專利名稱：：純化因子VIII和VonWillebrand因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明領(lǐng)域涉及在藥物中用作活性劑的因子VIII以及VonWillebrand因子的純化?，F(xiàn)有技術(shù)因子VIII(下面也稱作"FVIII")是以低濃度存在于人血漿中的血漿蛋白質(zhì)。然而，其代表了凝結(jié)級(jí)聯(lián)中的關(guān)鍵點(diǎn)。事實(shí)上，這一蛋白質(zhì)起因子IX(或"FIX")的輔因子的作用以便活化因子X(jué)(或"FX")。一旦被活化，因子X(jué)將凝血酶原轉(zhuǎn)變成凝血酶，后者再將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，從而導(dǎo)致止血纖維蛋白凝塊的形成。罹患A型血友病的人具有FVIII缺陷，這自發(fā)地或在源于事故或外科手術(shù)的創(chuàng)傷后造成嚴(yán)重的失血。通常通過(guò)注射純化的血漿源FVIII來(lái)治療那些個(gè)體。由于此注射通常為多次且重復(fù)，所以可獲得高純度FVIII濃縮物是至關(guān)重要的。事實(shí)上，如果FVIII濃縮物未充分純化，它們可能含有大量的纖維蛋白原和免疫球蛋白，這可能誘導(dǎo)不期望的免疫應(yīng)答。因此，提供血漿源蛋白質(zhì)用于治療目的需要血漿源FVIII純化方法以獲得高純度產(chǎn)物。最通常從冷沉淀的人血漿級(jí)分來(lái)制備因子VIII濃縮物。通常在工業(yè)中心獲得的用于治療人血漿的因子VIII濃縮物的純度通常約1IU/mg并且通常不超過(guò)10至20IU/mg的最大范圍。最常見(jiàn)的純化方法都意味著沉淀步驟，該步驟針對(duì)于除去(通常不夠充分)蛋白源污染物如纖維蛋白原、纖連蛋白以及免疫球蛋白。這些方法可使用或組合低溫沉淀(10°C)，或者添加蛋白沉淀劑，像親水聚合物如PEG(Newman等人，Br.J.Haemato121:1-20，1971;Hao等人，MethodsofPlasmaProteinFractionation,AcademicPress1980，pp.57-74)，聚乙烯妣咯烷酮(Casillas和Simonetti，Br.J.Haemato,50:665-672，1982)、葡聚糖、聚糖體、珀可、羥乙基淀粉以及氧化鋁也被建議用作沉淀劑。Thorell和BlombSck推薦的甘氨酸以及氯化鈉的使用(Thorell和Blomb3ck,ThrombRes.1984Aug15;35(4):431-50)也適用于沉淀劑。類似地，一些作者(Ng等人，ThrombosisRes.，42:825-834,1986)成功地將三種沉淀劑PEG、甘氨酸和氯化鈉組合以獲得具有比活性在10至16IU/mg范圍的因子VIII濃縮物。也通過(guò)在生產(chǎn)過(guò)程中包括與多孔硅珠的接觸步驟來(lái)生產(chǎn)因子VIII濃縮物，該接觸步驟旨在截留低分子量蛋白源污染物(Margolis等人，VoxSang.46:341-348，1984)。產(chǎn)物的比活性仍舊保持相對(duì)較差lUI/mg。出現(xiàn)了制備非常高純度因子VIII濃縮物的方法。事實(shí)上，提出了通過(guò)免疫親禾口色i普f(shuō)去來(lái)獲f尋農(nóng)縮凈勿(Zimmerman禾口Fulcher，ThrombosisRes.，Suppl.VII，p.58，1987;Berntorp禾口Nilsson，ThrombosisRes.，S聊l.VII，p.60，1987;Levine等人，ThombosisRes，Su卯l.VI1，1987)。此種方法在于利用固定到色譜底物的抗因子VIII:C或抗VonWillebrand因子抗體的方法來(lái)純化因子VIII。此種方法是有效的但是卻需要烈性(drastic)溶液的使用以將因子VIII從其抗體或從VonWillebrand因子解吸附。因此需要針對(duì)于除去不想要的化學(xué)劑的其他超濾步驟，但是這可能影響因子VIII的生物活性。生產(chǎn)期間，因子VIII的比活性可達(dá)到4000至10000IU/mg，但是其不穩(wěn)定性需要在凍干步驟前加入穩(wěn)定劑例如白蛋白，這將因子VIII的比活性降至3-5IU/mg。然而，免疫親和純化的主要缺點(diǎn)在于動(dòng)物源殘留抗體的存在并因此可能在患者中造成針對(duì)那些非人蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)的發(fā)生。因此，通過(guò)可用于大規(guī)模工業(yè)環(huán)境的方法，所有這些方法都不允許提供完全沒(méi)有非人蛋白質(zhì)如動(dòng)物源抗體的極高純度的因子VIII濃縮物。EP0343275描述了從冷沉淀物制備因子VIII的方法，其特征在于，在病毒滅活處理之前，冷沉淀物懸浮于pH值在6.5至7.5范圍的含有1至3U/ml肝素的水中，與氫氧化鋁懸液反應(yīng)并在IO至18t:的溫度下冷卻以及將pH值調(diào)整至6至7的范圍，離心或過(guò)濾，然后再經(jīng)過(guò)后處理，尤其是通過(guò)使用親水型離子交換樹(shù)脂如Fractogel-DEAE(現(xiàn)在稱作DEAE-TOYOPEARL⑧，由TosohBioscience公司出售)的色譜法進(jìn)一步進(jìn)行純化。這一文本因而描述了通過(guò)將非常特殊的預(yù)備步驟(尤其是特征為完全沒(méi)有任何乙醇處理)與在親水型樹(shù)脂如FractogelDEAE上的離子交換色譜聯(lián)合使用，而只純化因子VIII。EP0359593描述了陰離子交換色譜純化方法，其使得在經(jīng)深思熟慮而不需要任何后處理的條件下，在單個(gè)色譜柱上分離預(yù)期的蛋白質(zhì)。此種方法使得能夠從人或動(dòng)物血漿分離因子VIII、纖維蛋白原、纖連蛋白和VonWillebrand因子蛋白質(zhì)。此種方法可總結(jié)如下將溶解于水的冷沉淀物級(jí)分通過(guò)使用基質(zhì)為大交聯(lián)乙烯聚合物凝膠類型的陰離子交換樹(shù)脂的色譜法進(jìn)行單次分離，該樹(shù)脂由于其孔隙率特性而能夠留住因子VIII-VonWillebrand因子復(fù)合物，然后通過(guò)連續(xù)增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度而選擇性地收集多種蛋白質(zhì)。此種方法通過(guò)使用接枝到Fraetoge1⑧tsk-deae650樹(shù)脂上的deae部分(現(xiàn)稱作DEAE-TOYOPEARL⑧，由TosohBioscience公司出售)而得到很好的結(jié)果。然而，此種方法雖然能獲得純化的FVIII，但不能獲得足夠純的VonWillebrand因子。另一方面，VonWillebrand因子(下文也稱作"FvW")通過(guò)發(fā)揮下述兩種不同功能而在止血起至關(guān)重要的作用，即作為粘著蛋白，它允許血小板分散，粘附并聚集到血管內(nèi)皮下膜上，并因此參與損傷血管的快速愈合，以及另一方面，其保證因子VIII穩(wěn)定并運(yùn)輸?shù)窖貉h(huán)中，而它并非與因子VIII共價(jià)相連。FvW先天缺乏或這一因子的結(jié)構(gòu)缺陷確實(shí)引起vonWillebrand疾病，該疾病表現(xiàn)為皮膚和粘膜出血。當(dāng)需要進(jìn)行手術(shù)時(shí)，這一疾病的臨床表現(xiàn)非常異類并且問(wèn)題頗多。急需對(duì)vonWillebrand疾病的治療以矯正原發(fā)止血(出血時(shí)間)和凝結(jié)缺陷。通常將使用富含F(xiàn)vW的人血漿衍生物(例如該血漿的冷沉淀物級(jí)分或含有足量與之相伴的FvW的因子VIII濃縮物)的替代療法對(duì)該疾病進(jìn)行治療。但是FvW是難于純化的蛋白質(zhì)。事實(shí)上，VonWillebrand因子是已知的在血漿中循環(huán)的最大蛋白質(zhì)。其由一組二硫鍵連接的多聚體構(gòu)成，該多聚體的基礎(chǔ)元件具有分子量約260千道爾頓(kDa)。血漿中，F(xiàn)vW的最小形式是440至500kDa的二聚體，而最大形式是分子量可以達(dá)到兩千萬(wàn)道爾頓的所述二聚體的多聚體。多聚體中亞基的排列可以是對(duì)于在其中形成它的細(xì)胞特異的FvW在巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中合成且聚合。因此，由于其復(fù)雜性以及由于其與FVIII的結(jié)合，VonWillebrand因子分子的制備非常復(fù)雜。制備FvW濃縮物的多種方法通常組合這樣的步驟，其在于沉淀血漿級(jí)分和/或色譜，該沉淀步驟移除不想要的蛋白質(zhì)的主要部分(纖維蛋白原，纖連蛋白等)，而該色譜步驟(離子交換色譜、親和色譜、免疫親和色譜、空間排阻色譜等)針對(duì)于提供高比活性的高純度濃縮物，同時(shí)保留多聚體形式的完整性，特別是高分子量的那些，其生物作用在治療過(guò)程中是決定性的。歐洲專利EP0503991公開(kāi)了以工業(yè)規(guī)模制備FvW濃縮物的方法，包括血漿冷沉淀物級(jí)分的預(yù)純化步驟和三步連續(xù)的色譜步驟，第三步色譜是在瓊脂糖固定的明膠柱上進(jìn)行的親和色譜。因此獲得的FvW濃縮物具有以每mg蛋白質(zhì)的瑞斯托菌素輔因子的活性單元來(lái)表示的比活性高于100VWF:RCo/mg，以及與初始血漿中相類似的高分子量多聚體水平。歐洲專利申請(qǐng)EP0934748描述了FvW制備方法，包括陰離子交換和陽(yáng)離子交換色譜法的組合。得到的FvW級(jí)分具有以每mg蛋白質(zhì)的FvW抗原單元來(lái)表示的比活性高于100IUFvW:Ag/mg，但仍舊含有顯著量的因子Vin。美國(guó)專利US6，579，723描述了通過(guò)免疫親和色譜制備高純度的FvW的方法，其中免疫吸附劑是抗FvW抗體。也可提供通過(guò)在肝素上的親和色譜來(lái)純化的額外步驟。然而，此種免疫親和純化的缺點(diǎn)是可能存在可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的殘留抗體。歐洲專利EP0383234教導(dǎo)了通過(guò)陰離子交換色譜的方法來(lái)制備FvW濃縮物，其使用含有碳水化合物的酸性溶液(PH范圍5.5至6.5)來(lái)進(jìn)行以在陰離子交換器上固定因子VIII。通過(guò)沖洗底物而回收FvW，以及未滯留的纖連蛋白和纖維蛋白原，確實(shí)需要額外的沉淀步驟以分離純化的FvW濃縮物。EP1632501描述了從含有VonWillebrand因子的生物級(jí)分制備高純度VonWillebrand濃縮物的方法，包括使用弱堿型乙烯基聚合物底物通過(guò)陰離子交換色譜的分離。有益地，此種方法可以非常容易地進(jìn)行并且能夠獲得含有非常少的因子VIII的高特異性VonWillebrand因子。FVIII和FvW是非常有用的血漿源蛋白質(zhì)，并且其在一些人中的缺乏導(dǎo)致嚴(yán)重的止血病。因此最重要的是研發(fā)制備這些蛋白質(zhì)的方法，該方法能夠生產(chǎn)具有適于患者重復(fù)使用的純度的產(chǎn)品。先前技術(shù)中描述的方法能夠獲得純的因子VIII，但是純度差的VonWillebrand因子，或者是獲得純的FVIII和FvW，但是卻要實(shí)施復(fù)雜且繁重的方法。發(fā)明才既述本發(fā)明涉及純化含有FVIII和FvW的混合物的溶液，或者含有FvW的溶液，或者源于動(dòng)物、尤其是非人動(dòng)物的分泌物的溶液，或者含有FVIII的植物提取物的方法，其特征在于，包括在可以吸附選自FVIII和FvW的蛋白質(zhì)中至少一種的離子交換色譜過(guò)濾型膜上的色譜步驟。發(fā)明詳明因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種從選自(i)含有FVIII和FvW的混合物的溶液，(ii)含有FvW的溶液，(iii)源于非人動(dòng)物的分泌物的溶液，和(iv)源于含有FVIII的植物提取物的溶液來(lái)純化FVIII或FvW的方法，所述方法的特征在于，包括在離子交換色5譜過(guò)濾型膜上吸附FVIII或FvW的步驟。如在此使用，"純化方法"旨在意指將FVIII從介質(zhì)中存在的其他分子分離的方法，或者將FvW從介質(zhì)中存在的其他分子分離的方法，或者將FVIII從FvW分離的方法，或者將FVIII/FvW復(fù)合物從介質(zhì)中存在的其他分子分離的方法。那些分子可以是不同于FVIII和FvW的蛋白質(zhì)、病毒、細(xì)菌、孢子、培養(yǎng)基、胎牛血清，這一列表并非局限性的。如在此使用，"FVIII"旨在意指任何形式的FVIII，尤其是能作用為FIX活化中的輔因子且能夠與FvW形成復(fù)合物，特別是成熟FVIII，成熟FVIII生物活性衍生物如含有前肽(pro-FVIII)的pro-FVIII，包含非成熟FVIII的蛋白構(gòu)建體，F(xiàn)VIII前體(pre-pro-FVIII)，切去信號(hào)肽和前肽后獲得的成熟FVIII。本發(fā)明包括的其他FVIII生物活性衍生物是處于翻譯后修飾或者轉(zhuǎn)變成生物活性形式的前藥，該生物活性形式例如截短形式、缺失形式如EP218712所述缺失定位于Arg-759和Ser_1709之間區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的FVIII、嵌合形式以及包括不同于血漿天然成熟形式的翻譯后修飾的形式。例如，這些多種FVIII形式可例如通過(guò)修飾成熟FVIII或者任何天然存在于血液中的其他形式而產(chǎn)生。編碼此FVIII的核苷酸序列可源于多種來(lái)源，優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物，包括人、豬、羊、牛、馬科和羊亞科來(lái)源，這一列表并非局限性的。如在此使用，"FvW"旨在意指任何FvW形式，尤其是成熟FvW，成熟FvW生物活性衍生物，例如含有前肽的pro-FvW，包含非成熟FvW的蛋白構(gòu)建體，包括FvW前體(pre-pro-FvW))，F(xiàn)vW前肽(pro-FvW)，切去信號(hào)肽和前肽后獲得的成熟FvW。本發(fā)明包括的其他FvW生物活性衍生物是經(jīng)歷翻譯后修飾或者轉(zhuǎn)變成生物活性形式的前藥，該生物活性形式例如截短形式、缺失形式如抗蛋白水解的A2結(jié)構(gòu)域缺失的FvW(Lankhof等人，Thromb.Haemost.77:1008-1013，1997)、Val449和Asn730之間包括糖蛋白lb結(jié)合結(jié)構(gòu)域和用于膠原以及肝素的結(jié)合位點(diǎn)(Pietu等人，Biochem.Biophys.Res.Co匪n.164:1339-1347，1989)的FvW片段，嵌合形式以及包括不同于血漿天然成熟形式的翻譯后修飾的形式。例如，這些多種FvW形式可通過(guò)修飾成熟FvW或者任何天然存在于血液中的其他形式而制備。編碼此FvW的核苷酸序列可源于多種來(lái)源，優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物，包括人、豬、羊、牛、馬科和羊亞科來(lái)源，這一列表并非局限性的。如在此使用，"含有FVIII和FvW的混合物的溶液"旨在意指處于復(fù)合狀態(tài)或分離狀態(tài)的任何含有FVIII和FvW的溶液。這些溶液可以是血漿或重組或轉(zhuǎn)基因來(lái)源的。當(dāng)該溶液是重組來(lái)源時(shí)，其源自單細(xì)胞體系，其中FVI11和FvW蛋白表達(dá)被誘導(dǎo)。可以提及任何轉(zhuǎn)染有包括編碼這些蛋白中各自的基因的載體的動(dòng)物或人細(xì)胞系，優(yōu)選編碼人蛋白質(zhì)的基因，其中所述細(xì)胞系可尤其選自CH0-K、CHO-LeClO、CH0Lec-l、CH0Pro_5、CH0dhfr-、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt_4、C0S_7、293_HEK、YB2/0(ATCCCRL-1662)、BHK、K61-I6、NS0、SP2/0-Ag14和P3X63Ag8.653、SK-H印、H印G2、PERC6(Crucell)細(xì)胞系，以及植物細(xì)胞、細(xì)菌體系，例如E.Coli、真菌體系、使用病毒的體系，尤其是桿狀病毒，這一列表并非局限性的。此種細(xì)胞體系通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法表達(dá)FvW和FVIII蛋白。可提及US5，198，349作為實(shí)例，其內(nèi)容在此通過(guò)引用并入本文。所述文獻(xiàn)描述了FVIII和FvW共表達(dá)，尤其是在CH0細(xì)胞中，該CH0細(xì)胞一方面共轉(zhuǎn)染有插入了FVIII編碼序列的表達(dá)載體，而另一方面共轉(zhuǎn)染有插入FvW編碼序列的表達(dá)載體。6當(dāng)該溶液是轉(zhuǎn)基因來(lái)源時(shí)，其源自多細(xì)胞體系，尤其來(lái)自通過(guò)轉(zhuǎn)基因獲得的動(dòng)物或植物，也就是說(shuō)其中一種或多種細(xì)胞接收了重組DNA分子。其適合的實(shí)例包括狗、貓、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、牛、山羊、綿羊、兔和豬、馬、昆蟲、植物如煙草、大豆，這一列表并非局限性的。當(dāng)通過(guò)動(dòng)物生產(chǎn)FVIII和FvW時(shí)，這一生產(chǎn)可在由動(dòng)物分泌的多種介質(zhì)中發(fā)生，該介質(zhì)例如尿、血液、唾液或乳汁，這一列表并非局限性的。此種生產(chǎn)方法可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行?？商峒癊P0741515和EP807170作為實(shí)例，這一列表并非局限性的。后者描述了以穩(wěn)定方式在其基因組中整合編碼FVIII和FvW的DNA分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)，以便表達(dá)它們并在乳汁中分泌它們。當(dāng)通過(guò)植物生產(chǎn)FVIII和FvW時(shí)，這一生產(chǎn)可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行，如在US6，331，416和US5，994，628中所述，這一列表并非局限性的。當(dāng)該溶液是血漿來(lái)源時(shí)，其可以是動(dòng)物或人源血漿，或冷沉淀物，或者通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)方法獲得的級(jí)分(Cohn等人，J.Am.Chem.Soc.，68,459,1946以及Kistler等人，VoxSang.，7，1962，414-424)。這些級(jí)分可任選地經(jīng)過(guò)預(yù)純化處理，例如在氫氧化鋁上的吸附。FVIII和FvW混合物意指這些蛋白質(zhì)可以近乎相似的量存在，或者一種蛋白質(zhì)相對(duì)于另一種是主導(dǎo)存在的，或者非常主導(dǎo)存在的。如在此使用，"含有FvW的溶液"旨在意指任何含有FvW的溶液，并且基本上缺乏，也就是具有很少或者甚至極少的FVIII。這一溶液可以是重組、轉(zhuǎn)基因或血漿來(lái)源。當(dāng)溶液是重組來(lái)源時(shí)，其源自單細(xì)胞體系，其中FvW蛋白表達(dá)被誘導(dǎo)。其適合的實(shí)例包括所有轉(zhuǎn)染有包括編碼這一蛋白的基因的載體的動(dòng)物或人細(xì)胞系，優(yōu)選編碼人蛋白質(zhì)的基因，其中所述細(xì)胞系可尤其選自CH0-K、CH0-LeC10、CH0Lec-1、CH0Pro-5、CH0dhfr-、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、C0S-7、293-HEK、YB2/0、朋K、K61_I6、NS0、SP2/0-Ag14和P3X63Ag8.653、SK-H印、H印G2細(xì)胞系，以及植物細(xì)胞、細(xì)菌體系，例如E.Coli、真菌體系、使用病毒的體系，尤其是桿狀病毒，這一列表并非局限性的。此種細(xì)胞體系表達(dá)FvW蛋白，并且可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法獲得?？商峒癠S5，198，349和W089/06096作為適合的實(shí)例，這一列表并非局限性的。US5，198,349描述了通過(guò)將編碼人FvW的cDNA插入表達(dá)載體而在COS細(xì)胞中表達(dá)人FvW。當(dāng)該溶液是轉(zhuǎn)基因來(lái)源時(shí)，其源自多細(xì)胞體系，尤其來(lái)自通過(guò)轉(zhuǎn)基因獲得的動(dòng)物或植物，也就是說(shuō)其中一種或多種細(xì)胞接收了編碼FvW的重組DNA分子。其適合的實(shí)例包括狗、貓、小鼠、大鼠、牛、山羊、綿羊、兔和豬、馬、昆蟲、植物如煙草、大豆，這一列表并非局限性的。當(dāng)通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)FvW時(shí)，這一生產(chǎn)可由由動(dòng)物分泌的多種介質(zhì)實(shí)現(xiàn)，該介質(zhì)例如尿、血液、唾液或乳汁，這一列表并非局限性的。此種生產(chǎn)方法可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。W02001/022810和W01999/058699是其適合的實(shí)例，這一列表并非局限性的。這一方面，W02001/022810描述了在其乳汁中生產(chǎn)人FvW的雌性轉(zhuǎn)基因小鼠的生產(chǎn)。當(dāng)通過(guò)植物生產(chǎn)FvW時(shí)，這一生產(chǎn)可由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法實(shí)現(xiàn)，如在US6，331，416和US5，994，628中所述，這一列表并非局限性的。當(dāng)該溶液是血漿來(lái)源時(shí)，其可以是動(dòng)物或人源血漿級(jí)分，或冷沉淀物，或者通過(guò)標(biāo)CN準(zhǔn)分級(jí)方法獲得的級(jí)分(Cohn等人，J.Am.Chem.Soc.，68,459，1946以及Kistler等人，VoxSang.，7，1962，414-424)。這些級(jí)分可任選地經(jīng)過(guò)預(yù)純化處理，例如在氫氧化鋁上的吸附。如在此使用，"源自非人動(dòng)物分泌物的含有FVIII的溶液"旨在意指任何源自任何分泌物，例如來(lái)自血槳、唾液、尿或乳汁，由經(jīng)遺傳改造以在前述分泌物之一中表達(dá)FVI11分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所生產(chǎn)的溶液。這種情況下，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不表達(dá)FvW。如在此使用，"源自含F(xiàn)VIII血漿的溶液"旨在也包括任何源自天然含有人或動(dòng)物FVIII的血漿、基本上沒(méi)有FvW的溶液。其可源自動(dòng)物或人血漿級(jí)分，或冷沉淀物，或者通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)方法獲得的級(jí)分(Cohn等人，J.Am.Chem.Soc.，68,459，1946以及Kistler等人，VoxSang.，7，1962，414-424)。這些級(jí)分可任選地經(jīng)過(guò)預(yù)純化處理例如在氫氧化鋁上的吸附?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)方分泌物的方法。其適合的實(shí)例包括US5，880，327和US2007/0011752，這一列表并非局限性的。這一方面，US5，880，327描述了在轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中生產(chǎn)人FVIII。US2007/0011752描述了從多種動(dòng)物的唾液生產(chǎn)人蛋白質(zhì)例如FVIII。如在此使用，"源自含F(xiàn)VI11植物提取物的溶液"旨在意指任何來(lái)自含F(xiàn)VIII蛋白質(zhì)(尤其是人源)的植物的級(jí)分，其在經(jīng)遺傳改造以表達(dá)FVIII分子的植物或轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞中獲得。此提取物可通過(guò)將含編碼FVIII的基因的核苷酸載體導(dǎo)入植物細(xì)胞而生產(chǎn)。此方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可通過(guò)屬于本領(lǐng)域的諸多文獻(xiàn)所描述，例如US2005/0060775。如在此使用，"離子交換色譜過(guò)濾型膜"旨在意指任何通過(guò)離子交換而使FVIII和/或FvW通過(guò)該膜時(shí)，具有吸附FVIII和/或FvW能力的物理半滲透屏障。此外，這一膜可以在膜與FVIII和/或FvW之間的離子交換相互作用不再足以將它們保留在膜上時(shí)，允許FVIII和FvW流過(guò)。因此，為了實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的純化FVIII或FvW的方法，使用由大孔底物制成的離子交換過(guò)濾型膜，所述底物包括固定到其上的負(fù)電或正電包被，所述包被提供為過(guò)濾型膜離子交換特性。通常，負(fù)電或正電包被通過(guò)化學(xué)接枝固定到大孔底物上。該大孔底物的孔隙率，也就是其平均孔徑是使得過(guò)濾型膜允許FVIII和FvW流過(guò)。使用此種膜的首要益處在于使用可棄式交換過(guò)濾型膜的可能性，其提高了該方法的衛(wèi)生安全級(jí)別。使用此種膜的第二個(gè)益處在于在待純化溶液的極高流速下，進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明純化方法，并且更準(zhǔn)確地，離子交換色譜步驟的可能性。任何類型的物理屏障底物可適合于適于根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施的過(guò)濾型膜，例如多聚體膜、芯(wick)、空心纖維、穩(wěn)定的纖維素、聚醚砜、或任何可以允許FVIII和FvW流過(guò)的三維結(jié)構(gòu)。過(guò)濾型膜與FVIII和FvW蛋白之間的離子交換相互作用源于固定到大孔底物上的正電或負(fù)電包被，所述包被包括可以被替代的堿性或酸性官能部分。離子交換包被可為單官能類型，也就是包括只有一種官能部分，或者如果存在多種類型的官能部分，則是多官能類型，。因此，由于FVIII和FvW蛋白質(zhì)和膜之間的相互作用，過(guò)濾型膜使得能夠同時(shí)捕獲或吸附FVIII和FvW蛋白。在將含有FVIII和FvW的溶液施用至膜上時(shí)，由于離子交換相8互作用，F(xiàn)vW和FVI11被膜保留。當(dāng)待純化的產(chǎn)物不存在于冷沉淀物時(shí)，優(yōu)選進(jìn)行溶液預(yù)純化步驟以在進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的純化方法前純化，從而獲得足以不含污染物的溶液。這一預(yù)純化步驟可以是有益的，尤其是用含有大量蛋白質(zhì)的介質(zhì)的復(fù)雜的溶液，例如源自乳汁或血漿。此預(yù)純化步驟可尤其包括澄清步驟，例如如WO2004/076695所述，或者提取步驟，例如如FR0604864或FR0611536所述，這一列表并非局限性的。這一方面，F(xiàn)R0604864描述了至少一種存在于乳汁中的蛋白質(zhì)的提取方法，所述蛋白質(zhì)對(duì)所述乳汁的f丐離子具有親和性(無(wú)論復(fù)合與否)，包括由下面的步驟(i)通過(guò)沉淀鈣化合物釋放蛋白質(zhì)，該化合物通過(guò)將乳汁與可溶性鹽如磷酸鈉接觸而獲得，依在此介質(zhì)中形成所述不溶性鈣化合物的能力選擇該可溶性鹽的陰離子，以便獲得富含蛋白質(zhì)的液相，(ii)從鈣化合物沉淀分離富含蛋白質(zhì)的液相，進(jìn)一步分離所述液相以形成脂相和水性、含有蛋白質(zhì)的非脂相，禾口(iii)回收該水性，含有蛋白質(zhì)的非脂相。此外，F(xiàn)R0611536描述了提取存在于乳汁中的蛋白質(zhì)的方法，包括至少一種疏水袋和在乳汁的中性pH下的負(fù)電荷，包括下述步驟a)撇取所述乳汁并脫脂化，b)在使得所述蛋白質(zhì)保留于接枝有具疏水和離子特性的配體的色譜底物上的pH條件下，將含有所述蛋白質(zhì)的脫脂化且經(jīng)過(guò)撇取的級(jí)分施用到所述底物上，例如4-巰基-乙基-吡啶，c)洗脫該蛋白質(zhì)，d)通過(guò)從所述洗脫級(jí)分中除去乳蛋白質(zhì)而純化該經(jīng)洗脫的級(jí)分，禾口e)回收所述蛋白質(zhì)。在通過(guò)細(xì)胞體系生產(chǎn)溶液的情況下，預(yù)純化步驟可這樣緊跟在細(xì)胞培養(yǎng)步驟本身后?？煽刂萍?xì)胞培養(yǎng)基的組成以使由細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外介質(zhì)中。此外，可進(jìn)行細(xì)胞選擇以便生成的蛋白質(zhì)分泌到介質(zhì)中。此后，可能需要深層過(guò)濾步驟或切向微過(guò)濾以獲得適于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明純化方法的步驟的預(yù)純化。本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式中，過(guò)濾型膜是陽(yáng)離子交換選擇性膜。該膜攜帶的官能團(tuán)的正平衡離子(positivecounter-ion)由與FvW和FVIII具有相同正負(fù)號(hào)的電荷所代替?？捎糜陉?yáng)離子交換包被的官能團(tuán)包括羧甲基(CM)、磷?；突潜?SP)、硫酸根(S)，這一列表并非局限性的。在這些使用陽(yáng)離子交換過(guò)濾型膜的實(shí)施方式中，可使用的緩沖液包括三-羥甲基-氨基甲烷、碳酸鹽、乙二胺、咪唑或三乙醇胺，這一列表并非局限性的。這些實(shí)施方式中，將根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)來(lái)選擇緩沖PH值，以便蛋白質(zhì)在該pH值具有整體正電荷水平。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，應(yīng)用的過(guò)濾型膜是陰離子交換選擇性膜。由膜攜帶的官能團(tuán)的負(fù)平衡離子由與FvW和FVIII具有相同正負(fù)號(hào)的電荷所代替?？捎糜陉庪x子交換包被的官能部分包括二乙基氨基乙基(DEAE)、二乙基(2_羥丙基)氨基乙基或季銨(QAE，Q)、二甲基氨基乙基(DMAE)和三甲基氨基乙基(TMAE)，這一列表并非局限性的。這些實(shí)施方式中，可使用的緩沖液是醋酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、甘氨酸、巴比妥酸鹽，這一列表并非局限性的。這些實(shí)施方式中，將根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)來(lái)選擇緩沖PH值，以便蛋白質(zhì)在該pH值具有整體負(fù)電荷水平。優(yōu)選地，過(guò)濾型膜包括由強(qiáng)陰離子交換器組成的離子交換包被。如在此使用，"強(qiáng)陰離子交換器"旨在意指任何能夠吸附離子化差的蛋白質(zhì)的陰離子交換膜。此種過(guò)濾型膜是市售可得的。適合的實(shí)例包括攜帶QAE或Q部分的膜，尤其是MustangQ⑧;膜(Pall)或SartobindQ膜(Sartorius)，這一列表并非局限性的。MustangQ膜(Pall)是尤其引起關(guān)注的，因?yàn)樗鼡碛懈呶侥芰透呱V容量流量，并且因?yàn)樗梢杂糜趩窝h(huán)(可棄式的)或多次循環(huán)。此外，所述膜使得不需要進(jìn)行底物沖洗的證實(shí)步驟，例如再生和衛(wèi)生處理(病毒和朊病毒安全方法等)。使用此過(guò)濾型膜也使得不需要進(jìn)行對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)底物而常規(guī)進(jìn)行的老化研究。因此，相比于現(xiàn)有技術(shù)的方法，使用此膜能夠降低生產(chǎn)時(shí)間。優(yōu)選地，與溶液接觸以純化的過(guò)濾型膜的表面包括陰離子交換包被，該包被包括通過(guò)化學(xué)接枝固定到大孔底物上的季銨基團(tuán)。進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，過(guò)濾型膜是大孔膜。如在此使用，術(shù)語(yǔ)"大？L"旨在意指由孔徑在0.3m至1.0m范圍的膜構(gòu)成的體系。更優(yōu)選地，孔徑在O.5iim至0.9iim的范圍。最優(yōu)選地，孔徑為0.8ym。根據(jù)本發(fā)明具體優(yōu)選的實(shí)施方式中，膜底物為聚醚砜底物。作為實(shí)例，此聚醚砜膜可為MlIStangQ⑧膜，由Pall出售。這一膜具有0.8iim直徑的孔并且其接枝有季銨基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，待純化的溶液含有FVIII或FvW，并且是血漿源的。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，待純化的溶液含有FVIII和FvW的混合物，并且更優(yōu)選地源于血槳。因此，根據(jù)本發(fā)明的這些實(shí)施方式中，溶液源于天然的人或動(dòng)物血漿，也就是源于分別天然含有人或動(dòng)物FVIII和FvW的人或動(dòng)物血漿。可從豬、兔、山羊收集此動(dòng)物血漿，這一列表并非局限性的。出人意料地，申請(qǐng)人觀察到過(guò)濾型膜，并且尤其是MustangQ敷膜具有比樹(shù)脂或凝膠更高的FVIII和/或FvW吸附能力。如在此使用，"吸附能力"旨在意指固定到凝膠上的目標(biāo)蛋白質(zhì)的量，并且其通常由凝膠或樹(shù)脂制造商以固定到凝膠或陰離子樹(shù)脂上的BSA量(牛血清白蛋白)來(lái)表示。例如，對(duì)于常規(guī)用于純化FVIII和/或FvW的DEAE-TOYOPEARUD'凝膠，其在25至35mg/ml的范圍，而對(duì)于MustangQ膜，其高于或等于30mg/ml。過(guò)濾型膜的較高吸附能力意味著相比于凝膠或樹(shù)脂，使用較小量的凝膠等效物吸附等量FVIII和/或FvW的可能。作為說(shuō)明，能夠在DEAE上吸附50至80IUFvW和FVI11/ml凝膠，在MustangQ⑧,膜上吸附200至250IUVWF和FVIII/ml凝膠等效物。相比于凝膠或樹(shù)脂，過(guò)濾型膜的最高吸附能力可源于FVIII和/或FvW對(duì)離子化位點(diǎn)的提高的可接近性，尤其是在它們形成FVIII/FvW復(fù)合物時(shí)。事實(shí)上，這些蛋白質(zhì)具有大的尺寸，尤其是在它們形成FVIII/FvW復(fù)合物時(shí)，并且可以假定相比于接枝到凝膠或樹(shù)脂上，當(dāng)它們接枝到大孔過(guò)濾型膜上時(shí)，由于孔徑，離子化位點(diǎn)更易于接近它們，而凝膠或樹(shù)脂的情況中，離子化位點(diǎn)嵌入通道中，使得不容易被大蛋白質(zhì)接近。有利地，根據(jù)本發(fā)明的這一優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法包括下述步驟a)提供來(lái)自血漿的冷沉淀物，b)在所述離子交換色譜膜上，并且更尤其在陰離子交換色譜膜上捕獲，也就是吸附因子VIII和VonWillebrand因子，和c)通過(guò)連續(xù)增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度值來(lái)選擇性地回收VonWillebrand因子和因子VIII。有利地，在提供來(lái)自血槳的冷沉淀物的步驟后，可以進(jìn)行通過(guò)在氧化鋁凝膠上吸附因子VIII和VonWillebrand因子的預(yù)純化步驟然后冷沉淀。上述方法步驟c)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)他對(duì)于FvW和FVIII蛋白質(zhì)中每種的理化特性以及對(duì)于過(guò)濾型膜的離子交換特性的普通知識(shí)，可容易地調(diào)整洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度值，該過(guò)濾型膜通常是市售可得的過(guò)濾型膜，其使用推薦由制造商提供。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于他的普通知識(shí)尤其知曉從陰離子交換色譜底物用具有離子強(qiáng)度值高于從相同底物洗脫FvW所需的離子強(qiáng)度值的緩沖液來(lái)洗脫FVIII所。因此，上述方法步驟c)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用這樣的緩沖液，其離子強(qiáng)度值適于洗脫(從底物解吸附)(i)FvW，(ii)FvW和FVIII或(iii)順序地首先FvW，然后FVIII。根據(jù)對(duì)由順序地首先洗脫FvW，然后FVIII所組成的備選的(iii)的第一實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可順序地使用兩種洗脫緩沖液，每種洗脫緩沖液具有分別針對(duì)于解吸附FvW或FVIII而調(diào)整的離子強(qiáng)度值。根據(jù)備選的(iii)的第二實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員用能夠產(chǎn)生漸增的離子強(qiáng)度梯度的緩沖液進(jìn)行洗脫，利用該離子強(qiáng)度梯度，F(xiàn)vW，然后FVIII順序地解吸附。因此，如在此使用，對(duì)于上述方法步驟c)，"順序增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度值"包括線性增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度值，這可通過(guò)添加鹽，例如氯化鈉、氯化鈣而得到，這一列表非局限性的?？梢酝ㄟ^(guò)增加緩沖液的離子強(qiáng)度值而首先獲得FvW洗脫物然后FVIII洗脫物。因此能夠回收FvW并在獲得FvW后停止洗脫，或者通過(guò)繼續(xù)洗脫獲得FVIII。如在此使用，"冷沉淀物"旨在意指通過(guò)低溫沉淀方法從人或動(dòng)物血漿獲得的沉淀物?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法獲得該冷沉淀物。作為實(shí)例，使冷凍血漿處于約-5t:至-i5t:的溫度，然后在攪拌下緩慢加熱至不超過(guò)rc或任選4t:的溫度。在這些條件下，冷凍血漿融化以得到液相和固相。然后通過(guò)離心回收固相(即冷沉淀物)。冷沉淀物基本上由纖維蛋白原、纖連蛋白、因子VIII和VonWillebrand因子(vWF)構(gòu)成。冷沉淀物中，F(xiàn)VIII通常與穩(wěn)定FVIII的FvW相伴。如在此使用，"選擇性回收"旨在意指根據(jù)洗脫方法，根據(jù)期望的蛋白質(zhì)，回收FVIII或者FvW或者FVIII和FvW的混合物的能力?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，通過(guò)改變pH值，或通過(guò)提高洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度值來(lái)獲得FvW或者FVIII或者FVIII和FvW的混合物(參見(jiàn)例如實(shí)施例1)。其他實(shí)施方式中，待純化的溶液含有重組或轉(zhuǎn)基因來(lái)源的FVIII和FvW的混合物。這一實(shí)施方式包括下述步驟a)提供包括FVIII和FvW的細(xì)胞培養(yǎng)物上清或預(yù)純化的溶液，b)在所述離子交換色譜膜，并且尤其在陰離子交換色譜膜上捕獲因子VIII和VonWillebrand因子，和c)通過(guò)連續(xù)增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度值來(lái)選擇性地回收VonWillebrand因子和因子VIII。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，待純化的溶液含有FVIII或FvW。這一實(shí)施方式包括下述步驟a)提供含有FVIII或FvW的細(xì)胞培養(yǎng)物上清或純化的溶液，b)在所述離子交換色譜膜，并且尤其在陰離子交換色譜膜上捕獲因子VIII或VonWillebrand因子，和c)回收VonWillebrand因子或因子VIII。有利地，利用血漿級(jí)分，本發(fā)明的方法使得降低了維生素K依賴性因子纖維蛋白原和纖連蛋白的量。有利地，尤其在待純化的溶液含有FVIII和FvW混合物時(shí)，選擇性回收FvW和FVIII通過(guò)下述步驟實(shí)現(xiàn)cl)通過(guò)增加所述色譜膜的平衡緩沖液的離子強(qiáng)度值來(lái)洗脫FvW。例如可通過(guò)添加0.25M氯化鈉至重量摩爾滲透壓濃度在約600至660m0sm/Kg范圍來(lái)增加離子強(qiáng)度值。C2)通過(guò)增加所述色譜膜的平衡緩沖液的離子強(qiáng)度值甚至高于用來(lái)回收VonWillebrand因子的值來(lái)洗脫FVIII。例如可通過(guò)添加0.7M氯化鈉，或0.35M氯化鈣至重量摩爾滲透壓濃度在約1400至170m0sm/Kg范圍來(lái)增加離子強(qiáng)度值。步驟cl)是選擇性回收FvW的步驟，此步驟期間使用離子強(qiáng)度適于從離子交換過(guò)濾型膜解吸附FvW的緩沖液。步驟c2)是選擇性回收FVIII的步驟，此步驟期間使用離子強(qiáng)度適于從離子交換過(guò)濾型膜解吸附FVIII的緩沖液。步驟c2)中，使用離子強(qiáng)度值高于步驟cl)所用緩沖液的離子強(qiáng)度值的緩沖液。在離子交換色譜過(guò)濾性膜上同時(shí)捕獲FVIII和FvW后進(jìn)行這些步驟。在步驟cl)中洗脫的FvW含有極少FVIII?；厥账@得了純化的FvW溶液。此外，在步驟c2)中獲得的FVIII含有比初始溶液更少的FvW?；厥账@得了FVIII純化溶液。任選地，能夠?qū)嵤╊~外步驟以解離高分子量FVIII-FvW復(fù)合物，例如如EP1037923所述。任選地，然后能在孔隙率小于或等于20nm，尤其是等于15mn的親水過(guò)濾膜上實(shí)施用于FVIII純化溶液的額外過(guò)濾步驟，如在WO2005/040214所述。進(jìn)一步具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法通過(guò)在所述離子交換色譜過(guò)濾型膜上的FVIII和FvW同時(shí)吸附步驟后進(jìn)行下述步驟而能夠獲得純化的FvW溶液d)通過(guò)增加所述色譜膜的平衡緩沖液的離子強(qiáng)度值來(lái)洗脫FvW，e)在離子交換色譜膜，更優(yōu)選在與第一膜相同類型的膜上捕獲VonWillebrand因子，和f)通過(guò)增加所述色譜膜的平衡緩沖液的離子強(qiáng)度值來(lái)洗脫VonWillebrand因子。這一實(shí)施方式中，任選地，能夠在通過(guò)增加所述色譜膜的平衡緩沖液的離子強(qiáng)度值的FvW洗脫步驟d)后，通過(guò)增加所述色譜膜的平衡緩沖液的離子強(qiáng)度值甚至高于用來(lái)回收VonWillebrand因子的值來(lái)洗脫FVIII。因此，在簡(jiǎn)化的方法中，獲得純化的含F(xiàn)vW溶液和純化的含F(xiàn)VIII溶液。本發(fā)明方法因此有益地能夠獲得從含F(xiàn)VIII和FvW的溶液順序或同時(shí)純化FVIII和FvW。如果溶液是血漿源的，根據(jù)本發(fā)明的方法是尤其有益的，因?yàn)樗軌虮M可能有利地使用人或動(dòng)物血漿。有益地，這一具體實(shí)施方式還包括下述步驟g)在具有明膠配體的親和凝膠柱上對(duì)步驟c)洗脫的富含VonWillebrand因子的級(jí)分進(jìn)行色譜，禾口h)回收沒(méi)有滯留的且缺乏纖連蛋白的Willebrand因子級(jí)分。例如，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，通過(guò)免疫比濁法，進(jìn)行纖連蛋白檢測(cè)。因此，根據(jù)本發(fā)明方法的實(shí)施方式能夠通過(guò)在離子交換色譜過(guò)濾型膜上的FVIII和FvW同時(shí)捕獲步驟后進(jìn)行下述步驟而獲得純化的FvW溶液和純化的FVIII溶液a)通過(guò)增加所述色譜膜的平衡緩沖液的離子強(qiáng)度值來(lái)洗脫FvW，b)通過(guò)增加所述色譜膜的平衡緩沖液的離子強(qiáng)度值甚至高于用來(lái)回收VonWillebrand因子的值來(lái)洗脫FVIII，c)在離子交換色譜膜上捕獲VonWillebrand因子，d)通過(guò)增加所述色譜膜的平衡緩沖液的離子強(qiáng)度值來(lái)洗脫VonWillebrand因子，e)在具有明膠配體的親和凝膠柱上對(duì)步驟d)洗脫的富含VonWillebrand因子的級(jí)分進(jìn)行色譜，禾口f)回收沒(méi)有在凝膠親和上保留的富含VonWillebrand的級(jí)分。因此，這一實(shí)施方式中，順序獲得純化的FVIII溶液和純化的FvW溶液。根據(jù)本發(fā)明的方法，在其多種實(shí)施方式中，能夠因此以簡(jiǎn)化的方式分離FVIII和FvW。根據(jù)本發(fā)明的純化步驟是唯一通過(guò)在陰離子交換色譜選擇性膜上同時(shí)捕獲兩種蛋白質(zhì)而能夠從血漿分別或同時(shí)純化因子VIII和VonWillebrand因子的步驟。本發(fā)明的又一目的在于提供制備純化的FVIII的方法，包括實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的純化方法。本發(fā)明的又一目的在于提供制備純化的FvW的方法，包括實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的純化方法。將在下面實(shí)施例中描述本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)，這只為說(shuō)明的目的而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。附圖圖1:VonWillebrand因子純化方法的圖表。圖2:因子VIII純化方法的圖表。實(shí)施例實(shí)施例1:VonWillebrand因子的純化方法通過(guò)將新鮮的冷凍血槳融化至1°C和6°C之間的溫度來(lái)制備冷沉淀物。離心后，回收含有纖維蛋白原、纖連蛋白、VonWillebrand因子和因子VIII的冷沉淀物并在含有肝素鈉(3IU/mL)的水性溶液中成為漿液。然后將溶液pH調(diào)至7.0士0.1。通過(guò)在氧化鋁凝膠上吸附以除去維生素K依賴的因子以及通過(guò)冷沉淀來(lái)除去纖維蛋白原和纖連蛋白，對(duì)冷沉淀物漿液進(jìn)行預(yù)純化。因此，攪拌中向懸液中加入氫氧化鋁，攪拌5分鐘。用乙酸0.1M將pH值調(diào)至6.5±0.2并在攪拌下冷卻溶液至溫度達(dá)到14至18t:的范圍。然后離心溶液至溫度為14-18°C?；厥丈锨宀⑼ㄟ^(guò)在0.22iim過(guò)濾膜上過(guò)濾來(lái)澄清。然后通過(guò)在足以對(duì)抗有包膜病毒的在聚山梨酯80(1%，w/v)和磷酸三正丁酯(0.3%，v/v)存在下的溶劑/去污劑處理來(lái)對(duì)預(yù)純化的溶液進(jìn)行病毒滅活步驟。用溶劑/去污劑的處理在pH值為7.1下進(jìn)行至少6小時(shí)的時(shí)間。然后使溶劑/去污劑處理的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)強(qiáng)陰離子交換接枝膜，例如MustangQ膜盒，該膜之前用pH6.9-7.1的富含氯化鈉的堿性緩沖液平衡以達(dá)到370至390mOsm/Kg范圍的重量摩爾滲透壓濃度?！┰摰鞍踪|(zhì)溶液通過(guò)，用相同的緩沖液(重量摩爾滲透壓濃度為370至390mOsm/Kg)洗滌膜盒直到柱洗脫液的光密度回到基線。未被膜吸附的蛋白質(zhì)級(jí)分含有大量纖維蛋白原以及被加入用于基于溶劑/去污劑的病毒滅活處理的化學(xué)劑。然后通過(guò)施用因加入氯化鈉而增加離子強(qiáng)度以達(dá)到重量摩爾滲透壓濃度為600-660mOsm/Kg的pH6.9-7.1的堿性緩沖液來(lái)洗脫吸附在膜上的VonWillebrand。然后用不含氯化鈉的pH6.9-7.1的堿性緩沖液稀釋洗脫后的級(jí)分直到達(dá)到重量摩爾滲透壓濃度為370至390mOsm/Kg。然后使稀釋后的級(jí)分通過(guò)MustangQ膜盒類型的強(qiáng)陰離子交換接枝膜，該膜之前用pH6.9-7.1的富含氯化鈉的堿性緩沖液平衡以達(dá)到370至390mOsm/Kg范圍的重量摩爾滲透壓濃度。一旦該蛋白質(zhì)溶液通過(guò)，用相同的緩沖液(重量摩爾滲透壓濃度為370至390mOsm/Kg)洗滌膜盒直到柱洗脫液的光密度回到基線。然后通過(guò)施用因加入氯化鈉而增加離子強(qiáng)度以達(dá)到重量摩爾滲透壓濃度為600-660mOsm/Kg的pH6.9_7.1的堿性緩沖液來(lái)洗脫吸附在膜上的VonWillebrand。然后使用明膠配體在凝膠上對(duì)洗脫后的級(jí)分進(jìn)行親和色譜，該凝膠之前用因加入氯化鈉而增加離子強(qiáng)度以達(dá)到重量摩爾滲透壓濃度為600-660mOsm/Kg的pH6.9_7.1的堿性緩沖液來(lái)平衡。一旦該蛋白質(zhì)溶液通過(guò)，用相同的緩沖液(重量摩爾滲透壓濃度為600至660mOsm/Kg)洗滌親和凝膠直到柱洗脫液的光密度回到基線。包括凝膠沖洗液的未吸附級(jí)分表示高純度的富含VonWillebrand的級(jí)分。圖l示出了純化圖表。結(jié)果表1:VonWillebrand因子的純化14<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例2:純化因子VIII的方法通過(guò)將新鮮的冷凍血槳融化至1°C和6°C之間的溫度來(lái)制備冷沉淀物。離心后，回收含有纖維蛋白原、纖連蛋白、VonWillebrand因子和因子VIII的冷沉淀物并在含有肝素鈉(3IU/mL)的水性溶液中成為漿液。然后將溶液pH調(diào)至7.0士0.1。通過(guò)在氧化鋁凝膠上吸附以除去維生素K依賴的因子以及通過(guò)冷沉淀來(lái)除去纖維蛋白原和纖連蛋白，來(lái)對(duì)冷沉淀物漿液進(jìn)行預(yù)純化。因此，攪拌下向懸液中加入氫氧化鋁并攪拌5分鐘。用乙酸0.1M將pH值調(diào)至6.5±0.2并在攪拌下冷卻溶液至溫度達(dá)到14至18t:的范圍。然后離心溶液至溫度為14-18°C?；厥丈锨宀⑼ㄟ^(guò)在0.22iim過(guò)濾膜上過(guò)濾來(lái)澄清。然后使溶劑/去污劑處理的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)強(qiáng)陰離子交換接枝膜，例如MustangQ膜盒，該膜之前用pH6.9-7.1的富含氯化鈉的堿性緩沖液平衡以達(dá)到370至390mOsm/Kg范圍的重量摩爾滲透壓濃度?！┰摰鞍踪|(zhì)溶液通過(guò)，用相同的緩沖液(重量摩爾滲透壓濃度為370至390mOsm/Kg)洗滌膜盒直到柱洗脫液的光密度回到基線。未被膜吸附的蛋白質(zhì)級(jí)分含有大量纖維蛋白原以及被加入用于基于溶劑/去污劑的病毒滅活處理的化學(xué)劑。然后通過(guò)施用因加入氯化鈉而增加離子強(qiáng)度以達(dá)到重量摩爾滲透壓濃度為600-660mOsm/Kg的pH6.9-7.1的堿性緩沖液來(lái)洗脫吸附在膜上的VonWillebrand。可按照實(shí)施例l所述繼續(xù)VonWillebrand因子的純化。然后通過(guò)施用因加入氯化鈉而增加離子強(qiáng)度以達(dá)到重量摩爾滲透壓濃度為1400-1700mOsm/Kg的pH6.9_7.1的堿性緩沖液來(lái)洗脫吸附在膜上的因子VIII。有利地，用通過(guò)加入氯化鈣而獲得的高離子強(qiáng)度值的pH6.0的緩沖液洗脫因子VIII。圖2示出了純化圖表。結(jié)果表2:因子VIII的純化步驟產(chǎn)率(％)比活性(IU/mg)初始冷沉淀物1000.3815<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權(quán)利要求從選自(i)含有FVIII和FvW的混合物的溶液，(ii)含有FvW的溶液，(iii)源于非人動(dòng)物的分泌物的溶液，和(iv)源于含有FVIII的植物提取物的溶液來(lái)純化FVIII或FvW的方法，所述方法的特征在于，包括在離子交換色譜過(guò)濾型膜上吸附FVIII或FvW的步驟。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述過(guò)濾型膜為陰離子交換色譜膜。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述過(guò)濾型膜為強(qiáng)陰離子交換器。4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述膜帶有包括季銨基團(tuán)的包被。5.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述膜為大孔型膜。6.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述膜為聚醚砜型膜。7.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述溶液含有FVIII和FvW的混合物。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述溶液為血漿源的。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其包括下述步驟a)提供來(lái)自血漿的冷沉淀物，b)在所述離子交換色譜膜上吸附因子VIII和VonWillebrand因子，c)通過(guò)使用具有適當(dāng)離子強(qiáng)度值的洗脫緩沖液來(lái)回收因子VIII或VonWillebrand因子。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中根據(jù)下述步驟進(jìn)行VonWillebrand因子和因子VIII的選擇性回收cl)通過(guò)用具有適當(dāng)離子強(qiáng)度值的緩沖液進(jìn)行洗脫來(lái)選擇性回收FvW，c2)通過(guò)用具有高于步驟cl)所用緩沖液的離子強(qiáng)度值的適當(dāng)離子強(qiáng)度值的緩沖液進(jìn)行洗脫來(lái)選擇性回收FVIII。11.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其還包括下述步驟d)通過(guò)增加所述色譜膜的平衡緩沖液的離子強(qiáng)度值來(lái)洗脫FvW，e)在離子交換色譜膜，更優(yōu)選在與第一膜相同類型的膜上捕獲VonWillebrand因子，f)通過(guò)增加所述色譜膜的平衡緩沖液的離子強(qiáng)度值來(lái)洗脫VonWillebrand因子。12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其還包括下述步驟g)在具有明膠配體的親和凝膠柱上對(duì)權(quán)利要求11的步驟c)洗脫的富含VonWillebrand因子的級(jí)分進(jìn)行色譜，h)回收沒(méi)有纖連蛋白的未被滯留的VonWillebrand因子級(jí)分。13.生產(chǎn)純化的FVIII的方法，其包括實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法。14.生產(chǎn)純化的FvW的方法，其包括實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法。全文摘要本發(fā)明涉及純化方法，包括從選自(i)含有FVIII和FvW的混合物的溶液，(ii)含有FvW的溶液，(iii)源于非人動(dòng)物的分泌物的溶液，和(iv)源于含有FVIII的植物提取物的溶液開(kāi)始在離子交換色譜過(guò)濾型膜上吸附FVIII或FvW的步驟。文檔編號(hào)C07K1/18GK101796065SQ200880104709公開(kāi)日2010年8月4日申請(qǐng)日期2008年8月28日優(yōu)先權(quán)日2007年8月30日發(fā)明者M(jìn)·普勒,P·博內(nèi)爾申請(qǐng)人:Lfb生物技術(shù)公司