué)系統(tǒng)中可以進(jìn)行表達(dá)。
本發(fā)明的FVII可以在任何帶有前面提到的糖基化特征的微生物、植物或動(dòng)物中表達(dá)，即在合成物中Galα1，3Gal的比例非常低或是零。微生物指任何細(xì)菌、真菌、病毒或細(xì)胞系統(tǒng)，該細(xì)胞可以是植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是動(dòng)物或人類細(xì)胞。還可以使用α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶敲除的細(xì)胞。
本發(fā)明的FVII也可以在轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物或植物內(nèi)產(chǎn)生，只要這些動(dòng)物或植物帶有FVII或前面提到的糖基化特征的FVII合成物，即在FVII合成物中沒有或非常低比例的Galα1，3Gal。這些動(dòng)物可以是兔、豬、綿羊、山羊、牛、雞或任何α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶敲除的動(dòng)物，這里所列的不是限制性的。
本發(fā)明的FVII像人類FVII一樣在145和322位置包含兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，在52和60位置有兩個(gè)氧-糖基化位點(diǎn)。在一N-糖基化位點(diǎn)上，寡糖鏈被連接到天冬酰胺(N-連接)。在氧-糖基化位點(diǎn)，寡糖鏈被連接到絲氨酸。連接到這些氨基酸的部分對(duì)于合成物的每個(gè)蛋白質(zhì)都會(huì)不同。然而，對(duì)于整個(gè)合成物，有可能量化其每個(gè)聚糖部分或每個(gè)糖的量。
本申請(qǐng)給出的不同聚糖的百分比并沒有將氧-糖基化計(jì)算在內(nèi)。
優(yōu)選地，F(xiàn)VII合成物的特征在于，在所有FVII合成物的聚糖部分中至少40％為二天線的、單唾液酸化的聚糖形式。在另一實(shí)施例中，存在的單唾液酸化的形式至少為50％。在另一實(shí)施例中，存在的單唾液酸化的形式至少為60％。
有利的，F(xiàn)VII的聚糖形式主要是二天線的單唾液酸化的聚糖形式。
FVII合成物的特征在于FVII中的至少部分唾液酸包含α2-6連接。
有利的，F(xiàn)VII中至少65％的唾液酸包含α2-6連接。更有利的，F(xiàn)VII中至少70％或80％，并且，特別的，至少90％的唾液酸包含α2-6連接。
根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，F(xiàn)VII的所有唾液酸包含α2-6連接，也就是所有唾液酸通過(guò)α2-6連接與半乳糖結(jié)合。本發(fā)明的FVII合成物可以進(jìn)一步包含含有α2-3連接的唾液酸。
事實(shí)上，F(xiàn)VII中至少65％的唾液酸包含α2-6分枝是本發(fā)明FVII的優(yōu)勢(shì)之一。事實(shí)上，可購(gòu)得的重組FVII中的唾液酸僅含有α2，3連接。然而，血漿FVII是這兩種異構(gòu)體的混合。然而，后者包含更多的α2，6連接，這使本發(fā)明的FVII更接近血漿FVII。根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)VII中65％到100％的唾液酸包含α2，6連接。在某些實(shí)施例中，F(xiàn)VII中從70％或80％到100％的唾液酸包含α2，6連接。
有利的，在FVII的二天線的、單唾液酸化的聚糖形式中，大部分是非巖藻糖基化的。
優(yōu)選地，本發(fā)明的FVII合成物中出現(xiàn)的這些二天線，單唾液酸化的，未巖藻糖基化的聚糖形式的比例大于20％。有利的，該比例高于25％，或高于40％。
特別有利的，本發(fā)明的FVII所包含巖藻糖基化的比例在20％到50％之間。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，該比例可以小于15％。
這個(gè)特征是本發(fā)明FVII的優(yōu)勢(shì)之一。事實(shí)上，可購(gòu)得的重組FVII表現(xiàn)出100％的巖藻糖基化比例，然而血漿FVII具有的巖藻糖基化比例約為16％。這樣，本發(fā)明的FVII的巖藻糖基化與血漿FVII接近，這在免疫原性上賦予了本發(fā)明的FVII優(yōu)勢(shì)。
有利的，本發(fā)明的FVII是轉(zhuǎn)基因FVII。這樣，本發(fā)明的FVII有利的是轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的重組FVII產(chǎn)品。
在本發(fā)明的一特別實(shí)施例中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因FVII生產(chǎn)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的奶中。
這種蛋白的生產(chǎn)可以通過(guò)移植負(fù)責(zé)合成奶蛋白的一個(gè)基因的調(diào)控區(qū)編碼所感興趣蛋白的基因?qū)崿F(xiàn)，其會(huì)指導(dǎo)特別是在乳腺中的合成，之后分泌到奶中。
特別有利的，本發(fā)明的FVII是通過(guò)轉(zhuǎn)基因雌兔生產(chǎn)的。
這一物種特別有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)橥貌槐憩F(xiàn)出對(duì)朊病毒，特別是對(duì)可傳染的亞急性海綿狀腦病敏感，，而這是一個(gè)主要的公共健康問(wèn)題。
另外，兔與人之間的物種屏障大。相反的，人與倉(cāng)鼠之間的物種屏障沒有那么大，其中倉(cāng)鼠是可購(gòu)得的重組FVII生產(chǎn)用的生物體系統(tǒng)。
因此，在兔中生產(chǎn)的FVII在考慮到病原體傳染的安全方面是有利的。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的FVII是在雌兔乳腺中生產(chǎn)的。
感興趣的蛋白從乳腺分泌，允許該分泌物進(jìn)入轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中，包含用組織依賴性方法來(lái)控制重組蛋白的表達(dá)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。
對(duì)表達(dá)的組織控制的執(zhí)行是由于允許導(dǎo)向特定動(dòng)物組織進(jìn)行蛋白表達(dá)的序列。這些序列就是啟動(dòng)子序列和肽信號(hào)序列。
啟動(dòng)子推進(jìn)感興趣蛋白在乳腺中的表達(dá)的例子是WVP啟動(dòng)子(乳清酸蛋白)，酪蛋白啟動(dòng)子，例如β-酪蛋白啟動(dòng)子，β-乳球蛋白啟動(dòng)子，此處列表不是限制性的。
在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物奶中重組蛋白的生產(chǎn)方法可以包括下列步驟合成DNA分子包含編碼人類FVII基因，該基因由天然分泌蛋白到奶中的啟動(dòng)子控制，該合成DNA分子被整合到非人類的哺乳動(dòng)物胚胎中。之后，胚胎被置于同種的雌性哺乳動(dòng)物中。一旦從該胚胎中獲得的哺乳動(dòng)物發(fā)育充分，誘導(dǎo)該哺乳動(dòng)物進(jìn)入哺乳期，收集奶。該奶中含有感興趣的轉(zhuǎn)基因FVII。
在非人類的雌性哺乳動(dòng)物的奶中制備蛋白的方法示例在文件EP0527063中進(jìn)行了描述，該教導(dǎo)可以作為本發(fā)明感興趣蛋白生產(chǎn)的參考，該例子不是限制性的。
含有WAP啟動(dòng)子的血漿通過(guò)引入包含WAP基因啟動(dòng)子的序列而制備，該血漿制備成能夠接受置于依賴WAP啟動(dòng)子之下的外來(lái)基因。編碼人體FVII的基因被整合，并被置于依賴WAP啟動(dòng)子之下。含有該啟動(dòng)子和編碼感興趣蛋白的基因的血漿用來(lái)通過(guò)顯微注射到兔雄原核中而獲得轉(zhuǎn)基因雌兔。之后，胚胎被轉(zhuǎn)移至通過(guò)激素制備的雌性的輸卵管中。轉(zhuǎn)基因的存在通過(guò)對(duì)從所獲得的轉(zhuǎn)基因幼兔中提取的DNA的Southern雜交來(lái)顯示。動(dòng)物奶中的濃度通過(guò)專門的放射免疫學(xué)檢測(cè)進(jìn)行評(píng)估。
通過(guò)雌兔在其奶中生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因FVII以合成物的形式獲得，其中合成物中因子VII的每個(gè)分子表現(xiàn)出兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，其特征在于在FVII合成物的所有分子中，Galα1，3Gal聚糖部分的比例小于4％，或甚至為零。這樣，有利的，通過(guò)雌兔生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因FVII不包含Galα1，3Gal聚糖部分。
優(yōu)選的，本發(fā)明的雌兔的轉(zhuǎn)基因FVII合成物的特征在于，合成物所有的聚糖部分中，至少40％是二天線的，單唾液酸化的聚糖形式。在另一實(shí)施例中，存在的單唾液酸化的形式至少是50％。在另一實(shí)施例中，存在的單唾液酸化的形式至少是60％。
有利的，聚糖的主要形式是二天線的，單唾液酸化的聚糖形式。
FVII合成物的特征在于因子VII的至少部分唾液酸包含α2-6連接。
有利的，F(xiàn)VII中至少65％的唾液酸包含α2-6連接。更有利的，F(xiàn)VII中至少70％或80％，特別的，至少90％的唾液酸包含α2-6連接。
根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例，F(xiàn)VII的所有唾液酸包含α2-6連接，即所有唾液酸通過(guò)α2-6連接與半乳糖結(jié)合。本發(fā)明的FVII合成物可以進(jìn)一步包含含有α2-3連接的唾液酸。
優(yōu)選的，在FVII的二天線，單唾液酸化的聚糖形式中，大部分是未巖藻糖基化的。有利的，本發(fā)明的FVII合成物中出現(xiàn)的這些二天線，單唾液酸化的，未巖藻糖基化的聚糖形式的比例大于20％。有利的，該比例高于25％，或高于40％。
優(yōu)選的，本發(fā)明的FVII合成物所包含巖藻糖化的比例在20％到50％之間。
在本發(fā)明的一實(shí)施例中，該比例可以小于15％。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因FVIIa可以包含幾種翻譯后修飾前九或十個(gè)N-端谷氨酸被γ-羧化，Asp63(門冬酰胺63)部分地羥化，Ser52(絲氨酸52)和Ser60(絲氨酸60)被氧-糖基化并分別攜帶葡萄糖(木糖)0-2和巖藻糖部分，Asn145和Asn322主要通過(guò)二天線的單唾液酸化的復(fù)合結(jié)構(gòu)而N-糖基化。
本發(fā)明的FVII可以從奶中利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的技術(shù)進(jìn)行提純。例如，如美國(guó)專利6,268,487中所描述的一種從牛奶中提純感興趣蛋白的方法，其包含下列步驟a)將奶在具有足夠引起滯留物和透過(guò)物的多孔膜上進(jìn)行切向過(guò)濾，透過(guò)物含有外源性蛋白，b)將透過(guò)物經(jīng)過(guò)通過(guò)色譜進(jìn)行捕獲的裝置來(lái)移置外源性蛋白，并得到流出物，c)將流出物與滯留物融合，d)重復(fù)步驟a)到c)直到FVII從脂質(zhì)、酪蛋白膠粒中分離出來(lái)，且至少75％的FVII被回收。
有利的，本發(fā)明的FVII被活化。活體中，F(xiàn)VIIa由在兩條由二硫鍵連接的鏈上用不同蛋白酶(FIXa，F(xiàn)xa，F(xiàn)VIIa)對(duì)酶原的裂解形成。FVIIa自身具有非常低的酶活性，但是與其輔助因子，組織因子(TF)復(fù)合后，其通過(guò)活化FX和FIX而觸發(fā)凝血過(guò)程。
因此，本發(fā)明的FVIIa是由通過(guò)單條二硫鍵相互連接(半胱氨酸135-半胱氨酸262)的分子量約為20kDa，具有152個(gè)氨基酸的輕鏈，和分子量約為30kDa，具有254個(gè)氨基酸的重鏈組成的化合物。
這樣，本發(fā)明的FVII是具有與血漿FVII相近活性和結(jié)構(gòu)的活化的FVII。
FVIIa在與組織因子(TF)相互作用上表現(xiàn)出比FVII大25到100倍的凝血活性。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，F(xiàn)VII可以在體外通過(guò)因子Xa，VIIa，IIa，IXa和XIIa活化。
本發(fā)明的FVII也可以在其提純過(guò)程中被活化。
申請(qǐng)人:驚奇的注意到FVII即使置于抗乳血清中天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子，例如WAP啟動(dòng)子，的控制下，其仍然易與奶中的鈣離子結(jié)合，從而與酪蛋白膠粒結(jié)合。
這樣，開發(fā)用于提取和提純FVII的，易于捕獲與抗乳血清復(fù)合物結(jié)合的或與酪蛋白膠粒結(jié)合的蛋白的方法將是非常有利的，該FVII表現(xiàn)出對(duì)奶中鈣離子的親和力。
例如，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的奶中提取和純化轉(zhuǎn)基因FVII的方法包含以下步驟 a)從奶中提取FVII，因子VII結(jié)合到奶中鈣的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)鹽以及/或復(fù)合物，通過(guò)由向奶中加入可溶性鹽而獲取的鈣化合物沉淀，其陰離子由于其形成所述不可溶的鈣化合物的能力而被選擇，從而通過(guò)該途徑從所述鹽和/或復(fù)合物中釋放因子VII，這樣因子VII就存在于液相中了， b)將蛋白質(zhì)富集的液相與鈣化合物沉淀分離，所述液相被進(jìn)一步分離為脂相和包含蛋白的水性非脂相， c)使用預(yù)定濃度的磷酸鹽為基礎(chǔ)的洗提緩沖液，對(duì)水性非脂相進(jìn)行親和層析步驟，以及 d)使用弱堿性陰離子交換柱，使用適合對(duì)殘留在所述柱上的因子VII連續(xù)洗提的緩沖液，對(duì)根據(jù)步驟c)得到的因子VII的洗出液進(jìn)行兩至三次層析。
申請(qǐng)人:驚奇地注意到，這樣的方法使用了對(duì)結(jié)合到奶中鈣的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)鹽以及/或復(fù)合物的FVII的提取步驟，通過(guò)由向奶中加入可溶性鹽而獲取的鈣化合物沉淀，其陰離子由于其形成所述不可溶的鈣化合物的能力而被選擇，而FVII從這些所述奶的鈣的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)鹽以及/或復(fù)合物和/或有機(jī)的和/或無(wú)機(jī)的復(fù)合物中被釋放，并重新在液相溶液中被發(fā)現(xiàn)。
FVII結(jié)合到所述奶的鈣的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)鹽以及/或復(fù)合物，這是指該FVII表現(xiàn)出對(duì)這些鈣的鹽和/或復(fù)合物的親和性。因此FVII表現(xiàn)出足夠數(shù)量的對(duì)這些鹽和/或復(fù)合物完全或部分結(jié)合的固定位點(diǎn)。
奶的鈣有機(jī)和/或無(wú)機(jī)鹽以及/或復(fù)合物表示磷酸鈣鹽與膠態(tài)酪蛋白膠粒相互作用的。不同的酪蛋白在存在磷酸鈣鹽的情況下形成膠態(tài)的膠粒復(fù)合體，其直徑能達(dá)到約0.5μm，例如以三鈣磷酸鹽的聚合《團(tuán)簇》形式，即Ca9(PO4)6。這些膠粒是由酪蛋白亞基形成的，酪蛋白亞基包含包圍著疏水核的富含酪蛋白-κ的親水層，磷酸鈣鹽通過(guò)靜電作用與親水層結(jié)合。這些磷酸鹽也可存在于膠粒的內(nèi)部空間中，不與酪蛋白結(jié)合。這些鹽和/或復(fù)合物還以磷酸一鈣和/或磷酸二鈣的形式存在于奶中，這與鈣的其他離子形式相平衡，取決于所執(zhí)行的化學(xué)的和生化的反應(yīng)。這些鈣鹽和/或復(fù)合物可以存在于酪蛋白膠粒的內(nèi)部空間中。
這種FVII對(duì)該鈣的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)鹽以及/或復(fù)合物的親和力可以由未修飾的或體內(nèi)或體外修飾過(guò)，例如通過(guò)翻譯后修飾，的蛋白的相互作用產(chǎn)生。
在本發(fā)明的方法中，轉(zhuǎn)基因FVII代表任何具有不同屬性，特別涉及糖基化的轉(zhuǎn)基因FVII。有利的，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因FVII是前述已經(jīng)定義的FVII。
不可溶鈣化合物是指在奶中溶解度小于0.5％的鈣鹽或復(fù)合物。
大部分FVII與酪蛋白膠粒的磷酸鈣鹽結(jié)合。FVII表現(xiàn)出對(duì)鈣的強(qiáng)烈的親和力，具有高的親和常數(shù)，即至少70％到90％的FVII被吸收于酪蛋白膠粒中。余下的FVII表現(xiàn)出對(duì)前面提到的其他形式的鈣的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)鹽以及/或復(fù)合物的親和力。
沒有被任何所觀察到機(jī)理的解釋束縛，申請(qǐng)人假設(shè)可溶性鹽的加入替換了膠粒的磷酸鈣鹽的平衡，從而導(dǎo)致其變性，以及酪蛋白亞基的聚合沉淀。吸收于膠粒中和/或上的與磷酸鈣鹽結(jié)合的FVII在其變性時(shí)被釋放進(jìn)入媒介中。另外，同時(shí)，F(xiàn)VII還被從磷酸鈣鹽上釋放或分離，由于它們?cè)诒景l(fā)明方法中所使用的可溶性鹽的作用下以不溶性鈣化合物的形式沉淀。同樣的，與可溶性鈣的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)鹽以及/或復(fù)合物結(jié)合的FVII將會(huì)由于相同類型的反應(yīng)而分離。
(見圖9) 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，該可溶性鹽是任何可以獲得期望效果的鹽。
在本發(fā)明的方法中，為了成功將FVII從鈣的鹽和/或復(fù)合物上分離，所使用的可溶性鹽可以以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇的濃度存在于奶中。事實(shí)上，該濃度足夠允許至少20％的分離，或有利的，至少30％到50％的FVII分離。特別有利的，該濃度足夠允許至少60％到80％的，或至少90％的FVII分離。
本發(fā)明的處理允許尤其是酪蛋白亞基聚合的沉淀。該沉淀是由于如前面提到的酪蛋白膠粒的變性。所應(yīng)用的本發(fā)明的處理由于沉淀而破壞了奶的膠質(zhì)狀態(tài)。
因此，本發(fā)明的處理是一種允許奶從膠質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w狀態(tài)的處理，其對(duì)應(yīng)于膠質(zhì)/液體的直接提取。
本發(fā)明的處理還可以獲得比初始奶中顏色更淺的抗乳血清。事實(shí)上，這是酪蛋白將它們的白色賦予了奶。一旦沉淀，它們不再能夠?qū)⑺鼈兊念伾x予奶。
根據(jù)本發(fā)明的可溶性鹽是指在奶中至少具有0.5份鹽每份奶(w/w)的溶解度的鹽。
有利的，處理中所使用的可溶性鹽是磷酸鹽。該鹽可以是水溶液，其隨后被加入到奶中，或是粉狀的，其被直接加入到奶中。
優(yōu)選的，該磷酸鹽選自由磷酸鈉，磷酸鋰，磷酸鉀，磷酸銣和磷酸銫組成的組，而特定的，是磷酸鈉。
可選的，在本發(fā)明處理中所使用的可溶性鹽可以是堿金屬草酸鹽，特別是草酸鈉或鉀，或堿金屬碳酸鹽，特別是碳酸鈉或鉀，或其的混合物。
有利的，為實(shí)施處理而制備的可溶性鹽在水溶液中的濃度在100mM到3M之間，更優(yōu)選的，在200mM到500mM之間，特別的，在200mM到300mM之間。
含有FVII的用于提取的奶可以是原始的全奶或脫脂奶。對(duì)脫脂奶采用本發(fā)明處理的優(yōu)勢(shì)在于其脂質(zhì)含量較低。該處理同樣可以應(yīng)用于新鮮的或冰凍過(guò)的奶。
該方法包含步驟b)對(duì)脂相和含有蛋白的水性非脂相的液相分離，優(yōu)選的是通過(guò)離心實(shí)現(xiàn)的。非脂水相實(shí)際上是抗乳血清。該分離步驟同時(shí)還可以分離酪蛋白膠粒狀亞基的聚合體以及鈣化合物的沉淀物。
在分離步驟之后，該處理還可以進(jìn)一步包含對(duì)非脂水相連續(xù)過(guò)濾的步驟，孔隙度逐漸減小，優(yōu)選的是1μm，接著是0.45μm。這些過(guò)濾器的使用，例如玻璃纖維基礎(chǔ)的，可以減少油脂，脂肪球以及自然存在于奶中的磷脂的含量?？紫抖刃∮?.5μm的過(guò)濾器可以保持非脂水相以及隨后執(zhí)行純化的載體(超濾器，層析柱等)(見此后)的細(xì)菌學(xué)質(zhì)量。脂相優(yōu)選的通過(guò)這些能完全保留奶中脂肪球的過(guò)濾器過(guò)濾，濾出液是清澈的。
這一步驟可以接著通過(guò)超濾的濃縮/透析的步驟。
該濃縮允許減少非脂水相的體積來(lái)保存它。超濾膜根據(jù)所感興趣蛋白的特征由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。通常，空隙尺寸小于或等于FVII分子量的孔隙度限制可以在沒有顯著損失的情況下濃縮產(chǎn)品。例如，空隙尺寸為50kDa的膜可以無(wú)損失地濃縮分子量為50kDa的FVII。
透析意在為了接下來(lái)的純化步驟，即層析法，調(diào)節(jié)含有FVII的非脂水相。透析也可以去除小分子量的化合物，例如乳糖，鹽，肽，朊間質(zhì)-蛋白胨以及任何會(huì)破壞產(chǎn)品保藏的試劑。最后，優(yōu)選的使用保留限度為50kDa的膜，從而FVII不會(huì)濾過(guò)該膜。
優(yōu)選的，透析緩沖液是0.025到0.050M，pH7.5到8.5的磷酸鈉溶液。
步驟b)之后，或者如果出現(xiàn)情況，在過(guò)濾和/或濃縮/透析的步驟之后獲得的非脂水相可以在實(shí)施后繼純化步驟之前冰凍并存放于-30℃。
之后，根據(jù)步驟b)獲得的非脂水相要進(jìn)行步驟c)使用標(biāo)準(zhǔn)層析設(shè)備的親和層析，有利的在層析柱上實(shí)施，其載體是羥磷灰石膠(Ca10(PO4)6(OH)2)或者氟磷灰石(Ca10(PO4)6F2)膠。這樣水相中的FVII被留在載體上，大部分的未保留的乳蛋白被消除。
優(yōu)選的，使用的層析柱與基于0.025M到0.035M磷酸鈉、pH7.5到8.5的水緩沖液A相平衡。富含F(xiàn)VII的水相被注入到柱上，其能夠保留FVII。未保留部分通過(guò)緩沖液A的浸透而去除，直到回到基線(RBL)來(lái)保證對(duì)如乳蛋白這樣不期望的化合物進(jìn)行良好的去除。吸收測(cè)量在波長(zhǎng)(λ)為280nm處進(jìn)行。
根據(jù)步驟c)的FVII的洗提用基于磷酸鹽的緩沖液，例如磷酸鈉或鉀或其混合，以預(yù)定濃度進(jìn)行，優(yōu)選的代表基于0.25M到0.35M，pH7.5到8.5的磷酸鈉緩沖液B。被洗提的部分被收集直至RBL(回到基線)。吸收測(cè)量在波長(zhǎng)(λ)為280nm處進(jìn)行。
由于這一步驟，超過(guò)90％的所有乳蛋白被去除，而超過(guò)90％的FVII被回收。在這一步，F(xiàn)VII在該洗提部分中的純度約為5％。
純度定義為FVII與被考慮的樣品、部分或洗提液中存在的所有蛋白的重量比例。
有利的，F(xiàn)VII的特異活性作為FVII對(duì)層析載體的親和力的結(jié)果從因子10增加到25。
之后，由步驟c)所得到的含有FVII的洗提液優(yōu)選的進(jìn)行切向過(guò)濾。
切向過(guò)濾膜由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)FVII的特性選擇。一般而言，孔隙尺寸比FVII分子量大兩倍的孔隙度可以對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾。因此孔隙尺寸為100kDa的膜可以對(duì)FVII進(jìn)行過(guò)濾，并有好的產(chǎn)量。
這一步過(guò)濾的目的是減少尤其是分子量大于FVII的蛋白質(zhì)的量，特別的來(lái)去除非典型型FVII(例如聚合形態(tài)的FVII)，以及在一定時(shí)間后易于降解其的蛋白酶。最后，使用孔隙度為100kDa化合物的膜是非常有利的。
有利的，過(guò)濾后的FVII的洗提液通過(guò)用保留限度為50kDa的膜超濾再次進(jìn)行濃縮和透析。透析緩沖液優(yōu)選的是0.15到0.20M的氯化鈉溶液。
在步驟c)最后獲得的FVII的洗提液可選的通過(guò)過(guò)濾、濃縮和透析，接著在弱堿性陰離子交換柱上使用合適的用于對(duì)保留在所述柱上因子VII進(jìn)行后續(xù)洗提的緩沖液進(jìn)行兩或三次層析步驟(步驟d)。這些步驟能對(duì)FVII進(jìn)一步純化，特別的對(duì)于乳蛋白。這些步驟用標(biāo)準(zhǔn)層析設(shè)備實(shí)施。
第一次陰離子交換層析步驟有利的使用

FF膠型層析載體進(jìn)行，其根據(jù)下述優(yōu)選的操作條件保留因子FVII。該載體用0.05M，pH7.0到7.5的Tris緩沖液沖洗。未保留的部分被沖洗緩沖液去除，直到回到基線。FVII的洗提液用基于0.05M Tris以及0.020M到0.05M，優(yōu)選的0.05M，氯化鈣的pH7.0到8.0的水性緩沖液進(jìn)行，來(lái)獲得FVII的第一次洗提液。吸收測(cè)量在波長(zhǎng)(λ)為280nm處進(jìn)行。
這一步FVII的回收率至少為70％，并能去除約80％的所結(jié)合蛋白，尤其是奶蛋白。
之后，F(xiàn)VII的洗提液如前面所述的進(jìn)行一透析步驟，使用0.15到0.20M氯化鈉作為緩沖液。
第二次層析步驟有利的在

FF膠型層析載體上進(jìn)行，根據(jù)下述優(yōu)選的操作條件，將在第一次陰離子交換層析步驟中獲得的FVII的第一次洗提液注入其中。載體用0.05M，pH7.0到7.5的Tris緩沖液沖洗。未保留部分隨沖洗緩沖液被去除，直到回到基線。通過(guò)在λ＝280nm吸收進(jìn)行檢測(cè)。
保留在載體上的FVII的洗提液用基于0.05M Tris和0.005M氯化鈣，pH7.0到8.0的水性緩沖液實(shí)施，以獲得高純度的FVII的第二次洗提液，即純度高于90％。吸收測(cè)量在波長(zhǎng)(λ)為280nm處進(jìn)行。
第二步層析意在限制可能的蛋白質(zhì)的蛋白降解。
在這一步，洗提液的純度約為90％，超過(guò)95％的殘留結(jié)合蛋白被消除。之后，該洗提液可以如前面所述的進(jìn)行透析步驟，使用0.15到0.20M氯化鈉作為緩沖液。
根據(jù)本發(fā)明非常優(yōu)選的實(shí)施，該處理包括在弱堿性陰離子交換柱上使用適當(dāng)?shù)膹乃鲋线B續(xù)洗提因子VII的緩沖液進(jìn)行的三次層析步驟。從而，在兩次前面提到的陰離子交換層析后，實(shí)施第三次陰離子交換層析步驟。該步驟可以制備富含蛋白質(zhì)的合成物，以適用于醫(yī)藥用途。
第三次層析步驟有利的在

FF膠型層析載體上進(jìn)行，根據(jù)下述優(yōu)選的操作條件，將在第二次陰離子交換層析步驟中所獲得的第二次FVII洗提液注入其中。
第二次陰離子交換層析步驟所獲得的第二次洗提液優(yōu)選的在用1到5倍體積的注射用純水(WFI)稀釋后注入到充滿能保留FVII的

FF型載體的柱中。該載體用0.05M Tris，pH7.0到7.5的緩沖液進(jìn)行沖洗。未保留部分用沖洗緩沖液去除，直到RBL(回到基線)。吸收測(cè)量在波長(zhǎng)(λ)為280nm處進(jìn)行。
保留在載體上的FVII的洗提液用基于0.02M Tris和0.20到0.30M，優(yōu)選地0.28M氯化鈉的pH6.5到7.5的水性緩沖液實(shí)施。吸收測(cè)量在波長(zhǎng)(λ)為280nm處進(jìn)行。
這樣獲得的轉(zhuǎn)基因FVII合成物的純度大于95％。非常有利的，該合成物以FVII的濃縮物形式出現(xiàn)。
該處理的實(shí)施導(dǎo)致累計(jì)的20％到25％的產(chǎn)率，每升被處理的奶至少能獲得20mg純化的FVII。
因此，三次在陰離子交換膠上的層析步驟能夠進(jìn)一步純化FVII。此外，它們?cè)试S濃縮和制備FVII合成物。
FVII的活化在處理中發(fā)生，很可能在第一步陰離子交換層析中發(fā)生。
一旦最后的洗提液被回收，所述洗提液可以用0.22μm的過(guò)濾器進(jìn)行一次過(guò)濾，并分裝至容器中，再在-30℃下冰凍并儲(chǔ)存。
本發(fā)明的處理還可包括至少以下步驟中的至少一步配制、病毒滅活和殺菌。一般而言，該處理可包括，在親和性層析步驟之前的一步抗病毒處理步驟，其有利的由溶劑/洗滌劑，特別的含有

80(1％w/v)和TnBP(tri-n-磷酸丁酯)(0.3％v/v，)的混合物，導(dǎo)致包膜病毒的失活。此外，從第二次在陰離子交換柱上的層析步驟獲得的FVII洗提液優(yōu)選地進(jìn)行一次納米過(guò)濾來(lái)有效地消除病毒，特別是非包膜病毒，例如細(xì)小病毒B19。使用ASAHI PLANOVATM15過(guò)濾器來(lái)截留大小大于15nm的病毒是可能的。
本發(fā)明的另一目的是本發(fā)明的FVII合成物用于藥物用途。
本發(fā)明的另一目的是根據(jù)本發(fā)明使用該FVII合成物來(lái)制備用于治療血友病患者的藥物。
本發(fā)明的另一目的是根據(jù)本發(fā)明使用該FVII合成物來(lái)制備用于治療多發(fā)出血性損傷的藥物。
本發(fā)明的另一目的是根據(jù)本發(fā)明使用該FVII合成物來(lái)制備用于采用手術(shù)止血治療大量不可控制出血的藥物。
本發(fā)明的另一目的是根據(jù)本發(fā)明使用該FVII合成物來(lái)制備用于治療由于抗凝血?jiǎng)┻^(guò)量而發(fā)生的出血或溢血(hemorrages)的藥物。
本發(fā)明的另一目的是一種藥物合成物，其包含根據(jù)本發(fā)明的因子VII和藥物學(xué)可接收的賦形劑和/或載體。
該賦形劑可以是任何溶液，例如生理鹽水，生理的、等壓的或緩沖溶液，和任何懸浮液，膠或粉劑，還有適于藥物學(xué)應(yīng)用的以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。
根據(jù)本發(fā)明的合成物可以進(jìn)一步含有一種或多種藥劑或載體，選自分散劑、增容劑、穩(wěn)定劑、表面活化劑或防腐劑之中。另一方面，該合成物可以包含其他藥劑或有效成分。
此外，該合成可以通過(guò)不同方式不同形式施用。施用可以是任何傳統(tǒng)的醫(yī)療方法類型的方式，例如特別的通過(guò)系統(tǒng)的途徑，特別的通過(guò)靜脈內(nèi)，皮內(nèi)，瘤內(nèi)，皮下，腹膜內(nèi)，肌肉內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)注射。例如，瘤內(nèi)注射或瘤附近區(qū)域注射或沖洗瘤，可以被提及。
劑量可以根據(jù)施用的數(shù)量，與其他有效成分的結(jié)合，病理學(xué)發(fā)展的程度等等而變化。
本發(fā)明的其他方面和優(yōu)勢(shì)將通過(guò)以下例子進(jìn)行描述，它們意在描述而不是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例中使用的縮略語(yǔ) FVII-tg＝FVIIa-tg根據(jù)本發(fā)明的活化的轉(zhuǎn)基因FVII FVII-rec＝FVIIa-rec可購(gòu)得的重組的活化的FVII FVII-pd＝FVIIa-pd從人類血漿中提純的、血漿來(lái)源的活化的FVII。
MALDI-TOF基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間 HPCE-LIF高效毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光 ESI-MS質(zhì)譜-電噴霧電離 LC-ESIMS液相色譜-質(zhì)譜-電噴霧電離 NP-HPLC正相高效液相色譜 PNGase F肽N-糖苷酶F LC-MS液相色譜-質(zhì)譜


圖1根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)于雌兔奶中的轉(zhuǎn)基因FVII的提取和純化/活化方法的例子的略圖。
圖2攜帶N-糖基化位點(diǎn)的肽的去卷積(deconvoltuted)質(zhì)譜ESI圖。
圖3通過(guò)PNGase F的FVII去糖基化之后的HPCE-LIF的電泳圖譜；圖例在中央的兩條電泳圖譜FVII-tg；

巖藻糖，(■)GlcNAc(N-乙酰氨基葡糖)，(●)甘露糖，(●)半乳糖，(▲)唾液酸 頂部的電泳圖譜FVII-pd 中央(2)的電泳圖譜FVII-tg 底部的電泳圖譜FVII-rec 圖4用NP-HPLC得到的FVII-tg(中央的圖譜)，F(xiàn)VII-pd(頂部的圖譜)和FVII-rec(底部的圖譜)的特征圖。糖殘基的圖例見圖3。
圖5使用MALDI-TOFMS對(duì)FVII-tg的主要聚糖形式的確定。糖殘基的圖例見圖3 圖6甲狀腺球蛋白的寡糖的HPCE-LIF分析。糖殘基的圖例見圖3 圖7轉(zhuǎn)基因FVII的寡糖的HPCE-LIF分析。糖殘基的圖例見圖3 圖8Galα1，3Gal結(jié)構(gòu)的量化 圖9FVII提取機(jī)制的例子 圖10攜帶氧-糖基化位點(diǎn)肽的去卷積ESI質(zhì)譜。這些肽在用胰蛋白酶分解后獲得，并進(jìn)行LC-ESIMS分析。Fuc巖藻糖，Glc葡萄糖，Xyl木糖 圖11攜帶γ-羧化位點(diǎn)肽的去卷積ESI質(zhì)譜。這些肽在用Asp-N分解后獲得，并進(jìn)行LC-ESIMS分析。不同批FVII-tg之間所得到的結(jié)果非常相似。不同肽的質(zhì)量是單一同位素質(zhì)量。Glaγ-羧酸。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1在轉(zhuǎn)基因雌兔的奶中生產(chǎn)生產(chǎn)人類FVII蛋白 首先，質(zhì)粒p1通過(guò)引入WAP基因的Bam H1-HindIII(6.3Kb片段)序列(在文件Devinoy et al，Nucleic Acids Research，vol.16，no.16，25 August 1988，p.8180中描述)到處于序列Bam H1與Hind III之間的p-poly III-I載體的多連接子(在文件Lathe et al，Gene(1987)57，193-201中描述)而制備。
在這個(gè)克隆的過(guò)程中，位點(diǎn)Bam H1被抑制，并被存在于載體p1中的位點(diǎn)Cla I取代。因此載體p1是能接受外來(lái)基因，其被置于依賴于6.3Kb WAP啟動(dòng)子。引入的外來(lái)基因可以引入，例如到多連接子的Sal I位點(diǎn)。該包含啟動(dòng)子和外來(lái)基因全體的插入物可以在切斷兩個(gè)Not 1位點(diǎn)之后從質(zhì)粒中分離，這兩個(gè)位點(diǎn)位于p-poly III-I質(zhì)粒的多連接子的末端。
從質(zhì)粒p1獲得的質(zhì)粒p2，包含兔的WAP基因的啟動(dòng)子(6.3Kb)和人類FVII的基因。用于獲得轉(zhuǎn)基因雌兔的片段被包含于兩個(gè)Not1位點(diǎn)之間。
位點(diǎn)Hid III通過(guò)位點(diǎn)特異性突變引入基因的前導(dǎo)序列來(lái)作為克隆位點(diǎn)使用。
轉(zhuǎn)基因雌兔通過(guò)傳統(tǒng)的顯微注射技術(shù)(Brinster et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82，4438-4442)獲得。包含500份基因拷貝的1-2p1被注入鼠胚胎的雄原核中。該構(gòu)建在質(zhì)粒p-poly III-I中進(jìn)行(Lathe et al，Gene(1987)57，193-201)。包含重組基因的該質(zhì)粒的Not 1-Not 1片段被顯微注射。之后，胚胎被轉(zhuǎn)移到激素制備的繼承性雌性的輸卵管中。約10％的被操作的胚胎產(chǎn)生幼兔，而2％到5％的被操作的胚胎產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的幼兔。轉(zhuǎn)基因的存在通過(guò)對(duì)提取自兔尾的DNA進(jìn)行Southern轉(zhuǎn)換技術(shù)來(lái)顯示。動(dòng)物血液中以及奶中FVII的濃度通過(guò)特異性放射免疫檢測(cè)得到計(jì)算。
FVII的生物學(xué)活性通過(guò)往細(xì)胞間或兔哺乳動(dòng)物移植培養(yǎng)基加入奶而得到評(píng)估。
為獲得能在其奶中產(chǎn)生本發(fā)明FVII的轉(zhuǎn)基因雌兔所采用的技術(shù)在文件EP0527063中有更詳細(xì)的描述。
實(shí)施例2獲得的FVII的提取和純化 a)FVII的提取 取500ml全原奶，用9倍體積的0.25M，pH8.2的磷酸鈉緩沖液稀釋。室溫下攪拌30分鐘后，富含F(xiàn)VII的水相在15℃下10000g離心1小時(shí)(離心機(jī)Sorvall Evolution RC-6700rpm-轉(zhuǎn)子SLC-6000)。6罐約為835ml是必需的。
離心后，存在三個(gè)相一脂相在表層(乳脂)，一非脂水性清澈富含F(xiàn)VII的相(主要相)以及一白色顆粒狀固相(不溶性酪蛋白和鈣化合物沉淀)。
含有FVII的非脂水相通過(guò)蠕動(dòng)泵(persistaltic pump)收集直至脂相。脂相單獨(dú)回收。固相(沉淀)被去除。
然而，非脂水相仍然含有非常少量的脂質(zhì)，其在一系列過(guò)濾器上過(guò)濾(PallSLK7002U010ZP-孔徑為1μm的玻璃纖維預(yù)濾器-之后Pall SLK7002NXP-孔徑為0.45μm的尼龍66)。在過(guò)濾的最后，脂相通過(guò)該過(guò)濾系列，其完全截留了奶中的脂肪球，濾出液是清澈的。
過(guò)濾過(guò)的非脂水相接著在超濾膜上進(jìn)行透析(Millipore Biomax 50kDa—0.1m2)以使其與層析相相容。分子量約為50kDa的FVII不濾過(guò)該膜，不像奶中的鹽、糖以及肽。第一時(shí)間內(nèi)，溶液(約5000ml)被濃縮到500ml，接著通過(guò)維持這個(gè)恒定體積的超濾膜透析可以去除電解質(zhì)以及使該生物材料適于層析步驟。透析緩沖液是0.025M，pH8.2的磷酸鈉緩沖液。
含有FVII的非脂水相可以被吸收到富含F(xiàn)VII-tg的抗乳血清中。該制備物在后繼處理前被保存于-30℃。
這步的FVII的總回收率非常令人滿意90％(用磷酸鹽提取91％+透析/濃縮99％)。
包含F(xiàn)VII的非脂水相在這步的最后完全清澈，并適于后續(xù)層析步驟。
大約93000IU的FVII-tg在這一步被提取。在這一步制備中的FVII的純度在0.2％的級(jí)別。
b)FVII的純化 1.羥磷灰石膠上的層析 Amicon90柱(直徑9cm-橫截面64cm2)充滿BioRad陶瓷羥磷灰石I型(CHT-I)膠。
該膠用水性緩沖液A平衡，A包含0.025M磷酸鈉和0.04氯化鈉的混合物，pH8.0。存于-30℃的所有制備物用水浴在37℃解凍，直到冰塊完全溶解，接著注入到膠上(直線流動(dòng)速率100cm/h，即105ml/min)。未保留的部分利用含有0.025M磷酸鈉和0.04M氯化鈉、pH8.2的緩沖液的經(jīng)過(guò)而去除，直到回到基線(RBL)。吸收測(cè)量在波長(zhǎng)(λ)為280nm處進(jìn)行。
含有FVII-tg部分用含有0.25M磷酸鈉和0.4M氯化鈉的、pH8.0的緩沖液B實(shí)施洗提。洗提部分被收集，直到回到基線。吸收測(cè)量在波長(zhǎng)(λ)為280nm處進(jìn)行。
該層析可以回收超過(guò)90％的FVII-tg，同時(shí)消除超過(guò)95％的乳蛋白。該特異活性(S.A.)增加了25倍。在這一步，可獲得約85000IU，純度為4％的FVII-tg。
2.100kDa切向過(guò)濾以及50kDa濃縮/透析 前一步驟中所有的洗提液在100kDa超濾膜(Pall OMEGA SC 100K-0.1m2)的切向模式下過(guò)濾。FVII濾過(guò)100kDa的膜，同時(shí)分子量超過(guò)100kDa的蛋白不能濾過(guò)。
之后，濾過(guò)的部分被濃縮到約500ml，接著在50kDa的已在之前描述了的超濾器上透析。透析緩沖液使用0.15M的氯化鈉。
在這階段的處理中，產(chǎn)品在進(jìn)行離子交換層析前被保存于-30℃。
這一階段可以減少分子量超過(guò)100kDa蛋白的量，并且特別的是酶前體。在100kDa膜上的處理可以截留留約50％的蛋白，其中為高分子量蛋白，同時(shí)濾過(guò)95％的FVII-tg，為82000IU的FVII-tg。
該處理可以減少后續(xù)步驟中的蛋白酶水解的風(fēng)險(xiǎn)。
3.在 FF上的層析 這連續(xù)三步在離子交換膠

Fast Flow(QSFF)上進(jìn)行的層析是為了純化有效成分，以允許FVII活化為活化的FVII(FVIIa)，以及最終濃縮并制備為FVII合成物。對(duì)化合物的檢測(cè)通過(guò)λ＝280nm處的吸收測(cè)量而進(jìn)行。
3.1

FF1步-洗提《高鈣》 一直徑2.6cm(橫截面5.3cm2)的柱用100ml

FF膠(GEHealthcare)填充。
該膠用0.05M，pH7.5的Tris緩沖液平衡。
保存于-30℃的整個(gè)部分在37℃水浴中解凍，直到所有冰塊都溶解。在注入到膠之前(流速13ml/min，即直線速度150cm/h)，該部分用平衡緩沖液稀釋到1/2[v/v]，未保留部分隨后隨緩沖液的通過(guò)去除，直到RBL。
具有低FVII含量的第一蛋白部分被0.05M的Tris和0.15M氯化鈉、pH7.5的緩沖液以9ml/min(即100cm/h)洗提而被去除。
第二富含F(xiàn)VII的蛋白部分被0.05M的Tris和0.05M氯化鈉和0.05M氯化鈣、pH7.5的緩沖液以9ml/min(即100cm/h)洗提。
該第二部分在50kDa的之前已描述過(guò)的超濾器上進(jìn)行透析。該透析緩沖液是0.15M氯化鈉。該部分在第二次通過(guò)陰離子交換層析前在夜間被存儲(chǔ)于+4℃。
這一步可以回收73％的FVII(即60000IU的FVII-tg)，同時(shí)消除80％的結(jié)合蛋白。它同時(shí)允許FVII活化成FVIIa。
3.2

FF2步-洗提《低鈣》 一直徑2.5cm(橫截面4.9cm2)的柱用30ml

FF膠(GEHealthcare)填充。
該膠用0.05M，pH7.5的Tris緩沖液平衡。
之前洗提存儲(chǔ)于+4℃的部分(第二部分)在注入到膠(9ml/min，即直線流速100cm/h)之前被稀釋。
在注入第二部分后，該膠用平衡緩沖液沖洗以去除未保留的部分，直到RBL。
含有很高純度FVII的部分被0.05M的Tris和0.05M氯化鈉和0.005M氯化鈣、pH7.5的緩沖液以4.5ml/min(即50cm/h)洗提。
約23000IU的FVII-tg被純化，即12mg的FVII-tg。
這一步可以消除超過(guò)95％的結(jié)合蛋白(兔奶蛋白)。
該洗提液，純度高于90％，表現(xiàn)出接近天然人類FVII分子的結(jié)構(gòu)與功能特征。其在第三次通過(guò)離子交換層析時(shí)被濃縮和制備。
3.3

FF3步-《鈉》洗提 一直徑2.5cm(橫截面4.9cm2)的柱用10ml

FF膠(GEHealthcare)填充。
該膠用0.05M，pH7.5的Tris緩沖液平衡。
前一步驟中洗提的，純化的部分在注入到膠上(流速4.5ml/min，即直線速度50cm/h)前用注射用純水(PWI)稀釋五倍。
在注入所述部分后，該膠用平衡緩沖液沖洗以去除未保留的部分，直到RBL。
之后，F(xiàn)VII-tg被0.02M的Tris和0.28M氯化鈉，pH7.0的緩沖液以3ml/min(即36cm/h)洗提。
濃縮的FVII-tg合成物被制備，純度高于95％。該產(chǎn)品適于靜脈注射。該處理引起的產(chǎn)量為22％，每升所使用的奶可以純化至少20mg的FVII。
另外，對(duì)合成物中的FVII-tg進(jìn)行不同的結(jié)構(gòu)分析，例如在下列例子中顯示的 實(shí)施例3基本序列的研究 1.肽圖 在胰蛋白酶和Asp-N(數(shù)據(jù)未顯示)分解樣品FVII-pd，F(xiàn)VII-rec和FVII-tg后，獲得LC-MS和UV檢測(cè)的色譜。
在對(duì)胰蛋白酶降解后所獲得的肽圖分析顯示它們?cè)谛∮?5分鐘的保留時(shí)間內(nèi)它們是相似的。之后，對(duì)應(yīng)于肽重鏈片段的種類在FVII-rec和FVII-tg中發(fā)現(xiàn)而未在FVII-pd中發(fā)現(xiàn)。這些具有高質(zhì)量的肽(4500Da到8000Da)對(duì)應(yīng)于未完成的裂解。這些肽在其他批FVII-pd中被發(fā)現(xiàn)，因此，它們的存在與不同的胰蛋白酶敏感性不相關(guān)聯(lián)。
不同F(xiàn)VII之間在Asp-N降解后獲得的肽圖非常相似，這沿著整個(gè)保留時(shí)間的系列都是這樣。所觀察到的強(qiáng)度的不同只是因?yàn)樽⑷肓康淖兓c不同結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)。
2.序列的重疊 序列的重疊從由MS和/或MS/MS確定的肽計(jì)算出來(lái)。表1概括了不同樣品所得到的結(jié)果?？紤]到胰蛋白酶和Asp-N降解，超過(guò)95％的基本序列可以核實(shí)，所獲得的結(jié)果與文獻(xiàn)中描述的一致(Thim L.et al，Biochemistry，1988，27，7785-7793)。
表1.不同樣品用LC-ESIMS(/MS)分析獲得的序列重疊 為了證實(shí)肽的鑒定，HPLC片段用MALDI和Edman測(cè)序(sequencing)分析。
所有的用Edman測(cè)序分析的HPLC部分可以獲得80％的序列重疊。序列核實(shí)對(duì)FVII-tg和FVII-rec在LC-MS上實(shí)施，得出基本序列重疊>95％。
實(shí)施例4通過(guò)ESI-MS對(duì)糖基化位點(diǎn)以及糖肽的表征 FVII-tg的N-糖基化位點(diǎn)通過(guò)LC-ESIMS(/MS)識(shí)別，通過(guò)MALDI-TOFMS證實(shí)，以及微觀不均一性通過(guò)LC-ESIMS確定。
圖2描述了的包含兩個(gè)糖基化天冬酰胺殘基的糖肽的去卷積ESI光譜。糖基化位點(diǎn)的位置通過(guò)MALDI-TOF(/TOF)和Edman測(cè)序證實(shí)。
分別具有N-糖基化位點(diǎn)Asn145和Asn322的血漿FVII(FVII-pd)的糖肽質(zhì)譜[D123-R152]和[K31.6-R353]的分析顯示存在二天線的、二唾液酸的、未巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)(A2)(觀察到的糖肽質(zhì)量5563.8Da)以及巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)(A2F)(觀察到的質(zhì)量5709.8Da)。同樣需要注意的是三天線的、三唾液酸的、未巖藻糖基化的寡糖(A3)(觀察到的質(zhì)量6220.0Da)和巖藻糖基化的寡糖(A3F)(觀察到的質(zhì)量6366.1Da)的存在。對(duì)于轉(zhuǎn)基因FVII(FVII-tg)，大部分位于Asn145的寡糖是二天線的、單唾液酸的、未巖藻糖基化的或巖藻糖基化的(A1，A1F)和A2，A2F型的。三天線的形式的很少出現(xiàn)。
關(guān)于Asn322的主要糖形式，觀察到不同比例的相同的聚糖結(jié)構(gòu)。圖2顯示存在比在Asn145上少的被處理過(guò)的形式(較少天線的和唾液酸的)。例如，對(duì)于血漿產(chǎn)物三天線的結(jié)構(gòu)在Asn322上比在Asn145上出現(xiàn)的少，而在FVII-tg上則是沒有的。同時(shí)還應(yīng)當(dāng)注意到，天冬酰胺145和322被100％糖基化。雖然是半定量的，這些結(jié)果與通過(guò)HPCE-LIF和NP-HPLC獲得的定量數(shù)值是一致的。
實(shí)施例5用HPCE-LIF對(duì)N-聚糖定量 在用PNGase F去糖基化后，N-連接寡糖的識(shí)別和量化通過(guò)HPCE-LIF實(shí)現(xiàn)。FVII樣品用外切糖苷酶(唾液酸酶(酶/底物(FVII)比例為1mIU/10μg)，半乳糖苷酶，乙酰氨基己糖苷酶(Prozyme試劑盒)，巖藻糖苷酶(酶/底物比例1mIU/10μg))處理，來(lái)保證對(duì)每個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)進(jìn)行識(shí)別和量化。所獲得的聚糖用熒光染料標(biāo)記并根據(jù)其質(zhì)量和電荷分離。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(葡萄糖均聚物和寡糖)可以識(shí)別結(jié)構(gòu)。通過(guò)綜合每個(gè)關(guān)于整體量化的寡糖的峰而實(shí)施量化。
在本例中，使用了毛細(xì)管電泳設(shè)備ProteoLab PA800(Beckman-Coulter)，其毛細(xì)管為50cm×50μm內(nèi)徑的N-CHO(Beckman-Coulter)涂層，。還使用了名為“膠緩沖液-N”(Beckman-Coulter)的分離緩沖液。實(shí)驗(yàn)在20℃，25kV下進(jìn)行20分鐘。使用激光(激發(fā)λ＝488nm；發(fā)射λ＝520nm)進(jìn)行檢測(cè)。
在同時(shí)用唾液酸酶，半乳糖苷酶和乙酰氨基己糖苷酶去糖基化后巖藻糖基化的比例通過(guò)對(duì)應(yīng)“核”的和巖藻糖基化“核”的峰區(qū)域之間的比例而計(jì)算。
FVII-pd中大部分聚糖為二天線的，二唾液酸化的(A2)，以及二天線的、二唾液酸的、巖藻糖基化的(A2F)類型。FVII-tg的聚糖形式(見圖3)顯示二天線的，單唾液酸的，巖藻糖基化的或未巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)類型(A1F，A1)，以及二天線的，雙唾液酸的，未巖藻糖基化的或巖藻糖基化的類型(A2，A2F)的存在。FVII-rec的形態(tài)顯示出對(duì)于不同的觀察到的結(jié)構(gòu)(A1F，A2F)的非典型性移動(dòng)時(shí)間。
表2.由天然樣品(未被去唾液酸的)獲得的以及由不同批FVIIFVII-pd和FVII-tg的去唾液酸樣品獲得的唾液酸結(jié)構(gòu)的百分比的匯總 *二巖藻糖化種類 G2，G2F二天線的，二半乳糖基化的，未巖藻糖基化的或巖藻糖基化的形式 G2FB二天線的，二半乳糖基化的，二等分的，巖藻糖基化的形式 不同聚糖結(jié)構(gòu)(表2)的量化分析顯示FVII-pd的唾液酸化的結(jié)構(gòu)的主要狀態(tài)為約51％的二唾液酸化聚糖(A2和A2F)以及30％三天線的，唾液酸化的，未巖藻糖基化的或巖藻糖基化的形式(G3和G3F)。FVII-tg(A批和B批)與FVII-pd相比較少的被唾液酸化，F(xiàn)VII-pd的35％為二天線的，二唾液酸化的形式而只有6％為三天線的，唾液酸化的形式。主要的形式是單唾液酸化的，其具有50％的A1和A1F結(jié)構(gòu)。FVII-rec與相比較少的被唾液酸化，F(xiàn)VII-pd的45％為A2F結(jié)構(gòu)，而僅6％為三天線的，唾液酸化的聚糖(結(jié)果未示出)。
對(duì)于FVII-rec，已注意到其未巖藻糖基化結(jié)構(gòu)的低比例。
表3.不同F(xiàn)VII的巖藻糖基化比例 定量分析顯示FVII-pd低的巖藻糖基化比例(16％)，對(duì)于FVII-tg，巖藻糖基化的比例從24到42％，而對(duì)于FVII-rec則是100％的巖藻糖基化了。
實(shí)施例6用NP-HPLC對(duì)N-聚糖定量 通過(guò)NP-HPLC對(duì)FVII-pd和FVII-tg進(jìn)行N-糖基化的定性和定量分析。在對(duì)蛋白去鹽以及干燥后，該蛋白通過(guò)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的程序進(jìn)行變性和還原。之后聚糖通過(guò)酶途徑(內(nèi)切糖苷酶PNGase F)被釋放，并用乙醇沉淀純化。這樣獲得的聚糖通過(guò)熒光團(tuán)2-氨基苯甲酰胺(2-AB)進(jìn)行標(biāo)記。所標(biāo)記的聚糖根據(jù)其親水性用NP-HPLC(氨基-80柱-4，6/250mm-Tosohaas)分離。在注入前，該柱用80％乙腈平衡。寡糖用逐漸增加的50mM，pH4.5甲酸銨梯度，在等于或大于140分鐘的時(shí)間內(nèi)洗提。檢測(cè)由熒光測(cè)定法實(shí)現(xiàn)(激發(fā)λ＝330nm；發(fā)射λ＝420nm)。
FVII-pd的色譜圖(圖4)顯示主要的聚糖是二天線的，二唾液酸化的類型(A2)，比例為39％。也觀察到了較低的量的二天線的，二唾液酸化的巖藻糖基化的(A2F)，單唾液酸化的(A1)和三唾液酸化的巖藻糖基化的和未巖藻糖基化的(A3F和A3)形式。
對(duì)于FVII-tg用NP-HPLC進(jìn)行的分析證實(shí)了存在的主要寡糖是A1類型的，比例高達(dá)27％。A1F，A2和A2F的結(jié)構(gòu)較少，而三天線的形式僅以痕量存在。這顯示FVII-pd和較少唾液酸化的因子FVII-tg之間唾液酸化上的差異。
實(shí)施例7用MALDI-TOFMS鑒定 質(zhì)譜MALDI-TOF MS(基質(zhì)輔助激光解析/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜)是一種可以精確測(cè)量肽、蛋白、聚糖、寡糖以及大部分可電離的聚合物的分子量的技術(shù)。
肽、蛋白、聚糖與基質(zhì)混合，基質(zhì)吸收所使用激光的波長(zhǎng)。對(duì)于分析肽主要的基質(zhì)是α-氰-4-羥基肉桂酸(HCCA)，對(duì)于蛋白是芥子酸(SA)，對(duì)于寡糖是2，5-二羥基苯甲酸(DHB)。
該方法包含用脈沖激光照射基質(zhì)/被分析物的共晶(co-cristals)，導(dǎo)致基質(zhì)和被分析物分子的解吸附。在氣相電離后，被分析物分子將穿過(guò)飛行時(shí)間檢測(cè)器?？紤]到質(zhì)量和飛行時(shí)間是直接相關(guān)的，檢測(cè)后者可以確定目標(biāo)被分析物的質(zhì)量。通過(guò)觀測(cè)到的質(zhì)量測(cè)量與理論質(zhì)量相比而實(shí)施鑒定?；谒@得的離子碎片在MS/MS模式下進(jìn)行排序。所使用的裝置是Bruker Autoflex 2，在TOF和TOF/TOF模式下工作。
為了鑒定存在于FVII-tg的聚糖結(jié)構(gòu)，對(duì)通過(guò)制備型NP-HPLC所獲得的洗提部分進(jìn)行MALDI-TOF MS分析(圖5)。
對(duì)FVII-tg進(jìn)行MALDI-TOF分析可以證實(shí)對(duì)用NP-HPLC分離的聚糖的鑒定，即大部分單唾液酸化的A1結(jié)構(gòu)和少量形式的A1F，A2F以及A2類型。
本研究還可以確定三天線的，二唾液酸化的和三唾液酸化的少數(shù)形式，雜交形式和類型Man5和Man6-P-HexNAc的寡糖。
為了進(jìn)一步鑒定聚糖結(jié)構(gòu)，在去唾液酸化后對(duì)FVII-tg進(jìn)行MALDI-TOFMS分析。
去唾液酸化后，觀察到兩種主要形式比例分別為35％和28％(由NP-HPLC量化)的G2和G2F的存在。這些結(jié)果與《天然的》產(chǎn)品(產(chǎn)品未去唾液酸化)結(jié)構(gòu)的確定是一致的。
其他被鑒定的形式以微小的量存在，實(shí)質(zhì)上是寡糖，Man6-P-HexNAc和Man7-P-HexNAc類型以及氫化物類型。注意到存在二巖藻糖基化形式。
實(shí)施例8唾液酸-半乳糖連接的HPCE-LIF分析 關(guān)于唾液酸-半乳糖連接(分枝)研究的實(shí)驗(yàn)程序與在實(shí)施例5中已描述的相似。在用PNGase F去糖基化后，寡糖用特異性外切唾液酸酶處理，來(lái)保證鑒定和量化每個(gè)單獨(dú)的結(jié)構(gòu)。所使用的唾液酸酶是來(lái)自S.pneumoniae(對(duì)于α2-3連接有特異性，0.02 IU，E/S＝0.4w/w)，C.perfringens(對(duì)α2-3和α2-6連接有特異性，0.04 IU，E/S＝0.1w/w)et A.urefaciens(可以水解α2-3，α2-6，α2-8和α2-9連接，0.01 IU，E/S＝0.05w/w)的重組酶。
通過(guò)分析顯示，F(xiàn)VII-rec具有二天線的，唾液酸化的，巖藻糖基化的聚糖結(jié)構(gòu)，主要是A2F，以及二天線的，單唾液酸化的，巖藻糖基化的(A1F)形式。注意到，對(duì)于A2F和A1F這些結(jié)構(gòu)，其與一般遇到的這些結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移時(shí)間相比具有非典型性的轉(zhuǎn)移時(shí)間。就是說(shuō)，這些唾液酸化的寡糖結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出在HPCE-LIF和NP-HPLC中與FVII-tg相比具有非典型性轉(zhuǎn)移時(shí)間。另一方面，對(duì)單糖化合物的分析沒有顯示任何特別的與Neu5Ac不同的唾液酸，而質(zhì)譜工具顯示聚糖具有與二唾液酸化類型一致的質(zhì)量。最后，F(xiàn)VII-rec聚糖的去唾液酸化可以再次發(fā)現(xiàn)與FVII-tg和FVII＝pd的寡糖相同的層析與電泳行為。
因此這些在電泳和層析行為上的差異可用唾液酸的不同分枝來(lái)解釋。該假設(shè)用HPCE-LIF和MS通過(guò)不同途徑進(jìn)行了評(píng)估。
結(jié)果被概括在以下表4中。
該結(jié)果顯示在三種FVII水平上顯著的唾液酸異構(gòu)現(xiàn)象。事實(shí)上，F(xiàn)VII-rec的唾液酸包含α2-3連接，而FVII-tg變現(xiàn)出α2-6分枝，而FVII-pd則是這兩種異構(gòu)體的混合。
表4不同批FVII中唾液酸的分枝 在HPCE-LIF和NP-HPLC中觀察到的FVII-rec聚糖相對(duì)于FVII-tg和FVII-pd不同的表現(xiàn)是與在唾液酸水平上的異構(gòu)體差異相關(guān)聯(lián)的。
實(shí)施例9氧-糖基化的研究 FVII具有兩個(gè)位于Ser52和Ser60位置上的氧-糖基化位點(diǎn)。這些殘基分別包含葡萄糖-(木糖)0-2和巖藻糖部分。在本研究的框架內(nèi)，氧-糖基化用LC-ESIMS(/MS)研究，以及使用相似的方法用MALDI-TOF(/TOF)研究(結(jié)果未示出)。
圖10圖解了樣品FVII-pd，F(xiàn)VII-rec和FVII-tg的氧-聚糖的結(jié)構(gòu)。在m/z3297.4的峰對(duì)應(yīng)于包含在Ser52的葡萄糖-(木糖)2部分和Ser60上的巖藻糖的肽[Leu39-Lys62]。在m/z 3165.4和3033.3的峰分別對(duì)應(yīng)于在糖肽上減少1個(gè)和2個(gè)木糖。三種類型的FVII都統(tǒng)一地被巖藻糖基化和糖基化了，但是木糖殘基的數(shù)量以及相對(duì)應(yīng)的糖形態(tài)比例不同。這樣，帶有0，1和2個(gè)木糖的形式以基本相等的比例存在于FVII-pd，而FVII-rec和FVII-tg只含有0和2個(gè)木糖的形式。
質(zhì)譜分析顯示在m/z 1516.6處雙倍電荷的離子對(duì)應(yīng)于攜帶巖藻糖和葡萄糖(木糖)0的肽[Leu39-Lys62]。通過(guò)MS/MS獲得的對(duì)應(yīng)于不同單糖的連續(xù)質(zhì)量損失，證實(shí)Ser52和Ser60分別用葡萄糖和巖藻糖殘基作修飾。Edman測(cè)序可以按照修飾位點(diǎn)備份這些結(jié)果。
同樣的，在m/z 1648.7處雙倍電荷的離子對(duì)應(yīng)于攜帶巖藻糖和葡萄糖(木糖)2的肽[Leu39-Lys62]。由MS/MS獲得的不同的離子碎片證實(shí)木糖部分與葡萄糖結(jié)合。
實(shí)施例10γ-羧化作用的研究 FVII-pd的前10個(gè)谷氨酸是γ-羧化的，而FVII-rec的第十個(gè)谷氨酸只部分γ-羧化。為了研究轉(zhuǎn)基因FVII以及其比較者的γ-羧化作用，在Asp-N和胰蛋白酶分解后獲得的肽用LC-MS分析。結(jié)論與這兩種酶相似，只顯示了關(guān)于Asp-N分解的數(shù)據(jù)。
在這些實(shí)驗(yàn)條件下，三條含有γ-羧化作用的肽[Ala1-Lys32]，[Asp33-Ser45]和[Asp33-Gly47]被鑒定。肽[Ala1-Lys32]包含前9個(gè)γ-羧化的酸(Gla)，而另外兩條肽[Asp33-Ser45]和[Asp33-Gly47]只包含第十個(gè)Gla殘基。這樣，更容易特異地研究第十個(gè)Gla殘基的部分修飾。
對(duì)FVII-pd的質(zhì)譜分析(圖11)顯示在4296.8Da處存在一主峰(～90％)，對(duì)應(yīng)于前9個(gè)谷氨酸(Glu)的完全γ-羧化的肽[Ala1-Lys32]，以及在1658.8Da的峰，其為在第十個(gè)谷氨酸Glu35完全γ-羧化的肽[Asp33-Ser45]的特征。這些結(jié)果顯示出與文獻(xiàn)中的一致(Jurlander B.et al，Semin.Thromb.Hemost.，2001，27，373-384)，即FVII-pd的前10個(gè)谷氨酸殘基被羧化的。
由于在相同的實(shí)驗(yàn)條件下獲得了不同的數(shù)據(jù)，對(duì)不同批的FVII之間進(jìn)行比較研究是合理的(表5)。
圖11顯示對(duì)于FVII-rec和FVII-tg，位于4296.8Da的峰，其對(duì)應(yīng)于完全γ-羧化的肽[Ala1-Lys32]，是主要的。另一方面，對(duì)于這兩種FVII，在1614.9的主峰的存在可以看見，其代表未在Gla35γ-羧化的肽[Asp33-Ser45]。該結(jié)果表明對(duì)于FVII-rec而言第十個(gè)Gla的部分γ-羧化作用評(píng)估為大約35％到40％，其與已公布值～50％一致(Thim L.et al，Biochemistry，1988，27，7785-7793andJurlander B.et al，Semin.Thromb.Hemost.，2001，27，373-383)。帶有8Gla具有不可忽略強(qiáng)度的肽[Ala1-Lys32]的存在也應(yīng)當(dāng)被報(bào)道。這最后一點(diǎn)表明，在該肽中，一個(gè)和多個(gè)Gla部分γ-羧化，帶有7Gla形式的痕量的存在更可以強(qiáng)調(diào)涉及單一殘基。
表5.關(guān)于Glu的γ-羧化數(shù)據(jù)的匯總。這些數(shù)據(jù)來(lái)自LC-ESIMS分析。Gla:γ-羧酸。
實(shí)施例11雙硫鍵的研究 對(duì)在非還原性條件下獲得的胰蛋白酶水解產(chǎn)物進(jìn)行關(guān)于FVII的二硫鍵的研究，非還原性條件即為二硫鍵得到維持的條件。
帶有碘乙酰胺(iodacetamid)反應(yīng)步驟被包括在內(nèi)，來(lái)阻止可能的自由半胱氨酸(cysteins)，從而避免在堿性pH中實(shí)施的步驟中替換二硫鍵。
在這些條件下，可能證實(shí)12個(gè)二硫鍵的存在，并配對(duì)10個(gè)半胱氨酸(表6)。然而，應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是，所得到的結(jié)果與FVII的這段序列有關(guān)，并與理論上的配對(duì)一致。這些結(jié)論適用于兩種被調(diào)查的樣本FVII-pd和FVII-tg。
表6.在對(duì)雙硫鍵研究中獲得的結(jié)果的匯總 所使用的實(shí)驗(yàn)策略被應(yīng)用到二肽[Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys341]上，且沒有任何翻譯后修飾(MPT)(結(jié)果未示出)。該策略包含4個(gè)互補(bǔ)方法i)通過(guò)對(duì)ESI-MS和MALDI-MS的實(shí)驗(yàn)性的和所觀察的質(zhì)量進(jìn)行雙質(zhì)量“匹配”而對(duì)含有雙硫鍵的二肽進(jìn)行鑒定，ii)通過(guò)化學(xué)還原S-S鍵對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)，并對(duì)二肽產(chǎn)生的兩條肽進(jìn)行MS鑒定，以及iii)用MS/MS和自動(dòng)Edman微序列測(cè)定對(duì)二肽進(jìn)行測(cè)序。
結(jié)果表明對(duì)于二肽[Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys341]通過(guò)實(shí)驗(yàn)性質(zhì)量(3264.6Da)與理論性質(zhì)量(3264.5Da)的《匹配》進(jìn)行的第一次鑒定指出一雙硫鍵Cys340-Cys368。
還原后，對(duì)應(yīng)于包含鍵Cys340-Cys368的該二肽[Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys341]的峰的消失被注意到是讓位于在m/z 2816.3的峰，其為含有Cys368的肽[Gly354-Ser379]的特征峰(理論質(zhì)量2816.3Da)。通過(guò)MS/MS和Edman chemistry進(jìn)行測(cè)序證實(shí)了對(duì)二肽[Gly354-Ser379]/[Asp338-Lys341]和其二硫鍵Cys340-Cys368的鑒定。
實(shí)施例12天冬氨酸63的β-羧基化研究 對(duì)肽的分析從蛋白的胰蛋白酶“消化”開始實(shí)施。肽用MALDI-MS進(jìn)行分析。對(duì)羥基化肽的鑒定是通過(guò)觀察到的質(zhì)量與理論質(zhì)量比較的測(cè)量進(jìn)行的。所使用的裝置是Bruker Autoflex 2，按TOF模式運(yùn)行。
不同的結(jié)果表示在表7中。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)FVII-pd和FVII-rec樣品的部分修飾可被觀察到時(shí)，兩者的β-羥基化會(huì)消失(Thim L.et al，Biochemistry，1988，27，7785-7793)，然而這種現(xiàn)象不如在FVII-tg中出現(xiàn)的多。
表7.關(guān)于Asp63羥基化的數(shù)據(jù)的匯總。這些數(shù)據(jù)來(lái)自對(duì)胰蛋白酶水解肽的LC-ESIMS分析。
(＊)與FVII-tg相比β-羥基化作用較少的“豐富”。
(＊＊)引用自Thim L.et al，Biochemistry，1988，27，7785-7793的值 實(shí)施例13對(duì)存在的Galα1，3Gal結(jié)構(gòu)的研究 為了研究可能出現(xiàn)的FVII-tg的Galα1，3Gal結(jié)構(gòu)，使用牛甲狀腺球蛋白作為Galα1，3Gal結(jié)構(gòu)的陽(yáng)性對(duì)照。
產(chǎn)品在用PNGase F去糖基化后，用Galα1，3Gal分枝特異性唾液酸酶，巖藻糖苷酶和α-半乳糖苷酶處理。
圖6說(shuō)明了在牛甲狀腺球蛋白上進(jìn)行的天然形態(tài)(“Natif”)和去唾液酸的，去巖藻糖的和去α-半乳糖(Dsial+Dfuc+Dgalα(1，3，4，6))的形態(tài)疊加的研究。在α-半乳糖苷化后獲得的聚糖形態(tài)顯示這個(gè)結(jié)構(gòu)在用酶處理后完全消失，從而證明所使用的α-半乳糖苷酶極具活性。所獲得的Galα1，3Gal結(jié)構(gòu)的比例是17.8％，其與預(yù)期比例一致。
圖7圖解了FVII-tg產(chǎn)品的去唾液酸化的和去巖藻糖化的電泳圖譜(Dsial+Dfuc)與去唾液酸化的，去巖藻糖化的和去α-半乳糖的產(chǎn)品(Dsial+Dfuc+Dgalα(1，3，4，6))的疊加。
應(yīng)當(dāng)注意，兩種形態(tài)都可完美地疊加。這些結(jié)果表明在FVII-tg中無(wú)Galα1，3Gal結(jié)構(gòu)。應(yīng)當(dāng)注意到的是少數(shù)結(jié)構(gòu)(*)的出現(xiàn)對(duì)應(yīng)于不在中線位置的巖藻糖聚糖。
實(shí)施例14Galα1，3Gal糖部分的量化 10μg人類重組和轉(zhuǎn)基因FVII被按照二硫鍵還原條件處理，置于電泳凝膠上，并被轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。牛甲狀腺球蛋白樣品(Sigma，T1001，源于牛甲狀腺的甲狀腺球蛋白)由于其高的α(1，3)半乳糖抗原含量而作為陽(yáng)性對(duì)照使用。α-Gal部分(半乳糖-α1-3半乳糖-(3)4乙酰葡萄糖胺-R)的存在通過(guò)純化的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的α-Gal抗原特異性(EY Laboratories，H-9001，MOA-HRP)的Marasmius oreades植物凝集素得到顯示。之后，過(guò)氧化物酶活性用生色底物檢測(cè)(Fluka，4-氯-1-萘酚)并用信號(hào)數(shù)字化(Bio-Rad，Quantity-one)量化。同樣的膜用阿爾法-半乳糖苷酶(Prozyme，Green coffee bean)處理來(lái)確定信號(hào)特異性。與此同時(shí)，總蛋白量也通過(guò)同樣的SDS-PAGE膠用考馬斯藍(lán)著色來(lái)評(píng)估。
結(jié)果顯示了植物凝聚素Marasmius oreades(MOA)的特異性作為觀察到的對(duì)于牛甲狀腺球蛋白強(qiáng)信號(hào)以及接著用阿爾法-半乳糖苷酶處理后的消失的結(jié)果。該結(jié)果用MOA信號(hào)的強(qiáng)度除以對(duì)應(yīng)于被分析蛋白量的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)表達(dá)，展示了FVII-tg樣品中殘留的α-Gal信號(hào)(2，3 à 3，7)水平，而重組FVII表現(xiàn)出更高的值。
這些結(jié)果(見圖8)展示了在兔中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因FVII沒有α-Gal抗原或者α-Gal抗原非常弱，例如與倉(cāng)鼠細(xì)胞中重組FVII產(chǎn)品相比。
表A概括了按照本發(fā)明的為提供本發(fā)明FVII合成物的優(yōu)選實(shí)施例的處理步驟，并提供了在每一步后獲得的產(chǎn)量，純度以及比活性。
表A Yld產(chǎn)量
序列表
<110>LFB生物科技公司
<120>重組或轉(zhuǎn)基因因子VII合成物，每個(gè)因子VII分子有兩個(gè)帶有定義了聚糖單元的N—糖基化位點(diǎn)
<130>PFD1080419F-CF
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>406
<212>PRT
<213>人類(Homo sapiens)
<400>權(quán)利要求
1.一種重組的或轉(zhuǎn)基因的因子VII(FVII)的合成物，合成物的每個(gè)因子VII分子表現(xiàn)出兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，其特征在于在合成物的所有FVII分子中，含有Galα1，3Gal聚糖部分的比例在0到4％之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的合成物，其中至少65％的FVII的唾液酸含有α2-6連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的合成物，其中所有的FVII的唾液酸含有α2-6連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的合成物，其中所述合成物的FVII中還包含含有α2-3連接的唾液酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任意一個(gè)的合成物，其中在合成物中FVII的所有聚糖部分中，至少40％是二天線的、單唾液酸化的聚糖形式。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的合成物，其中FVII的雙天線的、單唾液酸化的聚糖形式占多數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的合成物，其中在FVII的雙天線的、單唾液酸化的聚糖形式中，多數(shù)的聚糖形式是未巖藻糖基化的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的合成物，其中因子VII所包含的巖藻糖基化比例在20％到50％之間。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中的任意一個(gè)的合成物，其特征在于它是通過(guò)轉(zhuǎn)基因雌兔生產(chǎn)的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9中的任意一個(gè)的合成物，其中因子VII是活化的。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到10中的任意一個(gè)的因子VII的合成物，用于藥物用途。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求1到10中任意一個(gè)的因子VII合成物的用途，用于制備用于治療患有血友病的病人的藥物。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求1到10中任意一個(gè)的因子VII合成物的用途，用于制備用于治療多發(fā)出血性損傷的藥物。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求1到10中任意一個(gè)的因子VII合成物的用途，用于制備采用手術(shù)止血治療大量不可控制出血的藥物。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求1到10中任意一個(gè)的因子VII合成物的用途，用于制備用于治療由于抗凝血?jiǎng)┻^(guò)量而發(fā)生的流血或出血的藥物。
16.一種藥物合成物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1到10中任一所定義的因子VII以及藥物學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體。
17.一種提取和純化包含于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的奶中的轉(zhuǎn)基因FVII的方法，包括下列步驟
a)奶中提取FVII，因子VII結(jié)合到奶中鈣的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)鹽以及/或復(fù)合物，通過(guò)由向奶中加入可溶性鹽而獲取鈣化合物沉淀，可溶性鹽的陰離子選擇具有能形成所述不可溶的鈣化合物的能力的陰離子，從而通過(guò)這種方法從所述鹽和/或復(fù)合物中釋放因子VII，這樣因子VII就存在于液相中了；
b)將蛋白質(zhì)富集的液相與鈣化合物沉淀分離，所述液相被進(jìn)一步分離為脂相和包含蛋白的水性非脂相；
c)用預(yù)定濃度的磷酸鹽為基礎(chǔ)的洗提緩沖液，對(duì)水性非脂相進(jìn)行親和層析步驟；以及
d)在弱堿性陰離子交換柱上，使用適合對(duì)保留在所述柱上的因子VII連續(xù)洗提的緩沖液，對(duì)根據(jù)步驟c)得到的因子VII的洗出液進(jìn)行兩次或者三次層析步驟。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中可溶性鹽是磷酸鹽。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中該磷酸鹽選自由磷酸鈉、磷酸鋰、磷酸鉀、磷酸銣和磷酸銫組成的組，而特別的是磷酸鈉。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中該可溶性鹽是堿金屬草酸鹽，特別是鈉或鉀的草酸鹽，或堿金屬碳酸鹽，特別是鈉或鉀的碳酸鹽，或上述的混合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求17到20中任意一個(gè)的方法，其中可溶性鹽在水溶液中的濃度在100mM到3M之間，更優(yōu)選的在200mM到500mM之間，特別的，在200mM到300mM之間。
22.根據(jù)權(quán)利要求17到21中任意一個(gè)的方法，其中步驟b)是通過(guò)離心實(shí)現(xiàn)的。
23.根據(jù)權(quán)利要求17到22中任意一個(gè)的方法，在分離步驟之后包含非脂水相的過(guò)濾步驟，其在孔隙逐漸變小的過(guò)濾器上連續(xù)進(jìn)行，優(yōu)選的1μm、接著0.45um，之后跟著通過(guò)超濾進(jìn)行的濃縮/透析步驟。
24.根據(jù)權(quán)利要求17到23中任意一個(gè)的方法，其中對(duì)脂相用孔隙逐漸變小的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，優(yōu)選的1μm、接著0.45μm。
25.根據(jù)權(quán)利要求17到24中任意一個(gè)的方法，其中親和層析在層析柱上實(shí)施，其載體是羥磷灰石膠(Ca10(PO4)6(OH)2)或氟磷灰石膠(Ca10(PO4)6F2)，而洗提緩沖液是基于0.25M-0.35M磷酸鈉的緩沖液，pH7.5到8.5。
26.根據(jù)權(quán)利要求17到25中任意一個(gè)的方法，其中對(duì)由步驟c)產(chǎn)生的FVII洗提液隨后進(jìn)行切向過(guò)濾。
27.根據(jù)權(quán)利要求17到26中任意一個(gè)的方法，其中第一次層析步驟在
FF膠類型層析載體上實(shí)施。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中FVII的洗提用基于0.05M Tris和0.020M-0.05M氯化鈣、pH7.0-8.0的水性緩沖液實(shí)施。
29.根據(jù)權(quán)利要求17到28中任意一個(gè)的方法，其中第二次層析步驟在
FF膠類型的層析載體上實(shí)施，將在第一次陰離子交換層析步驟中獲得的FVII的第一次洗提液注射到該載體上。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中FVII的洗提用基于0.05M Tris和0.005M氯化鈣、pH7.0-8.0的水性緩沖液實(shí)施。
31.根據(jù)權(quán)利要求17到30中任意一個(gè)的方法，其中第三次層析步驟在
FF膠類型的的層析載體上實(shí)施，將在第二次陰離子交換層析步驟中獲得的FVII的第二次洗提液注射到該載體上。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中FVII的洗提用基于0.02M Tris和0.20-0.30M，優(yōu)選0.28M的氯化鈉，pH6.5-7.5的水性緩沖液實(shí)施。
33.根據(jù)權(quán)利要求17到32中任意一個(gè)的方法，包含下列步驟中的至少一步配制、病毒滅活和殺菌。
34.根據(jù)權(quán)利要求17到33中任意一個(gè)的方法，包含在親和層析步驟前進(jìn)行的用溶劑/洗滌劑實(shí)施的抗病毒處理步驟。
35.根據(jù)權(quán)利要求17到33中任意一個(gè)的方法，其中對(duì)由第二陰離子交換層析步驟得到的洗提液進(jìn)行納米過(guò)濾步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組的或轉(zhuǎn)基因的因子VII的合成物，該因子VII合成物的每個(gè)分子均表現(xiàn)出兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，其中，在FVII合成物的所有分子中，所包含的Galα1，3Gal聚糖部分的比例在0到4％之間。本發(fā)明還涉及制備這樣的FVII合成物的方法。
文檔編號(hào)A61K38/48GK101460189SQ200780020263
公開日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2007年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日
發(fā)明者阿卜杜勒薩塔爾·薩米·什圖魯, 埃馬紐埃爾·諾尼, 尼古拉·比奧羅 申請(qǐng)人:Lfb生物科技公司