專利名稱：重組嵌合分子Cb1－Grb2(SH2)－RING真核表達(dá)質(zhì)粒及抗腫瘤基因藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤基因治療領(lǐng)域，涉及重組嵌合Cbl泛素連接酶Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其用于抗HER2陽性腫瘤的基因藥物的用途。
背景技術(shù)：
Cbl(Casitas B-lineage lymphoma)是一類進(jìn)化上保守的、廣泛分布的胞漿蛋白，由906個(gè)氨基酸組成，包含有多個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，可以介導(dǎo)與不同的細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)合，因此在細(xì)胞活化過程中可作為接頭分子或支架分子參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；同時(shí)分子內(nèi)的RING結(jié)構(gòu)域賦予Cbl泛素連接酶的功能，促進(jìn)其結(jié)合的靶分子發(fā)生泛素化、下調(diào)，從而參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控機(jī)制。Cbl突變或功能異?？梢詫?dǎo)致細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化或者免疫功能失調(diào)。
1.Cbl的結(jié)構(gòu)及功能(1)Cbl含有多個(gè)蛋白-蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域Cbl蛋白由N末端開始分別含有酪氨酸激酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TKB)、Linker、RING結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸區(qū)、C末端幾個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)及亮氨酸拉鏈。其中TKB結(jié)構(gòu)域由4H、EF及變異的SH2構(gòu)成，識別和結(jié)合活化蛋白酪氨酸激酶PTK。RING介導(dǎo)與泛素結(jié)合酶E2結(jié)合。Linker對于保持Cbl分子上結(jié)合的底物、RING及E2三者之間形成的最佳空間位置具有重要作用。C端的脯氨酸富含區(qū)及酪氨酸位點(diǎn)分別介導(dǎo)Cbl分子與其它含SH3或含SH2的蛋白結(jié)合。
(2)Cbl作為泛素連接酶促進(jìn)多種蛋白酪氨酸激酶泛素化、下調(diào)，參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)向調(diào)控
Cbl分子的多價(jià)結(jié)合能力一方面決定了它作為一種多價(jià)接頭分子參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。另一方面，RING賦予了Cbl蛋白在本質(zhì)上是一種泛素連接酶，分子中的TKB及其他結(jié)構(gòu)域可以識別并結(jié)合靶蛋白，RING負(fù)責(zé)募集泛素結(jié)合酶E2并將結(jié)合在E2上的泛素轉(zhuǎn)移至其所結(jié)合的底物分子上，從而啟動(dòng)泛素化降解途徑。以這種方式Cbl蛋白促進(jìn)多種受體型蛋白酪氨酸激酶(RTK)如EGFR、PDGFRα、β、CSF-1R、Met、Hck等發(fā)生配體誘導(dǎo)的泛素化、隨后降解，參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)向調(diào)控，這對于維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要意義。并且對于許多蛋白酪氨酸激酶如EGFR、Syk等而言，Cbl N端截短體(包含N末端到RING)便足以促使底物發(fā)生泛素化。Cbl突變后可成為癌蛋白；許多致癌性RTK如EGFRvV、CSF-1R、HER2等發(fā)生突變后能夠逃逸Cbl的負(fù)調(diào)控作用。這些現(xiàn)象提示，加強(qiáng)或重建Cbl的負(fù)調(diào)控作用，或許能夠抑制某些腫瘤細(xì)胞增殖。
2.重組嵌合泛素連接酶的應(yīng)用在泛素化過程中泛素連接酶E3負(fù)責(zé)特異性識別與結(jié)合底物。近年來多個(gè)研究組應(yīng)用重組技術(shù)構(gòu)建重組嵌合泛素連接酶，成功降解正常情況下并非泛素化系統(tǒng)天然底物的某些蛋白。例如通過修飾泛素連接酶復(fù)合物Skp1-Cullin1-F-box(SCF)的底物結(jié)合亞單位F-box構(gòu)成的嵌合F-box蛋白CFP，可靶向性降解pRB和β-catenin。將分別來自BRCA1和BARD的兩個(gè)RING與增殖細(xì)胞核抗原PCNA進(jìn)行重組后，該重組分子以蛋白酶體依賴的方式降低p57蛋白的水平，并且下調(diào)其功能。這些研究表明利用重組的泛素連接酶，可靶向性地降解一些疾病相關(guān)分子。但目前還沒有應(yīng)用重組Cbl泛素連接酶進(jìn)行基因治療研究的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于Cbl細(xì)胞內(nèi)蛋白的SH2負(fù)責(zé)識別和結(jié)合多種活化的蛋白酪氨酸激酶，為了靶向性地降解致癌相關(guān)蛋白HER2，本發(fā)明的目的在于，構(gòu)建能夠靶向性降解致癌相關(guān)蛋白HER2的重組嵌合Cbl泛素連接酶真核表達(dá)質(zhì)粒，并應(yīng)用于制備抗HER2陽性腫瘤的基因藥物。
本發(fā)明將Cbl蛋白N端部分的SH2置換為能夠結(jié)合并且介導(dǎo)HER2活化信號的下游信號分子Grb2的SH2，構(gòu)建重組嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING，其中置換的SH2結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)對HER2靶向性結(jié)合，RING負(fù)責(zé)將泛素分子連接至底物以促進(jìn)其發(fā)生泛素化、降解。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)解決方案是1)將BamH I和EcoR v引入Cbl N端編碼基因SH2的兩端，構(gòu)建pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)本發(fā)明利用PCR及重疊延伸技術(shù)，分別設(shè)計(jì)3對引物，進(jìn)行3輪PCR反應(yīng)，首先將BamH I引入CblN基因的SH2 N端即獲得CblN(BamH I)。以CblN(BamH I)為模板，同法將EcoR V引入CblN基因的SH2 C端獲得CblN(BamH I+EcoR V)。將其克隆入pGEM-T easy載體進(jìn)行測序，測序正確后利用KpnI/XhoI酶切將其插入到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體的KpnI/XhoI酶切位點(diǎn)之間，即得到pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)。
2)擴(kuò)增Grb2的SH2基因片段并置換入pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR v)，獲得重組嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING以SK-BR-3細(xì)胞的cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到Grb2SH2基因片段并克隆到pGEM-T easy載體中，酶切鑒定及測序證實(shí)序列正確后，以BamH I和EcoR v雙酶切將Grb2SH2基因片段切出，并將經(jīng)同樣酶切的pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR v)載體片斷分別回收，兩片段經(jīng)T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取單克隆培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamH I和EcoR v雙酶切鑒定后，對獲得預(yù)期大小的插入片段的載體再進(jìn)行測序證實(shí)，命名為pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING，此即為重組嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING的真核表達(dá)質(zhì)粒。
3)Cbl-Grb2(SH2)-RING促進(jìn)HER2泛素化和下調(diào)、抑制HER2陽性腫瘤細(xì)胞增殖將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HER2陽性的乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3細(xì)胞，通過免疫印跡、流式細(xì)胞儀和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)其通過下調(diào)HER2水平，有效抑制了與HER2過度活化有關(guān)的腫瘤細(xì)胞增殖。進(jìn)一步通過體內(nèi)結(jié)合實(shí)驗(yàn)及泛素化實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING能夠結(jié)合靶蛋白HER2并促進(jìn)其泛素化程度增加。


圖1是pcDNA3.1(+)載體質(zhì)粒圖；圖2是對pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)載體的酶切鑒定；其中1pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)以Kpn I和Xho I雙酶切；2pcDNA3.1(+)-CblN以Kpn I和Xho I雙酶切；3pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)以BamH I和EcoR V雙酶切；4pcDNA3.1(+)-CblN以BamH I和EcoR V雙酶切；M已知分子量標(biāo)準(zhǔn)品。
圖3是對pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING載體的酶切鑒定，其中1pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)以BamH I和EcoR V雙酶切；2pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING以BamH I和EcoR V雙酶切；M已知分子量標(biāo)準(zhǔn)品。
圖4是pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING重組質(zhì)粒對HER2的下調(diào)作用。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒(vector)、pcDNA3.1(+)-CblN(簡寫為CblN)以及pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING(簡寫成CblN/Grb2)的SK-BR-3細(xì)胞株細(xì)胞提取物分別利用抗HER2和ACTIN的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。CblN/Grb2能夠下調(diào)HER2蛋白。
圖5是Cbl-Grb2(SH2)-RING對HER2陽性的乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3的增殖抑制作用。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒(control)和CblN/Grb2的SK-BR-3細(xì)胞株，以200個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于60mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)14天，計(jì)算克隆形成率。CblN/Grb2能夠抑制SK-BR-3細(xì)胞的克隆增殖能力。
圖6是Cbl-Grb2(SH2)-RING促進(jìn)HER2陽性的乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3中HER2泛素化程度增加。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒(vector)、CblN/Grb2和pcDNA3.1(+)-CHIP(此處作為陽性對照，簡寫為CHIP)的SK-BR-3細(xì)胞株分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-3×HA-Ub并給予25μM MG-132處理4h。取1.5mg細(xì)胞提取物以抗HER2抗體進(jìn)行免疫沉淀，以抗HA抗體(圖6上)或抗HER2抗體(圖6下)進(jìn)行免疫印跡分析。CblN/Grb2能夠促進(jìn)HER2泛素化程度增加。
下面結(jié)合附圖和實(shí)驗(yàn)對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式
以下是發(fā)明人給出的重組嵌合Cbl泛素連接酶Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING)的構(gòu)建與鑒定及該質(zhì)粒對HER2陽性的腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用。
1.重組嵌合Cbl泛素連接酶Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1.1實(shí)驗(yàn)材料限制性內(nèi)切酶、T4連接酶均購于大連寶生生物有限公司，真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)購于Invitrogen公司，pcDNA3.1(+)質(zhì)粒圖參見圖1。圖中，PCMVCMV啟動(dòng)子，232-819位堿基，T7T7啟動(dòng)子/引物位點(diǎn)，863-882位堿基；多克隆酶切位點(diǎn)895-1010位堿基，BGHpA牛生長激素多腺苷酸化序列，1028-1252位堿基，f1 orif1起始位點(diǎn)，1296-1726位堿基，SV40 oriSV40起始位點(diǎn)，1731-2074位堿基，Neomycin新霉素抗藥性基因，2136-2930位堿基，SV40pASV40多腺苷酸化信號，3104-3234位堿基，pUC oripUC起始位點(diǎn)，3617-4287位堿基，Amipicilin氨芐青霉素抗藥性基因，4432-5428位堿基。
1.2重組嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING)的構(gòu)建過程首先利用PCR及重疊延伸技術(shù)，將BamH I和EcoR V引入Cbl N端編碼基因SH2的兩端，將其克隆入pGEM-T easy載體進(jìn)行測序，測序正確后利用KpnI/XhoI酶切將其插入到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體的KpnI/XhoI酶切位點(diǎn)之間，即pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)。利用PCR得到Grb2SH2基因片段并克隆到pGEM-T easy載體中，酶切鑒定及測序證實(shí)序列正確后，以BamH I和EcoR v雙酶切將Grb2 SH2基因片段切出，并與經(jīng)同樣酶切的pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR v)載體片斷分別回收后進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取單克隆培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamH I和EcoR v雙酶切鑒定后，對獲得預(yù)期大小的插入片段的載體再進(jìn)行測序證實(shí)，命名為pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING，此即為重組嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING的真核表達(dá)質(zhì)粒。
2.重組嵌合Cbl泛素連接酶Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HER2陽性乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3后對細(xì)胞增殖的影響將對數(shù)生長期的SK-BR-3細(xì)胞以每孔2×105細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)液均為DMEM(GIBCO Co)，10％小牛血清(杭州四季青生物制品廠)，在二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)。次日當(dāng)細(xì)胞生長至90-95％時(shí)，按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。于轉(zhuǎn)染后24h按照1∶10傳代，48h開始以400μg/mL的G418進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。對照細(xì)胞以同樣的方法轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)并篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。通過免疫印跡、流式細(xì)胞儀以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測Cbl-Grb2(SH2)-RING的表達(dá)對HER2蛋白水平、細(xì)胞增殖的影響。進(jìn)一步通過體內(nèi)結(jié)合實(shí)驗(yàn)及泛素化實(shí)驗(yàn)檢測該重組嵌合分子是否能夠結(jié)合靶蛋白HER2并促進(jìn)其泛素化。
在實(shí)際應(yīng)用到腫瘤病人時(shí)，擬將該質(zhì)粒以脂質(zhì)體包裹后行局部瘤體注射；或者進(jìn)一步將Cbl-Grb2(SH2)-RING構(gòu)建到腺病毒載體中，獲得Cbl-Grb2(SH2)-RING重組腺病毒后利用適當(dāng)?shù)味鹊闹亟M腺病毒進(jìn)行局部瘤體注射。
本發(fā)明的技術(shù)效果是1.構(gòu)建了重組嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING，經(jīng)酶切鑒定(圖2、3)和DNA序列測定證明，序列完全正確。
2.重組嵌合Cbl泛素連接酶Cbl-Grb2(SH2)-RING對HER2陽性的乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3細(xì)胞增殖的影響2.1下調(diào)SK-BR-3細(xì)胞中HER2蛋白免疫印跡分析顯示，與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒(vector)及CblN的對照細(xì)胞株比較，穩(wěn)定表達(dá)Cbl-Grb2(SH2)-RING(CblN/Grb2)的SK-BR-3細(xì)胞中HER2發(fā)生下調(diào)(圖4)。間接免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面HER2表達(dá)情況也證明后者HER2陽性率降低至28.4％(轉(zhuǎn)染了空載體的對照細(xì)胞株為89.6％)。
2.2抑制SK-BR-3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的增殖克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的對照細(xì)胞株(control)比較，穩(wěn)定表達(dá)Cbl-Grb2(SH2)-RING(CblN/Grb2)的SK-BR-3克隆形成率降低66％(圖5)。
2.3結(jié)合并促進(jìn)HER2泛素化體內(nèi)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，SK-BR-3細(xì)胞中過表達(dá)的嵌合重組分子Cbl-Grb2(SH2)-RING與HER2具有相互作用，表明該嵌合重組分子能夠在體內(nèi)結(jié)合HER2。穩(wěn)定表達(dá)嵌合重組分子Cbl-Grb2(SH2)-RING的SK-BR-3細(xì)胞以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)的對照細(xì)胞株分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-3×HA-Ub，并給予MG-132處理以抑制蛋白降解，細(xì)胞裂解液用抗HER2的抗體進(jìn)行免疫沉淀，以抗HA的抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，結(jié)果表明穩(wěn)定表達(dá)重組分子Cbl-Grb2(SH2)-RING的SK-BR-3細(xì)胞中HER2泛素化較對照細(xì)胞明顯增加。(圖5)。
經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明構(gòu)建的重組嵌合Cbl泛素連接酶Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING，轉(zhuǎn)染HER2陽性乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3后，通過與HER2蛋白結(jié)合并促進(jìn)其泛素化、下調(diào)，能夠有效抑制與HER2過度活化有關(guān)的細(xì)胞的增殖，因而具有抗HER2陽性腫瘤的用途。
權(quán)利要求
1.重組嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于首先將BamH I和EcoR v引入Cbl N端基因SH2的兩端，將其克隆入pGEM-T easy載體進(jìn)行測序，測序正確后利用KpnI/XhoI酶切并將其插入到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體的KpnI/XhoI酶切位點(diǎn)之間，即pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)；利用PCR得到Grb2 SH2基因片段并克隆到pGEM-T easy載體中，酶切鑒定及測序證實(shí)序列正確后，以BamH I和EcoR v雙酶切將Grb2SH2基因片段切出，插入到pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)載體的BamHI/EcoR V酶切位點(diǎn)之間；經(jīng)BamH I和EcoR v雙酶切鑒定后，對獲得預(yù)期大小的插入片段的載體再進(jìn)行測序證實(shí)，命名為pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING，即為重組嵌合Cbl泛素連接酶Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表達(dá)質(zhì)粒。
2.重組嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING用于制備抗HER2陽性腫瘤的基因藥物的用途。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，重組嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING轉(zhuǎn)染HER2陽性乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3后，通過與HER2蛋白結(jié)合并促進(jìn)其泛素化、下調(diào)，抑制與HER2過度活化有關(guān)的細(xì)胞的增殖。
全文摘要
本發(fā)明公開了重組嵌合Cb1泛素連接酶Cb1－Grb2(SH2)－RING真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)－Cb1－Grb7(SH2)－RING能夠作為抗HER2陽性腫瘤的基因藥物。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明重組嵌合分子Cb1－Grb2(SH2)－RING真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HER2陽性乳腺癌細(xì)胞系SK－BR－3后，通過與HER2蛋白結(jié)合并促進(jìn)其泛素化、下調(diào)，能夠有效抑制與HER2過度活化有關(guān)的細(xì)胞的增殖，因而具有抗HER2陽性腫瘤的用途。
文檔編號C12Q1/68GK1740326SQ200510042989
公開日2006年3月1日 申請日期2005年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月25日
發(fā)明者李霞, 張璟, 劉新平, 藥立波 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)