專利名稱：高度可見的染色體特異性探針及相關(guān)方法
高度可見的染色體特異性探針及相關(guān)方法相關(guān)申請的交叉引用本申請根據(jù)35 U. S. C. § 119(e)要求2007年7月26日提交的美國臨時申請 60/962，258的優(yōu)先權(quán)，為了所有目的，在此引入該臨時申請的全部公開內(nèi)容作為參考。序列表的引用本申請包括2008年7月25日創(chuàng)建的、包含3666個字節(jié)的、名稱為 SEQLIS019168-000910PC. txt的文本文件形式的序列表。本文引入該文本文件中包含的內(nèi) 容作為參考。以計算機可讀形式記錄的序列表信息與本文所附的文字序列表一致。
背景技術(shù)：
特定染色體的檢測對于多種診斷方法是重要的。例如，一種通常用于目標染 色體檢測的核酸雜交技術(shù)是熒光原位雜交(FISH)。高度的特異性和準確性和快速產(chǎn) 生結(jié)果的能力，已經(jīng)使得FISH成為鑒定例如染色體異常、遺傳疾病和癌癥的可選擇的 方法° (參見，Heim 禾口 Mitelman, Cancer Cytogenetics, Chromosomal and Molecular GeneticAberrations of Tumor Cells,1995 ；Klinger, Cytogenetics Analysis, Non-Isotopic Methods in Molecular Biology,A Practical Approach, 1995 ;Timm等人， Cytometry 22 :250_5,1995 ;Heselmeyer 等人，Genes, Chromosomes & Cancer 19:233-40, 1997 ；Sauer等人，Apmisl 11 =444-50, 2003) 在產(chǎn)前診斷中，F(xiàn)ISH通常用于檢測非整倍性。 最近已經(jīng)證明，通過FISH可以檢測自然流產(chǎn)中存在的所有染色體異常中的83%。(參見， Jobanputra 等人，Hum. Reprod. 17 :1166_70，2002)。一系列最近的出版物已經(jīng)突出了 FISH 為較新的植入前遺傳學診斷(PGD)領(lǐng)域中的一種重要的分析工具。(例如，參見，Μιιηη 等 人，R印rod Biomed Online 7 :91_7，2003)。用于生殖輔助方法的技術(shù)如體外授精(IVF)的 越來越多的使用，使得有必要開發(fā)新的確定哪些受精卵是植入的最佳候選者的方法。令人 驚訝的是，數(shù)據(jù)表明，盡管看起來形態(tài)正常，但是IVF產(chǎn)生的大多數(shù)胚胎顯示不同程度的染 色體非整倍性。(參見，Marquez 等人，R印rod Biomed Online 1 729-31,2000 ；Abdelhadi 等人，R印rod Biomed Online 6 =226-31,2003) 此外，在IVF之前使用分裂間期FISH使植 入的成功率增加了一倍。(參見，Gianaroli 等人，F(xiàn)ertil Steril 72 =837-44,1999)。100 多年前，von Hansemann (Von Hansemann D. , “ Ueberasymmetrische Zelltheilung in epithelkrebsen und deren bioIogischebedeutung, " Virchow' s Arch Pathol Anat 119 :299_326 (1890))首次描述了在惡性腫瘤中觀察到非整倍性。最近， 有人提出，細胞中的非整倍性程度很好地反映了細胞的基因組不穩(wěn)定性的傾向(Duesberg 等人，“Genetic instability of cancer cells is proportional to their degree ofaneuploidy, " Proc Natl Acad Sci USA 95 :13692_13697 (1998))。20 世紀初，Theodore Boveri認為，非整倍性導致癌癥，但是在他于1915年去世之后沒有人對他的理論感興趣 (Duesberg^Α “ Aneuploidy thesomatic mutation that makes cancer a species on its own, “ Cell Motil. Cytoskeleton 47:81-107(2000))。自那以后，非整倍性一直被 認為是惡性轉(zhuǎn)化中的遺傳不穩(wěn)定性的結(jié)果而不是原因。隨著對實體瘤的遺傳學的進一步了 解，由于在超過20，000種實體瘤中發(fā)現(xiàn)的最常見的異常是染色體數(shù)目改變，非整倍性假說
8重新興起(Bialy H. , “ Aneuploidy andcancer :vintage wine in a new bottle ？ , " Nat Biotechnol,16 (2) 137-8 (1998) ；Sen S. , " Aneuploidy and cancer, " Curr Opin Oncol, 12(1) :82-8(2000))。在許多人類腫瘤中描述了非整倍性，其可以作為惡性腫瘤的標 記。事實上，F(xiàn)DA已經(jīng)批準了在利用最常改變的染色體3、7、9和17通過FISH的非整倍性 檢測中臨床使用的膀胱癌檢測試劑盒。Sokolova等人，J Mol Diagn. 2(3) 116-23 (2000)。 目前在這些檢測方法中使用的FISH探針來源于克隆到質(zhì)?；駼ACs中的基因組DNA片段， 并需要整夜雜交，以獲得最佳結(jié)果。確定的著絲粒重復序列的存在允許使用更小和更精確的合成寡脫氧核苷酸探針 (0DN探針)，而不是來源于大基因組DNA序列的更常用的探針(Matera等人，Genomics 18:729-31,1993)。ODN—般更快速地雜交，更保持一致，并且生產(chǎn)成本更低。在以下文 獻中描述了一些當前的染色體特異性寡核苷酸，例如，美國專利6，300, 066 ；Pellestor 等人(Cytogenet. Cell Genet. 70 138-142(1995) ；Anston 等人(Eur. J. Hum. Genet. 11 357-363，2003) ；Paulasova 等人(Mol. Hum. Reprod. 10 :467_472，2004)；及 0 ‘ Keefe 和 Matera(Genome Res. 10 :1342_1350，2000)。然而，設(shè)計用于靶向和/或檢測重復序列的較小的ODN探針通常缺乏足夠的檢測 靈敏性和/或特異性。例如，使用常規(guī)的染色體特異性寡核苷酸探針的檢測通常需要成組 的間接標記的特異性探針和/或信號放大、數(shù)字增強或整合，以檢測信號。因此，本領(lǐng)域中 需要新的染色體特異性寡核苷酸，其當被標記或用作染色體分析的探針時是高度可見的。 這些高度可見的探針一般會使基于染色體的診斷方法具有更大的檢測靈敏性，并且在一些 應(yīng)用中，將允許檢測特定染色體，而不需要用于信號增強或整合的計算機輔助方法。發(fā)明概述本發(fā)明一般地涉及染色體特異性核酸序列。本發(fā)明的各個方面包括，例如，包含染 色體特異性核酸序列的合成寡核苷酸和標記探針，用于選擇這些序列的方法，用于制備寡 核苷酸或標記探針的方法和試劑盒，以及用于檢測特定人類染色體的方法和試劑盒。一般地，本發(fā)明的合成寡核苷酸包括由25-35個與特定人類染色體(例 如，2或4號染色體或Y染色體)上的重復序列(例如，著絲粒重復序列、近著絲粒 (pericentromeric)重復序列、異染色質(zhì)重復序列、端粒重復序列、α隨體重復序列、β隨 體重復序列、Y隨體重復序列或隨體1、2或3重復序列)完全互補的連續(xù)核苷酸組成的染 色體特異性序列，該染色體特異性序列與所有人類染色體的共有重復序列不到84%相同。 通常情況下，該合成寡核苷酸與人類基因組內(nèi)的所有其它連續(xù)核酸序列不到84%相同。在 某些實施方案中，該染色體特異性序列由25-50、25-45、25-40或25-30個與重復序列(例 如，著絲粒重復序列、近著絲粒重復序列、異染色質(zhì)重復序列、端粒重復序列、α隨體重復序 列、β隨體重復序列、Y隨體重復序列或隨體1、2或3重復序列)完全互補的連續(xù)核苷酸 組成。本發(fā)明的合成寡核苷酸可以進一步包括可檢測標記(例如，熒光團)。在某些實施 方案中，標記通過連接體、交聯(lián)劑或間隔物連接到染色體特異性序列上。本發(fā)明的合成寡核苷酸可以進一步包括形成包括莖區(qū)和環(huán)區(qū)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核 苷酸，其中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的多個核苷酸具有連接的可檢測標記。在某些實施方案中，莖區(qū)包 括16-40個核苷酸。在某些實施方案中，至少兩個具有連接的可檢測標記的核苷酸是相鄰的。在某些實施方案中，具有連接的可檢測標記的核苷酸間隔至少2、3、4、5、6、7、8或9個 核苷酸。在某些實施方案中，標記是熒光團(如熒光素、羅丹明、得克薩斯紅(Texas Red)、 藻紅素、Cy3、Cy5、Alexa532、Alexa 546,Alexa 568 或 Alexa 594)。在某些實施方案中，標 記通過連接體、交聯(lián)劑或間隔物連接到形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸上。本發(fā)明的合成寡核苷酸可以進一步包括富含G的核酸序列。通常，富含G的核酸序 列包括最少大約75%的G核苷酸。富含G的核酸序列可以包括，例如，大約20至大約100 個核苷酸，通常為大約30至大約40個核苷酸。在包含染色體特異性序列和富含G的序列 的寡核苷酸的某些變化形式中，寡核苷酸還包括連接富含G的序列與染色體特異性序列的 第三核酸序列。富含G的序列可以是，例如，末端序列(例如，富含G的序列連接到染色體 特異性序列的5'端或富含G的序列連接到染色體特異性序列的3'端)。本發(fā)明的標記探針一般包括本文所述的寡核苷酸和可檢測標記。該標記可以是， 例如，直接標記。特別合適的直接標記包括熒光團，諸如，如熒光素、羅丹明、得克薩斯紅、藻 紅素、Cy3、Cy5、Alexa 532,Alexa 546, Alexa 568 或 Alexa 594。另外，該標記也可以是間 接標記。在標記探針包括本文所述的富含G的序列的某些實施方案中，標記探針還包括連 接在富含G的序列中的G核苷酸上的鉬標記絡(luò)合物，該鉬標記絡(luò)合物包含可檢測標記。在 這些實施方案中的一些實施方案中，標記是鉬絡(luò)合物的鉬。此外，在某些變化方案中，標記 探針包括多個鉬標記絡(luò)合物(例如，至少3個)，每個絡(luò)合物連接到富含G的核酸序列中的 不同G核苷酸上。通常，鉬絡(luò)合物連接到G核苷酸N7的基團。在某些方面，本發(fā)明還提供了探針混合組合物。一般來說，探針混合組合物包括多 種不同的標記探針，每種不同的標記探針是本文所述的探針，且具有(a)不同的染色體特 異性序列，和(b)可與每種其它可檢測標記區(qū)別的不同的可檢測標記。在這些實施方案中 的一些實施方案中中，每種可檢測標記是具有光譜可區(qū)別的發(fā)射波長的熒光團。本發(fā)明也提供了確定染色體特異性探針序列的方法。在某些實施方案中，該方法 包括(a)比較特定人類染色體(例如，染色體1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、乂染色體或￥染色體)的重復序列與所有人類染色體的共有重復 序列，和(b)確定由特定重復序列中的25-35個連續(xù)核苷酸組成并且與共有重復序列具有 低于84%的同一性的核酸序列，從而確定潛在的染色體特異性探針序列。在某些實施方案 中，步驟(b)的核酸序列由特定重復序列中的25-50、25-45、25-40或25-30個連續(xù)核苷酸 組成。在某些實施方案中，重復序列包括著絲粒重復序列、近著絲粒重復序列、異染色質(zhì)重 復序列或端粒重復序列。在某些實施方案中，共有重復序列包括α隨體重復序列、β隨體 重復序列、Y隨體重復序列、端粒重復序列或隨體1、2或3重復序列。在其它實施方案中， 該方法一般包括(a)比較特定人類染色體(例如，染色體1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X染色體或Y染色體)的著絲粒重復序列與所有人類 染色體的α-單體重復序列，和(b)確定由特定著絲粒重復序列中的25-35個連續(xù)核苷酸 組成并且與所有其它α “單體重復序列具有低于84%的同一性的核酸序列，從而選擇染色 體特異性探針序列。在某些實施方案中，步驟(b)的核酸序列由特定重復序列中的25-50、 25-45,25-40或25-30個連續(xù)核苷酸組成。這些方法可以進一步包括制備包含選擇的染色 體特異性核酸序列的寡核苷酸探針。
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在某些實施方案中，所述方法包括(e)用可檢測標記標記染色體特異性探針序 列；(f)在人類的分裂中期或分裂間期，使用標記探針進行原位雜交；(g)檢測與標記相關(guān) 的信號，其中，選擇雜交時產(chǎn)生至少2倍高的信號的染色體特異性探針序列作為染色體特 異性探針。在選擇染色體特異性探針序列的方法的某些變化形式中，該方法包括如步驟(b) 所述確定多種核酸序列，從而選擇多種染色體特異性探針序列。這些變化形式中的一些還 包括制備多種標記的寡核苷酸探針，每種探針包含可檢測標記和不同的染色體特異性核酸 序列，每種不同的序列是(b)中選擇的染色體特異性序列之一；在人類的分裂中期或分裂 間期，單獨地用不同寡核苷酸探針中的每一種進行原位雜交；檢測與每種雜交探針的標記 相關(guān)的信號；以及根據(jù)檢測信號的程度，選擇一種或多種寡核苷酸探針。在用于選擇染色體特異性探針序列的方法的其它實施方案中，該方法還包括(C) 比較在(a)中確定的核酸序列的核苷酸序列與人類基因組中的所有其它連續(xù)核苷酸序列； 和(d)保留與人類基因組中的另一種連續(xù)核苷酸序列具有低于84%的同一性的任何序列， 或舍棄與人類基因組中的另一種連續(xù)核苷酸序列具有少于16%的錯配的任何序列，其中， 確定這些序列為潛在的染色體特異性探針序列。在某些實施方案中，所述方法進一步包括 制備多種標記的寡核苷酸探針，每種探針包含可檢測標記和不同的染色體特異性核酸序 列，每種不同的序列是在(d)中未舍棄的染色體特異性序列中的一種；在人類的分裂中期 或分裂間期，單獨地用不同寡核苷酸探針中的每一種進行原位雜交；檢測與每種雜交探針 的標記相關(guān)的信號；以及根據(jù)檢測信號的程度，選擇一種或多種寡核苷酸探針。本發(fā)明還提供了制備標記探針的方法。在某些實施方案中，這些方法包括將標記 (例如，熒光團)直接連接到染色體特異性寡核苷酸的5'或3'末端上。在某些實施方案 中，所述方法包括將標記(例如，熒光團)連接到包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的染色體特異性寡核苷酸 上。在某些實施方案中，所述方法一般包括(1)將富含G的核酸序列的至少一個G核苷 酸連接到鉬絡(luò)合物上，其中，所述鉬絡(luò)合物包括可檢測標記或能夠連接到可檢測標記上，和 (2)將富含G的序列連接到由與特定人類染色體上的重復序列完全互補的25-35個連續(xù)核 苷酸組成的染色體特異性核酸序列上，其中該染色體特異性序列與所有人類染色體的共有 重復序列(例如，α隨體重復序列、β隨體重復序列、Y隨體重復序列、端粒重復序列或隨 體1、2或3重復序列)不到84%相同。步驟⑵可以在步驟⑴之前進行，或者相反。在 某些實施方案中，步驟(2)的染色體特異性核酸序列由與特定人類染色體上的重復序列完 全互補的25-50、25-45、25-40或25-30個連續(xù)核苷酸組成。在某些變化方案中，鉬絡(luò)合物 能夠連接到可檢測標記上，并且所述方法還包括將鉬絡(luò)合物連接到可檢測標記上。此外，該 方法可以包括將所述富含G的核酸序列中的多個G核苷酸中的每一個連接到單獨的鉬絡(luò)合 物上。通常，富含G的核酸序列包括至少大約75%的G核苷酸。富含G的核酸序列可以包 括，例如，大約20至大約100個核苷酸，通常為大約30至大約40個核苷酸。富含G的序列 可以是，例如，末端序列(例如，富含G的序列連接到染色體特異性序列的5'端或富含G的 序列連接到染色體特異性序列的3'端)。根據(jù)本發(fā)明，一種檢測特定人類染色體的方法一般包括將人類染色體制品與本文 所述的標記探針接觸；在足以允許探針與具有與探針的染色體特異性序列完全互補的重復 序列的特定人類染色體(如果存在的話)雜交的條件下，孵育該染色體制品和探針；以及檢 測所述標記以檢測特定人類染色體(如果存在的話)。在某些變化方案中，該方法是確定染色體異常的方法?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法，包括例如使用顯微鏡和CCD照相機的 顯微成像，實現(xiàn)標記的檢測。在某些實施方案中，標記的檢測包括使用計算機和CCD照相機 的圖像掃描顯微鏡術(shù)。在典型的實施方案中，染色體制品包括人類細胞，且雜交步驟在細胞 內(nèi)的染色體上原位進行。在某些實施方案中，所述方法包括將人類細胞與多種(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多種)不同的標記探針接觸，每種不同標記探針 具有(a)不同的染色體特異性序列和(b)可與每種其它可檢測標記區(qū)別的不同的可檢測 標記。在一些這樣的實施方案中，每種可檢測標記是具有光譜上可區(qū)分的發(fā)射波長的熒光團。本發(fā)明還提供了各種用于制備標記探針的試劑盒，以及用于檢測目標染色體的試 劑盒。在某些實施方案中，該試劑盒包括提供包含染色體特異性序列的寡核苷酸的第一容 器和提供標記(如熒光團)的第二容器。在某些實施方案中，包含染色體特異性序列的寡 核苷酸進一步包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在某些實施方案中，該試劑盒包括提供包含染色體特異性序 列和本文所述的富含G的核酸序列的寡核苷酸的第一容器，和提供鉬絡(luò)合物的第二容器。 鉬絡(luò)合物包括特征在于能夠被G核苷酸取代的第一離去基團和選自以下的基團(i)可檢 測標記，( )連接到可檢測標記上的連接體，(iii)能夠連接可檢測標記的連接體，和(iv) 第二離去基團，其特征在于能夠被(i)、(ii)和(iii)中的至少一種取代。在某些實施方案 中，鉬絡(luò)合物包括(iii)的連接體，并且所述試劑盒還包括提供可檢測標記的第三容器。在 某些可替代的實施方案中，鉬絡(luò)合物包括第二離去基團，并且所述試劑盒還包括提供(i)、 ( )或(iii)的第三容器。用于檢測細胞中的目標染色體的試劑盒一般包括提供本文所述的標記探針的第 一容器。在探針具有間接標記的某些變化方案中，試劑盒還包括提供用于檢測間接標記的 第二試劑的第二容器。


圖1顯示了 4種示例性的用于包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的染色體特異性探針的標記策略。標 記的核苷酸用黑體字表示。圖IA顯示每3個核苷酸進行標記，環(huán)結(jié)構(gòu)除外。圖IB顯示最 低限度標記的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，其中，標記密度不應(yīng)影響熒光團偶合或誘導猝滅。圖IC顯示每6 個核苷酸和在環(huán)的頂點進行標記。標記的核苷酸處于莖螺旋的相對的位置。圖ID顯示除 了環(huán)結(jié)構(gòu)之外，只有一條莖鏈被標記。莖螺旋上的線性標記位置使氨基90°間隔，假定形成 β-DNA。發(fā)明詳述I.引言本發(fā)明提供一般涉及使用具有高檢測靈敏性和特異性的較小的染色體特異性寡 核苷酸探針的組合物和方法?？梢酝ㄟ^多種技術(shù)中的任何一種標記本文所述的染色體特異 性寡核苷酸，以產(chǎn)生高度可見的、在特定實施方案中允許檢測目標人類染色體(例如，染色 體 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、乂染色體或￥染色體) 的探針，而無需計算機輔助的數(shù)字增強或整合。II.定義
除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。雖然任何與本文所述類似的方法和材料均可用于實 踐或測試本發(fā)明，但是只描述了示例性的方法和材料。為了本發(fā)明的目的，下列術(shù)語定義如 下?！叭旧w”是包含細胞的基因組的全部或一部分的染色質(zhì)復合體。細胞的基因組通 常用其核型進行表征，核型是包含細胞的基因組的所有染色體的集合。細胞的基因組可以 包含一個或多個染色體。人類基因組包含23對染色體，包括染色體1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 以及一對 X 和 Y 染色體?！胺至验g期”是指細胞分裂的一個階段，此時，染色體伸長并且相互纏繞。術(shù)語“分 裂間期(interphases) ”指分裂間期染色體?！胺至阎衅凇笔侵讣毎至阎械娜魏坞A段，此時，染色體凝縮或收縮，并且相互可以 區(qū)分。術(shù)語“分裂中期(metaphases)”指分裂中期染色體?！爸貜托蛄小笔侵溉祟惢蚪M中的非編碼的串聯(lián)重復核苷酸序列，包括，例如， 來自α隨體、隨體1、隨體2、隨體3、β隨體、γ隨體和端粒的重復序列。重復序列 在本領(lǐng)域中是已知的，且在以下文獻中描述，例如，(Allshire等人，Nucleic Acids Res 17(12) :4611_27 (1989) ；Cho 等人，Nucleic Acids Res 19(6) :1179_82(1991)； Fowler 等人’ Nucleic Acids Resl5(9) 3929(1987) ；Haaf 等人’ Cell 70(4) 681-96(1992) ；Lee 等人，Chromosoma 109(6) 381-9(2000) ；Maeda 和 Smithies, Annu Rev Genet 20:81—108(1986) ；Meyne 禾口 Goodwin, Chromosoma 103(2) 99-103 (1994)； Miklos(1985). Localized highly repetitive DNA sequences in vertebrategenomes. Molecular evolutionary genetics. I. J. R. Macintyre.NY, PlenumPublishing Corp. 241-321 (1985) ；Tagarro 等人，Hum Genet 93(2) 125-8 (1994) ；Waye 和 Wi llard，PNAS USA 86(16) 6250-4(1989)；及 Willard和 Waye，J Mol Evol 25(3) :207_14(1987))。重復序列 位于，例如，染色體的著絲粒、近著絲粒、異染色質(zhì)和端粒區(qū)域。以下文獻描述了共有重復序 列，例如，WiIlard 和 Waye，J Mol Evol 25(3) :207_14 (1987)及 Tagarro 等人，Hum Genet 93(2) 125-8 (1994). Vissel 和 Choo，Nucleic Acids Res. 15(16) :6751_6752(1987)，Cho 等人，Nucleic Acids Res 19(6) :1179_82 (1991)。術(shù)語“核苷酸”，除了指自然產(chǎn)生的核糖核苷酸或脫氧核苷酸單體外，在本文應(yīng)被 理解為是指其相關(guān)結(jié)構(gòu)變異體，包括衍生物和類似物，其在使用該核苷酸的特定范圍內(nèi)在 功能上相當(例如，與鉬絡(luò)合物連接，與互補性堿基雜交，或者兩個不相鄰的核酸序列之間 的連接)，除非上下文清楚地表明并非如此。因此，核苷酸可以包括，例如，包含天然存在的 堿基(例如，A、G、C或T)或修飾的堿基(例如，7-脫氮鳥苷或肌苷)的核苷酸。術(shù)語“核酸”是指具有多個核苷酸單體的聚合物。核酸可以是單鏈或雙鏈的，可以 是DNA(cDNA或基因組DNA)、RNA、合成形式和混合聚合物，也可以是化學或生化修飾的，或 可以包含非自然的或衍生的核苷酸堿基。這些修飾包括，例如，甲基化，用類似物取代一種 或多種自然發(fā)生的核苷酸，核苷酸之間的修飾，如不帶電的連接(例如，膦酸甲酯、磷酸三 酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、帶電的連接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、側(cè)鏈 部分(pendent moieties)(如多肽)、嵌入劑(例如，吖啶、補骨脂素等)、螯合劑、烷基化劑 和修飾的連接(例如，α異頭核酸等)。本發(fā)明還包括在通過氫鍵和其它化學相互作用結(jié)合
13指定序列方面模擬核酸的合成分子。通常，核苷酸單體通過磷酸二酯鍵連接，盡管核酸的合 成形式可以包含其它連接(例如，肽核酸(本文也稱為“PNA”)，如Nielsen等人，Science 254，1497-1500，1991所述)。核酸還可以包括，例如，構(gòu)象限制的核酸(例如，“鎖定核酸” 或“LNA”，如 Nielsen 等人，J. Biomol. Struct. Dyn. 17 :175_91，1999 所述)?！昂怂帷辈幌?于任何特定長度的聚合物，因此，可以是基本上任何長度，一般為大約6個核苷酸至大約IO9 個核苷酸或更長。在雙鏈聚合物情況下，“核酸”可以指任一條或兩條鏈。術(shù)語“寡核苷酸”指長度為大約6個核苷酸到大約175個核苷酸的一類核酸。 寡核苷酸可以使用已知的方法合成(例如，使用自動寡核苷酸合成儀，例如，Applied BioSystems (Foster City, CA)制造的)。術(shù)語“序列”當用于核酸時，是指連續(xù)的一系列核苷酸。如本文中所用，術(shù)語“染色體特異性核酸序列”指對于細胞基因組內(nèi)的特定染色體 為特異性的核酸序列。如果核酸序列與基因組內(nèi)的特定染色體上的核苷酸區(qū)段完全互補， 但是該完全互補的核苷酸區(qū)段在該基因組的大部分或全部其它染色體上不存在，則該核酸 序列對于該特定染色體是特異性的。如本文中所用，“染色體特異性核酸”或“染色體特異性寡核苷酸”指包含染色體特 異性核酸序列的核酸或寡核苷酸。術(shù)語“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”或“發(fā)夾序列”指具有雙鏈“莖”區(qū)和單鏈“環(huán)”區(qū)的核酸，其中，莖 區(qū)和環(huán)區(qū)由具有以下區(qū)域的核酸單鏈形成(1)互相基本上互補的兩個區(qū)域，從而形成包 含莖的雙鏈序列(即，通過互補堿基配對)，和(2)插入兩個互補區(qū)域之間的第三區(qū)域，其形 成環(huán)。下面文獻中描述了發(fā)夾結(jié)構(gòu)，例如，Varani, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24 379-404，1995。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可包括修飾的核苷酸，包括，例如，氨基修飾的核苷酸，以提供用于 連接標記如熒光團的反應(yīng)性官能團。術(shù)語“相鄰的”在用于兩個核酸序列(例如，染色體特異性核酸序列和發(fā)夾序列或 染色體特異性核酸序列和富含G的核酸序列)時，意思是這兩個序列是不重疊的(不共享 限定這兩個序列的一個或多個核苷酸)，并且沒有被插入分子分隔開(即，沒有被如下文定 義的“連接體”分隔開)。如本文中所用，術(shù)語“富含G的核酸序列”指本發(fā)明的合成寡核苷酸或探針的特定 區(qū)域或部分，其連接染色體特異性核酸序列與一種或多種鉬絡(luò)合物。“富含G的核酸序列” 指包含至少大約50%、一般至少大約60%、更通常至少大約75%的鳥嘌呤核苷酸的核酸序 列。“鳥嘌呤核苷酸”，如在富含G的核酸序列中使用時，是指包含自然發(fā)生的鳥嘌呤堿基或 者具有適合與鉬絡(luò)合物連接的受體基團的修飾鳥嘌呤堿基或鳥嘌呤類似物的核苷酸。通 常，富含G的核酸序列是與結(jié)合目標的元件互相排斥的探針的部分或區(qū)域，即，富含G的序 列通常不會設(shè)計為特異性結(jié)合目標。本發(fā)明的富含G的核酸序列通常為至少20個核苷酸 的長度。在各個實施方案中，富含G的核酸序列在長度上是至少30個核苷酸、至少40個核 苷酸或至少50個核苷酸。在其它非互相排斥的實施方案中，富含G的核酸序列在長度上不 超過70、不超過80、也不超過90或不超過100個核苷酸。在具有核酸目標結(jié)合序列的探針中，富含G的“末端”核酸序列意味著該富含G的 序列是探針的末端區(qū)域，即，最5'區(qū)域或最3'區(qū)域。在兩個分子(不論是單體還是聚合分子)的連接中，“連接體”是指插入所連接的兩個分子之間并且與它們相鄰的分子(不論是單體還是聚合分子)?！斑B接體”可以用來連接例如染色體特異性核酸序列和標記，染色體特異性核酸序列和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，染色體特異性 核酸序列和富含G的核酸序列，或可檢測標記和鉬絡(luò)合物中的鉬原子。連接體可以是核苷 酸連接體(即，在非相鄰的序列之間并且與它們相鄰的核酸序列)或非核苷酸連接體。因 此，例如，在染色體特異性核酸序列與不相鄰也不重疊的富含G的核酸序列的連接中，“連接 體”是指插入不相鄰的染色體特異性序列與富含G的序列之間并且與它們相鄰的分子。如本文中所用，“探針”指能夠結(jié)合互補的目標核酸的核酸。如本文進一步描述的， 探針結(jié)合染色體中的互補目標位點。通常，探針是標記探針，具有一種或多種可檢測標記， 以允許探針在與互補目標雜交后被檢測到。如本文中所用，“鉬絡(luò)合物”或“含鉬的化合物”指包含多價鉬原子的分子，并且其 已通過與鳥嘌呤核苷酸受體反應(yīng)而與鳥嘌呤核苷酸形成加合物或具有此能力，從而將鉬絡(luò) 合物與富含G的核酸序列的至少一個鳥嘌呤核苷酸連接。在本發(fā)明的典型的實施方案中， 鉬絡(luò)合物是四價或六價?！般f標記絡(luò)合物”或“鉬標記化合物”是指包含可檢測標記的鉬絡(luò) 合物。以下文獻描述了適用于本發(fā)明的含鉬化合物，例如，國際專利公開WO 92/01699、美國 專利5，714，327和美國專利6，825，330。如本文中所用，術(shù)語“加合物”指通過鉬絡(luò)合物中的鉬原子與G核苷酸的原子配位 形成的復合物。在本文中所用的加合物中，鉬原子直接參與鉬絡(luò)合物與G核苷酸的結(jié)合。如本文中所用，術(shù)語“離去基團”是指可以從本文所述的鉬絡(luò)合物的鉬原子處置換 的部分，有利于受體分子在適當?shù)臈l件下連接鉬原子。例如，離去基團的特征為其能夠被富 含G的核酸序列的G核苷酸、被可檢測標記、或被連接于或能夠連接于可檢測標記的連接體 所取代。離去基團的選擇在本領(lǐng)域的技術(shù)人員的能力之內(nèi)，通過比較候選離去基團與受體 分子的電負性進行選擇(即，候選受體分子上的相對較高電負性的基團將趨向于取代相對 較低電負性的離去基團)。例如，用于連接鉬絡(luò)合物與富含G的核酸序列的合適的離去基團 包括在適當條件下允許在鉬離子與鳥嘌呤核苷酸受體之間形成鍵的基團。離去基團包括， 例如，F(xiàn)、NO2、Ots、SOPO4、Cl、Br、I、CN、N3、NR3、OAr、OR、SR、SO2R 和 NH2，其中 R 是有機殘基， Ar是芳基有機殘基。其它包括，例如，硫酸酯、硝酸酯、磷酸酯、碳酸酯和其低級烷基衍生物 (如硝酸乙酯、硝酸丙酯等)。適于離去基團置換的條件是本領(lǐng)域公知的，并且隨具體的離 去基團和受體分子而變化。在某些變化方案中，合適的條件包括在0. 5至120分鐘加熱到 15-100°C的包含具有“軟”配體的分子的溶液，所述配體如較重的鹵素、膦、硫化物，氮化合 物如胺、腺嘌呤、腺苷及其衍生物、鳥嘌呤、鳥苷及其衍生物、DNA、RNA、PNA、烯烴、炔烴和其 它π-化合物。如本文在包含標記的探針中所用，術(shù)語“可檢測標記”指能夠檢測的試劑，這樣它 所結(jié)合的相應(yīng)的探針的存在就可以檢測出來。標記可以是間接或直接的?！伴g接標記”是可 特異性結(jié)合的分子(“配體”)，使用特異性結(jié)合間接標記的標記的二級試劑(“結(jié)合配體的 配偶體”)檢測。相反，“直接標記”不利用結(jié)合配體的配偶體的相互作用即可檢測。對于間 接標記，二級試劑通常具有直接標記，或者，可選擇地，二級試劑也可以被間接標記。典型的 “直接標記”包括，例如，熒光團(如熒光素、羅丹明或酞菁染料)、生色團(如藻膽蛋白)、發(fā) 光劑(Iuminescers)(例如，化學發(fā)光劑和生物發(fā)光劑)、鑭系元素螯合物(如Eu3+或Tb3+的 絡(luò)合物)、酶(如堿性磷酸酶)、輔因子和包含放射性同位素如3H、35S、32P、125I和14C的殘基。典型的間接標記包括，例如，半抗原、生物素或其它可特異性結(jié)合的配體“半抗原”是指分離的表位，即具有抗原決定簇的分子。半抗原的例子包括二硝基 苯酚(DNP)、洋地黃毒苷、生物素以及各種熒光團或染料(如熒光素、Alexa 405/Cascade 藍、Alexa 488、Bodiby FL、丹酰(Dansyl)、俄勒岡綠(Oregon Green)、螢光黃(Lucifer Yellow)、四甲基羅丹明/羅丹明紅和得克薩斯紅)。作為間接標記，半抗原通常使用抗半 抗原抗體作為結(jié)合配體的配偶體進行檢測。然而，也可以使用可選擇的結(jié)合配體的配偶體 (例如，在生物素的情況下，可以使用例如抗生物素抗體或鏈霉抗生物素作為結(jié)合配體的配 偶體)檢測半抗原。此外，在某些實施方案中，也可以直接檢測半抗原(例如，在熒光素的 情況下，可以使用抗熒光素抗體或直接檢測熒光)。本發(fā)明提供一般涉及使用具有高檢測靈敏性和特異性的較小的、染色體特異性寡 核苷酸探針的組合物和方法?？梢酝ㄟ^多種技術(shù)中的任何一種標記本文所述的染色體特異 性寡核苷酸，以產(chǎn)生高度可見的、在某些實施方案中允許檢測目標人類染色體的探針，而無 需計算機輔助的數(shù)字增強或整合。III.染色體特異性寡核苷酸、探針和探針混合物因此，在某些方面，本發(fā)明提供了新的具有染色體特異性序列的合成寡核苷酸。這 樣的合成寡核苷酸可用于，例如，制備用于檢測特定目標染色體(包括例如，染色體2或4 或Y染色體)的標記探針。一般來說，本發(fā)明的合成寡核苷酸包括由25-35個與特定人類 染色體上的重復序列完全互補的連續(xù)核苷酸組成的染色體特異性序列。通常情況下，染色 體特異性序列與所有人類染色體的共有重復序列(例如，α隨體重復序列、β隨體重復序 列、Y隨體重復序列、端粒重復序列或隨體1、2或3重復序列)不到84%相同。在某些實 施方案中，染色體特異性序列與共有重復序列低于85%、低于84%、低于80%、低于78%、 低于75%、小于73%或低于70%相同。優(yōu)選地，合成寡核苷酸與人類基因組內(nèi)的所有其它 連續(xù)核酸序列不到84%相同。根據(jù)本發(fā)明，合成寡核苷酸的染色體特異性序列對于特定人類染色體是特異性 的。在某些變化方案中，染色體特異性序列對于人類染色體2或4或Y染色體是特異性的。 示例性的染色體2、染色體4和Y染色體特異性的核酸序列在表1列出。表1.示例性的染色體特異性核酸序列
SEQ ID NO I 名稱序列(5，-3，)
~IYlCCAGTCGAATCCATTCGAGTACATACC
~~2 2CCTTTTGAATCCATTCCATTGGAGTCC
3ATTCATTGCATTCCGTTTCATGAAATTCGA
~ 4CTGCATACAATTTCACTCCATTCGTTCCCA
~ 5TCCATTGGAGTCAATTCCTTTCGACACCCA
權(quán)利要求
合成寡核苷酸，包括由25 35個與特定人類染色體上的重復序列完全互補的連續(xù)核苷酸組成的染色體特異性序列，其中，所述染色體特異性序列與所有人類染色體的共有重復序列不到84％相同。
2.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述重復序列選自著絲粒重復序列、近著絲粒 重復序列、異染色質(zhì)重復序列和端粒重復序列。
3.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述共有重復序列選自α隨體、β隨體、Υ 隨體、隨體1、隨體2和隨體3重復序列。
4.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述染色體特異性序列與人類基因組內(nèi)的所 有其它連續(xù)核酸序列不到84%相同。
5.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述染色體特異性序列對于選自Y染色體、染 色體2和染色體4的染色體的α單體重復序列是特異性的。
6.如權(quán)利要求5所述的寡核苷酸，其中，所述染色體特異性序列選自CCAGTCGAATCCATTCGAGTACATACC(SEQ IDNO1)CCTTTTGAATCCATTCCATTGGAGTCC(SEQ IDNO2)ATTCATTGCATTCCGTTTCATGAAATTCGA(SEQIDNO3)CTGCATACAATTTCACTCCATTCGTTCCCA(SEQIDNO4)TCCATTGGAGTCAATTCCTTTCGACACCCA(SEQIDNO5)TTGATCCTATTTTATTAAATTGCATTCTAT(SEQIDNO6)GTGCGCCCTCAACTAACAGTGTTGAAGCTT(SEQIDNO7)GAAACGGGATTGTCTTCATATAAACTCTAG(SEQIDNO8)GTATCTTCCAATAAAAGCTAGATAGAAGCA(SEQIDNO9)ATGTCAGAAACTTTTTCATGATGTATCTAC(SEQIDNO=10)TATGTGTGATGTGCGCCCTCAACTAAGAGT(SEQIDNO=11)TCTCAGAAGCTTCATTGGGATGTTTCAATT(SEQIDNO=12)GGAATACGGTGATAAAGGAAATATCTTCCA(SEQIDNO=13)TCTTTGTGTTGTGTGTACTCATGTAACAGT(SEQIDNO=14)TTTCTGCCCTACCTGGAAGCGGACATTTCG(SEQIDNO=15)GGTTATCTTCATATAAAATCCAGACAGGAG(SEQIDNO16)CGGCACTACCTGGAAGTGGATATTTCGAGC(SEQIDNO=17)TCTGCACTACCTGGAAGAGGCCATTTCGAG(SEQIDNO=18)CCTACGGGGAGAAAGGAAAATTCTTCAAAT(SEQIDNO19)
7.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，進一步包括可檢測標記。
8.如權(quán)利要求7所述的寡核苷酸，其中，所述可檢測標記包括熒光團。
9.如權(quán)利要求7所述的寡核苷酸，其中，所述熒光團選自熒光素、羅丹明、得克薩斯紅、 藻紅素、Cy3、Cy5、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 568 禾口 Alexa 594。
10.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，進一步包括形成包括莖區(qū)和環(huán)區(qū)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡 核苷酸，其中，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的多個核苷酸具有連接的可檢測標記。
11.如權(quán)利要求10所述的寡核苷酸，其中，所述莖區(qū)具有16-40個核苷酸。
12.如權(quán)利要求10所述的寡核苷酸，其中，至少2個具有連接的可檢測標記的核苷酸是相鄰的。
13.如權(quán)利要求10所述的寡核苷酸，其中，所述具有連接的可檢測標記的核苷酸間隔 至少2個核苷酸。
14.如權(quán)利要求10所述的寡核苷酸，其中，所述具有連接的可檢測標記的核苷酸間隔3 個核苷酸。
15.一種包含多個如權(quán)利要求7所述的寡核苷酸的組合物。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中，每個寡核苷酸的可檢測標記是具有光譜可區(qū) 別的發(fā)射波長的熒光團。
17.標記探針，包括由25-35個與特定人類染色體上的重復序列完全互補的連續(xù)核苷酸組成的染色體特 異性序列，其中，所述染色體特異性序列與所有人類染色體的共有重復序列不到84%相同； 和可檢測標記。
18.如權(quán)利要求17所述的探針，其中，所述可檢測標記是直接標記。
19.如權(quán)利要求18所述的探針，其中，所述直接標記包括熒光團。
20.如權(quán)利要求19所述的探針，其中，所述熒光團選自熒光素、羅丹明、得克薩斯紅、藻 紅素、Cy3、Cy5、Alexa 532、Alexa 546、Alexa568 禾口 Alexa 594。
21.如權(quán)利要求17所述的探針，其中，所述標記是間接標記。
22.如權(quán)利要求21所述的探針，其中，所述間接標記包括熒光團。
23.如權(quán)利要求22所述的探針，其中，所述熒光團選自熒光素、羅丹明、得克薩斯紅、藻 紅素、Cy3、Cy5、Alexa 532、Alexa 546、Alexa568 禾口 Alexa 594。
24.如權(quán)利要求17所述的探針，進一步包括形成包括莖區(qū)和環(huán)區(qū)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷 酸，其中，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的多個核苷酸具有連接的可檢測標記。
25.如權(quán)利要求24所述的探針，其中，所述莖區(qū)具有16-40個核苷酸。
26.如權(quán)利要求24所述的探針，其中，至少2個具有連接的可檢測標記的核苷酸是相鄰的。
27.如權(quán)利要求24所述的探針，其中，所述具有連接的可檢測標記的核苷酸間隔至少2 個核苷酸。
28.如權(quán)利要求24所述的探針，其中，所述具有連接的可檢測標記的核苷酸間隔3個核苷酸。
29.一種探針混合組合物，包括多種不同的標記探針，每種不同的標記探針包含由25-35個與特定人類染色體上的重 復序列完全互補的連續(xù)核苷酸組成的染色體特異性序列，其中，所述染色體特異性序列與 所有人類染色體的共有重復序列不到84%相同，且具有(a)不同的染色體特異性寡核苷酸；和(b)可與每種其它可檢測標記區(qū)別的不同的可檢測標記。
30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中，每種可檢測標記是具有光譜可區(qū)別的發(fā)射波 長的熒光團。
31.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中，每個探針進一步包括形成包括莖區(qū)和環(huán)區(qū)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，其中，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的多個核苷酸具有連接的可檢測標記。
32.一種確定染色體特異性探針序列的方法，所述方法包括(a)比較特定人類染色體的重復序列與所有人類染色體的共有重復序列；和(b)將由特定人類染色體的重復序列內(nèi)的25-35個連續(xù)核苷酸組成并且與共有重復序 列具有低于84%的同一性的核酸序列確定為潛在的染色體特異性探針序列。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，進一步包括(c)比較在(b)中確定的染色體特異性探針序列與人類基因組中的所有其它連續(xù)核苷 酸序列；和(d)將與人類基因組中的所有其它連續(xù)核苷酸序列具有超過16%的錯配的核酸序列 確定為潛在的染色體特異性探針序列。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，進一步包括(e)化學合成并用可檢測標記標記染色體特異性探針序列；(f)使用(e)的標記探針序列，在人的分裂中期或分裂間期進行原位雜交；(g)檢測與標記相關(guān)的信號，其中，選擇雜交時產(chǎn)生至少2倍于背景的信號的染色體特 異性探針序列作為染色體特異性探針。
35.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述重復序列選自著絲粒重復序列、近著絲粒重 復序列、異染色質(zhì)重復序列和端粒重復序列。
36.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述重復序列選自α隨體、β隨體、Υ隨體、隨 體1、隨體2和隨體3重復序列。
37.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述共有重復序列選自著絲粒重復序列、近著絲 粒重復序列、異染色質(zhì)重復序列和端粒重復序列。
38.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述共有重復序列選自α隨體、β隨體、γ隨 體、隨體1、隨體2和隨體3重復序列。
39.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述特定人類染色體選自Y染色體、染色體2和 染色體4。
40.一種檢測特定人類染色體的方法，所述方法包括(a)將人類染色體制品與標記的寡核苷酸接觸，該標記的寡核苷酸包含由25-35個與 特定人類染色體上的重復序列完全互補的連續(xù)核苷酸組成的染色體特異性序列，其中，所 述染色體特異性序列與所有人類染色體的共有重復序列不到84%相同；(b)在足以允許寡核苷酸與可能存在的具有與探針的染色體特異性序列完全互補的重 復序列的特定人類染色體雜交的條件下，孵育所述染色體制品和寡核苷酸；和(c)檢測所述標記以檢測可能存在的特定人類染色體。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述標記包括熒光團。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述熒光團選自熒光素、羅丹明、得克薩斯紅、藻 紅素、Cy3、Cy5、Alexa 532、Alexa 546、Alexa568 禾口 Alexa 594。
43.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述標記連接到形成包括莖區(qū)和環(huán)區(qū)的發(fā)夾結(jié) 構(gòu)的寡核苷酸的發(fā)夾部分上。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的多個核苷酸具有連接的標記。
45.如權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述莖區(qū)具有16-40個核苷酸。
46.如權(quán)利要求43所述的方法，其中，至少2個具有連接的標記的核苷酸是相鄰的。
47.如權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述具有連接的標記的核苷酸間隔至少2個核苷酸。
48.如權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述具有連接的可檢測標記的核苷酸間隔3個核苷酸。
49.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述人類染色體的檢測確定染色體異常。
50.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述染色體制品包含人類細胞，且雜交步驟在細 胞內(nèi)的染色體上原位進行。
51.一種檢測特定人類染色體的方法，所述方法包括(a)將人類染色體制品與包含多個不同的標記寡核苷酸的探針混合組合物接觸，所述 標記寡核苷酸具有由25-35個與特定人類染色體上的重復序列完全互補的連續(xù)核苷酸組 成的染色體特異性序列，其中，所述染色體特異性序列與所有人類染色體的共有重復序列 不到84%相同，其中，每種不同的寡核苷酸具有不同的染色體特異性序列和不同的可與每 種其它可檢測標記區(qū)別的可檢測標記；(b)在足以允許寡核苷酸與可能存在的具有與寡核苷酸的染色體特異性序列完全互補 的重復序列的特定人類染色體雜交的條件下，孵育染色體制品和探針混合組合物；和(c)檢測所述標記以檢測可能存在的特定人類染色體。
52.一種選擇染色體特異性探針序列的方法，所述方法包括(a)比較特定人類染色體的著絲粒重復序列與所有人類染色體的著絲粒重復序列的共 有α -單體重復序列；和(b)確定由特定著絲粒重復序列中的25-35個連續(xù)核苷酸組成且與共有α-單體重復 序列有低于84%的同一性的核酸序列，從而選擇染色體特異性探針序列。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，進一步包括制備包含染色體特異性核酸序列的寡核苷 酸探針，所述序列由(b)中選擇的染色體特異性序列組成。
54.如權(quán)利要求52所述的方法，包括在(b)中確定多種核酸序列，從而選擇多種染色體 特異性探針序列。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，進一步包括制備多種標記的寡核苷酸探針，每種探針包含可檢測標記和不同的染色體特異性核酸 序列，每種不同的序列是(b)中選擇的染色體特異性序列之一；在人類的分裂中期或人類的分裂間期，單獨地用每種不同的寡核苷酸探針進行原位雜、-父；檢測與每種雜交探針的標記相關(guān)的信號；和 根據(jù)檢測信號的程度，選擇一種或多種寡核苷酸探針。
56.如權(quán)利要求54所述的方法，進一步包括(c)比較在(b)中確定的核酸序列與人類基因組中的所有其它連續(xù)核苷酸序列；和(d)舍棄與人類基因組中的另一種連續(xù)核苷酸序列具有超過84%的同一性的任何核 酸序列。
57.如權(quán)利要求33所述的方法，包括在(b)和(d)中確定多種核酸序列，從而確定多種 潛在的染色體特異性探針序列。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，進一步包括制備多種標記的寡核苷酸探針，每種探針包含可檢測標記和不同的染色體特異性核酸 序列，每種不同的序列是(d)中確定的染色體特異性序列之一；在人類的分裂中期和人類的分裂間期，單獨地用每種不同的寡核苷酸探針進行原位雜、-父；檢測與每種雜交探針的標記相關(guān)的信號；和 根據(jù)檢測信號的程度，選擇一種或多種寡核苷酸探針。
59.一種制備標記探針的方法，所述方法包括使形成包括莖區(qū)和環(huán)區(qū)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸連接到由25-35個與特定人類染色體 上的著絲粒重復序列完全互補的連續(xù)核苷酸組成的染色體特異性序列上，其中所述發(fā)夾結(jié) 構(gòu)中的多個核苷酸具有連接的可檢測標記，其中所述染色體特異性序列與所有人類染色體 的端粒重復序列的共有α “單體重復序列不到84%相同。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述莖區(qū)具有16-40個核苷酸。
61.如權(quán)利要求59所述的方法，其中，至少2個具有連接的可檢測標記的核苷酸是相鄰的。
62.如權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述具有連接的可檢測標記的核苷酸間隔至少2 個核苷酸。
63.如權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述具有連接的可檢測標記的核苷酸間隔3個核苷酸。
64.一種檢測特定人類染色體的方法，所述方法包括將人類染色體制品與標記探針接觸，該標記的探針包含由25-35個與特定人類染色體 上的重復序列完全互補的連續(xù)核苷酸組成的染色體特異性序列，其中，所述染色體特異性 序列與所有人類染色體的共有重復序列不到84%相同；在足以允許所述探針與可能存在的具有與探針的染色體特異性序列完全互補的著絲 粒重復序列的特定人類染色體雜交的條件下，孵育所述染色體制品和所述探針；和 檢測所述標記以檢測可能存在的特定人類染色體。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，包括使人類染色體制品與多種不同的標記探針接觸， 每種不同的標記探針具有不同的染色體特異性序列和不同的可與其它可檢測標記中的每 一種區(qū)分開的可檢測標記。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其中，每種可檢測標記是具有光譜可區(qū)別的發(fā)射波長 的熒光團。
67.如權(quán)利要求64所述的方法，它是一種用于確定染色體異常的方法。
68.如權(quán)利要求64所述的方法，其中，檢測標記包括顯微成像。
69.如權(quán)利要求64所述的方法，其中，檢測標記包括圖像掃描顯微鏡術(shù)。
70.如權(quán)利要求64所述的方法，其中，所述染色體制品包括人類細胞，且雜交步驟在細 胞內(nèi)的染色體上原位進行。
71.一種用于檢測細胞中的特定人類染色體的試劑盒，所述試劑盒包括標記的寡核苷酸，其包含由25-35個與特定人類染色體上的重復序列完全互補的連續(xù) 核苷酸組成的染色體特異性序列，其中，所述染色體特異性序列與所有人類染色體的共有重復序列不到84%相同。
72.如權(quán)利要求71所述的試劑盒，其中，所述標記通過連接體連接到染色體特異性序 列上。
73.如權(quán)利要求71所述的試劑盒，其中，所述標記的寡核苷酸進一步包括形成包括莖 區(qū)和環(huán)區(qū)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列，其中，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的多個核苷酸具有連接的可檢測標記。
74.如權(quán)利要求73所述的試劑盒，其中，所述莖區(qū)具有16-40個核苷酸。
75.如權(quán)利要求73所述的試劑盒，其中，至少2個具有連接的可檢測標記的核苷酸是相 鄰的。
76.如權(quán)利要求73所述的試劑盒，其中，所述具有連接的可檢測標記的核苷酸間隔至 少2個核苷酸。
77.如權(quán)利要求73所述的試劑盒，其中，所述具有連接的可檢測標記的核苷酸間隔3個核苷酸。
78.一種用于檢測細胞中的特定人類染色體的試劑盒，所述試劑盒包括多種不同的標記探針，每種不同的標記探針包括由25-35個與特定人類染色體上的重 復序列完全互補的連續(xù)核苷酸組成的染色體特異性序列，其中，所述染色體特異性序列與 所有人類染色體的共有重復序列不到84%相同；且具有(a)不同的染色體特異性序列；和(b)可與其它可檢測標記中的每一種區(qū)別開的不同的可檢測標記。
79.如權(quán)利要求78所述的試劑盒，其中，所述每種可檢測標記是具有光譜可區(qū)別的發(fā) 射波長的熒光團。
全文摘要
本文公開了染色體特異性的合成寡核苷酸和標記探針組合物，以及制備和使用這類組合物的相關(guān)方法。本文還公開了用于制備或使用標記探針的方法的試劑盒。
文檔編號C07H21/00GK101970451SQ200880104705
公開日2011年2月9日 申請日期2008年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月26日
發(fā)明者瓊·奧里馳-科斯塔, 肖恩·P·布拉德利, 菲利浦·T·小摩恩 申請人:塞雷公司