與免疫抗體相結(jié)合的多肽及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：與免疫抗體相結(jié)合的多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與免疫抗體結(jié)合的多肽，尤其涉及與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，更具體的是涉及一種有三個(gè)精氨酸被修飾的與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體相結(jié)合的 多肽。
背景技術(shù)：
臨床上自身免疫疾病主要有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、皮肌 炎、多發(fā)性肌炎、系統(tǒng)(多發(fā))性硬化癥、硬皮病等，這些疾病曾被命名為“結(jié)締組織病”，后 來(lái)國(guó)外和國(guó)內(nèi)均將它們歸為風(fēng)濕性疾病。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種較常見(jiàn)的以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為 主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫疾病，其病程長(zhǎng)，多反復(fù)，且會(huì)造成組織不可逆的損傷，而給患 者造成很大痛苦。該病的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)為0.5-1%，中國(guó)的發(fā)病率約為0.36%?；?者發(fā)病年齡多在20 50歲，女性多于男性，男女之比為1 3。最近流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎有逐年增加的趨勢(shì)，其突出的早期臨床表現(xiàn)為對(duì)稱性關(guān)節(jié)紅腫熱痛、常見(jiàn)四肢小關(guān) 節(jié)、指間近端關(guān)節(jié)腫脹、掌指、腕、肘和踝等關(guān)節(jié)腫痛及活動(dòng)困難、晨間關(guān)節(jié)僵硬、午后逐漸 減輕、關(guān)節(jié)外癥狀約有20%患者可出現(xiàn)皮下結(jié)節(jié)；長(zhǎng)久不愈的晚期癥狀則有不同程度的關(guān) 節(jié)畸形和強(qiáng)直，以及關(guān)節(jié)功能喪失等現(xiàn)象，還會(huì)損傷臟器和多組織器官，造成骨頭缺血性壞 死，對(duì)人體消耗大，致殘率高。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病因至今尚不十分清楚，且早期臨床表現(xiàn)也不典型。在國(guó) 內(nèi)外臨床實(shí)踐中，該疾病的常用診斷工具是美國(guó)風(fēng)濕學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Rheumatology, ACR)在 1987 年制定的類風(fēng)濕分類標(biāo)準(zhǔn)(Arthritis Rheum 1988，31， 315-24)，該標(biāo)準(zhǔn)更依賴于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎所表現(xiàn)出的臨床病癥。但是，在該疾病早期，這些臨 床指標(biāo)通常是不易操作的。因此，目前普遍認(rèn)為這一標(biāo)準(zhǔn)不能較好適應(yīng)于早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎的診斷(Arthritis Rheum 2001，44，2485-91 ；Neth J Med 2002，60，383-8)。而目前使用 的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法主要是采用消炎方法，這種方法雖能使得關(guān)節(jié)腫脹(swelling) 和侵蝕(erosive)的程度得以減慢，卻無(wú)法使疾病得到治愈。當(dāng)前人們共同的觀點(diǎn)認(rèn)為， 在該疾病早期采用多種方法治療能得到最佳的治療效果(Autoimmunity Reviews 2006，6， 37-41)。由此，具有高專一性(Specificity)和高靈敏度(Sensitivity)的血清學(xué)檢測(cè)標(biāo) 記對(duì)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在骨關(guān)節(jié)遭受損傷之前的早期診斷就顯得尤為必要(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239—62)。研究發(fā)現(xiàn)一些自身免疫抗體雖然與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病相聯(lián)系，如抗 calpastatin 抗體(Proc Natl Acad Sci USA 1995，92，7267-71)、抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體 (anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA)(IntArch Allergy Immunol 1996, 109，201-6)、核抗原抗體(anti-nuclearantigens，ANA) (Scand J Rheumatol 1986,15， 185-92)、抗 II 型膠原抗體(anti-collagen type II) (J Immunol Methods 2001,247, 191-203)和抗葡萄糖 6 磷酸異構(gòu)酶(anti-glucose-6-phosphate isomerase, anti-GPI)(Nat Immunol2001, 2, 746-53)等也都能在患有其它自身免疫疾病的病人中，甚至于在健康個(gè)體中檢測(cè)出來(lái)(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239-62)。其中的某些抗體雖然能應(yīng) 用于風(fēng)濕性疾病的識(shí)別，而且篩選這些抗體也有助于疾病監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)，但由于其對(duì)類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎缺乏專一性，這些抗體中的絕大多數(shù)都很少應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期診斷(Clinica Chimica Acta 2004，350，17—34)。對(duì)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期診斷的理想標(biāo)記(Marker)應(yīng)當(dāng)至少滿足4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(1)高 靈敏度，能檢測(cè)的病人達(dá)到高百分比；(2)高專一性，盡可能地限制錯(cuò)誤陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生； (3)能適用于早期診斷；(4)能預(yù)見(jiàn)到某些病人會(huì)發(fā)展成侵蝕性疾病(erosive disease) (AutoimmunityReviews 2006，6，37-41 ；MEDICINE 2006，34，441-4)。類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)抗體作為血清學(xué)檢測(cè)方法應(yīng)用于ACR標(biāo) 準(zhǔn)中，被公認(rèn)為是IgG分子上Fc結(jié)構(gòu)域的直接抗體。雖然其檢測(cè)靈敏度范圍可以達(dá)到 60-80%，但其對(duì)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的專一性也比較一般，為60%。此外，RF同樣可以在其 它患有自身免疫疾病的病人中、患有感染性疾病的病人中以及3-5 %健康人群中(其中 10-30% 的老年人)檢測(cè)到(Ann Rheum Dis 2003，62，261-3)?？笲iP(p68)抗體，抗Sa抗體和抗環(huán)狀胍氨酸化蛋白抗體(APF、AKA、抗fiIaggrin 和抗CCP)則對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有更高的專一性。64%的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人能產(chǎn)生直接針對(duì) BiP的抗體，還有報(bào)道稱其對(duì)該疾病具有高度的專一性，但目前沒(méi)有數(shù)據(jù)支持BiP在預(yù)測(cè)類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎方面具有作用，而且這些報(bào)道的BiP抗體還需要等待進(jìn)一步通過(guò)獨(dú)立的臨床研 究加以確認(rèn)(Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)?？筍a抗體是源自于人脾臟和胎盤 的提取物當(dāng)中，分子量為50kDa的蛋白(Internal Medicine 2005，44，1122-6)。另有研究 揭示Sa抗原對(duì)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的專一性可以高達(dá)92-99 %，但其靈敏度則顯得一般，僅為 30-40% (J Rheumatol 1994，21，1027-33 ;J Rheumatol 1999，26，7-13)?？购酥芤蜃?antiperinuclear factor, APF)首次披露于1964年。經(jīng)研究這些自 身免疫抗體對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有專一性，并能通過(guò)以人頰粘膜細(xì)胞為抗原底物的免疫熒光 法間接測(cè)得(Ann Rheum Dis 1964，23，302-5)。1979年研究者描述了一種類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎專一性角質(zhì)蛋白抗體，它能直接抑制 角質(zhì)層上皮細(xì)胞角質(zhì)化，并將這類抗體的名稱暫定為抗角質(zhì)蛋白抗體(anti-keratin andtibody，AKA) (BMJ 1979,2,97-9)。之后的研究證實(shí)，雖然AKA和APF的發(fā)現(xiàn)是互相 獨(dú)立的，但是兩者所直接對(duì)應(yīng)的抗原是一致的(J.Clin. Invest 1995，95，2672-9)。許多 研究進(jìn)一步表明AKA和APF具有許多共同的特性，它們均對(duì)于RA患者表現(xiàn)出高度的專一 性(Internal Medicine 2005，44，1122-6)。Filaggrin(filamentaggregating protein) 是一種互相交聯(lián)的角蛋白絲狀體，作用是形成非常堅(jiān)固的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，其也是AKA和 APF 的常見(jiàn)抗原(Clin AppliedImmunol Rev 2004，4，239-62)。其中，APF 的目標(biāo)抗原為 profilaggrin，而 AKA 的抗原為 filaggrin(J Clin Invest 1995，95，2672-9)。雖然AKA和APF對(duì)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有專一性，但其缺陷也很突出。這兩種抗體 的檢測(cè)靈敏度嚴(yán)重依賴于filaggrin的純化方法。實(shí)踐中，由于難以分離得到純的且胍基 含量具有可重復(fù)性的抗原，再加上其檢測(cè)手段不簡(jiǎn)便，以及熒光免疫檢測(cè)過(guò)程需要耗費(fèi)較 大的工作量，從而使得實(shí)驗(yàn)室間難以形成標(biāo)準(zhǔn)化，導(dǎo)致AKA和APF沒(méi)有成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎檢 測(cè)的主流方法(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239-62)。
基于filaggrin和profiIaggrin是AKA和APF抗體靶點(diǎn)的知識(shí)，人們合成了 含有瓜氨酸的多肽以檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清中AKA和APF抗體的活性。由于瓜氨酸不 是基本氨基酸而無(wú)法在蛋白質(zhì)翻譯中加入，因此通常的方法是通過(guò)肽精氨酸脫亞胺酶 (peptidylargnine deiminine, PAD, EC3. 5. 3. 15)催化精氨酸殘基脫氨基得到。根據(jù)這 些事實(shí)，一些從filaggrin序列中衍生出來(lái)的精氨酸側(cè)鏈經(jīng)修飾的，尤其是含有瓜氨酸的 多肽被合成出來(lái)，并用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體的體外檢測(cè)(US6，858，438)。在用酶聯(lián)免疫吸 附(Enzyme-Linked immunosorbent Assay, ELISA)方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，這一方法合成的含有 瓜氨酸直線性多肽能從類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中檢測(cè)出抗瓜氨酸肽抗體，在保持高專一性 (大于90%)的情況下，還大大提高了檢測(cè)的靈敏度(達(dá)到63%)。實(shí)驗(yàn)還證明，只有含 瓜氨酸的多肽才能實(shí)現(xiàn)該反應(yīng)，若將多肽中的瓜氨酸用其它氨基酸代替則完全沒(méi)有反應(yīng)發(fā) 生。這些結(jié)果表明，瓜氨酸部分是決定能被AKA和APF抗體識(shí)別的抗原決定因子(J Clin Invest 1998，101，273-81)。其它研究者發(fā)現(xiàn)將含有瓜氨酸的直線性多肽通過(guò)二硫鍵(S-S鍵)形成環(huán)形結(jié) 構(gòu)的方式能模擬類似轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，從而模仿最初抗原決定簇的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，并可增 加多肽-抗體的親和力(FASEB J 1995,9,37-42 ；Mol Immunol 1985，22，1255-64)。由 此，一種環(huán)狀肽被人工合成出來(lái)，其將filaggrin主要表位上的兩個(gè)絲氨酸換成半胱 氨酸后，再由二硫鍵環(huán)化形成，即第一代環(huán)瓜氨酸肽(the first generation cyclic citrullinatedpeptide, CCP1) (Internal Medicine 2005，44，1122-6)。研究者將一條由 19個(gè)氨基酸殘基組成的瓜氨酸肽中兩個(gè)絲氨酸替換為半胱氨酸形成與β -轉(zhuǎn)角具有相似 結(jié)構(gòu)的二硫鍵，得到人工合成CCP，并將CCPl與直線肽的檢測(cè)結(jié)果作了比較。結(jié)果顯示， 采用CCPl為抗原的多肽用ELISA法檢測(cè)RA患者的抗CCP抗體，靈敏度較用直線性瓜氨酸 肽為抗原有顯著提高，分別為68%和49%，二者專一性相似(Arthritis Rheum 2000,43, 155-63)。穆榮等人在266例RA患者和186例對(duì)照者血清中檢測(cè)RF和AKA抗體、APF和抗 CCP抗體的方式，評(píng)估了抗聚絲蛋白抗體群(anti-filaggrin antibodies,AFAs)與RF聯(lián)合 檢測(cè)的意義。由于AKA和APF的敏感性太低，臨床上以RF和抗CCP抗體的聯(lián)合測(cè)定更為實(shí) 用(北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2005，37，894)。研究還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)檢測(cè)抗CCP抗體還能作為類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期病人一項(xiàng)重要指標(biāo)，為這類人群的早期防治提供參考(J India Rheumatol Assoc 2004，12，143-6)，其還能預(yù)測(cè)侵蝕性疾病(Clin Applied Immunol Rev 2004,4, 239-62)。在含有不同瓜氨酸多肽的反應(yīng)模式中，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清檢測(cè)表現(xiàn)出巨大的可變性。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血清/血漿中除了 filaggrin精氨酸殘基被瓜氨酸化外，Sa抗原、 膠原蛋白(I和II型)、組蛋白、髓磷脂堿蛋白、纖維連接蛋白等也出現(xiàn)瓜氨酸化，并產(chǎn)生抗 CCP抗體。深入研究表明，瓜氨酸化的自身抗原中并非所有精氨酸脫氨基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸；已 瓜氨酸化的瓜氨酸也不完全參與形成抗原表位，即產(chǎn)生抗CCP抗體。綜上，抗瓜氨酸抗體 的產(chǎn)生與瓜氨酸密切相關(guān)，并且瓜氨酸的側(cè)翼序列對(duì)抗瓜氨酸抗體的產(chǎn)生起重要作用，這 一事實(shí)暗示著瓜氨酸殘基的周邊氨基酸對(duì)于抗原表位(antigen episode)具有重要作用， 以及抗瓜氨酸化蛋白(如AKA和APF抗體)活性是多克隆反應(yīng)(J Clin Invest 1998， 101，273-81)?；趂ilaggrin的屬性，它被認(rèn)為是模擬瓜氨酸抗原表位的天然庫(kù)藏(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239—62)。
第二代CCP(CCP2)檢測(cè)方法產(chǎn)生于2002年，通過(guò)將含有瓜氨酸的多肽庫(kù)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清篩選得到與filaggrin無(wú)關(guān)的第二代CCP，其具有更有利于抗體檢測(cè)的表位 (Report on the 5th Dresden symposium onautoantibodies. Lengerich, Germany :Pabst Science Publishers ；2000. p. 140-5)。將CCPl和CCP2經(jīng)同一組病人測(cè)試后表明，CCP2不僅 保持了較高專一性(96% )，而且其分析靈敏度也有顯著的提高(Arm. Rheum. Dis. 2005，64， 1510-2)。許多研究者在最近5年的研究證明，抗含瓜氨酸多肽的測(cè)試的靈敏度具有較高的 可變性，范圍在 40% -94% (Clin. ExpRheumatol. 2005, 23 (Suppl39), 569-76 ；Ann. Rheum. Dis. 2006，65，845-51)。CCP2在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體體外檢測(cè)中得到應(yīng)用說(shuō)明了在 該領(lǐng)域的檢測(cè)抗原的篩選并不需要僅僅依賴filaggrin，也說(shuō)明與filaggrin不同的結(jié)合 表位能更有利于體外檢測(cè)。Bizzaro N 等人(Clin Chem 2007，53，1527-33)和 Lutteri L 等人(Clinica Chimica Acta 2007，386，76-81)分別針對(duì)現(xiàn)在市場(chǎng)上使用的第二代和第三代CCP試劑盒 (Kit)進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伊諾瓦診斷(InovaDiagnostics)公司開(kāi)發(fā)的三種檢測(cè)方法 中，其CCP3試劑盒與使用CCP2為抗原的方法相比僅僅略有改善，各自的靈敏度分別為67 % 和64%。相反地，用于抗IgG的CCP3. 0與即能檢測(cè)IgG又能檢測(cè)IgA的CCP3. 1的檢測(cè)方 法相比后發(fā)現(xiàn)，兩者竟然沒(méi)有絲毫差別。可見(jiàn)，同時(shí)檢測(cè)IgG和IgA抗體的方法并沒(méi)有象看 上去那樣有顯著改進(jìn)。他們的結(jié)論是由于測(cè)試的診斷試劑盒靈敏度可能與胍基化精氨酸殘 基的位置和數(shù)量有關(guān)，而專一性則可能受到蛋白質(zhì)或雜多肽序列的影響，因此，對(duì)此二者而 言，抗原的種類顯得更為重要。兩者綜合考慮，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明抗原的制備是決定測(cè)定方法優(yōu) 劣的最重要的可變因素。Lutteri L等人(Clinica Chimica Acta 2007，386，76-81)的研究還發(fā)現(xiàn)了抗CCP 的另一個(gè)價(jià)值，他們指出，IgM-RF是最靈敏的標(biāo)記，能在77. 9%的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中發(fā) 現(xiàn)。必須注意的是，作為ACR標(biāo)準(zhǔn)中的RF，其類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷中靈敏度不能直接與那些沒(méi) 有包括在診斷標(biāo)準(zhǔn)中的其它方法相比較。IgM-RF被認(rèn)為在疾病專一性方面略有欠缺。使用 IgM-RF檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者，其中有13-19%的人為RF陰性，與之相比，當(dāng)這些患者使用 抗CCP方法檢測(cè)時(shí)均為陽(yáng)性。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的遺傳因素會(huì)影響瓜氨酸化蛋白的出現(xiàn)和產(chǎn)生，也會(huì)影響針對(duì) 這些修飾蛋白的抗體產(chǎn)物(Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)。一系列相關(guān)研 究表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與某些HLA-DR等位基因有密切聯(lián)系，尤其是HLA-DRB1*0401和 HLA-DRB 1*0404 (Cell 1996，85，307-10)。與相應(yīng)的含有精氨酸的多肽相比，將多肽瓜氨 酸化就能與HLA-DRB 1*0401和HLA_DRB1*0404兩種“袋形”抗原更好地結(jié)合(J India Rheumatol Assoc 2004,12,143-6) 在不同地區(qū)的人群中，這些等位基因也略有不同。 DRB1*0401主要出現(xiàn)在北歐和北美地區(qū)的人群中，有證據(jù)表明該基因與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 所導(dǎo)致的“特大關(guān)節(jié)”表征(extraarticular manifestations)有聯(lián)系，在 DRB1*0401/ DRB1*0404 雜合基因型中尤為突出。DRB1*0403、DRB1*0406 和 DRB1*0407 與 DRB1*0401、 *0404或*0101基因組合后會(huì)增加類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情的發(fā)展可能。DRB1*0404與DRB1*0408 只要存在于白色人種中。DRB1*0405很少在北歐人群中，但在亞洲和環(huán)地中海沿岸國(guó)家 的人群中極其普遍。DRB1*0101主要存在于北歐和北美人群中。美洲印第安人群中則為 DRB1*1402和*1406(Hum Immuno 2000，61，1254-1261)。雖然這些與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的基因在各地區(qū)人群中各有不同，但研究發(fā)現(xiàn)在DRBl的第三高度可變區(qū)(HV3)具有共享表位 (shared epitope, SE)，在 70-74 位氨基酸殘基都為 QKRAA、QRRAA 或RRRAA (ClinicaChimica Acta 2004，350，17-34)。將一群有幾個(gè)共享表位基因型的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者與具有抗CCP2抗體的患 者比較研究表明，一種共享表位等位基因與抗CCP2抗體的產(chǎn)生具有密切的內(nèi)在聯(lián)系 (Arthritis Rheum 2000,50,2113-21 ；Arthritis ResTher 2004，6，R303-8)。經(jīng)證實(shí)，這一 關(guān)聯(lián)是由于MHC分子共享表位β鏈的70-74位氨基酸殘基(Q/R，K/R，R，A，A)形成第4個(gè) 錨定袋(P4)，其與電中性或負(fù)電荷氨基酸具有高度親和性(J Immuno 2003，171，538-541)。 當(dāng)帶正電荷精氨酸在PAD酶作用下轉(zhuǎn)換成電中性的瓜氨酸后，得到的翻譯后修飾蛋白/多 肽親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于精氨酸與P4的親和力，并能夠激活⑶4+T細(xì)胞，這些“瓜氨酸特異T細(xì) 胞”可有助于抗瓜氨酸蛋白(多肽)抗體的產(chǎn)生(J Immuno 2003，171，538-541 ；Arthritis Rheuml987,30,1205-13 ；Rheum Dis Clin North Am 1992,18,741-59 ；ArthritisRheum 2005，52，1063-68)。這些結(jié)果表明具有共享表位的DBRl等位基因能激活類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患 者自身免疫反應(yīng)。綜合目前的研究結(jié)果，抗CCP抗體對(duì)RA具有較高的專一性，能將RA與其它與RA相 似的疾病相區(qū)分，這類抗體存在于絕大多數(shù)的病人體內(nèi)，在疾病的早期就能檢測(cè)到，有助于 對(duì)疾病的預(yù)測(cè)，能通過(guò)簡(jiǎn)單的方式加以檢測(cè)(J India Rheumatol Assoc 2004，12，143-6)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種與免疫抗體相結(jié)合的多肽。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體相結(jié)合的多肽。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種既能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體相結(jié)合，同 時(shí)還能與HLA-DR具有高親和力的多肽。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體體外檢測(cè)的 多肽。本發(fā)明所述的與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，其包含有如下氨基酸序 列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xa alI-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為 Arg ；Xaa6 為 Arg ；Xaa7 為 Arg ；Xaa8 為 Ser 或 Arg ；Xaa9 為 Arg 或 Leu ；XaalO 為Ala或Ile ；Xaall為Ala或Arg，其中有三個(gè)精氨酸被修飾。另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xa alI-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為修飾的 Arg ；Xaa6 為修飾的 Arg ；Xaa7 為修飾的 Arg ；Xaa8 為 Ser 或 Arg ；Xaa9 為 Arg 或 Leu ；XaalO 為 Ala 或 Ile ；Xaall 為 Ala 或 Arg0另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，其包含有如下氨基酸序列
His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Cys-Gly,其中，Xaal為Arg或Gln ；Xaa2為Phe或Met ；Xaa3為修飾的Arg ；Xaa4為修飾的Arg ；Xaa5 為修飾的 Arg ；Xaa6 為 Ser 或 Arg ；Xaa7 為 Arg 或 Leu ；Xaa8 為 Ala 或 Ile ；Xaa9 為 Ala 或 Arg0另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Ala-Ala-Cy s-Gly,其中，Xaal為Arg或Gln ；Xaa2為Phe或Met ；Xaa3為修飾的Arg ；Xaa4為修飾的 Arg ；Xaa5 為修飾的 Arg ；Xaa6 為 Ser 或 Arg ；Xaa7 為 Arg 或 Leu0另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Ala-Ala-Cys-Gly,其中，Xaal為修飾的Arg ；Xaa2為修飾的Arg ；Xaa3為修飾的Arg ；Xaa4為Ser或 Arg ； Xaa5 為 Arg 或 Leu0上述與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，所述修飾的Arg為側(cè)鏈修飾的Arg， 其側(cè)鏈具有通式(I)所述的結(jié)構(gòu)。Gi式 I<formula>formula see original document page 8</formula>其中Gl 為 0、NH 或 CH2 ；G2 為 NH2, CH3> NHCH3 或 N(CH3) 2 ；G3 為 0、NH、NHCH3> NHCH3 ； η為2、3或4 ；其中當(dāng)Gl為NH，G2為NH2時(shí)，G3不為ΝΗ。另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xa alI-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為修飾的 Arg ；Xaa6 為修飾的 Arg ；Xaa7 為修飾的 Arg ；Xaa8 為 Ser 或 Arg ；Xaa9 為 Arg 或 Leu ；XaalO 為 Ala 或 Ile ；Xaall 為 Ala 或 Arg0所述的修飾的Arg為瓜氨酸(Cit)，即當(dāng)Gl為NH，G2為NH2, G3為0，及η為3。另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Cit-Cit-Cit-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Cys -Gly,其中，Xaal為 Arg 或 Gln ；Xaa2 為 Phe 或 Met ；Xaa3 為 Ser 或 Arg ；Xaa4 為 Arg 或 Leu ；Xaa5 為 Ala 或 Ile ；Xaa6 為 Ala 或 Arg0另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Cit-Cit-Cit-Xaa3-Xaa4-Ala-Ala-Cys-GIy，其中，Xaal為 Arg 或 Gln ；Xaa2 為 Phe 或 Met ；Xaa3 為 Ser 或 Arg ；Xaa4 為 Arg 或 Leu0上述與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽能與自身免疫抗體相結(jié)合，形成抗原_抗體復(fù)合物(Complex)。上述多肽能與HLA-DR分子具有高親和力，與HLA-DR相結(jié)合形成HLA-DR-多肽復(fù) 合物。多肽通過(guò)序列中不相鄰的兩個(gè)Cys之間形成二硫鍵。所形成的二硫鍵能使該多肽 具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)并能模擬β “轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，使得該多肽不僅具有與HLA-DR分子的高親和力，與 HLA-DR相結(jié)合形成HLA-DR-多肽復(fù)合物；還能與抗CCP抗體高效結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù) 合物。另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，其包含有如下氨基酸序列，該序 列中第三位的Cys與第十六位的Cys之間形成二硫鍵His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xa alI-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為 Cit ；Xaa6 為 Cit ；Xaa7 為 Cit ；Xaa8 為 Ser Arg ；Xaa9 為 Arg Leu ；XaalO 為 Ala 或 Ile ；Xaall 為 Ala 或 Arg0另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，其包含有如下氨基酸序列，該序 列中第三位的Cys與第十六位的Cys之間形成二硫鍵His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Cit-Cit-Cit-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Cys -Gly,其中，Xaal為 Arg 或 Gln ；Xaa2 為 Phe 或 Met ；Xaa3 為 Ser 或 Arg ；Xaa4 為 Arg 或 Leu ；Xaa5 為 Ala 或 Ile ；Xaa6 為 Ala 或 Arg0另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，其包含有如下氨基酸序列，該序 列中第三位的Cys與第十六位的Cys之間形成二硫鍵His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Cit-Cit-Cit-Xaa3-Xaa4-Ala-Ala-Cys-G ly，其中，Xaal為 Arg 或 Gln ；Xaa2 為 Phe 或 Met ；Xaa3 為 Ser 或 Arg ；Xaa4 為 Arg 或 Leu0另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，其包含的氨基酸序列為His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Cit-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly (SEQ ID No :1)，其第 三位Cys與第十六位Cys之間形成二硫鍵。上述與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體相結(jié)合的多肽，其包含的氨基酸序列如SEQ ID No 2-178所示。其序列第三位Cys與第十六位Cys之間形成二硫鍵。上述多肽的制備方法為多肽的化學(xué)方法直接合成，或者先由化學(xué)合成或基因工程 方法合成，即將從表達(dá)載體(J.薩姆布魯克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯，分子克隆[M]，科 學(xué)出版社，1994)中分離純化得到的的多肽再經(jīng)過(guò)修飾精氨酸側(cè)鏈的步驟得到。上述多肽的一種制備方法為通過(guò)化學(xué)方法直接合成。
上述多肽的另一種制備方法為先通過(guò)化學(xué)方法合成后，再由PAD酶修飾精氨酸側(cè)鏈得到。本發(fā)明所述的多肽能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體相結(jié)合。一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體相結(jié)合的專一性大于90%的多肽，其氨基酸系列如下:His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xaa 1I-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為 Cit ；Xaa6 為 Cit ；Xaa7 為 Cit ；Xaa8 為 Ser Arg ；Xaa9 為 Arg Leu ；XaalO 為 Ala 或 Ile ；Xaall 為 Ala 或 Arg0另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體相結(jié)合的專一性大于95%的多肽，其氨基酸 系列如下:His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-X aalI-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為 Cit ；Xaa6 為 Cit ；Xaa7 為 Cit ；Xaa8 為 Ser Arg ；Xaa9 為 Arg Leu ；XaalO 為Ala或Ile ；Xaall為Ala或Arg，該序列中第三位的Cys與第十六位的Cys之間形成二 硫鍵。另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體相結(jié)合的專一性大于95%的多肽，其氨基酸 系列如下His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Cit-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly, 其第三位Cys與第十六位Cys之間形成二硫鍵。另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體相結(jié)合的專一性大于95%的多肽，其氨基酸 系列如SEQ ID No 2-178所示，多肽的第三位Cys與第十六位Cys之間形成二硫鍵。—種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體檢測(cè)靈敏度大于70%的多肽，其氨基酸系列如 T" :His-Gln-CyS-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-XaalI-C ys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為 Cit ；Xaa6 為 Cit ；Xaa7 為 Cit ；Xaa8 為 Ser Arg ；Xaa9 為 Arg Leu ；XaalO 為 Ala 或 Ile ；Xaall 為 Ala 或 Arg0另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體測(cè)靈敏度大于75%的多肽，其氨基酸系列如 T" :His-Gln-CyS-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-XaalI-C ys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為 Cit ；Xaa6 為 Cit ；Xaa7 為 Cit ；Xaa8 為 Ser Arg ；Xaa9 為 Arg Leu ；XaalO 為Ala或Ile ；Xaall為Ala或Arg，該序列中第三位的Cys與第十六位的Cys之間形成二 硫鍵。另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體測(cè)靈敏度大于75%的多肽，其氨基酸系列如 下His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Cit-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly, 其第三位Cys與第十六位Cys之間形成二硫鍵。
另一種與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體測(cè)靈敏度大于75%的多肽，其氨基酸系列如 SEQ ID No 2-178所示，多肽的第三位Cys與第十六位Cys之間形成二硫鍵。上述多肽對(duì)HLA-DR具有高親和力，與HLA-DR相結(jié)合形成HLA-DR-多肽復(fù)合物。上述多肽還包括在其氨基酸序列骨架上進(jìn)行化學(xué)修飾或生物修飾后所得的產(chǎn) 物。用于修飾的分子選自于高分子聚合物或有機(jī)小分子。其修飾修飾方式包括聚乙二醇化 (PEGylation)(Adv. Drug deliv. Rev. 28,275-299 ；Adv. Drug deliv. Rev. 54,453-609 ；Adv. Drug deliv. Rev. 60，1-88)、?；?Acylation) (J. Pharma. Sci. 86，768—773 ;J. Pharma. Sci.86，1365-1368)、糖基化(Glycosylation)(J. Pharma. Sci. 87，326-332 ；Adv. Drug deliv. Rev. 6，103-131 ；Adv. Drug deliv. Rev. 13，251-267)和有機(jī)小分子修飾等。用以修飾多肽的分子與多肽氨基酸骨架之間通常以酰胺鍵(amidebond)或尿鍵 (urine bond)連接。所述多肽經(jīng)過(guò)上述修飾能顯著增加多肽的化學(xué)穩(wěn)定性(如抗酶解) 和物理穩(wěn)定性(如抗凝聚(aggregation)、抗熱變性和抗機(jī)械力等)，還能增強(qiáng)與抗體的免 疫應(yīng)答。
高分子聚合物是指分子量大于2，000Da的化合物，分子間由結(jié)構(gòu)單位 (structural unit)或單體經(jīng)由共價(jià)鍵相互連接在一起。所述聚合物具體選自于聚乙二醇、 聚氨基酸、聚核苷酸、聚乳酸、聚賴氨酸、聚亞胺和10個(gè)以上單糖通過(guò)糖苷鍵形成的多聚糖 (polysaccharide)，如淀粉及其水解產(chǎn)物、纖維素、甲殼素或葡聚糖。有機(jī)小分子具體選自于各類氨基酸、各類單糖、各類維生素(Vitamin)、由兩個(gè)單 糖單元通過(guò)糖苷鍵形成的二糖(disaccharide)(如蔗糖、乳糖或麥芽糖)、由2_10單糖通 過(guò)糖苷鍵形成的寡聚糖(oligosaccharide)(如低聚異麥芽糖、低聚木糖或低聚半乳糖) 和分子量在20-2，OOODa的聚合物。聚乙二醇化修飾所用的聚乙二醇為一端封閉的聚乙二醇，封閉基團(tuán)可以為 C1-C30的烷基，C1-C30的脂肪酸或糖基。聚乙二醇為分子量2，000-100, OOODa，一般選擇 2，000-50, OOODa，優(yōu)先選擇 5，000-50, OOODa0 烷基與聚乙二醇一端通常形成醚鍵，也可以由酯鍵相連接。鏈長(zhǎng)可以選擇Cl-ClO 的烷基，優(yōu)先選擇甲基、乙基或丙基。脂肪酸與聚乙二醇一端通常形成酯鍵，脂肪酸鏈長(zhǎng)一般選擇C1-C18的脂肪酸，優(yōu) 先選擇鏈長(zhǎng)為C10、C12、C16和C18的脂肪酸。?；褂肅1-C30的脂肪酸，優(yōu)先選擇C1-C18的脂肪酸。有機(jī)小分子指具有C、H、0或C、H、0、N、P、S等幾種元素組成的分子量小于2，OOODa 的有機(jī)小分子。具體地指各類氨基酸、各類單糖或多糖、各類維生素(Vitamin)、生物素和分 子量在20-2，OOODa的聚合物，如聚乙二醇、多肽、寡聚糖和多聚糖(葡聚糖、淀粉和甲殼素 等)和核苷等。上述多肽能應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體的體外檢測(cè)。所述的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體的體外檢測(cè)的應(yīng)用，其一般方法為將待測(cè)血清 (serums)與包含有上述的多肽(即抗原)試劑混合，檢測(cè)所述多肽與血清中抗體所形成的 復(fù)合物。檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性表明，該血清中具有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病自身免疫抗體?！N類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體的體外檢測(cè)的方法ELISA檢測(cè)，其具體的實(shí)驗(yàn)步 驟可以參見(jiàn)US6，858，438中的相應(yīng)部分。
其基本原理是多肽(抗原)包被在酶標(biāo)板表面，將稀釋后的待檢血清/血漿和對(duì) 照物加入反應(yīng)板孔中，如果被檢血清/血漿中存在抗CCP抗體，經(jīng)溫育后，則血清/血漿中 特異性抗體與反應(yīng)板孔中的CCP抗原多肽結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物，洗去未結(jié)合的 血清/血漿中其它成分，加入酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，溫育，固相CCP抗原(多肽)結(jié)合的 抗CCP抗體再與酶標(biāo)記的抗人IgG抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)記抗體成分，加入酶底物， 并被催化成為有色產(chǎn)物，最后加入終止液終止反應(yīng)。根據(jù)試劑盒內(nèi)的對(duì)照物，可對(duì)抗CCP抗 體進(jìn)行定量或定性測(cè)定。所述的抗人IgG抗體為辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的 抗人IgG抗體。一種具體配制方式為，取20 μ 1儲(chǔ)存液，加800ml抗體稀釋液作1 40000稀釋，混勻，分裝標(biāo)準(zhǔn)小瓶，每瓶15ml，2 8°C下保存。其中HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體底物A配制方式為稱取檸檬酸17. 9g和 Na2HPO4 · 1220 4. 67g溶解于400ml去離子水中，然后緩慢加入30 % Η202330 μ L，攪拌均勻 后，加水至500ml，2 8°C下保存。其中HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體底物B配制方式為稱取四甲基聯(lián)苯氨 (tetramethyl benzidine, TMB) 0. Ig 于 IOOml 去離子水中，加入二甲基亞砜(DMSO) 2. 5ml, 在攪拌的同時(shí)，緩慢加入0.5ml 6M HC1，直至完全溶解，最后加水至500ml，2 8°C下保存。其中HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體底物反應(yīng)終止液的配制方式分別量取55ml 98% H2SO4和去離子水445ml，然后將濃硫酸緩慢加入到去離子水中，混勻，2 8°C下保存。酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)設(shè)定在450nm，30分鐘內(nèi)測(cè)定各孔OD45tl值。另一種應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體的ELISA體外檢測(cè)方法，將上述多肽先 經(jīng)生物素(Biotin)標(biāo)記，其能與親和素或鏈霉親和素非共價(jià)結(jié)合。然后再使用上述ELISA 體外檢測(cè)方法。所述的親和素(Avidin)是一種相對(duì)分子質(zhì)量為68，OOODa, pi為10. 5的一種堿性
糖蛋白，又稱卵白素，在雞蛋清中含量比較豐富，一般從蛋白清中提取。所述的鏈霉親和素 (Streptavidin)是一種從鏈霉菌(Str印tomycesavidinii)培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)，相對(duì) 分子質(zhì)量60，OOODa,不具有糖鏈。其特性與親和素一樣，也具有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，與生 物素具有高親和力。所述的多肽與生物素標(biāo)記相結(jié)合的方法可以通過(guò)先由固相合成或基因工程表達(dá) 并純化，所得多肽再與生物素連接并純化(如申請(qǐng)?zhí)枮?00310108264. 0中國(guó)發(fā)明專利所 公開(kāi)的技術(shù)方案)。所述的多肽與生物素標(biāo)記相結(jié)合的方法還可以在多肽的固相合成過(guò)程中先與生 物素連接再純化的方式(P印t. Res. 1989，2，189-194)。具體地說(shuō)，所述的結(jié)合有生物素的多肽，其上生物素與多肽的N末端相結(jié)合。本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果本發(fā)明所述的多肽，其上序列有三個(gè)精氨酸側(cè)鏈經(jīng)修飾后呈現(xiàn)電中性或電負(fù)性， 并優(yōu)先選擇瓜氨酸。這些多肽序列上兩個(gè)不相鄰的半胱氨酸側(cè)鏈巰基形成二硫鍵而成環(huán) 狀。這類多肽不僅能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體相結(jié)合，同時(shí)還能對(duì)HLA-DR具有高親和 力。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該類多肽與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體相結(jié)合的專一性大于95%，對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體的檢測(cè)靈敏度大于75%。與市場(chǎng)上銷售的同類產(chǎn)品相比，其靈敏 度得到顯著提高，更有利于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體的體外檢測(cè)。所述多肽經(jīng)生物素標(biāo)記后能進(jìn)一步提高與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體相結(jié)合的 專一性和靈敏度。本發(fā)明所涉及的術(shù)語(yǔ)與其一般概念相同。所述的“C1-C30烷基”和“C1-C10烷基”指直鏈或支鏈烷基，數(shù)字表示基團(tuán)所含的
碳原子數(shù)。所述的“聚乙二醇”指直線型(Linear)或分叉型(Branched)或多臂型 (Multi-arm)結(jié)構(gòu)，聚合物分叉數(shù)量或多臂數(shù)量不能限制本發(fā)明。所述的“C1-C18的脂肪酸”、“C10脂肪酸”、“C12脂肪酸”、“C16脂肪酸”和“C18脂
肪酸”指直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪酸，數(shù)字表示碳原子數(shù)。
具體實(shí)施例方式以下詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而 非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解， 可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍， 其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購(gòu)自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)。實(shí)施例1多肽的制備多肽采用Fmoc化學(xué)方法，通過(guò)固相合成技術(shù)合成。該方法的具體步驟參見(jiàn)Eur. J. Immunol. 1994，24，3188-3193 J. Org. Chem. 1972，37，3404-3409 ；黃惟德，陳常慶多肽合 成[M]，北京科學(xué)出版社，1985。二硫鍵的形成方法及其步驟可以參見(jiàn)文獻(xiàn)黃惟德，陳常慶多肽合成[M]，北京
1985, ρ85 ；Michael W. Pennington PeptideSynthesis Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press,1994, p91_169通過(guò)上述步驟，合成多肽的具體序列為多肽=His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Cit-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly (SEQ ID No :1)，其上第三位和第十六位Cys通過(guò)巰基形成二硫鍵，并使多肽形成環(huán)狀結(jié) 構(gòu)，并能模擬轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。先將蛋白質(zhì)或多肽末端的保護(hù)基在二甲基酰胺(DMF)溶劑中脫保護(hù)，中和。再 用氟化氫將多肽從合成樹(shù)脂上切下，得到的粗產(chǎn)物經(jīng)過(guò)反相色譜C18或C8柱(如5μπι， 250X4. 6mm)，以流動(dòng)相A(0. 1% (ν/ν)三氟乙酸乙腈溶液)和流動(dòng)相B (0. 1% (ν/ν)三氟 乙酸水溶液)為梯度洗脫溶劑。在45分鐘內(nèi)，流動(dòng)相A占Α、Β兩相總體積0% (ν/ν)變化 至IJ100% (ν/ν)收集得到目標(biāo)多肽，通過(guò)脫鹽色譜柱(GE Healthcare)或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī) 溶劑后，得到目標(biāo)多肽。(參見(jiàn)中國(guó)分析化學(xué)2002，30，1126-9)得到的多肽通過(guò)反相色譜(RP-HPLC)測(cè)定，其具體方法為4. 6 X 250mm 5ym C18 分析柱(Kromasil)；流動(dòng)相 A 為三氟乙酸(trifluoroacetic, TFA)加入 100% 乙腈(acetonitrile, ACN)中，使得TFA濃度為0. 1 % (ν/ν)；
流動(dòng)相B為TFA加入100%水中，使得TFA濃度為0. 1% (ν/ν)；流速為 1. Oml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm;洗脫梯度以流動(dòng)相A占A、B兩相總體積10% (ν/ν)的比例平衡，進(jìn)樣后，采用線 性梯度洗脫(Gradient Elution)，在25分鐘內(nèi)流動(dòng)相A占A、B兩相總體積從10% (ν/ν) 改變至35% (ν/ν)的比例，之后以100% (ν/ν)流動(dòng)相A平衡5分鐘。多肽的保留時(shí)間(Retention Time)為9. 32，其純度大于95%。通過(guò)ESI質(zhì)譜測(cè)定多肽分子量，其具體條件為質(zhì)譜(Probe)ESI質(zhì)譜電壓(Probe bias)+4. 5kv噴霧器流速(NebulizerGas Flow)1. 5L/min檢測(cè)器(Detector)1. 5kv樣品電離化裝置(CDL)-20. Ov流動(dòng)相流速(Τ.Flow)0. 2ml/minCDL 溫度(CDL Temp)250 °C緩沖液濃度(B.conc)50% H2O, 50% ACN加熱塊溫度(BlockTemp)200°C多肽分子量為2017. 26Da。實(shí)施例2生物素標(biāo)記的多肽的制備生物素-多肽(SEQ ID No 1)采用在固相合成過(guò)程中先與生物素連接再純化的 方式分別進(jìn)行，其具體方式參見(jiàn) Deibel，M.R.，Jr. ,Lobl, Τ. J. and Yem, Α. W.，A technique for rapid purification of low yield products :B iotinylation ofchemically synthesized proteins on-resin. Pept. Res. 1989,2,189-194。當(dāng)生物素通過(guò)縮合劑在多肽合成時(shí)直接縮合后，使用Kaiser test檢測(cè)縮合反 應(yīng)是否完全。該反應(yīng)的詳細(xì)說(shuō)明請(qǐng)參見(jiàn)Sigma-Aldrich 60017產(chǎn)品說(shuō)明(60017 Data Sheet)，該方法可不僅應(yīng)用于定性(Analytical Biochemistryl970, 34，595)，還能進(jìn)行定 量(Analytical Biochemistry 1981，117，147)檢測(cè)。在樹(shù)脂上進(jìn)行生物素標(biāo)記。首先，蛋白質(zhì)或多肽末端在二甲基酰胺(DMF)溶劑中 脫保護(hù)，中和；然后與N-羥基琥珀酰亞胺生物素反應(yīng)(即生物素化)，反應(yīng)條件為45°C 24 小時(shí)；再用氟化氫將標(biāo)記有生物素的多肽切下，得到的粗產(chǎn)物經(jīng)過(guò)親和素偶聯(lián)瓊脂的親和 層析柱(GEHealthcare)，用磷酸鹽緩沖液洗滌，去除未結(jié)合的成分，最后用0. IM的甘氨酸 溶液(PH2. 0)洗脫，得到生物素化的蛋白質(zhì)或多肽。通過(guò)實(shí)施例1公開(kāi)的二硫鍵形成方法，在多肽第三位和第十六位Cys通過(guò)巰基形成二硫鍵，并使多肽形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。得到的的環(huán)形生物素_多肽通過(guò)反相色譜(RP-HPLC)測(cè)定，其具體方法為4. 6 X 250mm 5ym C18 分析柱(Kromasil)；流動(dòng)相 A 為三氟乙酸(trifluoroacetic, TFA)加入 100% 乙腈(acetonitrile, ACN)中，使得TFA濃度為0. 1% (ν/ν)；流動(dòng)相B為TFA加入100%水中，使得TFA濃度為0. 1% (ν/ν)；
流速為 1. Oml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm;洗脫梯度以流動(dòng)相A占A、B兩相總體積15% (ν/ν)的比例平衡，進(jìn)樣后，采用線 性梯度洗脫(Gradient Elution)，在25分鐘內(nèi)流動(dòng)相A占A、B兩相總體積從15% (ν/ν) 改變至40% (ν/ν)的比例，之后以100% (ν/ν)流動(dòng)相A平衡5分鐘。生物素-環(huán)形多肽的保留時(shí)間(Retention Time)為17. 76，其純度大于95%。通過(guò)ESI質(zhì)譜分別測(cè)定多肽的分子量，其具體條件為
質(zhì)譜(Probe)ESI質(zhì)譜電壓(Probe bias)+4. 5kv噴霧器流速(NebulizerGas Flow) 1. 5L/min檢測(cè)器(Detector)1. 5kv樣品電離化裝置(CDL)-20. Ov流動(dòng)相流速(Τ.Flow)0. 2ml/minCDL 溫度(CDL Temp)250 °C緩沖液濃度(B.conc)50 % H2O, 50 % ACN加熱塊溫度(BlockTemp)200°C所得生物素-環(huán)形多肽分子量為2243. 57Da。實(shí)施例3類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體的體外檢測(cè)使用ELISA方法檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血清中自身免疫抗體，具體的實(shí)驗(yàn)步驟 可以參見(jiàn)US6，858，438中關(guān)于ELISA檢測(cè)的相應(yīng)部分。其基本原理是多肽(抗原)包被在酶標(biāo)板表面，將稀釋后的待檢血清/血漿和對(duì) 照物加入反應(yīng)板孔中，如果被檢血清/血漿中存在抗CCP抗體，經(jīng)溫育后，則血清/血漿中 特異性抗體與反應(yīng)板孔中的CCP抗原多肽結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物，洗去未結(jié)合的 血清/血漿中其它成分，加入酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，溫育，固相CCP抗原(多肽)結(jié)合的 抗CCP抗體再與酶標(biāo)記的抗人IgG抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)記抗體成分，加入酶底物， 并被催化成為有色產(chǎn)物，最后加入終止液終止反應(yīng)。根據(jù)試劑盒內(nèi)的對(duì)照物，可對(duì)抗CCP抗 體進(jìn)行定量或定性測(cè)定。抗人IgG抗體為HRP標(biāo)記的兔抗人IgG抗體采購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司 (貨號(hào)BA1070)。其具體配制方式為，取20 μ L儲(chǔ)存液，加800ml抗體稀釋液作1 40000 稀釋，混勻，分裝標(biāo)準(zhǔn)小瓶，每瓶15ml，2 8°C下保存?？贵w稀釋液購(gòu)自Pierce公司(貨 號(hào)=37552)。HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體底物A配制稱取檸檬酸17. 9g和Na2HPO4 · 1220 4. 67g 溶解于400ml去離子水中，然后緩慢加入30% Η202330 μ L，攪拌均勻后，加水至500ml，2 8°C下保存。HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體底物B配制稱取四甲基聯(lián)苯氨(tetramethylbenzidine， TMB) 0. Ig于100ml去離子水中，加入二甲基亞砜(DMSO) 2. 5ml，在攪拌的同時(shí)，緩慢加入 0.5ml 6M HC1，直至完全溶解，最后加水至500ml，2 8°C下保存。HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體底物反應(yīng)終止液的配制分別量取55ml98% H2SO4和去離 子水445ml，然后將濃硫酸緩慢加入到去離子水中，混勻，2 8°C下保存。
酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)設(shè)定在450nm，30分鐘內(nèi)測(cè)定各孔OD450值。將實(shí)施例1中合成的環(huán)形多肽分別與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清進(jìn)行驗(yàn)。
多肽(SEQ IDNo 1)
假陰性72
合計(jì)256多肽靈敏度=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陰性)=184/256 = 71.88%將實(shí)施例1中合成的環(huán)形多肽分別與非類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
多肽(SEQ ID No 1)假陽(yáng)性11
真陰性245
合計(jì)256_多肽專一性=真陰性/(真陰性+假陽(yáng)性)=245/256 = 95. 70%實(shí)施例4生物素標(biāo)記多肽用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體的體外檢測(cè)加有0. 05% (v/v) Tween-20的pH7. 4磷酸緩沖鹽溶液(PBST)稀釋鏈霉親和素，使 其濃度為5μ g/ml。然后加入到酶標(biāo)板各孔中，4°C過(guò)夜，取出酶標(biāo)板，去除包被液，用pH7. 4 的PBST溶液洗2次，然后加入PBST稀釋的生物素標(biāo)記的多肽，室溫孵育1小時(shí)(在脫色搖 床上混勻)，洗板，備用。將稀釋后的待檢血清/血漿和對(duì)照物加入反應(yīng)板孔中，如果被檢血清/血漿中存 在抗CCP抗體，經(jīng)溫育后，則血清/血漿中特異性抗體與反應(yīng)板孔中的CCP抗原多肽結(jié)合， 形成固相抗原-抗體復(fù)合物，洗去未結(jié)合的血清/血漿中其它成分，加入酶標(biāo)記的抗人IgG 抗體，溫育，固相CCP抗原(多肽)結(jié)合的抗CCP抗體再與酶標(biāo)記的抗人IgG抗體結(jié)合，洗 去未結(jié)合的酶標(biāo)記抗體成分，加入酶底物，并被催化成為有色產(chǎn)物，最后加入終止液終止反 應(yīng)。根據(jù)試劑盒內(nèi)的對(duì)照物，可對(duì)抗CCP抗體進(jìn)行定量或定性測(cè)定。后續(xù)操作及所用試劑與實(shí)施例3記載相一致。合成的環(huán)形生物素_多肽類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
生物素—多肽(SEQ ID No 1) Γ 真陽(yáng)性202
假陰性54
合計(jì)256多肽靈敏度=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陰性)=202/256 = 78. 9%將合成的環(huán)形生物素_多肽分別與非類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。生物素—多肽(SEQ ID Nol)假陽(yáng)性5
真陰性251 合計(jì)_256_多肽專一性=真陰性/(真陰性+假陽(yáng)性)=251/256 = 98. 05%序列表<110>上海榮盛生物藥業(yè)有限公司<120>與免疫抗體相結(jié)合的多肽及其應(yīng)用<130)0911089<160>178<170>PatentIn version 3.3<210>SEQ ID No 1<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>1His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 2<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>2His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 3<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>3His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 4<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>4His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 5<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>5His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 6<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>6His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 7<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>7His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 8<211>17
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>8His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 9<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>9His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 10<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>10His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 11<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>11His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 12<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa為瓜氨酸
<400>12His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 13<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>13His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 14<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>14His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 15<211>17<212>PRT<213>入工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>15His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 16<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>16His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 17<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>17His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 18<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>18His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 19<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>19His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 20<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa為瓜氨酸<400>20His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 21<211>17
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>21His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 22<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>22His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 23<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>23His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 24<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>24His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 25<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸.
<400>25His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 26<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>26His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 27<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>27His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 28<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>28His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 29<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>29His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 30<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>30His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 31<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>31His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 32<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>32His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 33<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>33His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 34
<211>17
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>34His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 35<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>35His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 36<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>36His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 37<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>37His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 38<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸
<400>38His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 39<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>39His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 40<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>40His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 41<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>41His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 42<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>42His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 43<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>43His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 44<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>44His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 45<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>45His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 46<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>46His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 47<211>17
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>47His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 48<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>48His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 49<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>49His Gln Cys His Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 50<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>50His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 51<211>17<212>PRT<213>人工合成.
<223>Xaa 為瓜氨酸
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Gly<210>SEQ ID No 56<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>56His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 57<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>57His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 58<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>58His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 59<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>59His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 60<211>17
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<400>64His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 65<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>65His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 66<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>66His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 67<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>67His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 68<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>68His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Arg Ala Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 69<211>17
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<400>77His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly
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Gly<210>SEQ ID No 82<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>82His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 83<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>83His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 84<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>84His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 85<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>85His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 86<211>17.
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>86His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 87<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>87His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 88<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>88His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 89<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>89His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 90<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸[1004]<400>90His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 91 [1009]<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>91His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 92<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>92His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 93<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>93His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 94<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>94His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015[1043]Gly<210>SEQ ID No 95<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>95His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 96<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>96His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 97<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>97His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 98<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa為瓜氨酸<400>98His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 99<211>17[1082]<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>99His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly [1089]<210>SEQ ID No 100<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>100His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 101<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>101His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 102<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>102His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 103<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸[1121]<400>103His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 104<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>104His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 105<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>105His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 106<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>106His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 107<211>17<212>PRT<213> 人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>107His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015[1160]Gly<210>SEQ ID No 108<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>108His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 109<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>109His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 110<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>110His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 111<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>111His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 112<211>17[1199]<212>PRT[1200]<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>112His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa His Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 113<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>113His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 114<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>114His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 115<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>115His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Leu Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 116<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸[1238]<400>116His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala lie Cys151015Gly<210>SEQ ID No 117<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>117His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 118<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>118His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 119<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>119His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 120<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>120His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015[1277]Gly<210>SEQ ID No 121<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>121His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 122<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>122His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 123<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>123His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 124<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>124His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 125<211>17.[1316]<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>125His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 126<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>126His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 127<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>127His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 128<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>128His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 129<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸.[1355]<400>129His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 130<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>130His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 131<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>131His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 132<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>132His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 133<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa為瓜氨酸<400>133His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015[1394]Gly<210>SEQ ID No 134<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>134His Gln Cys His Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 135<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>135His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 136<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>136His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 137<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>137His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 138 [1432]<211>17[1433]<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>138His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 139<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>139His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 140<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>140His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 141<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>141His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 142<211>17<212>PRT<213>人工合成 [1471]<223>Xaa 為瓜氨酸[1472]<400>142His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 143<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>143His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 144<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>144His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 145<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>145His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 146<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>146His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Ala Cys151015[1511]Gly[1512]<210>SEQ ID No 147<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>147His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 148<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>148His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 149<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>149His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 150<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>150His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 151<211>17[1550]<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>151 [1554]His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 152<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>152His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 153<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>153His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 154<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>154His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 155<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸[1589]<400>155His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys [1591]151015Gly<210>SEQ ID No 156<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>156His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 157<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>157His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 158<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>158His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 159<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>159His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Arg Cys151015[1628]Gly<210>SEQ ID No 160<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>160His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 161<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>161His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 162<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>162His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 163<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>163His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 164<211>17[1667]<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>164His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 165<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>165His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 166<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>166His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Met Arg His Xaa Ser Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 167<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>167His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 168<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸[1706]<400>168His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 169<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>169His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 170<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸 [1724]<400>170His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 171<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>171His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 172<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>172His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015[1745]Gly<210>SEQ ID No 173<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>173His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 174<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>174His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 175<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>175His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ IDNo 176<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>176His Gln Cys His Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 177<211>17[1784]<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>177His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 178<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>178His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015 [1799]Gly
權(quán)利要求
一種與免疫抗體相結(jié)合的多肽包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaa1-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Cys-Gly，其中，Xaa1為His或Ala；Xaa2為Gln或Arg；Xaa3為Arg或Gln；Xaa4為Phe或Met；Xaa5為修飾的Arg；Xaa6為修飾的Arg；Xaa7為修飾的Arg；Xaa8為Ser或Arg；Xaa9為Arg或Leu；Xaa10為Ala或Ile；Xaa11為Ala或Arg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與免疫抗體相結(jié)合的多肽，其特征在于所述修飾的Arg為側(cè) 鏈修飾，側(cè)鏈具有通式(I)所述的結(jié)構(gòu) <formula>formula see original document page 2</formula>其中 Gl 為 O、NH 或 CH2 ；G2 為 NH2、CH3、NHCH3 或 N(CH3) 2 ；G3 為 O、NH、NHCH3> NHCH3 ；η 為 2、3或4 ；當(dāng)Gl為NH，G2為NH2時(shí)，G3不為ΝΗ。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與免疫抗體相結(jié)合的多肽，其特征在于所述的多肽包含如下 氨基酸序列:His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gl y，其中Xaa為瓜氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與免疫抗體相結(jié)合的多肽，其特征在于所述多肽包含的具體 氨基酸序列為SEQ ID No 2-178。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的與免疫抗體相結(jié)合的多肽，其特征在于所述的多肽結(jié) 合有生物素標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的與免疫抗體相結(jié)合的多肽，其特征在于所述的多肽N末端結(jié) 合有生物素標(biāo)記。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的與免疫抗體相結(jié)合的多肽，其特征在于所述的標(biāo)記有生物素 的多肽與親和素或鏈霉親和素非共價(jià)結(jié)合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的多肽，其特征在于多肽在第三位Cys與第十六位Cys 之間形成二硫鍵。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體體 外檢測(cè)中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多肽，其特征在于所述多肽在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體 體外ELISA檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
一種與免疫抗體相結(jié)合的多肽，其序列中有三個(gè)精氨酸側(cè)鏈被修飾為電中性或電負(fù)性氨基酸。這些多肽序列上兩個(gè)不相鄰的半胱氨酸側(cè)鏈巰基形成二硫鍵而成環(huán)狀。這類多肽不僅能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體相結(jié)合，同時(shí)還能對(duì)HLA-DR具有高親和力。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該類多肽與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體相結(jié)合的專一性大于95％，對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體的檢測(cè)靈敏度大于75％。與市場(chǎng)上銷售的同類產(chǎn)品相比，其靈敏度得到顯著提高，更有利于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體的體外檢測(cè)。
文檔編號(hào)C07K7/08GK101812119SQ20091004664
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2009年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月25日
發(fā)明者朱紹榮 申請(qǐng)人:上海榮盛生物藥業(yè)有限公司