用于制備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法

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專利名稱：用于制備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法
專利說(shuō)明用于制備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法本發(fā)明涉及用于制備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法，以及用于制備聚甲基丙烯酸或聚甲基丙烯酸酯的方法。
甲基丙烯酸是重要的中間產(chǎn)物，其特別地以其烷基酯形式用于制備聚合產(chǎn)物。已知的甲基丙烯酸衍生物為例如甲基丙烯酸甲酯。目前，甲基丙烯酸甲酯的世界年產(chǎn)量為大約150萬(wàn)噸。聚甲基丙烯酸酯是在塑料領(lǐng)域中在各種各樣方面可使用的原材料。
通常，甲基丙烯酸的商業(yè)生產(chǎn)通過(guò)在作為催化劑的固體多金屬氧化物物料上C4-碳化合物(例如丁烯、異丁烯、丁烷、異丁烷、叔丁醇或異丁烯醛)的多相的、兩步催化的氣相氧化來(lái)實(shí)現(xiàn)。然后，將由此獲得的產(chǎn)物氣體混合物(其除了甲基丙烯酸外，還包含許多副產(chǎn)物)經(jīng)歷完全冷凝從而獲得甲基丙烯酸水溶液，或者吸收在合適的溶劑混合物中。此后，通常通過(guò)蒸餾、結(jié)晶、萃取或通過(guò)這些措施的組合來(lái)對(duì)如此獲得的液相進(jìn)行進(jìn)一步的純化。除了C4-碳化合物的催化氣相氧化外，還可以通過(guò)催化氧化脫氫從異丁酸形成甲基丙烯酸，如例如在EP-A-0 356 315中所描述的那樣。所謂的“ACH過(guò)程”提供了用于制備甲基丙烯酸的另一種可能性，其中使丙酮合氰化氫和硫酸進(jìn)行反應(yīng)從而形成作為中間產(chǎn)物的甲基丙烯酰胺，該甲基丙烯酰胺隨后與水進(jìn)一步進(jìn)行反應(yīng)以產(chǎn)生甲基丙烯酸。隨后，對(duì)如此獲得的甲基丙烯酸進(jìn)行蒸餾純化。這種方法例如在EP-A-1 359 137中作了描述。
用于制備甲基丙烯酸的這些常規(guī)方法的缺點(diǎn)尤其在于，不僅在甲基丙烯酸的制備本身中而且在后面的蒸餾純化步驟中，由于通過(guò)這些熱負(fù)荷性步驟引起甲基丙烯酸的高聚合傾向而形成二聚體或寡聚體，這除了額外的純化花費(fèi)外還與產(chǎn)量損失相聯(lián)系。
本發(fā)明的任務(wù)在于，克服由現(xiàn)有技術(shù)所產(chǎn)生的缺點(diǎn)。
特別地，本發(fā)明的任務(wù)在于提供用于制備甲基丙烯酸的方法，其中可以以盡可能少的熱負(fù)荷性步驟來(lái)獲得甲基丙烯酸。
該方法還應(yīng)當(dāng)使得能夠從再生性原料，特別是從碳水化合物和/或甘油來(lái)制備甲基丙烯酸。
一種用于制備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法為解決上述任務(wù)作出了貢獻(xiàn)，所述方法包括下列步驟 IA)通過(guò)包括下述步驟的方法來(lái)制備3-羥基異丁酸，即在從碳源形成3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸(Polyhydroxyalkanoat)的條件下，使細(xì)胞與包含碳水化合物、甘油、二氧化碳、甲烷、甲醇、L-纈氨酸或L-谷氨酸作為碳源的培養(yǎng)基相接觸，所述細(xì)胞相對(duì)于其野生型而言如此地經(jīng)基因工程改造，從而與其野生型相比，它能夠形成更多的3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸；任選地，從培養(yǎng)基中純化出3-羥基異丁酸；以及任選地，中和3-羥基異丁酸，其中，3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成優(yōu)選地經(jīng)由甲基丙二酸半醛或經(jīng)由3-羥基異丁酰輔酶A(作為初產(chǎn)物)來(lái)實(shí)現(xiàn)； IB)使3-羥基異丁酸脫水從而形成甲基丙烯酸；以及任選地，使甲基丙烯酸酯化。
如果3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛來(lái)實(shí)現(xiàn)，那么進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述形成經(jīng)由琥珀酰輔酶A、丙酰輔酶A、丙烯酰輔酶A，特別優(yōu)選地經(jīng)由琥珀酰輔酶A(作為進(jìn)一步的中間產(chǎn)物)來(lái)實(shí)現(xiàn)。如果3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為初產(chǎn)物的3-羥基異丁酰輔酶A來(lái)實(shí)現(xiàn)，那么進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述形成經(jīng)由異丁酰輔酶A或經(jīng)由3-羥基丁酰輔酶A，優(yōu)選地經(jīng)由3-羥基丁酰輔酶A(作為進(jìn)一步的中間產(chǎn)物)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“初產(chǎn)物(Vorprodukt)”定義了這樣的化合物，其可以在僅單個(gè)反應(yīng)步驟中通過(guò)酶促方式被轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸；而術(shù)語(yǔ)“中間產(chǎn)物”定義了這樣的化合物，其不能在僅一個(gè)反應(yīng)步驟中通過(guò)酶促方式被轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“3-羥基異丁酸”總是描述以這樣形式的相應(yīng)的C4-羧酸，所述形式為C4-羧酸在由相應(yīng)的微生物形成之后依賴于pH值而呈現(xiàn)的形式。因此，該術(shù)語(yǔ)總是包括純的酸形式(3-羥基異丁酸)、純的堿形式(3-羥基異丁酸鹽)以及由酸的質(zhì)子化和脫質(zhì)子化形式所組成的混合物。此外，術(shù)語(yǔ)“3-羥基異丁酸”原則上不僅包括(R)-立體異構(gòu)體而且包括(S)-立體異構(gòu)體，其中特別優(yōu)選的是(S)-立體異構(gòu)體。
表述“與其野生型相比，它能夠形成更多的3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸”還涉及這樣的情況經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞的野生型完全不能形成3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸，或者至少不能形成可檢測(cè)量的這些化合物；并且在經(jīng)過(guò)基因工程改造之后才能形成可檢測(cè)量的這些組分。
細(xì)胞的“野生型”優(yōu)選地是指這樣的細(xì)胞，其基因組以如同它自然地通過(guò)進(jìn)化而形成的那種狀態(tài)存在。該術(shù)語(yǔ)不僅用于整個(gè)細(xì)胞，而且用于單個(gè)基因。因此，術(shù)語(yǔ)“野生型”特別地不包括這樣的細(xì)胞或這樣的基因，其基因序列已由人借助于重組方法至少部分地進(jìn)行了改變。
隨后，通過(guò)小心的脫水反應(yīng)從3-羥基異丁酸獲得甲基丙烯酸。在基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的情況下，可以分離出細(xì)胞中所包含的充滿這些聚羥基鏈烷酸的囊泡，隨后裂解所述聚合物從而獲得3-羥基異丁酸，其然后可以進(jìn)行脫水從而獲得甲基丙烯酸。
在此，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是，在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的、經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞是如此地經(jīng)基因工程改造的，從而所述細(xì)胞在確定的時(shí)段內(nèi)，優(yōu)選地在2小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選地在8小時(shí)內(nèi)和最優(yōu)選地在24小時(shí)內(nèi)，所形成的3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的量為所述細(xì)胞的野生型的至少2倍，特別優(yōu)選地至少10倍，更優(yōu)選地至少100倍，更加優(yōu)選地至少1000倍和最優(yōu)選地至少10000倍。在此，產(chǎn)物形成的增加可以例如通過(guò)下列方式來(lái)測(cè)定將在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的細(xì)胞和野生型細(xì)胞各自分開(kāi)地在相同的條件(相同的細(xì)胞密度、相同的培養(yǎng)基、相同的培養(yǎng)條件)下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)過(guò)確定的時(shí)段；隨后測(cè)定培養(yǎng)基中目標(biāo)產(chǎn)物(3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸)的量。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的細(xì)胞可以是原核生物細(xì)胞或真核生物細(xì)胞。在此，可以涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如來(lái)自人的細(xì)胞)，植物細(xì)胞，或者微生物例如酵母、真菌或細(xì)菌，其中特別優(yōu)選的是微生物，最優(yōu)選的是細(xì)菌和酵母。
作為細(xì)菌、酵母或真菌，以細(xì)菌、酵母或真菌菌株形式保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)，Braunschweig，Deutschland)中的那些細(xì)菌、酵母或真菌是特別合適的。根據(jù)本發(fā)明合適的細(xì)菌屬于在http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm中所列出的那些類別，根據(jù)本發(fā)明合適的酵母屬于在http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm中所列出的那些類別，和根據(jù)本發(fā)明合適的真菌屬于在http://www.dsmz.de/species/fungi.htm中所列出的那些類別。
根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的是，使用下列屬的細(xì)胞棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、糖酵母屬(Saccharomyces)、埃希氏菌屬(Escherichia)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)和梭菌屬(Clostridium)，其中黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)、大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克魯維酵母(Kluveromyces lactis)、布蘭克假絲酵母(Candidablankii)、皺落假絲酵母(Candida rugosa)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、有效棒桿菌(Corynebacteriumefficiens)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵假單胞菌(Zymomonas mobilis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、扭脫甲基桿菌(Methylobacteriumextorquens)、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)(特別是富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)、善變副球菌(Paracoccusversutus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)或巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)是特別優(yōu)選的。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第一種變化形式，使用這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中，3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛來(lái)實(shí)現(xiàn)。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的該第一種變化形式的第一個(gè)特別的實(shí)施方案，優(yōu)選的是，3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成優(yōu)選地經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中在根據(jù)本發(fā)明的方法的該實(shí)施方案中所使用的、經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞優(yōu)選地能夠利用碳水化合物、甘油或谷氨酸作為碳源。
在此，在根據(jù)本發(fā)明的方法的第一種變化形式的第一個(gè)特別的實(shí)施方案方面，可以是有利的是，在根據(jù)本發(fā)明的方法的該實(shí)施方案中所使用的、經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的酶E1的活性，所述酶E1催化琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶A(見(jiàn)

圖1)。
術(shù)語(yǔ)“增加的酶的活性”，如其在上文中在酶E1方面和在下面的關(guān)于酶E2等方面的論述中所使用的，優(yōu)選地理解為增加的細(xì)胞內(nèi)活性。
現(xiàn)在接下來(lái)的關(guān)于提高細(xì)胞中的酶活性的論述不僅適用于提高酶E1的活性，而且適用于下文提及的其活性任選地可以被提高的所有酶。
原則上，可以如此來(lái)獲得酶活性的增加，即通過(guò)增加編碼所述酶的基因序列的拷貝數(shù)，使用強(qiáng)啟動(dòng)子，或者利用編碼具有增加的活性的相應(yīng)酶的基因或等位基因，以及任選地將這些措施相組合。根據(jù)本發(fā)明經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞例如通過(guò)用載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合或這些方法的組合來(lái)產(chǎn)生，所述載體包含所期望的基因、該基因的等位基因或其部分和使該基因能夠表達(dá)的載體。特別地，異源表達(dá)通過(guò)將所述基因或等位基因整合到細(xì)胞的染色體中或染色體外復(fù)制型載體中來(lái)獲得。
DE-A-100 31 999給出了關(guān)于用于提高細(xì)胞中的酶活性(例如丙酮酸羧化酶的酶活性)的可能性的綜述，該文獻(xiàn)在此引入作為參考，并且其關(guān)于用于提高細(xì)胞中的酶活性的可能性的公開(kāi)內(nèi)容構(gòu)成本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的一部分。
上文所提及的以及所有下文所提及的酶或基因的表達(dá)可借助于下列方式來(lái)檢測(cè)1-和2-維蛋白質(zhì)凝膠分離，和隨后用相應(yīng)的評(píng)價(jià)軟件來(lái)光學(xué)鑒定凝膠中的蛋白質(zhì)濃度。如果酶活性的提高僅基于相應(yīng)基因的表達(dá)的提高，那么可以簡(jiǎn)單地通過(guò)在野生型細(xì)胞和經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞之間比較1-或2-維蛋白質(zhì)分離來(lái)定量酶活性的提高。用于制備蛋白質(zhì)凝膠(在棒狀桿菌的情況下)和用于鑒定蛋白質(zhì)的常用方法為Hermann等人(Electrophoresis，221712.23(2001))所描述的程序。也可以通過(guò)下列方式來(lái)分析蛋白質(zhì)濃度用對(duì)于待檢測(cè)的蛋白質(zhì)特異的抗體來(lái)進(jìn)行Western-印跡雜交(Sambrook等人，MolecularCloninga laboratory manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.USA，1989)，隨后用相應(yīng)的用于濃度測(cè)定的軟件來(lái)進(jìn)行光學(xué)評(píng)價(jià)(Lohaus和Meyer(1989)Biospektrum，532-39；Lottspeich(1999)，Angewandte Chemie 1112630-2647)。DNA結(jié)合蛋白的活性可以借助于DNA條帶移位分析(也稱為凝膠阻滯)來(lái)測(cè)量(Wilson等人，(2001)Journal ofBacteriology，1832151-2155)。DNA結(jié)合蛋白對(duì)于其他基因的表達(dá)的影響可以通過(guò)各種經(jīng)充分描述的報(bào)道基因分析方法來(lái)檢測(cè)(Sambrook等人，Molecular Cloninga laboratory manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.USA，1989)。細(xì)胞內(nèi)的酶活性可以通過(guò)各種經(jīng)描述的方法來(lái)測(cè)定(Donahue等人，(2000)Journal of Bacteriology 182(19)5624-5627；Ray等人，(2000)Journal of Bacteriology 182(8)2277-2284；Freedberg等人，(1973)Journal of Bacteriology 115(3)816-823)。如果在后面的論述中，沒(méi)有說(shuō)明用于測(cè)定特定酶的活性的具體方法，那么優(yōu)選地借助于下列文獻(xiàn)中所描述的方法來(lái)測(cè)定酶活性的增加以及酶活性的降低Hermann等人，Electophoresis，221712-23(2001)；Lohaus等人，Biospektrum 5 32-39(1998)；Lottspeich，Angewandte Chemie 1112630-2647(1999)；和Wilson等人，Journal of Bacteriology 1832151-2155(2001)。
如果酶活性的提高是通過(guò)內(nèi)源基因的突變而實(shí)現(xiàn)的，那么這樣的突變可以或者根據(jù)傳統(tǒng)方法隨機(jī)產(chǎn)生，例如通過(guò)UV輻射或通過(guò)誘發(fā)突變的化學(xué)藥品；或者借助于基因工程方法例如刪除、插入和/或核苷酸交換來(lái)達(dá)到。通過(guò)這些突變獲得經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞。特別地，特別優(yōu)選的酶突變體還是這樣的酶，其不再是反饋可抑制的或者至少與野生型酶相比較而言其反饋可抑制性降低了。
如果酶活性的提高是通過(guò)提高酶的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，那么就例如增加相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或者使啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)域或位于結(jié)構(gòu)基因上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)突變。同樣地，嵌入至結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒也起作用。通過(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子另外還可能在任一時(shí)間點(diǎn)處增強(qiáng)表達(dá)。此外，也可以給酶基因分派所謂的“增強(qiáng)子”作為調(diào)控序列，其通過(guò)RNA聚合酶和DNA之間改善的相互作用也導(dǎo)致提高的基因表達(dá)。通過(guò)用于延長(zhǎng)mRNA壽命的措施也可改善表達(dá)。此外，通過(guò)防止酶蛋白質(zhì)的降解也可增強(qiáng)酶活性。在此，基因或基因構(gòu)建體或者存在于具有不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒中，或者整合在染色體中并于其中進(jìn)行擴(kuò)增。備選地，所涉及的基因的過(guò)表達(dá)此外還可以通過(guò)改變培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件來(lái)達(dá)到。本領(lǐng)域技術(shù)人員尤其可在Martin等人(Bio/Technology 5，137-146(1987))中，在Guerrero等人(Gene 138，35-41(1994))，在Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1988))中，在Eikmanns等人(Gene 102，93-98(1991))中，在EP-A-0 472 869中，在US4,601,893中，在Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991))中，在Reinscheid等人(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60，126-132(1994))中，在LaBarre等人(Journalof Bacteriology 175，1001-1007(1993))中，在WO-A-96/15246中，在Malumbres等人(Gene 134，15-24(1993))中，在JP-A-10-229891中，在Jensen和Hammer(Biotechnology andBioengineering 58，191-195(1998))中，以及在已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書(shū)中找到關(guān)于此的指導(dǎo)。與突變一樣，上面所描述的措施產(chǎn)生經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞。
為了提高各基因的表達(dá)，使用例如附加型質(zhì)粒。合適的質(zhì)粒特別為在棒狀桿菌中進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒。眾多的已知質(zhì)粒載體，例如pZ1(Menkel等人，Applied and Environmental Microbiology 64549-554(1989))、pEKEx1(Eikmanns等人，Gene 10769-74(1991))或pHS2-1(Sonnen等人，Gene 10769-74(1991))基于隱蔽性質(zhì)粒pHM1519、pBL1或pGA1。同樣地，也可以使用其他質(zhì)粒載體，例如基于pCG4(US 4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等人，F(xiàn)EMSMicrobiology Letters 66119-124(1990))或pAG1(US 5,158,891)的那些質(zhì)粒。
此外，這樣的質(zhì)粒載體也是合適的，借助于所述質(zhì)粒載體可以采用通過(guò)整合入染色體中來(lái)進(jìn)行基因擴(kuò)增的方法，如由Reinscheid等人(Applied and Environmental Microbiology 60126-132(1994))對(duì)于復(fù)制或擴(kuò)增hom-thrB操縱子所描述的那樣。在該方法中，將完整的基因克隆到質(zhì)粒載體中，后者可以在宿主(通常為大腸桿菌(Escherichia coli))中進(jìn)行復(fù)制，但不能在谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)中進(jìn)行復(fù)制。作為載體，例如可以考慮pSUP301(Simon等人，Bio/Technology 1784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(

等人，Gene 14569-73(1994))、pGEM-T(Promega Corporation，Madison，Wisconsin，USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman，Journal of Biological Chemistry 26932678-84(1994))、

Blunt(Invitrogen，Groningen，Niederlande)、pEM1(Schrumpf等人，Journal of Bacteriology 1734510-4516))或pBGS8(Spratt等人，Gene 41337-342(1986))。隨后，包含待擴(kuò)增的基因的質(zhì)粒載體通過(guò)接合或轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)移到所期望的谷氨酸棒桿菌菌株中。接合的方法例如在

等人，Applied andEnvironmental Microbiology 60756-759(1994)中進(jìn)行了描述。轉(zhuǎn)化的方法在例如在Thierbach等人，Applied Microbiology andBiotechnology 29356-362(1988)；Dunican和Shivnan，Bio/Technology 71067-1070(1989)；和Tauch等人，F(xiàn)EMSMicrobiology Letters 123343-347(1994)中進(jìn)行了描述。在借助于“交換(cross-over)”事件進(jìn)行同源重組后，所得的菌株包含至少兩個(gè)拷貝的所涉及的基因。
在上文中和在下面的論述中所使用的表述“相對(duì)于其野生型而言增加的酶Ex的活性”優(yōu)選地總是指，各酶Ex的活性增加到至少2倍，特別優(yōu)選地至少10倍，更優(yōu)選地至少100倍，更加優(yōu)選地至少1000倍和最優(yōu)選地至少10000倍。此外，在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的、經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞(其具有“相對(duì)于其野生型而言增加的酶Ex的活性”)特別地也包括這樣的細(xì)胞，所述細(xì)胞的野生型不具有該酶Ex的活性或至少不具有可檢測(cè)的該酶Ex的活性，并且在提高所述酶活性之后(例如通過(guò)過(guò)表達(dá))才顯示出可檢測(cè)的該酶Ex的活性。在這種情況下，術(shù)語(yǔ)“過(guò)表達(dá)”或者在下面的論述中所使用的表述“表達(dá)的提高”也包括這樣的情況，即起始細(xì)胞例如野生型細(xì)胞不具有表達(dá)或至少不具有可檢測(cè)的表達(dá)，并且只有通過(guò)重組方法才誘導(dǎo)出可檢測(cè)的酶Ex的表達(dá)。
相應(yīng)地，下面所使用的表述“降低的酶Ex的活性”優(yōu)選地是指，降低為至少0.5倍，特別優(yōu)選地至少0.1倍，更優(yōu)選地至少0.01倍，更加優(yōu)選地至少0.001倍和最優(yōu)選地至少0.0001倍的活性。特定酶的活性的降低可以例如通過(guò)定向突變，通過(guò)添加競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，或者通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于降低特定酶的表達(dá)的其他措施來(lái)實(shí)現(xiàn)。
催化琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶A的酶E1優(yōu)選地為甲基丙二酰輔酶A變位酶(EC 5.4.99.2)。優(yōu)選地，該酶由選自下列的基因編碼mut、mutA、mutB、sbm、sbmA、sbmB、sbm5、bhbA、mcmA、mcmA1、mcmA2、mcmB、mcm1、mcm2、mcm3、icmA、meaA1和meaA2。這些基因的核苷酸序列可以例如從“基因和基因組京都百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)”(KEGG數(shù)據(jù)庫(kù))、國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書(shū)館(National Library of Medicine)(Bethesda，MD，USA)的國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)(NCBI)的數(shù)據(jù)庫(kù)或者歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EuropeanMolecular Biologies Laboratories)(EMBL，Heidelberg，Deutschland或Cambridge，UK)的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第一種變化形式的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，酶E1為來(lái)自谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的甲基丙二酰輔酶A變位酶，其由具有根據(jù)SEQ ID NO01的DNA序列編碼并具有根據(jù)SEQ IDNO02的氨基酸序列。
此外，依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)備選方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸時(shí)形成作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，優(yōu)選的是，依照根據(jù)本發(fā)明的方法的該備選方案所使用的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，任選地除了增加的酶E1的活性外，還具有相比于其野生型而言增加的下述酶E2至E4中至少一種酶的活性(見(jiàn)圖2) -酶E2，其催化甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸； -酶E3，其催化甲基丙二酸轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛； -酶E4，其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
根據(jù)本發(fā)明，特別地使用這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是增加的E2、E3、E4、E2E3、E2E4、E3E4、E2E3E4，其中E2E3E4是最優(yōu)選的。此外，也可能的是，酶還能夠催化至少兩個(gè)前面所描述的反應(yīng)步驟。因此，例如可以使用這樣的酶，其不僅具有酶E2的活性，而且具有酶E3的活性(因而催化甲基丙二酰輔酶A直接轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛)，例如來(lái)自Sulfolobus tokodaii的丙二酰輔酶A還原酶，其由具有SEQ ID NO03的DNA序列編碼并且具有根據(jù)SEQ ID NO04的氨基酸序列；或者可以使用這樣的酶，其具有所有三種酶活性E2、E3和E4，如來(lái)自橙色綠屈撓菌(Chloroflexus aurantiacus)的丙二酰輔酶A還原酶(Hügler等人，Journal of Bacteriology 184，第2404-2410頁(yè)，2002)。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E2為甲基丙二酰輔酶A水解酶(EC 3.1.2.17)，酶E3為醛脫氫酶(EC 1.2.1.3)或醛氧化酶(EC 1.2.3.1)，和酶E4為3-羥基異丁酸脫氫酶(EC 1.1.1.31)或3-羥基酰基輔酶A脫氫酶(EC 1.1.1.35)。
優(yōu)選地，酶E2由aox1基因編碼。來(lái)自大鼠肝臟的甲基丙二酰輔酶A水解酶例如描述于Kovachy等人，“Recognition，isolation，andcharacterization of rat liver D-methylmalonyl coenzyme Ahydrolase”，J.Biol.Chem.258(1983)，第11415-11421頁(yè)中。
優(yōu)選地，酶E3由選自下列的基因編碼aldh2、aldh3a1、aldh3a2、aldh1b1、aldh9a1、aldh7a1、aldh1a4、aldh1a1、aldh1a2、mgc80785、mgc83352、mgc89020、dmel-CG31075、cg3752、cg9629、alh-9、alh-1、alh-2、f508.35、t7023.15、f15I1.19、tT17F15.130、ald1、ald2、ald4、ald5、ald6、ac1044Wp、adr417wp、msc7、tb06.5F5.780、aldH、puuC、putA、aldA、badH、alkH、pcD、rsp1591、rs01031、exaC、acoD、dhaL、pchA、aldB、dhaS、betB、ywdH、ycbD、aldX、aldY、aldA1、aldA2、aldC、pcd、cg10546、cg12668、cg12796、scg11A.05、sci30A.27c、sce9.27c、sck13.05c、sc5H4.03、thcA、gabD2、alkH、aldH、aldH1、aldY1、aldY2、aldY3、aldY4、aldY5、aldY6、aldY7和aldhT。
酶E4的合適的基因選自hibadh、cg15093、cg15093、cg4747、mwL2.23、t13k14.90、f19b15.150、hibA、ygbJ、mmsB、mmsB、garR、tsar、mmsB-1、mmsB-2、yfjR、ykwC、ywjF、hibD、glxR、SCM1.40c、hibD、ehhahd、hadh2、hadhsc、hsd17B4、loc488110、had、mgC81885、hadh2-prov、cg3415、cg7113、ech-1、ech-8、ech-9、ard-1、yfcX、fadB、faoA、fadB2x、hbd-1、hbd-2、hbd-3、hbd-4、hbd-5、hbd-6、hbd-7、hbd-8、hbd-9、hbd-10、fadJ、rs04421、rs02946、rs05766、bbsD、bbsC、fadB1、fadB2、fadB5、hbdA、pimF、fabJ-1、fabJ、scbac19f3.11、sci35.13、scbac8d1.10c、sc5f2a.15、sc6a5.38、fadC2、fadC4、fadC5、fadC6、had和paaH。其他合適的3-羥基異丁酸脫氫酶例如描述于下列文獻(xiàn)中Bannerjee等人，(1970)，J.Biol.Chem，245，第1828至1835頁(yè)；Steele等人，(1992)，J.Biol.Chem.，267，第13585至13592頁(yè)；Harris等人，(1988)，J.Biol.Chem.，263，第327至331頁(yè)；Harris等人，Biochim.Biophys.Acta，1645(1)，第89至95頁(yè)；Hawes等人，(2000)，Methods Enzymol.，324，第218至228頁(yè)；Harris等人，J.Biol.Chem.，275(49)，第38780至38786頁(yè)；Rougraff等人，(1988)，J.Biol.Chem.，263(1)，第327至331頁(yè)；Robinson等人，J.Biol.Chem.，225，第511至521頁(yè)；Hawes等人，(1995)，Biochemistry，34，第4231至4237頁(yè)；Hasegawa J.(1981)，Agric.Biol.Chem.，45，第2805至2814頁(yè)；Hawes等人，(1996)，F(xiàn)EBS Lett.，389，第263至267頁(yè)；Hawes等人，(1996)，Enzymology and Molecular Biology of CarbonylMetabolism，Plenum Press，New York，第395至402頁(yè)；Adams等人，(1994)，Structure，2，第651至668頁(yè)；Zhang等人，(1999)，Biochemistry，38，第11231至11238頁(yè)；Mirny等人，(1999)，J.Mol.Biol.，291，第177至196頁(yè)；和Lokanath等人，(2005)，J MolBiol.。這些出版物的公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考，并且構(gòu)成本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的一部分。
酶E2至E4的上述基因以及其他基因的核苷酸序列尤其還可以

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的該備選方案的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸時(shí)形成作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，優(yōu)選的是，關(guān)于使甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛，使用來(lái)自Sulfolobus tokodaii的丙二酰輔酶A還原酶，其由具有SEQ ID NO03的DNA序列編碼并且具有根據(jù)SEQ ID NO04的氨基酸序列。根據(jù)該變化形式的另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，關(guān)于使甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸，使用來(lái)自橙色綠屈撓菌的丙二酰輔酶A還原酶(Hügler等人，Journalof Bacteriology 184，第2404-2410頁(yè)，2002)。
此外，在根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)特別的實(shí)施方案的該第一個(gè)備選方案方面，優(yōu)選的是，根據(jù)該實(shí)施方案所使用的、經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞具有相比于其野生型而言降低的酶E5的活性，所述酶E5具有從甲基丙二酸半醛向丙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化，其中該酶優(yōu)選地為甲基丙二酸半醛脫氫酶(EC 1.2.1.27)。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)備選方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸時(shí)形成作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，優(yōu)選的是，所述細(xì)胞，任選地除了增加的酶E1的活性外，還具有相比于其野生型而言增加的下述酶E4至E7中至少一種酶的活性(見(jiàn)圖3) -酶E6，其催化(R)-甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為(S)-甲基丙二酰輔酶A； -酶E7，其催化(S)-甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A； -酶E5，其催化丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛； -酶E4，其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選地使用這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是增加的E4、E5、E6、E7、E4E5、E4E6、E4E7、E5E6、E5E7、E6E7、E4E5E6、E4E5E7、E4E6E7、E5E6E7和E4E5E6E7，其中E4E5E6E7是最優(yōu)選的。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E6為甲基丙二酰輔酶A差向異構(gòu)酶(EC 5.1.99.1)，酶E7為甲基丙二酰輔酶A脫羧酶(EC 4.1.1.41)，酶E5為甲基丙二酸半醛脫氫酶(EC 1.2.1.27)，和酶E4為3-羥基異丁酸脫氫酶(EC 1.1.1.31)或3-羥基?；o酶A脫氫酶(EC 1.1.1.35)。
在此，優(yōu)選的酶E4為已經(jīng)在上文中在根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的第一種變化形式方面作了描述的那些。
優(yōu)選地，酶E6由mcee基因編碼。合適的甲基丙二酰輔酶A脫羧酶(酶E7)例如由Benning等人在Biochmistry，Vol.39(2000)，第4630-4639頁(yè)中進(jìn)行了描述。
優(yōu)選地，酶E5的合適的基因選自aldh6a1、cg17896、t22c12.10、ald6、putA1、mmsA、mmsA-1、mmsA-2、mmsA-3、mmsA-4、msdA、iolA和iolAB。
優(yōu)選地，酶E7的合適的基因選自mmdA、bcc、oadB、oadB2、oadB3、SC1C2.16、SC1G7.10、pccB1、accA2、mmdB、mmdC和ppcB。
酶E5、E6和E7的上述基因的核苷酸序列尤其還可以從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第三個(gè)備選方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸時(shí)形成作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，優(yōu)選的是，所述細(xì)胞，任選地除了增加的酶E1的活性外，還具有相比于其野生型而言增加的下述酶E4、E5和E7中至少一種酶的活性(見(jiàn)圖4) -酶E7，其催化甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A； -酶E5，其催化丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛； -酶E4，其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
該途徑基本上相應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的第二種變化形式，然而其中與第二種變化形式不同，直接從甲基丙二酰輔酶A制備丙酰-CoA。關(guān)于酶E4、E5和E7的優(yōu)選的酶和基因?yàn)橐呀?jīng)在上文中在第二種變化形式方面被提及的那些基因或酶。
此外，依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)特別的實(shí)施方案(和還有依照所有在下面所描述的實(shí)施方案)，也可以是優(yōu)選的是，使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，所述細(xì)胞能夠?qū)⑺纬傻?-羥基異丁酸轉(zhuǎn)變成聚羥基鏈烷酸。這樣的聚羥基鏈烷酸被許多微生物以強(qiáng)折光性顆粒的形式貯存在細(xì)胞內(nèi)。在這種情況下，特別優(yōu)選的是，在根據(jù)本發(fā)明的方法所使用的、經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下列酶E8和E9中至少一種酶(優(yōu)選地這兩者)的活性(見(jiàn)圖5) -酶E8，其催化3-羥基異丁酸轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酰輔酶A； -酶E9，其催化3-羥基異丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E8為3-羥基異丁酰輔酶A水解酶(EC 3.1.2.4)，和酶E9為聚羥基鏈烷酸合酶。
如在上文中已經(jīng)說(shuō)明的，在根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的情況下，從作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A和從作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛產(chǎn)生3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸。在此，原則上可能合適的是，除了影響上文所提及的酶活性E1至E9中的一種或多種酶活性外，還影響這樣的酶活性，該酶活性導(dǎo)致細(xì)胞中琥珀酰輔酶A的形成的提高。
如果依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第一種變化形式的第一個(gè)特別的實(shí)施方案，經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛從碳水化合物或甘油來(lái)形成3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸，那么依照在上文中所描述的根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)、第二個(gè)或第三個(gè)備選方案之中一個(gè)特別的布置方案，優(yōu)選的是，所使用的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E10和E11中至少一種酶(優(yōu)選地這兩者)的活性(見(jiàn)圖6) -酶E10，其催化磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸； -酶E11，其催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E10為磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC 4.1.1.31)，和酶E11為丙酮酸羧化酶(EC 6.4.1.1)。
優(yōu)選地，酶E10由選自下列的基因編碼f12m16.21、f14n22.13、k15m2.8、ppc、clpA、pepC、capP、cgl1585、pepC、pck、ppc和pccA，其中ppc基因是特別優(yōu)選的。特別地，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶還描述于US 4,757,009、US 4,980,285、US 5,573,945、US 6,872,553和US 6,599,732中。這些出版物中關(guān)于磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考，并且構(gòu)成本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的一部分。
優(yōu)選地，酶E11由選自下列的基因編碼pc、pcx、cg1516、cg1516、pyc-1、pyc-2、aar162Cp、pyr1、accC-2、pycA、pycA2、pca、cgl0689、pyc、pycB、accC、oadA、acc和accC1，其中pyc基因是特別優(yōu)選的。特別地，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的丙酮酸羧化酶還描述于US 6,455,284、US6,171,833、US 6,884,606、US 6,403,351、US 6,852,516和US6,861,246中。其他根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的丙酮酸羧化酶為在″A novelmethodology employing Corynebacterium glutamicum genomeinformation to generate a new L-lysine-producing mutant″，Ohnishi J等人，Applied Microbiology and Biotechnology，Vol.58(2)，第217-223頁(yè)(2002)中所描述的那種突變體。
酶E10和E11的合適的基因的核苷酸序列可以從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
從草酰乙酸-中間階段開(kāi)始，存在有幾種可能性來(lái)達(dá)到琥珀酰輔酶A，其然后可以借助于開(kāi)頭所提及的三種變化形式經(jīng)由甲基丙二酰輔酶A而轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
第一條途徑經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的富馬酸而前行。在該情況下，依照在上文中所描述的根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)、第二個(gè)或第三個(gè)備選方案之中第一個(gè)特別的布置方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中形成作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛和作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A)，優(yōu)選的是，所述細(xì)胞，任選地除了增加的酶E10或E11的活性外，還具有相比于其野生型而言增加的下述酶E12至E15中至少一種酶的活性(見(jiàn)圖7) -酶E12，其催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為蘋(píng)果酸； -酶E13，其催化蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化為富馬酸； -酶E14，其催化富馬酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸； -酶E15，其催化琥珀酸轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A。
在此，根據(jù)本發(fā)明特別地使用這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是增加的E12、E13、E14、E15、E12E13、E12E14、E12E15、E13E14、E13E15、E14E15、E12E13E14、E12E13E15、E12E14E15、E13E14E15、E12E13E14E15，其中E12E13E14E15是最優(yōu)選的。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E12為蘋(píng)果酸脫氫酶(EC 1.1.1.37)或蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶(1.1.99.16)，酶E13為富馬酸水合酶(EC 4.2.1.2)，酶E14為琥珀酸脫氫酶(EC 1.3.99.1或EC 1.3.5.1)或琥珀酸-醌氧化還原酶(1.3.5.1)，和酶E15為琥珀酸-輔酶A連接酶(EC 6.2.1.4或EC 6.2.1.5)。
優(yōu)選地，酶E12由選自下列的基因編碼mdh1、mdh2、mor1、cg10748、cg10749、cg5362、mdh-1、f46e10.10、f19p19.13、f12m16.14、t30120.4、k15m2.16、f1p2.70、f17i14.150、mn112.18、mik19.17、mdh3、adl164cp、adr152cp、adr252wp、mdhA、mdhC、mdhB、ybiC、mdh、yiaK、ybiC、allD、citH、yjmC、citH、cg12380、ldh、sqdB、mqo、yojH、mqoA、mqoB、mqo1、mqo2、mqo3、mqo4和cgl2001，其中mqo基因和mdh基因是特別優(yōu)選的。
優(yōu)選地，酶E13由選自下列的基因編碼fh、fh1、sc4094、sc4095、t30b22.19、k3k7.11、acr013Cp、fum1、fum2、fum3、fum4、fumH、fumA、fumB、fumC、fumC1、fumC2、fum、ttdA、ttdB、fumB-alpha、fumB-beta、citG、citB、fumX、fum-1和fum-2，其中fum基因是特別優(yōu)選的。
優(yōu)選地，酶E14由選自下列的基因編碼sdh1、sdh2、sdh3、sdh4、sdh5、sdh6、osm1、osm2、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、frdA、frdB、frdC、frdD、ifcA-1、ifcA-2、sdhB-1、sdhB-2、frdC2、cgl0370、cgl0371、cgl0372、scm10.10c、scm10.11c、scm10.12c、sc5g8.25c、sc5g8.26c、scbac-31e11.02c、scbac31e11.02c、sc4b10.10c、sdhA2、sdhB2、sdhA1、sdhB1、qcrB2、sdhA3、sdhB3、frdB1和frdB2，其中基因sdhA、sdhB和sdhC是特別優(yōu)選的。
優(yōu)選地，酶E15由選自下列的基因編碼suclg1、suclg2、loc434885、cg10622、dmel-CG6255、f11a3.3、f8115.30、mkd15.11、lsc1、lsc2、ae1211wp、afr134cp、scsA、scsB、sucC和sucD。
酶E12至E15的合適的基因的核苷酸序列依舊同樣還是可以從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
如果提高酶E12至E15中一種或多種酶的活性，那么還經(jīng)證明有利的是，所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言降低的下述酶E16至E23之一的活性 -酶E16，其催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為檸檬酸； -酶E17，其催化蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸； -酶E18，其催化琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)化為琥珀酸； -酶E19，其催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇丙酮酸； -酶E20，其催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸； -酶E21，其催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為天冬氨酸； -酶E22，其催化蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸； -酶E23，其催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酸。
在此，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的細(xì)胞為這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是降低的E16、E17、E18、E19、E20、E21和E16E17E18E19E20E21E22E23。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E16為檸檬酸合酶(EC 2.3.3.1或EC 2.3.3.8)，酶E17為蘋(píng)果酸氧化酶(EC 1.1.3.3)，酶E18為琥珀酰輔酶A水解酶(EC 3.1.2.3)，酶E19為磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(EC 4.1.1.49或4.1.1.32)，酶E20為草酰乙酸脫羧酶(EC 4.1.1.3)，酶E21為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.1)，酶E22為蘋(píng)果酸脫氫酶(EC 1.1.1.38、EC 1.1.1.39或EC1.1.1.40)，酶E23為丙酮酸脫氫酶(EC 1.2.1.51)。
優(yōu)選地，酶E16由選自下列的基因編碼glt、cs、csl、cg3861、cts-1、f7f19.21、f4i1.16、t20n10.90、t20n10.100、t209.80、cit1、cit2、cit3、aar004cp、agr002wp、cshA、gltA、citZ、cit、prpC、cisY、cis、mmgD、citA、gltA1、gltA2、gltA3、cg10829、prpC1、scd10.20、citA1、citA2、citA3、acly、cg8322、f5e6.2、k7jJ8.14和citE，其中g(shù)ltA是最優(yōu)選的。
優(yōu)選地，酶E19由選自下列的基因編碼pckA、pck1、pck2、cg10924、cg17725、cg17725、pckG、ppcK、cg12863、pck和2sck36.02。
優(yōu)選地，酶E20由選自下列的基因編碼oadA、oadB、oadC、oadG、oag3、eda、dcoA、oadA1、oadA2、pycB和mmdB。
優(yōu)選地，酶E21由選自下列的基因編碼myn8.7、glt1、adr290wp、gltB、gltD、glt1、gls1、gltA、glt、glxD、gltD1、gltD2、gdh2、agl040Cp、gdhA1、gdhA、gdhA2、gluD、gluD1、gluD2、rocG、ypcA、gudB、t11i18.2、t2i1.150、mrg7.13、f19c24.7、gdh、gdh1、gdh2、gdh3、got1、got2、cg4233、cg8430、f23n19.17、f13j11.16、t26c19.9、f7f1.18、F10N7.200、t1611.170、f15n18.110、t20d1.70、aat1、aat2、abl038wp、afr211cp、agx1、bna4、aatA、aatB、ybdL、aspC、yfbQ、aat、avtA1、avtA2、tyrB、avtA、avtB、argD1、argD2、aspB1、aspB2、aspB3、aspB、aspC1、aspC2、aspC3、aspC4、RS05143、aspAT、ywfG、yhdR、argD、mtnV、alaT、hisC、avtA1、avtA2、avtA3、cg10240、cgl1103、cgl2599、cgl2844、2sck36.07c、sc9e12.21、sc2h4.04c、tyrB、gtp、gtp1、gtp2、cg1640、f20d23.34、f26f24.16、f24j13.15、t10d10.20和agr085wp，其中aspC、aatA、gdh、gudB、gdhA、gltB和gltD是特別優(yōu)選的。
優(yōu)選地，酶E21由選自下列的基因編碼myn8.7、glt1、adr290wp、gltB、gltD、glt1、gls1、gltA、glt、glxD、gltD1、gltD2、gdh2、agl040Cp、gdhA1、gdhA、gdhA2、gluD、gluD1、gluD2、rocG、ypcA，優(yōu)選地，酶E22由選自下列的基因編碼me、me1、me2、me3、mae、mae1、mae2、sfcA、sfcA1、maeA、maeB、tme、yqkJ、ywkA、yqkJ、malS、ytsJ、mleA、mleS、mez、sce59.10c、2sc7g11.23、malS1、malS2、dme、maeB1、maeB2、mdh、mdh1、mdh2、dmel_cg10120、dmel_cg10120、dmel-cg5889、f19k16.27、f6f22.7、t22p22.60、f18a17.1、mod1、tme、mao、cgl3007、malS和malE。
優(yōu)選地，酶E23由選自下列的基因編碼me、me1、me2、me3、mae、mae1、mae2、sfcA、sfcA1、maeA、maeB、tme、yqkJ、ywkA、yqkJ、malS、ytsJ、mleA、mleS、mez、sce59.10c、2sc7g11.23、malS1、malS2、dme、maeB1、maeB2、mdh、mdh1、mdh2、dmel_cg10120、dmel_cgl0120、dmel-cg5889、f19k16.27、f6f22.7、t22p22.60、f18a17.1、mod1、tme、mao、cg13007、malS和malE。
此外，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是，在借助于上文所描述的途徑(草酰乙酸-＞蘋(píng)果酸-＞富馬酸-＞琥珀酰輔酶A)來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中增加的琥珀酰輔酶A的供給這樣的情況下，還有針對(duì)性地增加細(xì)胞中還原當(dāng)量

的供給。
增加還原當(dāng)量的一種可能性在于增加氧化戊糖磷酸途徑。在這種情況下，特別優(yōu)選的是，提高葡糖-6-磷酸脫氫酶(EC 1.1.1.49)和/或6-磷酸葡糖酸脫氫酶(EC 1.1.1.44)(其優(yōu)選地由gnd基因編碼)的活性，并且任選地同時(shí)抑制糖酵解，例如通過(guò)減弱葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶的活性，如在WO-A-01/07626中所描述的那樣。除了有針對(duì)性地促進(jìn)戊糖磷酸途徑外，或者代替有針對(duì)性地促進(jìn)戊糖磷酸途徑，可以是進(jìn)一步優(yōu)選的是，通過(guò)下述方式供給還原當(dāng)量，即給細(xì)胞提供乙醇作為碳源并且促進(jìn)在細(xì)胞中借助于醇脫氫酶(EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC 1.1.1.71或EC 1.1.99.8)將乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛和借助于乙醛脫氫酶(EC 1.2.1.10)將乙醛進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的合適的基因依舊同樣可以從技術(shù)人員已知的基因數(shù)據(jù)庫(kù)，例如KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
從草酰乙酸至琥珀酰輔酶A的第二條途徑經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的檸檬酸而前行。在該情況下，依照在上文中所描述的根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)、第二個(gè)或第三個(gè)備選方案之中第二個(gè)特別的布置方案，優(yōu)選的是，使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，其任選地除了增加的酶E10或E11的活性外，還具有相比于其野生型而言增加的下述酶E13至E16和E24至E26中至少一種酶的活性(見(jiàn)圖8) -酶E16，其催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為檸檬酸； -酶E24，其催化檸檬酸轉(zhuǎn)化為異檸檬酸； -酶E25，其催化異檸檬酸轉(zhuǎn)化為乙醛酸和琥珀酸； -酶E26，其催化乙醛酸轉(zhuǎn)化為蘋(píng)果酸； -酶E13，其催化蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化為富馬酸； -酶E14，其催化富馬酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸； -酶E15，其催化琥珀酸轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A。
在此，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的細(xì)胞為這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是提高的E13、E14、E15、E16、E24、E25、E26、E13E14、E13E15、E13E16、E13E24、E13E25、E13E26、E14E15、E14E16、E14E24、E14E25、E14E26、E15E16、E15E24、E15E25、E15E26和E13E14E15E16E24E25E26，其中E13E14E15E16E24E25E26是最優(yōu)選的。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E13為富馬酸水合酶(EC 4.2.1.2)，酶E14為琥珀酸脫氫酶(EC 1.3.99.1或EC 1.3.5.1)或琥珀酸-醌氧化還原酶(1.3.5.1)，酶E15為琥珀酸-輔酶A連接酶(EC 6.2.1.4或EC 6.2.1.5)，酶E16為檸檬酸合酶(EC 2.3.3.1或EC 2.3.3.8)，酶E24為烏頭酸水合酶(EC 4.2.1.3)，酶E25為異檸檬酸裂合酶(EC 4.1.3.1)，和酶E26為蘋(píng)果酸合酶(EC 2.3.3.9)。
酶E13至E16的優(yōu)選的基因?yàn)橐呀?jīng)在上文中在從草酰乙酸至琥珀酰輔酶A的第一條途徑方面作了描述的那些。
優(yōu)選地，酶E24由選自下列的基因編碼aco1、aco2、ratireb、dmel-CG4706、dmel-CG4900、dmel-cg6342、cg9244、t3p4.5、f10m23.310、f4b14.100、adl032Wp、afr629wp、acnA、acnB、acnC、acnD、rpfA、acnA1、acnA2、acnM、citB、leuC、cgl1540、sacA、can和aco，其中acnA和acnB是特別優(yōu)選的。
優(yōu)選地，酶E25由選自下列的基因編碼msd21.4、ic11、ic12、adl066cp、agl057wp、aceA、icl、aceAa、aceAb、cgl0097和cgl2331，其中aceA是特別優(yōu)選的。根據(jù)一個(gè)特別的實(shí)施方案，這樣的基因是優(yōu)選的，所述基因編碼在基因水平或蛋白質(zhì)水上失調(diào)的異檸檬酸裂合酶。
優(yōu)選地，酶E26由選自下列的基因編碼med24.5、mlsS1、acr268cp、masA、glcB、aceB、mls、glcB-1、glcB-2、cgl2329、masZ、aceB1、aceB2和mas，其中aceB基因是特別優(yōu)選的。
在此，酶E24至E26的合適的基因的核苷酸序列還是可以從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
當(dāng)通過(guò)增加酶E10或E11的活性來(lái)促進(jìn)從磷酸烯醇丙酮酸或從丙酮酸供給草酰乙酸時(shí)，在通過(guò)異檸檬酸裂合酶裂解異檸檬酸時(shí)除了乙醛酸外所形成的琥珀酸也可以用于形成琥珀酰輔酶A。此外，在從草酰乙酸至琥珀酸的該第二條途徑的情況下，可以是有利的是，降低酶E27的活性，所述酶E27催化異檸檬酸轉(zhuǎn)化為2-酮戊二酸并且優(yōu)選地為異檸檬酸脫氫酶(EC 1.1.1.41或EC 1.1.1.42)。優(yōu)選地，異檸檬酸脫氫酶為由選自下列的基因編碼的酶idh1、idh2、cg7176、cg7176、cg7176、f20d21.16、f12p19.10、t15n1.80、idp1、idp2、idp3、aal022Wp、aer061Cp、idhC、idhM、icdA、icd、idh、icd1、icd2、leuB、citC、citC、cgl0664、leuB2、idh3A、idg3B、idh3G、cg12233、dmel-CG5028、dmel-CG6439、f6p23.14、f23e12.180、f8d20.160、f12e4.20、adl223wp和afr137cp，其中icdA和citC是特別優(yōu)選的。
從草酰乙酸至琥珀酰輔酶A的第三條途徑經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的2-酮戊二酸而前行。在該情況下，依照在上文中所描述的根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)、第二個(gè)或第三個(gè)備選方案的第三個(gè)特別的布置方案，優(yōu)選的是，使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，其任選地除了增加的酶E10或E11的活性外，還具有相比于其野生型而言增加的下述酶E16、E24、E27和E28中至少一種酶的活性(見(jiàn)圖9) -酶E16，其催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為檸檬酸； -酶E24，其催化檸檬酸轉(zhuǎn)化為異檸檬酸； -酶E27，其催化異檸檬酸轉(zhuǎn)化為2-酮戊二酸； -酶E28，其催化2-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A。
在此，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的細(xì)胞為這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是提高的E16、E24、E27、E28、E16E24、E16E27、E16E28、E24E27、E24E28、E27E28、E16E24E27、E16E24E28、E24E27E28和E16E24E27E28，其中E16E24E27E28是最優(yōu)選的。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E16為檸檬酸合酶(EC 2.3.3.1或EC 2.3.3.8)，酶E24為烏頭酸水合酶(EC 4.2.1.3)，酶E27為異檸檬酸脫氫酶(EC 1.1.1.41或EC 1.1.1.42)，和酶E28為2-酮戊二酸合酶(EC 1.2.7.3)。
酶E16、E24和E27的優(yōu)選的基因?yàn)橐呀?jīng)在上文中在從草酰乙酸至琥珀酰輔酶A的第一條和第二條途徑方面作了描述的那些。
優(yōu)選地，酶E28由選自下列的基因編碼korA、korB、korD、korA1、korA2、korB1、korB2、oorA、oorB、oorC、oorD、oforA、oforB、porA、porB、porA1、porA2、porA3、porA4、porG、porG1、porG2、porB1、porB2、porB3、SCD20.12c、SCD20.13c、SCAH10.34c、SCAH10.35c、korG、orA、orB、korG1和korG2。此外，E28還可以為由具有不同的酶活性的幾個(gè)亞基組成的脫氫酶復(fù)合物。特別地，可以涉及包含酮戊二酸脫氫酶(EC 1.2.4.2)、二氫硫辛酸脫氫酶(EC1.8.1.4)和二氫硫辛酰賴氨酸殘基-琥珀?；D(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.61)的脫氫酶復(fù)合物。在此，優(yōu)選地，酮戊二酸脫氫酶(EC 1.2.4.2)由選自下列的基因編碼ogdh、ghdhl、loc239017、mgc68800、mgc80496、cg11661、t22e16.70、mpA24.10、kgd1、aer374cp、sucA、odhA、kgdA和cgl1129，其中sucA和odhA是特別優(yōu)選的。優(yōu)選地，二氫硫辛酸脫氫酶(EC 1.8.1.4)由選自下列的基因編碼dld、dld-prov、dldh、cg7430、t2j15.6、k14a17.6、at3g17240、mgd8.71pd1、afr512wp、dld1、lpd、tb03.26j7.650、tb04.3m17.450、tb927.8.7380、tb08.10k10.200、lpdA、lpdG、lpdV、lpd3、acoD、lpdA1、lpdA2、lpdA3、odhL、pdhD、pdhD1、pdhD2、pdhD3、pdhD42、lpdAch1、lpdAch2、lpdAc、acoL、bfmbC、bkdD、cgl0366、cgl0688、scm1.17c、pdhL、sck13.11、lpdB2和dld1，其中l(wèi)pd是特別優(yōu)選的。在此，優(yōu)選地，二氫硫辛酰賴氨酸殘基-琥珀酰基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.61)由選自下列的基因編碼dlst、dlst-prov、mgc89125、dmel_CG5214、f10m23.250、k13p22.8、kgd2agl200wp、kgd2、odhB、sucB、aceF、kgdB、sucB1、sucB2、pdhC、dlaT、kgd、sc5F7.20和sc4B10.24c，其中sucB和odhB是特別優(yōu)選的。
酶E28或上文所提及的酶E28的亞基的合適的基因的核苷酸序列依舊同樣可以從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
上文所描述的從草酰乙酸至琥珀酰輔酶A的途徑開(kāi)始于作為底物前體的磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸。在這種情況下，可以是進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述細(xì)胞如此地經(jīng)基因工程改造，從而其可以從碳水化合物和/或甘油提供特別大量的丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸。
如果細(xì)胞可以利用甘油作為培養(yǎng)物來(lái)源，那么優(yōu)選的是，在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的、經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E29至E42中至少一種酶(優(yōu)選地所有酶)的活性 -酶E29，其使得甘油易于擴(kuò)散入細(xì)胞中， -酶E30，其催化甘油轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸， -酶E31，其催化甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)化為二羥丙酮磷酸， -酶E32，其催化硫轉(zhuǎn)移至硫接納體硫氧還蛋白1， -酶E33，其催化磷脂水解從而形成醇和甘油， -酶E34，其催化甘油-3-磷酸通過(guò)交換磷酸而轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞中， -酶E35，其催化二羥丙酮磷酸轉(zhuǎn)化為甘油醛-3-磷酸， -酶E36，其催化甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為1，3-二磷酸甘油酸， -酶E37，其催化1，3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油酸， -酶E38，其催化3-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為2-磷酸甘油酸， -酶E39，其催化2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇丙酮酸， -酶E40，其催化磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸， -酶E41，其催化甘油轉(zhuǎn)化為二羥丙酮， -酶E42，其催化二羥丙酮轉(zhuǎn)化為二羥丙酮磷酸。
在此，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的細(xì)胞為這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是降低的E29、E30、E31、E32、E33、E34、E35、E36、E37、E38、E39、E40、E41、E42、E29E30、E29E31、E29E32、E29E33、E29E34、E29E35、E29E36、E29E37、E29E38、E29E39、E29E40、E29E41、E29E42、E30E31、E30E32、E30E33、E30E34、E30E35、E30E36、E30E37、E30E38、E30E39、E30E40、E30E41、E30E42、E31E32、E31E33、E31E34、E31E35、E31E36、E31E37、E31E38、E31E39、E31E40、E31E41、E31E42、E32E33、E32E34、E32E35、E32E36、E32E37、E32E38、E32E39、E32E40、E32E41、E32E42、E33E34、E33E35、E33E36、E33E37、E33E38、E33E39、E33E40、E34E41、E33E42、E34E35、E34E36、E34E47、E34E38、E34E39、E34E40、E34E41、E34E42、E35E36、E35E37、E35E38、E35E39、E35E40、E35E41、E35E42、E36E37、E36E38、E36E39、E36E40、E36E41、E36E42、E37E38、E37E39、E37E40、E37E41、E37E42、E38E39、E39E40、E39E41、E39E42、E40E41、E40E42、E41E42和E29E30E31E32E33E34E35E36E37E38E39E40E41E42。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E29為水甘油孔蛋白(Aquaglyceroporin)(甘油易化蛋白)，其優(yōu)選地由glpF基因編碼，酶E30為甘油激酶(EC 2.7.1.30)，其優(yōu)選地由glpK基因編碼，酶E31為甘油-3-磷酸脫氫酶(EC 1.1.99.5)，優(yōu)選地FAD-依賴性甘油-3-磷酸脫氫酶，其中所述甘油-3-磷酸脫氫酶優(yōu)選地由glpA基因、glpB基因、glpC基因或glpD基因，特別優(yōu)選地由glpD基因編碼，酶E32為硫轉(zhuǎn)移酶，其由glpE基因編碼，酶E33為甘油磷酸二酯酶(EC 3.1.4.46)，其優(yōu)選地由glpQ基因編碼，酶E34為甘油-3-磷酸通透酶，其優(yōu)選地由glpT基因編碼，酶E35為丙糖磷酸異構(gòu)酶(EC 5.3.1.1)，酶E36為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(EC 1.2.1.12)，酶E37為磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)，酶E38為磷酸甘油酸變位酶(EC 5.4.2.1)，酶E39為烯醇化酶(EC 4.2.1.11)，酶E40為丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)，酶E41為甘油脫氫酶(EC 1.1.1.6)，其優(yōu)選地由gldA基因編碼，和酶E42為二羥丙酮激酶(EC 2.7.1.29)，其優(yōu)選地由dhaK基因編碼。
上文所提及的酶的基因序列依舊同樣可以從技術(shù)人員已知的基因數(shù)據(jù)庫(kù)，特別是KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
此外，還從其他來(lái)源知曉編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992)，Journal of Bacteriology 1746076-6086)、編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 1746076-6086)和編碼3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，Journal of Bacteriology 1746076-6086)。
用已知的酶E29至E42的基因，可以制備這樣的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中，酶E29至E42中至少一種酶，特別優(yōu)選地至少兩種酶，更加優(yōu)選地至少三種酶和最優(yōu)選地所有酶的活性通過(guò)開(kāi)頭在酶E1方面所描述的技術(shù)(酶的突變或酶表達(dá)的增加)而得到提高。這些細(xì)胞能夠在作為唯一碳源的甘油(或者與作為進(jìn)一步的碳源的碳水化合物一起)存在下進(jìn)行培養(yǎng)。
除了提高酶活性E29至E42中的一種或多種酶活性外，當(dāng)細(xì)胞能夠利用甘油作為碳源時(shí)，如果在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的細(xì)胞之中表達(dá)，優(yōu)選地異源表達(dá)下列基因，那么這也可以是有利的 -glpG基因或3925基因， -glpX基因， -dhaR基因、ycgU基因或b1201基因， -fsa基因、mipB基因、ybiZ基因或B0825基因， -talC基因、fsaB基因、yijG基因或b3946基因。
這些基因的核苷酸序列依舊同樣可以從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
如果細(xì)胞可以利用碳水化合物作為培養(yǎng)物來(lái)源，那么優(yōu)選的是，在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E43至E45和E36至E40中至少一種酶(優(yōu)選地所有酶)的活性 -酶E43，其催化α-D-葡糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為β-D-果糖-6-磷酸， -酶E44，其催化β-D-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為β-D-果糖-1，6-二磷酸， -酶E45，其催化β-D-果糖-1，6-二磷酸轉(zhuǎn)化為甘油醛-3-磷酸和二羥丙酮磷酸， -酶E36，其催化甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為1，3-二磷酸甘油酸， -酶E37，其催化1，3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油酸， -酶E38，其催化3-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為2-磷酸甘油酸， -酶E39，其催化2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇丙酮酸，和 -酶E40，其催化磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸。
在此，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞為這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是增加的E36、E37、E38、E39、E40、E43、E44、E45、E36E37、E36E38、E36E39、E36E40、E36E43、E36E44、E36E45、E37E38、E37E39、E37E40、E37E43、E37E44、E37E45、E38E39、E38E40、E38E43、E38E44、E38E45、E39E40、E39E43、E39E44、E39E45、E40E43、E40E44、E40E45、E43E44、E43E45、E44E45和E36E37E38E39E40E43E44E45。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E43為葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶(EC 5.3.1.9)，酶E44為6-磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.11)，酶E45為果糖二磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.13)，酶E36為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(EC 1.2.1.12)，酶E37為磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)，酶E38為磷酸甘油酸變位酶(EC 5.4.2.1)，酶E39為烯醇化酶(EC 4.2.1.11)，和酶E40為丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)。
這些基因的核苷酸序列依舊同樣可以從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
此外，當(dāng)細(xì)胞能夠利用碳水化合物作為碳源時(shí)，優(yōu)選的是，除了上述酶E43至E45和E36至E40的活性外，細(xì)胞中葡萄糖的攝取也得到提高，例如通過(guò)提高磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的酶(特別是由ptsI、ptsH和ptsM基因編碼的那些酶)的活性，或者通過(guò)增強(qiáng)優(yōu)選地由glk基因編碼的葡糖激酶(EC 2.7.1.2)。在這種情況下，特別地可參閱US 6,680,187、US 6,818,432、US 6,913,910和US 6,884,614，其關(guān)于用于過(guò)表達(dá)ptsI、ptsH、ptsM和glk基因的可能性的公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考，并且構(gòu)成本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的一部分。在碳水化合物作為碳源的情況下，也可以是有利的是，有針對(duì)性地促進(jìn)戊糖磷酸途徑，例如通過(guò)提高葡糖-6-磷酸脫氫酶(EC 1.1.1.49)和6-磷酸葡糖酸脫氫酶(EC1.1.1.44)(其優(yōu)選地由gnd基因編碼)的活性，并且任選地同時(shí)抑制糖酵解，例如通過(guò)減弱葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶的活性，如在WO-A-01/07626中所描述的那樣。
如果依照根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別的布置方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中形成作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛和作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A)，細(xì)胞經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的草酰乙酸和丙酮酸而形成3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸，那么可以是進(jìn)一步優(yōu)選的是，降低所述細(xì)胞中至少一種(優(yōu)選地所有)下述酶活性的活性 -催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇丙酮酸的酶，例如磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(EC 4.1.1.49)(還可參見(jiàn)DE-A-199 50 409)， -催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酸的酶，例如丙酮酸氧化酶(EC 1.2.2.2)(還可參見(jiàn)DE-A-199 51 975)， -催化α-D-葡糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為β-D-果糖-6-磷酸的酶(還可參見(jiàn)US 09/396,478)， -催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的酶，例如1-乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.27)或乳酸-蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)氫酶(EC 1.1.99.7)， -催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A的酶，例如丙酮酸脫氫酶(EC1.2.1.51)， -催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰磷酸的酶，例如丙酮酸氧化酶(EC1.2.3.3)， -催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酸的酶，例如丙酮酸脫氫酶(EC 1.2.2.2)， -催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇丙酮酸的酶，例如磷酸烯醇丙酮酸合酶(EC 2.7.9.2)或丙酮酸磷酸二激酶(EC 2.7.9.1)， -催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙氨酸的酶，例如丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.2)或丙氨酸-酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.12)，和/或 -催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰乳酸的酶，例如乙酰羥酸合酶(EC2.2.1.6)。
根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的細(xì)胞(所述細(xì)胞能夠經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A從作為碳源的碳水化合物形成3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸，并且在所述細(xì)胞中可以提高一種或多種上文所提及的酶活性，特別是酶活性E1至E45之一，更優(yōu)選地酶活性E1、E1E2E3E4、E1E4E5E6E7或/和E1E4E5E7)是由Bennett等人，Metab.Eng.(2005)，7(3)，第229至239頁(yè)；Bennett等人，Biotechnol.Bioeng.(2005)，90(6)，第775至779頁(yè)；Bennett等人，Biotechnol.Prog.(2005)，21(2)，第358至365頁(yè)；Bennett等人，(2005)，Appl.Microbiol.Biotechnol.，67(4)，第515至523頁(yè)；Vemuri等人，(2002)，Applied and Ebvironmental Microbiology 68(4)，第1715至1727頁(yè)以及在US 6,455,284中所描述的那些微生物。
如果依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)特別的實(shí)施方案，經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A從作為碳源的L-谷氨酸形成3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸，那么依照根據(jù)本發(fā)明的方法的進(jìn)一步的特別的實(shí)施方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中形成作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛和作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A)，根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的是，所使用的細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E28和E46中至少一種酶(優(yōu)選地這兩者)的活性(見(jiàn)圖10) -酶E46，其催化L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為2-酮戊二酸； -酶E28，其催化2-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E46為谷氨酸合酶(EC 1.4.1.13或EC 1.4.1.14)、谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.1或EC 2.6.1.2)，和酶E28為2-酮戊二酸合酶(EC 1.2.7.3)。
作為酶E28，優(yōu)選的是已經(jīng)在開(kāi)頭作為優(yōu)選的酶E28而提及的那些。
優(yōu)選地，酶E46由選自下列的基因編碼myn8.、glt1、adr290wp、gltB、gltD、yeiT、aegA、ygfT、gltD-1、gltD-2、glt1、glt2、gls1、gltA、glt、glxD、gltA、yerD、cgl0184、cgl0185、sc3c9.12、gdh1、gdh2、agl40cp、gdhA、gdhA1、gdhA2、gluD、rocG、ypcA、gudB、gluD、gdhA、gdhA2、gdh、gdhA-1、gdhA2-2、gdhA-3、gluD1、gluD2、glud1-prov、glud1a、t11I18.2、t2I1.150、mrg7.13、got1、got2、caspat、got2-prov、xr406-prov、406-prov、cg4233、cg4233、cg8430、cg8430、f23n19.17、f13j11.16、t26c19.9、f7f1.18、f10n7.200、t1611.170、f15n18.110、t20d1.70、aat、aat1、aat2、abl038wp、afr211cp、agx1、bnA4、aatA、aatB、ybdL、aspC、yfbQ、ydcR、avtA2、aspC-1、aspC-2、aspC-3、aspC-4、aspB、aspB-1、aspB-2、aspB-3、aspB-4、argD1、argD2、aatAc、ywfG、mtnV、alaT、avtA1、avtA2、avtA3、cgl0240、cgl1103、cgl2599、cgl2844、dapC、2sck36.07c、sc9e12.21、sc2h4.04c、aspB1、aspB2、aspB3、tyrB、gpt、gpt1、gpt2、mgc82097、cgl640、c32f10.8、f20d23.34、f26f24.16、f24j13.15、t10d10.20和agrwp。
這些基因的核苷酸序列依舊同樣可以從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)特別的實(shí)施方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛來(lái)實(shí)現(xiàn))，優(yōu)選的是，3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的丙酰輔酶A來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所使用的細(xì)胞優(yōu)選地能夠利用碳水化合物、甘油、甲烷或甲醇作為碳源。在此，存在有各種不同的途徑來(lái)從丙酰輔酶A達(dá)到3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)特別的實(shí)施方案的第一個(gè)備選方案，中間產(chǎn)物丙酰輔酶A的形成經(jīng)由作為進(jìn)一步的中間產(chǎn)物的乙酰輔酶A來(lái)實(shí)現(xiàn)。在這種情況下，特別優(yōu)選的是，所使用的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E4、E5和E47至E52中至少一種酶的活性(見(jiàn)圖11和12) -酶E47，其催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A； -酶E48，其催化丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酸半醛； -酶E49，其催化丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸； -酶E50，其催化3-羥基丙酸轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酰輔酶A； -酶E51，其催化3-羥基丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙烯酰輔酶A； -酶E52，其催化丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A； -酶E5，其催化丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛； -酶E4，其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的是，使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是增加的E47、E48、E49、E50、E51、E52、E4、E5和E47E48E49E50E51E52E4E5。
此外，在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E4為3-羥基異丁酸脫氫酶(EC 1.1.1.31)或3-羥基?；o酶A脫氫酶(EC 1.1.1.35)，酶E5為甲基丙二酸半醛脫氫酶(EC 1.2.1.27)，酶E47為丙二酰輔酶A脫羧酶(EC 4.1.1.9)、丙二酸-輔酶A轉(zhuǎn)移酶(EC 2.8.3.3)、甲基丙二酰輔酶A羧基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.1.3.1)或乙酰輔酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)，酶E48為丙二酸半醛脫氫酶(EC 1.2.1.18)，酶E49為3-羥基丙酸脫氫酶(EC 1.1.1.59)，酶E50為3-羥基異丁酰輔酶A水解酶(EC 3.1.2.4)，酶E51為烯酰輔酶A水合酶(EC 4.2.1.17)，和酶E52為?；o酶A脫氫酶(EC 1.3.99.3)。
酶E4和E5的優(yōu)選的基因?yàn)橐呀?jīng)在上文中在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的第一個(gè)特別的實(shí)施方案方面作了描述的那些。
優(yōu)選地，酶E47由選自下列的基因編碼mlycd、t19b17.4、tb08.2904.110、matA、acac、acaca、acacb、f5j5.21、f15c21.2、t8p21.5、acc1、aar071wp、accA、accB、accC、accD、accC1、accC2、mmdA、fabG、accD1、accD2、accD3、cgl0831、accBC、dtsR1、accDA、scc24.16c和cgl1327，其中accA、accC和accD是最優(yōu)選的。
優(yōu)選地，酶E48由iolD基因編碼。
優(yōu)選地，酶E51由選自下列的基因編碼echS1、ehhadh、hadha、echs1-prov、cg4389、cg4389、cg6543、cg6984、cg8778、ech-1、ech-2、ech-3、ech-4、ech-5、ech-6、ech-7、FCAALL.314、fcaall.21、fox2、eci1、eci2、paaF、paaG、yfcX、fadB、faoA、rpfF、phaA、phaB、echA1、echA2、echA3、echA4、echA5、echA6、echA7、echA8、echA9、echA9、echA10、echA11、echA12、echA13、echA14、echA15、echA16、echA17、echA18、echA19、echA20、echA21、fad-1、fad-2、fad-3、dcaE、hcaA、fadJ、rsp0671、rsp0035、rsp0648、rsp0647、rs03234、rs03271、rs04421、rs04419、rs02820、rs02946、paaG1、paaG2、paaG3、ech、pksH、ydbS、eccH1、eccH2、pimF、fabJ1、fabJ2、caiD2、ysiB、yngF、yusL、fucA、cg10919、scf41.23、scd10.16、sck13.22、scp8.07c、stbac16h6.14、sc5f2a.15、sc6a5.38、hbd-1、hbd-2、hdb-3、hdb-4、hdb-5、hdb-6、hdb-7、hdb-8、hdb-9、hdb-10、fad-1、fad-2、fad-3、fad-4、fad-5、paaF-1、paaF-2、paaF-3、paaF-4、paaF-5、paaF-6、paaF-7和crt。
優(yōu)選地，酶E52由選自下列的基因編碼acadl、acadm、acad10、acad11、acadm-prov、acadl-prov、mgc81873、cg12262、cg4703、cg4860、f3e22.5、afl213wp、acdC、fadE13、acd-1、acd-2、acd-3、acd-4、acd-5、acd-6、acd-7、acd-8、acd-9、acd-10、acd-11、acd-12、acd、fadE1、fadE2、fadE3、fadE4、fadE5、fadE6、fadE7、fadE13、fadE14、fadE15、fadE16、fadE17、fadE18、fadE19、fadE20、fadE21、fadE22、fadE23、fadE26、fadE27、fadE30、fadE31、fadE33、fadE35、fadE38、fadE45、fadE、caiA、aidB、RSp0036、RS03588、mmgC、acdA-3、bcd、acdA、acdH1、acdH2、acdH3、aidB、acdI和acdH。
酶E47至E52，特別是酶E49和E50的合適的基因的核苷酸序列可以從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的該第二個(gè)特別的實(shí)施方案的第二個(gè)備選方案，中間產(chǎn)物丙酰輔酶A的形成同樣也是經(jīng)由乙酰輔酶A(作為進(jìn)一步的中間產(chǎn)物)來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中依照該備選方案，丙酰輔酶A不是直接地，而是經(jīng)由甲基丙二酰輔酶A來(lái)轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛。在這種情況下，特別優(yōu)選的是，所使用的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E2至E4、E6、E7和E47至E52中至少一種酶的活性(見(jiàn)圖13和14) -酶E47，其催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A； -酶E48，其催化丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酸半醛； -酶E49，其催化丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸； -酶E50，其催化3-羥基丙酸轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酰輔酶A； -酶E51，其催化3-羥基丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙烯酰輔酶A； -酶E52，其催化丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A； -酶E7，其催化丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為(S)-甲基丙二酰輔酶A； -酶E6，其催化(S)-甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為(R)-甲基丙二酰輔酶A； -酶E2，其催化(R)-甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸； -酶E3，其催化甲基丙二酸轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛； -酶E4，其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的是，使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是增加的E2、E3、E4、E6、E7、E47、E48、E49、E50、E51、E52和E2E3E4E6E7E47E48E49E50E51E52。
這些酶的優(yōu)選的酶和基因?yàn)橐呀?jīng)在上文中在酶E2至E4、E6、E7和E47至E52方面被提及的那些基因和酶。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)特別的實(shí)施方案的該第一個(gè)備選方案的第三個(gè)備選方案，中間產(chǎn)物丙酰輔酶A的形成同樣也是經(jīng)由乙酰輔酶A(作為進(jìn)一步的中間產(chǎn)物)來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中依照該備選方案，丙酰輔酶A同樣也不是直接地，而是經(jīng)由(R)-甲基丙二酰輔酶A(和不經(jīng)由(S)-甲基丙二酰輔酶A)來(lái)轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛。在這種情況下，特別優(yōu)選的是，所使用的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E2至E4、E7和E47至E52中至少一種酶的活性(見(jiàn)圖15和16) -酶E47，其催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A； -酶E48，其催化丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酸半醛； -酶E49，其催化丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸； -酶E50，其催化3-羥基丙酸轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酰輔酶A； -酶E51，其催化3-羥基丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙烯酰輔酶A； -酶E52，其催化丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A； -酶E7，其催化丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶A； -酶E2，其催化甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸； -酶E3，其催化甲基丙二酸轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛； -酶E4，其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的是，使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是增加的E2、E3、E4、E7、E47、E48、E49、E50、E51、E52和E2E3E4E7E47E48E49E50E51E52。
這些酶的優(yōu)選的酶和基因依舊同樣為已經(jīng)在上文中在酶E2至E4、E7和E47至E52方面被提及的那些基因和酶。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)特別的實(shí)施方案的第四個(gè)備選方案，中間產(chǎn)物丙酰輔酶A的形成同樣也是經(jīng)由乙酰輔酶A(作為進(jìn)一步的中間產(chǎn)物)來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中根據(jù)該備選方案，形成作為中間產(chǎn)物的乙酰乙酰輔酶A。在這種情況下，可以是優(yōu)選的是，所使用的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E8和E53至E61中至少一種酶的活性 -酶E53，其催化兩個(gè)乙酰輔酶A單元轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰輔酶A； -酶E54，其催化乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基丁酰輔酶A； -酶E55，其催化3-羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為巴豆酰輔酶A； -酶E56，其催化巴豆酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丁酰輔酶A； -酶E57，其催化丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙基丙二酰輔酶A； -酶E58，其催化乙基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基琥珀酰輔酶A； -酶E59，其催化甲基琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)化為異丁酰輔酶A； -酶E60，其催化異丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙烯酰輔酶A； -酶E61，其催化甲基丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酰輔酶A； -酶E8，其催化3-羥基異丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
在此，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞是這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是增加的E8、E53、E54、E55、E56、E57、E58、E59、E60、E61和E8E53E54E55E56E57E58E59E60E61。
該代謝途徑以及參與該代謝途徑的酶例如描述于Korotkova等人，Journal of Bacteriology(2002)，第1750-1758頁(yè)中。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)特別的實(shí)施方案的第五個(gè)備選方案，中間產(chǎn)物丙酰輔酶A的形成依舊同樣經(jīng)由乙酰輔酶A(作為進(jìn)一步的中間產(chǎn)物)來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中根據(jù)該改變形式，同樣形成作為中間產(chǎn)物的乙酰乙酰輔酶A，然而其中在該情況下，從巴豆酰輔酶A直接形成乙基丙二酰輔酶A。在這種情況下，可以是優(yōu)選的是，所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E8、E53至E55、E58和E62至E65中至少一種酶的活性(見(jiàn)圖17) -酶E53，其催化兩個(gè)乙酰輔酶A單元轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰輔酶A； -酶E54，其催化乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基丁酰輔酶A； -酶E55，其催化3-羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為巴豆酰輔酶A； -酶E62，其催化巴豆酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙基丙二酰輔酶A； -酶E58，其催化乙基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基琥珀酰輔酶A； -酶E63，其催化甲基琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)化為中康酰輔酶A； -酶E64，其催化中康酰輔酶A轉(zhuǎn)化為β-甲基蘋(píng)果酰輔酶A； -酶E65，其催化β-甲基蘋(píng)果酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙醛酸和丙酰輔酶A。
然后，可以以上文所描述的方法類型和方式(提高酶E7、E2、E3和E4中一種或多種酶的活性，提高酶E7、E6、E2、E3和E4中一種或多種酶的活性，或者提高酶E4和E5中一種酶或兩者的活性)，從丙酰輔酶A形成3-羥基異丁酸。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E53為β-酮硫解酶(EC 2.3.1.9)，酶E54為乙酰乙酰輔酶A還原酶(EC 1.1.1.36)，酶E55為烯酰輔酶A水合酶(EC 4.2.1.17)，酶E62為巴豆酰輔酶A脫羧酶，酶E58為乙基丙二酰輔酶A變位酶(EC 5.4.99.2)，酶E63為甲基琥珀酰輔酶A脫氫酶，酶E64為中康酰輔酶A水合酶，和酶E65為β-甲基蘋(píng)果酰/L-蘋(píng)果酰輔酶A裂合酶。
優(yōu)選地，酶E53由選自下列的基因編碼acat1、acat2、loc484063、loc489421、mgc69098、mgc81403、mgc81256、mgc83664、kat-1、erg10、ygeF、atoB、fadAx、phbA-1、phbA-2、atoB-2、pcaF、pcaF-2、phb-A、bktB、phaA、tioL、thlA、fadA、paaJ、phbAf、pimB、mmgA、yhfS、thl、vraB、th1、mvaC、thiL、paaJ、fadA3、fadA4、fadA5、fadA6、cgl12392、catF、sc8f4.03、thiL1、thiL2、acaB1、acaB2、acaB3或acaB4，其中acat1、acat2、atoB和phbA以及來(lái)自類球紅細(xì)菌的相應(yīng)基因是特別優(yōu)選的。
優(yōu)選地，酶E54由選自下列的基因編碼phbB、fabG、phbN1、phbB2或cgl12444，其中phbB以及來(lái)自類球紅細(xì)菌的相應(yīng)基因是特別優(yōu)選的。
優(yōu)選地，酶E55由選自下列的基因編碼echS1、ehhadh、hadha、echs1-prov、cg4389、cg4389、cg6543、cg6984、cg8778、ech-1、ech-2、ech-3、ech-4、ech-5、ech-6、ech-7、FCAALL.314、fcaall.21、fox2、eci1、eci2、paaF、paaG、yfcX、fadB、faoA、rpfF、phaA、phaB、echA1、echA2、echA 3、echA4、echA5、echA6、echA7、echA8、echA9、echA9、echA10、echA11、echA12、echA13、echA14、echA15、echA16、echA17、echA18、echA19、echA20、echA21、fad-1、fad-2、fad-3、dcaE、hcaA、fadJ、rsp 0671、rsp0035、rsp0648、rsp0641rs03234、rs03271、rs04421、rs04419、rs02820、rs02946、paaG1、paaG2、paaG3、ech、pksH、ydbS、eccH1、eccH2、pimF、fabJ1、fabJ2、caiD2、ysiB、yngF、yusL、fucA、cg10919、scf41.23、scd10.16、sck13.22、scp8.07c、stbac16h6.14、sc5f2a.15、sc6a5.38、hbd-1、hbd-2、hdb-3、hdb-4、hdb-5、hdb-6、hdb-7、hdb-8、hdb-9、hdb-10、fad-1、fad-2、fad-3、fad-4、fad-5、paaF-1、paaF-2、paaF-3、paaF-4、paaF-5、paaF-6、paaF-7和crt，其中來(lái)自類球紅細(xì)菌的相應(yīng)基因是特別優(yōu)選的。
酶E58的合適的基因選自mut、mutA、mutB、sbm、sbmA、sbmB、sbm5、bhbA、mcmA、mcmA1、mcmA2、mcmB、mcm1、mcm2、mcm3、icmA、meaA1和meaA2，其中來(lái)自類球紅細(xì)菌的相應(yīng)基因在此也是特別優(yōu)選的。
作為酶E62，優(yōu)選地使用來(lái)自類球紅細(xì)菌的酶，其由具有SEQ ID NO05的DNA序列編碼并且具有根據(jù)SEQ ID NO06的氨基酸序列。
酶E63、E64和E65的優(yōu)選的基因特別地為來(lái)自類球紅細(xì)菌的這些酶的基因。
上文所提及的基因的核苷酸序列的其他例子尤其還可以從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
如在上文中已經(jīng)說(shuō)明的，在根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的第一個(gè)備選方案的情況下，經(jīng)由丙酰輔酶A和乙酰輔酶A(作為中間產(chǎn)物)產(chǎn)生3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸。在此，原則上可能合適的是，除了影響上文所提及的酶活性E2至E8和E47至E65中的一種或多種酶活性外，還影響這樣的酶活性，該酶活性導(dǎo)致細(xì)胞中乙酰輔酶A的形成的提高。
當(dāng)從碳水化合物或從甘油(作為碳源)來(lái)形成3-羥基異丁酸時(shí)，可以是優(yōu)選的是，所述細(xì)胞具有增加的酶E66的活性，所述酶E66催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。優(yōu)選地，該酶E66為丙酮酸脫氫酶(EC1.2.1.51)。
當(dāng)從C1-碳源例如甲烷或甲醇來(lái)形成3-羥基異丁酸時(shí)，可以是優(yōu)選的是，所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的酶E67至E71中至少一種酶的活性 -酶E67，其催化甲烷轉(zhuǎn)化為甲醇； -酶E68，其催化甲醇轉(zhuǎn)化為甲醛； -酶E69，其催化甲醛轉(zhuǎn)化為5，10-亞甲基四氫葉酸； -酶E70，其催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸； -酶E71，其催化5-甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E67為甲烷單加氧酶(EC 1.14.13.25)，酶E68為甲醇脫氫酶(EC 1.1.1.244)，酶E69為甲基丙二酸半醛脫氫酶(EC 1.2.1.27)，酶E70為亞甲基四氫葉酸還原酶(EC 1.5.1.20)，酶E71為一氧化碳脫氫酶(EC 1.2.99.2)。
酶E63至E67的合適的基因的核苷酸序列可以從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第三個(gè)特別的實(shí)施方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛來(lái)實(shí)現(xiàn))，優(yōu)選的是，3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的丙烯酰輔酶A來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所使用的細(xì)胞優(yōu)選地能夠利用碳水化合物、甘油或谷氨酸作為碳源。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的第三個(gè)特別的實(shí)施方案方面，當(dāng)所使用的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E2至E4、E62、E72和E73中至少一種酶的活性(見(jiàn)圖18)時(shí)，是特別優(yōu)選的 -酶E72，其催化β-丙氨酸轉(zhuǎn)化為β-丙氨酰輔酶A； -酶E73，其催化β-丙氨酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙烯酰輔酶A； -酶E62，其催化丙烯酸輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶A(或者巴豆酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙基丙二酰輔酶A)； -酶E2，其催化甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸； -酶E3，其催化甲基丙二酸轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛； -酶E4，其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
在此，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的細(xì)胞為這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是增加的E62E2、E62E3、E62E4、E62E2E3和E72E73E62E2E3E4。在根據(jù)本發(fā)明的方法的第四個(gè)特別的實(shí)施方案方面，也可以是有利的是，使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中過(guò)表達(dá)能夠催化至少兩個(gè)上文所描述的反應(yīng)步驟的酶。因此，在此，還可以使用例如不僅具有酶E2的活性而且具有酶E3的活性的酶，例如來(lái)自Sulfolobus tokodaii的丙二酰輔酶A還原酶，其由具有SEQ ID NO03的DNA序列編碼并且具有根據(jù)SEQ ID NO04的氨基酸序列。此外，在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的第四個(gè)特別的實(shí)施方案方面，原則上還可能使用這樣的細(xì)胞，其已經(jīng)能夠形成特別大量的丙烯酰輔酶A。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E72為輔酶A轉(zhuǎn)移酶(EC 2.8.3.1)或輔酶A合成酶，優(yōu)選地輔酶A轉(zhuǎn)移酶，酶E73為β-丙氨酰輔酶A銨裂合酶(EC 4.3.1.6)，酶E62為巴豆酰輔酶A脫羧酶，酶E2為甲基丙二酰輔酶A水解酶(EC 3.1.2.17)，酶E3為醛脫氫酶(EC 1.2.1.3)或醛氧化酶(EC 1.2.3.1)，和酶E4為3-羥基異丁酸脫氫酶(EC 1.1.1.31)或3-羥基酰基輔酶A脫氫酶(EC 1.1.1.35)。
優(yōu)選的具有輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性的酶E72為來(lái)自埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)和還有大腸桿菌的那些。作為編碼輔酶A轉(zhuǎn)移酶的DNA序列的例子，在這點(diǎn)上可以提及在WO-A-03/062173中稱為SEQ ID NO24的來(lái)自埃氏巨球形菌的序列。其他優(yōu)選的酶為在WO-A-03/062173中所描述的輔酶A轉(zhuǎn)移酶的那些變體。
合適的具有β-丙氨酰輔酶A銨裂合酶活性的酶E73例如為來(lái)自丙酸梭菌的那些。編碼此類酶的DNA序列可以例如從丙酸梭菌中獲得，如在WO-A-03/062173的實(shí)施例10中所描述的。編碼來(lái)自丙酸梭菌的β-丙氨酰輔酶A銨裂合酶的DNA序列在WO-A-03/062173中被指定為SEQ ID NO22。
作為酶E62，依舊同樣優(yōu)選地使用來(lái)自類球紅細(xì)菌的巴豆酰輔酶A脫羧酶，其由具有SEQ ID NO05的DNA序列編碼并且具有根據(jù)SEQ IDNO06的氨基酸序列。該酶不僅能夠?qū)投辊］o酶A轉(zhuǎn)化為乙基丙二酰輔酶A，而且還能夠?qū)⒈］o酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶A。
酶E2至E4的合適的基因已經(jīng)在根據(jù)本發(fā)明的方法的第一種變化形式方面提及，其中在第二種變化形式方面，也優(yōu)選的是，作為酶E3的基因，上文所描述的來(lái)自Sulfolobus tokodaii的基因是特別優(yōu)選的。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第三個(gè)特別的實(shí)施方案的特別優(yōu)選的變化形式，使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，所述細(xì)胞相比于其野生型而言至少具有增加的酶E2和E62或者酶E2、E3和E62的活性，其中酶E2或者酶E2和E3由根據(jù)SEQ ID NO03的DNA序列編碼和酶E62由根據(jù)SEQ IDNO05的DNA序列編碼。在這種情況下，當(dāng)增加的這兩種酶的活性通過(guò)在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)具有SEQ ID NO04和SEQ ID NO06的多肽或者分別與根據(jù)SEQ ID NO04和SEQ ID NO06的氨基酸序列具有至少50％，優(yōu)選地至少55％，更優(yōu)選地至少60％，更加優(yōu)選地至少65％和最優(yōu)選地至少70％同一性的氨基酸序列來(lái)獲得時(shí)，則是優(yōu)選的。在此，這兩種DNA序列可以整合入細(xì)胞的基因組中，或者存在于在細(xì)胞內(nèi)的載體上。
在上文所描述的根據(jù)本發(fā)明的方法的第三個(gè)特別的實(shí)施方案方面，當(dāng)出現(xiàn)下述情況時(shí)，可以是進(jìn)一步有利的，即除了酶E62的活性和/或酶E2或酶E2和E3的活性的提高外，所使用的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞還具有下列特性中的至少一種特性(優(yōu)選地兩者) -相比于其野生型而言增加的催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的酶E11或催化磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的酶E74的活性，然而優(yōu)選的是增加的催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的酶E11的活性，以及 -增加的催化天冬氨酸轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸的酶E75的活性。
優(yōu)選地，酶E11為羧化酶，特別優(yōu)選地為催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的丙酮酸羧化酶(EC編號(hào)6.4.1.1)。在這種情況下特別優(yōu)選的丙酮酸羧化酶為在″A novel methodology employing Corynebacteriumglutamicum genome information to generate a new L-lysine-producing mutant.″Ohnishi J等人，Applied Microbiology andBiotechnology，Vol.58(2)，第217-223頁(yè)(2002)中所描述的那些突變體。在該突變中，第458位處的氨基酸脯氨酸被置換為絲氨酸。該出版物關(guān)于用于制備丙酮酸羧化酶突變體的可能性的公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考，并且構(gòu)成本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的一部分。
酶E75優(yōu)選地為脫羧酶，特別優(yōu)選地為谷氨酸脫羧酶或天冬氨酸脫羧酶，其中1-天冬氨酸-1-脫羧酶(EC編號(hào)4.1.1.11)是最優(yōu)選的，其由panD基因編碼。天冬氨酸脫羧酶催化天冬氨酸轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸。尤其已經(jīng)從大腸桿菌中(FEMS Microbiology Letters，143，第247-252頁(yè)(1996)，″Photorhabdus luminescens subsp.Laumondii，Mycobacterium bovis subsp.Bovis″)以及從眾多的其他微生物中克隆了天冬氨酸脫羧酶的基因(panD基因)，并進(jìn)行了測(cè)序。特別地，在DE-A-198 55 313中描述了來(lái)自谷氨酸棒桿菌的panD基因的核苷酸序列。原則上，可以使用具有任何想得到的來(lái)源的panD基因，不論來(lái)自細(xì)菌、來(lái)自酵母還是來(lái)自真菌都是無(wú)關(guān)緊要的。此外，還可以使用panD基因的所有等位基因，特別是還有由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性或通過(guò)功能中性有義突變而產(chǎn)生的那些。除了來(lái)自谷氨酸棒桿菌的天冬氨酸脫羧酶外，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的天冬氨酸脫羧酶還為大腸桿菌-突變體DV9(Vallari和Rock，Journal of Bacteriology，164，第136-142頁(yè)(1985))。該出版物關(guān)于上述突變體的公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考，并且構(gòu)成本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的一部分。在DE-A-10 2005 048 818中描述了重組細(xì)胞的制備，在所述細(xì)胞中不僅丙酮酸羧化酶的活性而且天冬氨酸脫羧酶的活性是提高的。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二種變化形式，3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為初產(chǎn)物的3-羥基異丁酰輔酶A來(lái)實(shí)現(xiàn)。
當(dāng)在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用這樣的細(xì)胞(即在所述細(xì)胞中3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成根據(jù)第二種變化形式經(jīng)由作為初產(chǎn)物的3-羥基異丁酰輔酶A來(lái)實(shí)現(xiàn))時(shí)，依照第一個(gè)特別的實(shí)施方案，優(yōu)選的是，3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的異丁酰輔酶A來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所述細(xì)胞優(yōu)選地能夠利用碳水化合物、甘油或L-纈氨酸作為碳源。
如果碳水化合物或甘油充當(dāng)碳源，那么依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二種變化形式的該第一個(gè)特別的實(shí)施方案的第一個(gè)備選方案，優(yōu)選的是，使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E76至E79、E60、E61和E8中至少一種酶的活性(見(jiàn)圖19) -酶E76，其催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為2-乙酰乳酸； -酶E77，其催化2-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2，3-二羥基異戊酸； -酶E78，其催化2，3-二羥基異戊酸轉(zhuǎn)化為2-氧代異戊酸； -酶E79，其催化2-氧代異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁酰輔酶A； -酶E60，其催化異丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙烯酰輔酶A； -酶E61，其催化甲基丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酰輔酶A； -酶E8，其催化3-羥基異丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的是，使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是增加的E8、E60、E61、E76、E77、E78、E79和E8E60E61E76E77E78E79。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E8為3-羥基異丁酰輔酶A水解酶(EC 3.1.2.4)，酶E76為乙酰乳酸合酶(EC 2.2.1.6)，酶E77為二羥基異戊酸脫氫酶(EC 1.1.1.86)，酶E78為2，3-二羥基異戊酸脫水酶(EC 4.2.1.9)，酶E79為2-氧代異戊酸脫氫酶(EC 1.2.1.25或EC 1.2.4.4)，酶E60為?；o酶A脫氫酶(EC 1.3.99.3)、丁酰輔酶A脫氫酶(EC1.3.99.2)或2-甲基?；o酶A脫氫酶(EC 1.3.99.12)，和酶E61為烯酰輔酶A水合酶(EC 4.2.1.17)。
優(yōu)選的酶E8、E60和E61為已經(jīng)在上文中描述了的那些。
優(yōu)選地，酶E76由選自下列的基因編碼ilvb1、t8p19.70、ilv1、ilv2、ilv6、aal021wp、ael305cp、ilvI、ilvH、ilvN、ilvB、ilvM、ilvG、ilvN、budB、ilvN-1、ilvN-2、atrC、ilvX、iolD、budB、alsS、ilvK、ilvB1、ilvB2、ilvB3、ilvN1、ilvN2、cgl1271、cgl1272、iolD和scc57A.40c。
優(yōu)選地，酶E77由選自下列的基因編碼f14p22.200、ilv5、acl198Wp、ilvC、ilvY、ilvC-1、ilvC-2、ilvC-3和cgl1273，其中ilvC基因是最優(yōu)選的。
優(yōu)選地，酶E78由選自下列的基因編碼f14o13.18、ilv3、acl117wp、ilvD、cgl1268、ilvD1和ilvD2，其中ilvD是最優(yōu)選的。
如果L-纈氨酸充當(dāng)碳源，那么依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)備選方案的第一個(gè)特別的實(shí)施方案的第二個(gè)改變形式(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為初產(chǎn)物的3-羥基異丁酰輔酶A和作為中間產(chǎn)物的異丁酰輔酶A來(lái)實(shí)現(xiàn))，優(yōu)選的是，這些所使用的細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E79、E80、E60、E61和E8中至少一種酶的活性(見(jiàn)圖20) -酶E80，其催化L-纈氨酸轉(zhuǎn)化為2-氧代異戊酸； -酶E79，其催化2-氧代異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁酰輔酶A； -酶E60，其催化異丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙烯酰輔酶A； -酶E61，其催化甲基丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酰輔酶A； -酶E8，其催化3-羥基異丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的是，使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中下列酶或酶組合的活性是增加的E8、E60、E61、E79、E80和E8E60E61E79E80。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是，酶E8為3-羥基異丁酰輔酶A水解酶(EC 3.1.2.4)，酶E60為酰基輔酶A脫氫酶(EC 1.3.99.3)、丁酰輔酶A脫氫酶(EC1.3.99.2)或2-甲基酰基輔酶A脫氫酶(EC 1.3.99.12)，酶E61為烯酰輔酶A水合酶(EC 4.2.1.17)，酶E79為2-氧代異戊酸脫氫酶(EC 1.2.1.25或EC 1.2.4.4)，和酶E80為氨基酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.6.1.42)。
優(yōu)選的酶E8、E60、E61和E79為已經(jīng)在上文中描述了的那些。
優(yōu)選地，酶E80由選自下列的基因編碼bcat1、bcat2、t27I1.8、t27i1.9、f2j10.5、f2j10.4、t12h1.16、mmb12.20、t9c5.3、mpa24.13、bat1、bat2、adl384wp、eca39、bcaA、ilvE、ilvE1、ilvE2、ilvE3、ywaA、ybgE、bcaT和cgl2204，其中ilvE是特別優(yōu)選的。
酶E80的合適的基因的核苷酸序列依舊同樣可以從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的第二種變化形式的第一個(gè)特別的實(shí)施方案的該第二個(gè)備選方案方面，可以是進(jìn)一步有利的是，使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸的酶E4的活性是降低的，其中該酶E4優(yōu)選地為3-羥基異丁酸脫氫酶(EC1.1.1.31)或3-羥基?；o酶A脫氫酶(EC 1.1.1.35)。
此外，依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二種變化形式的第一個(gè)特別的實(shí)施方案的第二個(gè)改變形式(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中經(jīng)由作為初產(chǎn)物的3-羥基異丁酰輔酶A和作為中間產(chǎn)物的異丁酰輔酶A而從作為碳源的L-纈氨酸開(kāi)始來(lái)形成3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸)，優(yōu)選的是，使用這樣的細(xì)胞，其已經(jīng)能形成大量的L-纈氨酸。在此，特別地考慮由Blombach等人在Applied Environmental Microbiology，Vol.73(7)(2007)，第2079-2084頁(yè)中描述的那些細(xì)胞。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別的實(shí)施方案，進(jìn)一步優(yōu)選的是，所使用的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞具有相對(duì)于其野生型而言增加的glbO基因的表達(dá)。此外，可能可以是優(yōu)選的是，所使用的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞具有相比于其野生型而言降低的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，所述檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由dctA基因或citP基因編碼。
優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞可通過(guò)這樣的方法來(lái)獲得，所述方法包括提高所述細(xì)胞中上文所描述的酶中至少一種酶(優(yōu)選地一種或多種下列酶)的活性的步驟 -E1至E4， -E1、E4、E5、E6和E7， -E1、E4、E5和E7， -E4、E5和E47至E52， -E2至E4、E6、E7和E47至E52， -E2至E4、E7和E47至E52， -E8和E53至E61， -E8、E53至E55、E58和E62至E64， -E2至E3、E62、E72和E73， -E8、E60、E61和E76至E79，或 -E8、E60、E61、E79和E80，其中，所述酶活性的提高優(yōu)選地通過(guò)開(kāi)頭所描述的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟IA)中，可以以分批方法(分批培養(yǎng))或補(bǔ)料分批方法(給料方法)或重復(fù)補(bǔ)料分批方法(重復(fù)給料方法)，使經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞連續(xù)地或不連續(xù)地與培養(yǎng)基相接觸并因此進(jìn)行培養(yǎng)，以便產(chǎn)生3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸。還可以考慮半連續(xù)的方法，如在GB-A-1009370中所描述的。關(guān)于已知的培養(yǎng)方法的概括描述在Chmiel的教科書(shū)(″Bioprozesstechnik1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik″(Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991))或Storhas的教科書(shū)(″Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen″，Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994)中。
待使用的培養(yǎng)基必須以合適的方式滿足各菌株的要求。關(guān)于各種微生物的培養(yǎng)基的描述包含在American Society for Bacteriology的手冊(cè)″Manual of Methods for General Bacteriology″(WashingtonD.C.，USA，1981)中。
作為碳源，可以使用碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素，油和脂肪例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油，脂肪酸例如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸，醇類例如甘油和甲醇，烴類例如甲烷，氨基酸例如L-谷氨酸或L-纈氨酸，或者有機(jī)酸例如乙酸。這些物質(zhì)可以單獨(dú)地或者作為混合物來(lái)進(jìn)行使用。特別優(yōu)選的是使用碳水化合物，特別是單糖、寡糖或多糖(如在US 6,01,494和US 6,136,576中所描述的)，使用C5-糖，或者使用甘油。
作為氮源，可以使用有機(jī)含氮化合物例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麥芽汁、玉米漿、大豆粉和尿素，或者無(wú)機(jī)化合物例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。這些氮源可以單獨(dú)地或者作為混合物來(lái)進(jìn)行使用。
作為磷源，可以使用磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或者相應(yīng)的含鈉鹽。此外，培養(yǎng)基還必須包含金屬鹽例如硫酸鎂或硫酸鐵，它們是生長(zhǎng)所必需的。最后，除了上面所述的物質(zhì)外，還可以使用必需的生長(zhǎng)物質(zhì)例如氨基酸和維生素。另外，可以向培養(yǎng)基中添加合適的前體。所述材料可以以單次添加的形式補(bǔ)充給培養(yǎng)物或者在培養(yǎng)期間以合適的方式供料給培養(yǎng)物。
關(guān)于培養(yǎng)物的pH控制，可以以合適的方式使用堿性化合物例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水，或者酸性化合物例如磷酸或硫酸。為了控制泡沫形成，可以使用防沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯。為了維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可以向培養(yǎng)基中添加合適的具有選擇作用的物質(zhì)例如抗生素。為了維持有氧條件，向培養(yǎng)物中輸入氧或含氧氣體混合物例如空氣。培養(yǎng)溫度通常為20℃至45℃，和優(yōu)選地25℃至40℃。特別地，在使用能轉(zhuǎn)化作為底物的甘油的細(xì)胞的情況下，可以是優(yōu)選的是，使用在US 6,803,218中所描述的此類細(xì)胞作為細(xì)胞。在該情況下，所述細(xì)胞可以在40至100℃的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。
優(yōu)選地，連續(xù)地從營(yíng)養(yǎng)液中純化出3-羥基異丁酸，其中，在這方面進(jìn)一步優(yōu)選的是，也連續(xù)地進(jìn)行通過(guò)發(fā)酵來(lái)制備3-羥基異丁酸，從而由3-羥基異丁酸的制備到從發(fā)酵液中純化出3-羥基異丁酸的整個(gè)過(guò)程可以連續(xù)地進(jìn)行。為了從發(fā)酵液中連續(xù)地純化出3-羥基異丁酸的制備，將發(fā)酵液連續(xù)地引導(dǎo)通過(guò)用于分離在發(fā)酵中所使用的微生物的裝置，優(yōu)選地通過(guò)具有20至200kDa的排阻大小的過(guò)濾器，在其中發(fā)生固/液分離。還可以設(shè)想使用離心機(jī)、合適的沉降裝置或這些裝置的組合，其中特別優(yōu)選的是，首先通過(guò)沉降來(lái)分離出至少一部分微生物，隨后將從中部分地去除了微生物的發(fā)酵液輸送至超濾或離心裝置。
在分離出微生物之后，將在其3-羥基異丁酸比例方面經(jīng)富集的發(fā)酵產(chǎn)品輸送至優(yōu)選地多步驟的分離設(shè)備。在該分離設(shè)備中，設(shè)置有多個(gè)相繼銜接的分離階段，從這些分離階段中各自匯出被引回至發(fā)酵罐的回輸管路。此外，從各個(gè)分離階段中引出排出管路。單個(gè)分離階段可以根據(jù)電滲析、反滲透、超濾或納米過(guò)濾的原理進(jìn)行工作。通常，在單個(gè)分離階段中涉及膜分離設(shè)備?；诎l(fā)酵副產(chǎn)物和底物殘留物的類型和規(guī)模來(lái)選擇單個(gè)分離階段。
除了借助于電滲析、反滲透、超濾或納米過(guò)濾(在其過(guò)程中作為終產(chǎn)物獲得了3-羥基異丁酸水溶液)來(lái)分離3-羥基異丁酸外，還可以通過(guò)萃取方法由從中去除了微生物的發(fā)酵液中分離出3-羥基異丁酸，其中在該情況下最終可以獲得純的3-羥基異丁酸。為了通過(guò)萃取來(lái)分離3-羥基異丁酸，可以向發(fā)酵液中添加例如銨化合物或胺，以形成3-羥基異丁酸的銨鹽。然后，可以通過(guò)下列方式從發(fā)酵液中分離出該銨鹽添加有機(jī)萃取劑，并隨后加熱如此獲得的混合物，由此銨鹽富集在有機(jī)相中。然后，例如通過(guò)進(jìn)一步的萃取步驟可以從該相中分離出3-羥基異丁酸，從而獲得純的3-羥基異丁酸。關(guān)于該分離方法的更精確的細(xì)節(jié)可從WO-A-02/090312獲取，該專利關(guān)于從發(fā)酵液中分離出羥基羧酸的公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考，并且構(gòu)成本申請(qǐng)公開(kāi)內(nèi)容的一部分。
根據(jù)從發(fā)酵液中分離3-羥基異丁酸的方法類型和方式，獲得包含2至90重量％，優(yōu)選地7.5至50重量％和特別優(yōu)選地10至25重量％的3-羥基異丁酸的3-羥基異丁酸水溶液，或者獲得純的3-羥基異丁酸。
此外，可以在純化之前、純化過(guò)程中或純化之后中和在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟IA)中制備的3-羥基異丁酸，其中為此可以使用堿例如氫氧化鈣或氫氧化鈉。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟IB)中，使3-羥基異丁酸脫水從而形成甲基丙烯酸，其中為此可以使用從發(fā)酵液中分離出的純的3-羥基異丁酸，或者使用在處理發(fā)酵液時(shí)分離出的3-羥基異丁酸水溶液，其中任選地，該3-羥基異丁酸水溶液還在脫水之前，任選地在合適的共沸劑存在下，例如通過(guò)蒸餾進(jìn)行濃縮。
原則上，脫水可以在液相或氣相中進(jìn)行。此外，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是，脫水在催化劑存在下進(jìn)行，其中所使用的催化劑的類型取決于施行氣相反應(yīng)還是液相反應(yīng)。
作為脫水催化劑，不僅可以考慮酸性催化劑，而且還可以考慮堿性催化劑。特別地，由于低的寡聚物形成傾向，酸性催化劑因而是優(yōu)選的。脫水催化劑不僅可以作為均相催化劑而且可以作為多相催化劑進(jìn)行使用。當(dāng)脫水催化劑作為多相催化劑存在時(shí)，優(yōu)選的是，所述脫水催化劑與支持物x相接觸。作為支持物x，可以考慮技術(shù)人員認(rèn)為合適的所有固體材料。在這種情況下，優(yōu)選的是，該固體材料具有合適的孔體積，其適合于良好地系住和接納脫水催化劑。此外，在0.01至3ml/g范圍內(nèi)的根據(jù)DIN 66133的總孔體積是優(yōu)選的，和在0.1至1.5ml/g范圍內(nèi)的總孔體積是特別優(yōu)選的。此外，優(yōu)選的是，按照根據(jù)DIN 66131的BET測(cè)試，適合作為支持物x的固體材料具有0.001至1000m2/g，優(yōu)選地0.005至450m2/g，和更優(yōu)選地0.01至300m2/g的表面積。作為用于脫水催化劑的支持物，首先可以使用具有0.1至40mm，優(yōu)選地1至10mm，和更優(yōu)選地1.5至5mm的平均顆粒直徑的疏松材料。進(jìn)一步地，脫水反應(yīng)器的壁可以充當(dāng)支持物。此外，支持物本身可以是酸性的或堿性的，或者可以在惰性支持物上涂覆酸性或堿性的脫水催化劑。作為涂覆技術(shù)，特別可以提及浸沒(méi)或浸漬或者摻入到支持物基質(zhì)中。
作為還可以具有脫水催化劑特性的支持物x，特別合適的是天然或合成的硅酸鹽物質(zhì)，例如特別是絲光沸石、蒙脫石、酸性沸石；用一、二或多堿價(jià)無(wú)機(jī)酸(特別是磷酸)或者無(wú)機(jī)酸的酸式鹽涂布的支持物材料，例如氧化物或硅酸鹽類型的物質(zhì)，例如Al2O3、TiO2；氧化物和混合氧化物，例如γ-Al2O3和雜多酸的ZnO-Al2O3混合氧化物。
相應(yīng)于一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，支持物x至少部分地由氧化物類型的化合物組成。這樣的氧化物類型的化合物應(yīng)當(dāng)具有元素Si、Ti、Zr、Al、P中的至少一種元素或者其中至少兩種元素的組合。這樣的支持物由于其酸性或堿性特性而本身還可以用作脫水催化劑。優(yōu)選的既用作為支持物x也用作脫水催化劑的化合物類別包括硅/鋁/磷氧化物。優(yōu)選的既用作脫水催化劑也用作支持物x的堿性物質(zhì)包括堿金屬、堿土金屬、鑭、鑭系元素或其中至少兩種(以其氧化物形式)的組合。這樣的酸性或堿性脫水催化劑不僅可以從Degussa AG，而且可以從Südchemie AG商購(gòu)獲得。其他類別為離子交換劑。同樣地，這不僅可以以堿性形式，而且可以以酸性形式存在。
特別地，作為均相脫水催化劑，可以考慮無(wú)機(jī)酸，優(yōu)選地含磷的酸，和更優(yōu)選地磷酸。這些無(wú)機(jī)酸可以通過(guò)浸沒(méi)或浸漬而固定在支持物x上。
特別地，在氣相脫水的情況下，使用多相催化劑經(jīng)證明是特別有利的。然而，在液相脫水的情況下，既使用均相脫水催化劑也使用多相脫水催化劑。
此外，優(yōu)選的是，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，所使用的脫水催化劑具有+1至-10，優(yōu)選地+2至-8.2，和更優(yōu)選地，在液相脫水的情況下+2至-3，和在氣相脫水的情況下-3至-8.2的H0-值。H0-值相應(yīng)于根據(jù)

的酸性功能(

)，并且通過(guò)所謂的胺滴定和使用指示劑，或通過(guò)氣體形式的堿的吸收來(lái)算出(參見(jiàn)“Studies inSurface Science and Catalytics”，Vol.51，1989“New solid Acidsand Bases，their catalytic Properties”，K.Tannabe等人)。
根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別的實(shí)施方案，作為酸性固體催化劑，使用與無(wú)機(jī)酸，優(yōu)選地與磷酸，或與超酸例如硫酸化或磷酸化的鋯氧化物相接觸的多孔支持體，所述多孔支持體以優(yōu)選地至少90重量％，更優(yōu)選地至少95重量％，和最優(yōu)選地至少99重量％基于硅氧化物，優(yōu)選地基于SiO2。多孔支持體與無(wú)機(jī)酸的接觸優(yōu)選地通過(guò)用酸對(duì)支持體進(jìn)行浸漬來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中優(yōu)選地以相對(duì)于支持體的重量而言10至70重量％，特別優(yōu)選地20至60重量％，和更優(yōu)選地30至50重量％的量，使所述酸與所述多孔支持體相接觸，并隨后進(jìn)行干燥。在干燥后，加熱所述支持體以固定無(wú)機(jī)酸，優(yōu)選地在300至600℃，更優(yōu)選地在400至500℃的溫度下。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別的實(shí)施方案，脫水在氣相中進(jìn)行。在此，可以使用常規(guī)的裝置(如技術(shù)人員已知其用于氣相反應(yīng))，例如管式反應(yīng)器。特別優(yōu)選的是，使用管束熱交換器以及包含熱交換板(Thermobleche)作為熱交換器的反應(yīng)器。
根據(jù)氣相脫水的一個(gè)實(shí)施方案，將純的3-羥基異丁酸引入到反應(yīng)器中，所述反應(yīng)器包含上文所提及的固定床催化劑中的一種。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，將以下列形式的3-羥基異丁酸引入到反應(yīng)器中包含2至80重量％，特別優(yōu)選地5至50重量％，和更加優(yōu)選地10至25重量％的3-羥基異丁酸的水溶液(各基于水溶液的總重量計(jì))。如此地來(lái)選擇反應(yīng)器內(nèi)的壓力和溫度條件，即從而使得3-羥基異丁酸或水溶液在其進(jìn)入反應(yīng)器中時(shí)以氣態(tài)形式存在。氣相中的脫水優(yōu)選地在200至400℃，特別優(yōu)選地250至350℃的溫度范圍內(nèi)來(lái)進(jìn)行。在氣相脫水的情況下，反應(yīng)器內(nèi)的壓力優(yōu)選地在0.1至50巴的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選地在0.2至10巴的范圍內(nèi)，和最優(yōu)選地在0.5至5巴的范圍內(nèi)。
在氣相脫水的情況下，引入反應(yīng)器中的3-羥基異丁酸的量?jī)?yōu)選地在10至100體積％的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選地在20至100體積％的范圍內(nèi)，和最優(yōu)選地在30至100體積％的范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個(gè)特別的實(shí)施方案，脫水在液相中進(jìn)行。液相脫水同樣可以在技術(shù)人員已知的所有裝置中進(jìn)行，在所述裝置中可以將流體加熱至所希望的反應(yīng)溫度，其中可以向所述裝置施加這樣的壓力，所述壓力足以使反應(yīng)組分在所希望的溫度條件下保持液態(tài)。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別的實(shí)施方案，液相脫水的方法包括第一步驟，在所述步驟中，將純的3-羥基異丁酸或者包含5至100重量％，特別優(yōu)選地20至100重量％和最優(yōu)選地50至100重量％的3-羥基異丁酸的水溶液(基于水溶液的總重量計(jì))引入到反應(yīng)器中。如此地來(lái)選擇反應(yīng)器內(nèi)的壓力和溫度條件，即從而使得3-羥基異丁酸或水溶液在其進(jìn)入反應(yīng)器中時(shí)以液體形式存在。依照根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別的實(shí)施方案(其中脫水在液相中進(jìn)行)，使3-羥基異丁酸或水溶液在脫水反應(yīng)器內(nèi)如此地經(jīng)過(guò)催化劑固定床，從而使得液相滴流經(jīng)過(guò)催化劑顆粒的表面。這樣的程序例如可以在滴流床反應(yīng)器中進(jìn)行。
液相中的脫水優(yōu)選地在200至350℃，特別優(yōu)選地250至300℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。在液相脫水的情況下，反應(yīng)器內(nèi)的壓力優(yōu)選地在1至50巴的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選地在2至25巴的范圍內(nèi)，和最優(yōu)選地在3至10巴的范圍內(nèi)。
不僅在氣相脫水的情況下，而且在液相脫水的情況下，脫水過(guò)程的催化可以均相地或多相地來(lái)進(jìn)行。
在均相催化的情況下，首先將催化劑與純的3-羥基異丁酸或者與包含3-羥基異丁酸的水溶液相接觸，在此所述催化劑優(yōu)選地為無(wú)機(jī)酸例如磷酸或硫酸。隨后，將如此獲得的組合物引入反應(yīng)器中，并在所希望的壓力和溫度條件下轉(zhuǎn)變成甲基丙烯酸。還可以考慮獨(dú)立于3-羥基異丁酸或所述水溶液地將無(wú)機(jī)酸引入反應(yīng)器中。在該情況下，反應(yīng)器具有至少兩個(gè)輸入管道，一個(gè)用于3-羥基異丁酸或包含3-羥基異丁酸的水溶液，而另一個(gè)用于催化劑。如果在滴流床反應(yīng)器中在液相中進(jìn)行脫水，那么優(yōu)選的是，將催化劑與3-羥基異丁酸或包含3-羥基異丁酸的水溶液一起引入至反應(yīng)器的頂部區(qū)域。
在異相催化的情況下，催化劑在反應(yīng)室中以固體基質(zhì)的形式存在，例如以固定床填料的形式，以涂覆有催化劑的板(優(yōu)選地，被布置于反應(yīng)器內(nèi)的熱交換板)的形式，或者以涂覆有催化劑的反應(yīng)器壁的形式?？赡艿姆磻?yīng)器例如描述于DE-A-198 48 208、DE-A-100 19 381和EP-A-I 234 612中。在異相催化的情況下，作為催化劑，優(yōu)選的是與無(wú)機(jī)酸相接觸的(優(yōu)選地，用無(wú)機(jī)酸浸漬的)多孔支持物。然后，將3-羥基異丁酸或包含3-羥基異丁酸的水溶液以蒸汽或液體形式與固體催化劑材料的表面相接觸。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，3-羥基異丁酸在液相中的脫水，在200至500毫巴的壓力下，在200至230℃的溫度下，并在作為催化劑的堿金屬離子存在下進(jìn)行。
作為在脫水后獲得的反應(yīng)混合物，獲得不含催化劑成分的甲基丙烯酸水溶液(這樣的溶液是在異相催化脫水的情況下獲得的)或者包含催化劑的甲基丙烯酸水溶液(這樣的溶液是在均相催化脫水的情況下獲得的)。此外，甲基丙烯酸水溶液可以以液體形式(如果脫水在液相中進(jìn)行)或者以氣態(tài)形式(如果脫水在氣相中進(jìn)行)存在。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別的實(shí)施方案，可以任選地使如此獲得的甲基丙烯酸溶液進(jìn)行酯化，而無(wú)需進(jìn)一步的處理。在此，使甲基丙烯酸溶液與相應(yīng)的醇(例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或1-丁醇)以及合適的技術(shù)人員已知的酯化催化劑(例如濃酸)在加熱下相接觸，并且以這種方式將甲基丙烯酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的酯。然而，有利的是，還在酯化前對(duì)甲基丙烯酸進(jìn)行純化，其中原則上可以使用技術(shù)人員已知的任何純化方法來(lái)進(jìn)行純化，所述純化方法常規(guī)地用于純化被污染的、通過(guò)丙烯的催化氣相氧化而獲得的(甲基)丙烯酸。
如果脫水在氣相中進(jìn)行，那么優(yōu)選的是，首先使甲基丙烯酸冷凝，從而獲得甲基丙烯酸水溶液。在此，原則上可以使用技術(shù)人員已知的任何冷凝方法，例如分級(jí)冷凝，如在WO-A-2004/035514、WO-A-03/014172或EP-A-EP 1 163 201中所描述的，或者通過(guò)完全冷凝，如在EP-A-0 695 736中所描述的。還可以考慮的是，在冷凝的情況下添加另外的溶劑，特別是水，以便盡可能完全地吸收甲基丙烯酸。
然后，可以在進(jìn)一步的純化步驟中使在冷凝后獲得的甲基丙烯酸水溶液或者在液相脫水的情況下獲得的甲基丙烯酸水溶液去除水和其他污染物。在此，可以首先在共沸劑存在下通過(guò)共沸蒸餾來(lái)除去水，如例如在DE-A-198 53 064中所描述的。還可以考慮的是，使用高沸點(diǎn)有機(jī)溶劑來(lái)吸收甲基丙烯酸，如例如在EP-A-0 974 574中所公開(kāi)的。除了這些蒸餾方法外，還可以使用膜來(lái)進(jìn)行除水，如例如在DE-A-44 01405中所提出的。此外，還可以考慮通過(guò)結(jié)晶方法來(lái)純化在液相脫水的情況下得到的或者通過(guò)冷凝獲得的甲基丙烯酸水溶液。
在除水后獲得的甲基丙烯酸可以在進(jìn)一步的步驟中更進(jìn)一步進(jìn)行純化。因此，可以通過(guò)進(jìn)一步的蒸餾步驟來(lái)去除仍然含有的高沸點(diǎn)污染物。然而，下述情形是特別優(yōu)選的，即通過(guò)結(jié)晶方法來(lái)進(jìn)一步純化在除水后獲得的甲基丙烯酸，如例如在DE-A-101 49 353中所描述的。
然后，任選地，如此獲得的經(jīng)純化的甲基丙烯酸可以經(jīng)歷酯化。
此外，一種用于制備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法為解決開(kāi)頭所述的任務(wù)作出了貢獻(xiàn)，所述方法包括下列步驟 IIA)通過(guò)上文所描述的方法來(lái)制備基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸， IIB)裂解基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸從而形成3-羥基異丁酸，以及任選地，中和3-羥基異丁酸和/或純化3-羥基異丁酸， IIC)使3-羥基異丁酸脫水從而形成甲基丙烯酸，以及任選地，使甲基丙烯酸鹽或甲基丙烯酸酯化。
一種用于制備聚甲基丙烯酸或聚甲基丙烯酸酯的方法也為解決開(kāi)頭所述的任務(wù)作出了貢獻(xiàn)，所述方法包括下列步驟 IIIA)通過(guò)上文所描述的方法來(lái)制備甲基丙烯酸， IIIB)甲基丙烯酸的自由基聚合，其中，任選地，在自由基聚合之前或之后，甲基丙烯酸的羧基基團(tuán)可以至少部分地被酯化。
現(xiàn)在，借助于非限制性的附圖和實(shí)施例來(lái)更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。
圖1顯示了由酶E1所催化的從琥珀酰輔酶A向甲基丙二酰輔酶A的轉(zhuǎn)化。
圖2顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)備選方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，由酶E2至E4所催化的從甲基丙二酰輔酶A向3-羥基異丁酸的轉(zhuǎn)化。
圖3顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)備選方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，由酶E4、E6和E7所催化的從(R)-甲基丙二酰輔酶A向3-羥基異丁酸的轉(zhuǎn)化。
圖4顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第三個(gè)備選方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，由酶E4、E5和E7所催化的從甲基丙二酰輔酶A向3-羥基異丁酸的轉(zhuǎn)化。
圖5顯示了由酶E8和E9所催化的從3-羥基異丁酸向聚羥基鏈烷酸的轉(zhuǎn)化。
圖6顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)、第二個(gè)或第三個(gè)備選方案的一個(gè)特別的布置方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，由酶E10或E11所催化的從磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸向草酰乙酸的轉(zhuǎn)化。
圖7顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)、第二個(gè)或第三個(gè)備選方案的第一個(gè)特別的布置方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，由酶E12至E15所催化的從草酰乙酸向琥珀酰輔酶A的轉(zhuǎn)化。
圖8顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)、第二個(gè)或第三個(gè)備選方案的第二個(gè)特別的布置方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，由酶E13至E16和E24至E26所催化的從草酰乙酸向琥珀酰輔酶A的轉(zhuǎn)化。
圖9顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)、第二個(gè)或第三個(gè)備選方案的第三個(gè)特別的布置方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，由酶E16、E24、E27和E28所催化的從草酰乙酸向琥珀酰輔酶A的轉(zhuǎn)化。
圖10顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第一個(gè)、第二個(gè)或第三個(gè)備選方案的進(jìn)一步的特別的布置方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，由酶E46和E28所催化的從L-谷氨酸向琥珀酰輔酶A的轉(zhuǎn)化。
圖11和12顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)特別的實(shí)施方案的第一個(gè)備選方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的丙酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，由酶E4、E5和E47至E52所催化的從乙酰輔酶A向3-羥基異丁酸的轉(zhuǎn)化。
圖13和14顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)特別的實(shí)施方案的第二個(gè)備選方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的丙酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，由酶E2至E4、E6、E7和E47至E52所催化的從丙酰輔酶A向3-羥基異丁酸的轉(zhuǎn)化。
圖15和16顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)特別的實(shí)施方案的第三個(gè)備選方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的丙酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，由酶E2至E4、E7和E47至E52所催化的從丙酰輔酶A向3-羥基異丁酸的轉(zhuǎn)化。
圖17顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二個(gè)特別的實(shí)施方案的第五個(gè)備選方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的丙酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，由酶E53至E55、E58和E62至E65所催化的從兩個(gè)單元的乙酰輔酶A向乙醛酸和丙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化。
圖18顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第三個(gè)特別的實(shí)施方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的丙烯酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛)，由酶E2至E4、E62、E72和E73所催化的從β-丙氨酸向3-羥基異丁酸的轉(zhuǎn)化。
圖19顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二種變化形式的第一個(gè)特別的實(shí)施方案的第一個(gè)備選方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的異丁酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的3-羥基異丁酰輔酶A)，由酶E76至E79、E60、E61和E8所催化的從丙酮酸向3-羥基異丁酸的轉(zhuǎn)化。
圖20顯示了依照根據(jù)本發(fā)明的方法的第二種變化形式的第一個(gè)特別的實(shí)施方案的第二個(gè)備選方案(其中使用經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中在制備3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸期間，形成作為中間產(chǎn)物的異丁酰輔酶A和作為初產(chǎn)物的3-羥基異丁酰輔酶A)，由酶E8、E60、E61、E79和E80所催化的從L-纈氨酸向3-羥基異丁酸的轉(zhuǎn)化。
圖21顯示了來(lái)自實(shí)施例3的質(zhì)粒pEKEx2MCM cgl。
圖22顯示了來(lái)自實(shí)施例3的載體pGA4_3HIBDH。
圖23顯示了來(lái)自實(shí)施例3的載體pGA5_MMCoAR_3HIBDH。
圖24顯示了來(lái)自實(shí)施例3的載體pECXT99A。
圖25顯示了來(lái)自實(shí)施例3的載體pECXT99A_MMCoAR_3HIBDH。
圖26顯示了在實(shí)施例3中借助于離子色譜法來(lái)檢測(cè)由重組細(xì)胞所進(jìn)行的3-羥基異丁酸的形成。
圖27顯示了離子色譜法檢測(cè)，其表明在圖26中所標(biāo)出的峰為關(guān)于3-羥基異丁酸的峰。
實(shí)施例實(shí)施例1 現(xiàn)在，在實(shí)施例1中借助于這樣的重組細(xì)胞來(lái)闡明本發(fā)明，所述重組細(xì)胞能夠從作為碳源的L-纈氨酸開(kāi)始，經(jīng)由作為初產(chǎn)物的3-羥基異丁酰輔酶A和作為中間產(chǎn)物的異丁酰輔酶A來(lái)產(chǎn)生3-羥基異丁酸。根據(jù)本發(fā)明，可以使用所述細(xì)胞來(lái)制備甲基丙烯酸。為此，在大腸桿菌BL21(DE3)中過(guò)表達(dá)酶EC 2.6.1.42和EC 1.2.4.4(均來(lái)自銅綠假單胞菌)，以及包括三種酶EC 1.3.99.12、EC 4.2.1.17和EC 3.1.2.4(來(lái)自乙酸鈣不動(dòng)桿菌)的簇。
在此，酶EC 1.2.4.4由具有根據(jù)SEQ ID NO07和08(α-和β-亞基)的DNA序列的基因編碼，而酶EC 2.6.1.42由具有根據(jù)SEQ IDNO09的DNA序列的基因編碼。酶EC 1.3.99.12由具有根據(jù)SEQ IDNO10的DNA序列的基因編碼，酶EC 4.2.1.17由具有根據(jù)SEQ ID NO11的DNA序列的基因編碼，和酶EC 3.1.2.4由具有根據(jù)SEQ ID NO12的DNA序列的基因編碼。
1.生物體、質(zhì)粒和寡核苷酸使用下列細(xì)菌菌株、載體、基因組DNA和寡核苷酸來(lái)制備所述重組細(xì)胞表1所使用的細(xì)菌菌株
表2所使用的載體
表3所使用的基因組DNA 表4所使用的寡核苷酸
2.PCR片1.2.4.4(2313kb)和2.6.1.42(958bp)的擴(kuò)增首先，借助于表4中給出的根據(jù)SEQ ID NO15至SEQ ID NO18的引物，從來(lái)自銅綠假單胞菌的總DNA開(kāi)始通過(guò)PCR來(lái)擴(kuò)增出1.2.4.4和2.6.1.42的片段。
3.載體pCDF-Duet-1和PCR片段2.6.1.42(958bp)的消化用EcoRI/SalI切割載體pCDFDuet-1(具有鏈霉素/壯觀霉素抗性)，PCR片段2.6.1.42也同樣如此處理，并用T4連接酶使如此獲得的限制酶切物連接過(guò)夜。獲得載體pCDFDuet::2.6.1.42。
4.將PCR片段克隆到載體pCR2.1-TOPO中根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用載體pCR2.1-TOPO來(lái)制備包含片段2.6.1.42或片段1.2.4.4的克隆載體。用以這種方式獲得的克隆載體pCR2.1-TOPO::1.2.4.4和pCR2.1-TOPO::2.6.1.42來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。由于載體pCR2.1-TOPO具有卡那霉素和氨芐青霉素抗性，因而將其在2AXI和KXI平板上鋪板(20和40μl)。分離出所獲得的克隆的質(zhì)粒，并進(jìn)行消化 pCR2.1-TOPO::1.2.4.4 BgIII+KpnI片段大小2313bp pCR2.1-TOPO::2.6.1.42 EcoRI+SalI片段大小958bp 將所述片段各自從凝膠中洗脫，并用Qiagen試劑盒QIAquick(根據(jù)指導(dǎo))進(jìn)行純化。
5.載體pCDFDuet::2.6.1.42-1.2.4.4的制備將載體pCDFDuet::2.6.1.42以及載體pCR2.1-TOPO::1.2.4.4用BgIII/KpnI進(jìn)行消化。隨后，將pCDFDuet::2.6.1.42(BgIII/KpnI)與pCR2.1-TOPO::1.2.4.4進(jìn)行連接，從而獲得載體pCDFDuet::2.6.1.42-1.2.4.4。用該克隆載體再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。分離出質(zhì)粒。質(zhì)粒pCDFDuet::2.6.1.42-1.2.4.4具有根據(jù)SEQID NO19的DNA序列。
6.來(lái)自乙酸鈣不動(dòng)桿菌的纈氨酸-簇(V-ClusAca)的克隆培養(yǎng)菌株ATCC 33304酸鈣不動(dòng)桿菌(HH瓊脂或培養(yǎng)基)以用于分離總DNA。用Qiagen的試劑盒DNEasy(L1和L2)并通過(guò)包括下列步驟的方法來(lái)進(jìn)行總DNA的分離i)離心1mL培養(yǎng)物，ii)向粒狀沉淀中添加200μL H2O，iii)在95℃下加熱10分鐘，iv)離心(10分鐘，13000rpm)，以及v)移出上清液以用于PCR。
為了從乙酸鈣不動(dòng)桿菌中擴(kuò)增出纈氨酸-簇，使用表4中給出的根據(jù)SEQ ID NO13和SEQ ID NO14的引物進(jìn)行PCR(根據(jù)制造商的指導(dǎo)，使用聚合酶Pfu或Taq)。
將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，并根據(jù)指導(dǎo)連接至質(zhì)粒pET101/D-TOPO，以及引入大腸桿菌DH5α中。獲得質(zhì)粒pET101/D-TOPO::V-簇Aca。質(zhì)粒pET101/D-TOPO::V-簇Aca具有根據(jù)SEQ ID NO20的DNA序列。
7.能夠從L-纈氨酸形成3-羥基異丁酸的重組細(xì)胞的制備用質(zhì)粒pET101/D-TOPO::V-簇Aca和pCDF-Duet::2.6.1.42-1.2.4.4轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(在LB-Spec./Amp培養(yǎng)基上鋪板)。如此獲得的細(xì)胞能夠在包含L-纈氨酸的培養(yǎng)基中將L-纈氨酸轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。與此相反，所述細(xì)胞的野生型(大腸桿菌BL21(DE3))在這樣的培養(yǎng)基中不形成可檢測(cè)量的3-羥基異丁酸。
實(shí)施例2 在該實(shí)施例中，分離出編碼基因的DNA，并在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)該基因。該DNA編碼不僅具有酶E2的活性而且具有酶E3的活性的酶。
1.Sulfolobus tokodaii的培養(yǎng)和收獲在75℃和3.0的pH值下，在搖動(dòng)(150rpm)下，以小的培養(yǎng)體積(40-200ml)使Sulfolobus tokodaii進(jìn)行生長(zhǎng)。采用光度法通過(guò)測(cè)量578nm處的光密度(OD578nm)來(lái)監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)。使用經(jīng)改良的Sulfolobus-培養(yǎng)基(根據(jù)Brock等人，Archives of Microbiology 84，第54-68頁(yè)，1972；Suzuki等人，Extremophiles，6，第39-44頁(yè)，2002進(jìn)行改良)。酵母提取物、酪蛋白氨基酸和葡萄糖充當(dāng)能源和碳源。該培養(yǎng)基由下列組分組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基、葡萄糖儲(chǔ)液、鐵儲(chǔ)液和痕量元素儲(chǔ)液。在0.3-0.5的OD578nm(指數(shù)期)時(shí)收獲細(xì)胞。在Sorvall離心機(jī)(SS34轉(zhuǎn)子)中以9000rpm離心15分鐘。將細(xì)胞沉淀直接用于DNA提取。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基。KH2PO4(0.28g/l)、(NH4)2SO4(1.3g/l)、MgSO4×7H2O(0.25g/l)、CaCl2×6H2O(0.07g/l)、酵母提取物(1g/l)和酪蛋白氨基酸(1g/l)。在進(jìn)行高壓滅菌前，用H2SO4將pH值調(diào)整至3.0。
葡萄糖儲(chǔ)液(100倍)。葡萄糖(100g/l)。對(duì)該溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌。
鐵儲(chǔ)液(1000倍)。FeCl3×6H2O(20g/l)。對(duì)該溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌。
痕量元素儲(chǔ)液(1000倍)。MnCl2×4H2O(1.8g/l)、Na2B4O7×10H2O(4.5g/l)、ZnSO4×7H2O(220mg/l)、CuCl2×2H2O(50mg/l)、Na2MoO4×2H2O(30mg/l)、VOSO4×5H2O(30mg/l)、CoCl2×6H2O(8.4mg/l)。將各組分依次溶解在蒸餾H2O中，用HCl將pH值調(diào)整至3.0，并對(duì)該溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌。
2.從S.tokodaii中分離基因組DNA 依照Murray和Thompson的方法(Nucleic Acid Research，8，第4321-4325頁(yè)，1980)進(jìn)行基因組DNA的分離。為此，在1.5mlEppendorf反應(yīng)容器中稱取10-50mg(濕重)新收獲的細(xì)胞，并重懸浮于570ml TE緩沖液(10mM Tris/HCl(pH 8.0)，1mM NaEDTA)中。添加30μl 10％(w/v)SDS溶液(十二烷基硫酸鈉溶液)和3μl蛋白酶K(20μg/μl)，并在52℃下溫育1小時(shí)。此后添加100μl 5M NaCl溶液和80μl經(jīng)預(yù)熱的10％(w/v)鯨蠟基三甲基銨溴化物(CTAB)溶液(10％(w/v)CTAB，在0.7M NaCl中)。在65℃下溫育10分鐘后，用780μl氯仿/異戊醇(24∶1(v/v))提取由CTAB、細(xì)胞壁碎片和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，并在14000rpm下離心15分鐘。將上層水相轉(zhuǎn)移至Eppendorf反應(yīng)容器中，并重復(fù)進(jìn)行提取。在水相沒(méi)有色素后，將其用400μl 100％異丙醇覆蓋。通過(guò)小心地混合兩個(gè)相，染色體DNA在邊界層處沉淀出來(lái)?？梢杂美L(zhǎng)的巴斯德移液管撈出DNA，并在200μl 70％乙醇中進(jìn)行洗滌。在再次進(jìn)行離心(5分鐘，14000rpm)后吸出上清液，將DNA在室溫下干燥2小時(shí)，并最后溶解在100μl TE緩沖液中。
3.丙二酰輔酶A還原酶基因的擴(kuò)增使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(Mullis等人，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.，51，第263-273頁(yè)，1986)，以便從在實(shí)施例2中獲得的Sulfolobus tokodaii基因組DNA開(kāi)始有針對(duì)性地?cái)U(kuò)增出丙二酰-CoA還原酶基因。所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在循環(huán)變溫器(Biometra，

)中進(jìn)行。
采用其中使用Pfu聚合酶(Pfunds，Genaxxon)的制備型PCR。Pfu聚合酶包含3′-5′外切核酸酶(“校正”)功能。
使用下面的引物 5′-ATTATCCCATGGGGAGAACATTAAAAGC-3′(“正向引物”；NcoI切割位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出；SEQ ID NO21)，和 5′-CGGGATCCTTACTTTTCAATATATCC-3′(“反向引物”；BamHI切割位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出；SEQ ID NO22)。
對(duì)于PCR反應(yīng)，使用在下表1中給出的反應(yīng)批料(Ansatz)。作為熱啟動(dòng)PCR來(lái)進(jìn)行所述PCR，即在添加Pfu聚合酶之前，將反應(yīng)批料在95℃下溫育2分鐘。隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)為95℃ 1分鐘，45℃ 1分鐘，和72℃ 5分鐘，接著進(jìn)行最后步驟，其中45℃30秒，72℃ 15分鐘，和最后停留在6℃。
表1用于使用Pfu聚合酶的校正PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)批料(50μl) 獲得長(zhǎng)度為1.1kb的基因片段。
4.丙二酰輔酶A還原酶基因的克隆為了從Sulfolobus tokodaii中克隆出丙二酰輔酶A還原酶基因，用“pCR T7 Topo TA Expression Kit”(Invitrogen，Karlsruhe)將在實(shí)施例3中擴(kuò)增出的基因非特異性地克隆到載體pCR T7/CT-Topo(Invitrogen，Karlsruhe)中。這按照制造商的說(shuō)明來(lái)進(jìn)行。
為了分離質(zhì)粒DNA，依照制造商的指導(dǎo)，用Qiagen的“QIAprepSpin Plasmid Miniprep Kit”(Hilden)，從5ml經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌TOP10F′細(xì)胞的過(guò)夜培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA。
5.表達(dá)載體的制備為了制備包含丙二酰輔酶A還原酶基因的表達(dá)載體，用限制酶NcoI和BamHI對(duì)在實(shí)施例4中獲得的經(jīng)分離的克隆載體進(jìn)行限制酶切消化。為此，將25-27μl質(zhì)粒DNA(表達(dá)載體pTrc99A或裝配有丙二酰輔酶A還原酶基因的pCR T7/CT-Topo載體)與5μl 10倍濃縮反應(yīng)緩沖液和2-3μl限制酶(10U/μl；Fermentas，St.Leon-Rot)充分混合。用蒸餾H2O將該反應(yīng)批料補(bǔ)足至50μl，并在制造商指定的溫度下溫育5小時(shí)。在進(jìn)一步使用前，進(jìn)行乙醇沉淀。為此，將DNA與3個(gè)體積單位的100％乙醇和0.1個(gè)體積單位的3M乙酸鈉緩沖液(pH5.3)相混合，并在-80℃下溫育2小時(shí)或過(guò)夜。在離心步驟(20分鐘，14000rpm，4℃，Eppendorf臺(tái)式離心機(jī))之后，小心地移去上清液，并用3個(gè)體積單位的70％(v/v)乙醇洗滌DNA。在室溫下溫育10分鐘后，再次離心(10分鐘，14000rpm，4℃，Eppendorf臺(tái)式離心機(jī))，并棄去上清液。將DNA在室溫下干燥1小時(shí)，并隨后接納在所希望的體積的H2O或TE緩沖液(10mM Tris/HCl(pH 8，0)，1mM NaEDTA)中。
然后，使用堿性磷酸酶，以便去除線性化的雙鏈載體的5′-磷酸基團(tuán)。以這種方式增加了克隆效率，這是因?yàn)樽柚沽溯d體的重新連接。使用牛小腸堿性磷酸酶來(lái)使經(jīng)消化的載體去磷酸化。
去磷酸化在與限制酶切消化相同的緩沖液中進(jìn)行。將50μl限制酶切批料與1.5μl CIAP(牛小腸堿性磷酸酶)(1U/μl；Fermentas，St.Leon-Rot)相混合，并于37℃溫育30分鐘。在進(jìn)一步使用經(jīng)切割并去磷酸化的載體之前，如上文所描述的進(jìn)行乙醇沉淀。
使用T4 DNA連接酶進(jìn)行插入物DNA與表達(dá)載體的連接，其中以1∶3至1∶6的摩爾比使用質(zhì)粒DNA和插入物DNA。
儲(chǔ)液連接緩沖液(10倍) 0.5M Tris/HCl，pH 7.6 100mM MgCl2 0.5mg/ml BSA 過(guò)濾除菌，在室溫下貯存 5mM ATP(腺苷三磷酸) 總是在無(wú)菌蒸餾H2O中新鮮配制 50mM DTE(二硫赤蘚糖醇) 總是在連接緩沖液中新鮮配制連接批料具有50μl的體積。將質(zhì)粒DNA(2-10μl)、插入物DNA(2-20μl)、5μl具有DTE(50mM)的連接緩沖液和相應(yīng)量的無(wú)菌蒸餾H2O移液在一起，渦旋振蕩，短暫離心，并隨后在45℃下溫育5分鐘。將批料在冰上進(jìn)行冷卻。添加5μl 5mM ATP和1.5μl T4 DNA連接酶(1U/μl；Fermentas；St.Leon-Rot)，并將所得批料進(jìn)行混合。于16℃連接過(guò)夜。
直接使用該連接批料來(lái)轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。
6.用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞從大腸桿菌Rosetta 2細(xì)胞的單個(gè)菌落開(kāi)始，生長(zhǎng)出5ml過(guò)夜培養(yǎng)物。次日早晨，用0.5-1.0ml該培養(yǎng)物接種50ml LB培養(yǎng)基(Sambrook等人，“Molecular CloningA Laboratory Manual”，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)。在培養(yǎng)1.5-2小時(shí)(37℃，搖動(dòng)(180rpm))后，達(dá)到0.6的OD578nm，將細(xì)胞在冰上冷卻10分鐘，并隨后在5000rpm和4℃下離心5分鐘(GSA轉(zhuǎn)子，Sorvall離心機(jī))。棄去上清液，并將細(xì)胞沉淀重懸浮在2.7ml冷的0.1M CaCl2溶液中。在添加2.3ml無(wú)菌的50％(v/v)甘油后，將細(xì)胞懸浮液按份(各300μl)分配入1.5mlEppendorf反應(yīng)容器中。立即將感受態(tài)細(xì)胞在液氮中進(jìn)行冷凍，并隨后貯存于-80℃。
為了轉(zhuǎn)化細(xì)胞，將化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的等分試樣(300μl)在冰上解凍，并摻入25μl連接批料。小心地混合所得的批料，并在冰上溫育30分鐘。在熱激(42℃，1分鐘)后，在冰上再溫育5分鐘。接著添加800μl LB培養(yǎng)基(Sambrook等人，1989)，并將細(xì)胞于37℃搖動(dòng)1小時(shí)(Thermomixer，Eppendorf 5436)。在將該批料涂布在LB培養(yǎng)基上之前，再次濃縮該批料。為此，在10000rpm下離心1分鐘，棄去750μl的上清液，并重懸浮細(xì)胞沉淀。將50μl、100μl和200μl的該經(jīng)濃縮的批料涂布在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB平板(Sambrook等人，1989)上，并于37℃在培養(yǎng)箱中溫育過(guò)夜。用1mlLB培養(yǎng)基洗滌平板。然后，在500ml帶擋板的錐形瓶(Erlenmeyer-Schikanekolben)中用該細(xì)胞懸浮液接種150ml LB培養(yǎng)基(含有100μg/ml氨芐青霉素)。培養(yǎng)物在37℃和180rpm下生長(zhǎng)。在0.6的OD578nm時(shí)，通過(guò)經(jīng)添加0.5M IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖糖苷)而誘導(dǎo)pTrc99A中的啟動(dòng)子來(lái)進(jìn)行過(guò)表達(dá)。將經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物在所述條件下溫育3小時(shí)，然后在OD578nm＝2.7時(shí)進(jìn)行收獲。
7.酶活性的檢測(cè) 借助于細(xì)胞破碎裝置將在實(shí)施例6中獲得的大腸桿菌菌株破碎。將細(xì)胞破碎物在85℃下加熱15分鐘。在該加熱沉淀期間，非熱穩(wěn)定的酶凝固并沉淀下來(lái)。由于目標(biāo)蛋白質(zhì)是熱穩(wěn)定的，因而它保留在上清液中。為了測(cè)量丙二酰輔酶A還原酶活性，將上清液按1∶50的比例稀釋在TM緩沖液(50mM Tris/Cl，1mM MgCl2，pH 8.1)中。向500μl HIPS緩沖液(100mM HEPES/NaOH，5mM MgCl2，1mM二硫赤蘚糖醇，包含0.5mM NADPH)中，移液入30μl經(jīng)稀釋的或未稀釋的(用于檢測(cè)甲基丙二酰輔酶A還原酶活性)上清液。
在第一批料中，通過(guò)添加丙二酰輔酶A來(lái)開(kāi)始反應(yīng)，其中終濃度為0.5mM。測(cè)得在365nm處的NADPH吸收下降。所測(cè)得的酶活性為15.5μmol/分鐘/mg蛋白質(zhì)(15.5U/mg)。
在第二批料中，通過(guò)添加甲基丙二酰輔酶A(Fluka公司，產(chǎn)品編號(hào)67767)來(lái)開(kāi)始反應(yīng)，其中終濃度為2.0mM。測(cè)得NADPH吸收下降。所測(cè)得的酶活性為0.24μmol/分鐘/mg蛋白質(zhì)(0.24U/mg)。
從這些結(jié)果可以得知，由具有SEQ ID NO03的DNA序列所編碼的多肽，不僅催化丙二酰-CoA的轉(zhuǎn)化而且催化甲基丙二酰輔酶A的轉(zhuǎn)化。
對(duì)于每摩爾所使用的丙二酰-CoA或甲基丙二酰-CoA，氧化了1摩爾NADPH。由此得出結(jié)論所述酶反應(yīng)導(dǎo)致獲得相應(yīng)的半醛。
實(shí)施例3 在實(shí)施例3中，借助于由這樣的重組細(xì)胞制備甲基丙烯酸來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，所述重組細(xì)胞能夠從作為碳源的葡萄糖開(kāi)始，經(jīng)由作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛來(lái)產(chǎn)生3-羥基異丁酸。為此，在谷氨酸棒桿菌ATCC13032中尤其過(guò)表達(dá)了甲基丙二酰輔酶A變位酶(E1)和3-羥基異丁酸脫氫酶(E4)。
1.將基因NCgl1470、NCgl1471和NCgl1472(精氨酸/鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP酶，甲基丙二酰輔酶A變位酶和甲基丙二酰輔酶A變位酶，N-末端結(jié)構(gòu)域/亞基)克隆到pEKEx2中，構(gòu)建pEKEx2MCM cgl 關(guān)于DNA操作，采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如在Sambrook，J.等人，(1989)，“Molecular Cloninga laboratory manual”，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York中所說(shuō)明的。用SAWADY Pwo-DNA聚合酶(Peqlab Biotechnologie，Erlangen，Germany)或Platinum Pfx-DNA-聚合酶(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)來(lái)進(jìn)行DNA擴(kuò)增。當(dāng)沒(méi)有另外說(shuō)明時(shí)，聚合酶的使用按照制造商的說(shuō)明來(lái)進(jìn)行。用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸以及限制酶切位點(diǎn)的引入從MWG-Biotech(Ebersberg，Germany)獲得。所構(gòu)建的菌株的檢測(cè)通過(guò)菌落PCR來(lái)進(jìn)行，其中使用Taq聚合酶READYMIX(Sigma，Taufkirchen，Germany)以及質(zhì)粒制備物。根據(jù)制造商的說(shuō)明，用MinElute凝膠提取試劑盒(Quiagen，Hilden，Germany)來(lái)純化和獲得DNA片段。借助于Qiaprep spin Miniprep試劑盒(Quiagen，Hilden，Germany)來(lái)分離質(zhì)粒DNA。所有構(gòu)建出的質(zhì)粒通過(guò)限制性分析以及隨后的測(cè)序來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。
為了構(gòu)建pEKEx2MCM_cgl，使用載體pEKEx2(Kleinertz等人，1991 Gene 10293)，其允許所克隆的基因在(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖糖苷)(IPTG)可誘導(dǎo)的tac啟動(dòng)子和lac阻抑蛋白系統(tǒng)(lacIq)的控制下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。借助于下面的寡核苷酸和作為模板的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的DNA來(lái)擴(kuò)增編碼基因NCgl1470、NCgl1471和NCgl1472的5.2kb大小的DNA片段 pcg1859-57_正向(SEQ ID NO23) 5′-cggtcgacaaggagatatagataTGACTGATCTCACAAAGACTGC-3′，和 pcg1857-59_反向(SEQ ID NO24) 5′-cTTAGGCTTTGTCGAACGCCTCC-3′。
(與基因組序列互補(bǔ)的序列以大寫(xiě)字母標(biāo)明)。
此外，在擴(kuò)增產(chǎn)物中在起始密碼子前8個(gè)核苷酸處引入限制酶切位點(diǎn)(用下劃線標(biāo)出)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(aaggag)。在此，原始的起始密碼子TTG被替換為ATG。用多核苷酸激酶(Roche，Basel，Switzerland)使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物磷酸化，并將其以平端克隆到載體pUC19的SmaI切割位點(diǎn)中(Yanisch-Perron等人，1985，Gene 33103-19)。5.2kb插入物的身份和正確性通過(guò)測(cè)序來(lái)確認(rèn)。然后，從該pUC19衍生物中分離出5.2kb片段(作為SalI片段)，并連接到載體pEKEx2的SalI切割位點(diǎn)中。根據(jù)限制酶切消化來(lái)選擇具有正確方向的質(zhì)粒，并且將其中一個(gè)命名為pEKEx2MCM cgl。在圖21中顯示了該所獲得的質(zhì)粒。
2.將來(lái)自嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的3-羥基異丁酸脫氫酶克隆到pEKEx2中，構(gòu)建pEC-XT99A MMCoAR 3HIBDH 在考慮了谷氨酸棒桿菌的密碼子使用的情況下來(lái)合成來(lái)自嗜熱棲熱菌(TTHA0237)的3-羥基異丁酸脫氫酶(3HIBDH)的基因。將該在密碼子使用方面經(jīng)優(yōu)化的基因(SEQ ID NO25)合成入載體pGA4中(pGA4_3HIBDH，圖22)。通過(guò)用內(nèi)切核酸酶KpnI和Ecl136II消化載體pGA4_3HIBDH，將3HIBDH的基因連接到用限制酶BamHI(和隨后的補(bǔ)平反應(yīng))和KpnI線性化的載體pGA5_MMCoAR中，所述載體已經(jīng)包含有處于T7啟動(dòng)子的功能性表達(dá)控制下的從來(lái)自Sulfolobustokodaii的甲基丙二酰輔酶A變位酶推導(dǎo)出的序列。所得到的載體pGA5_MMCoAR_3HIBDH描繪在圖23中。
通過(guò)用KpnI和Ecl136II進(jìn)行消化，從載體pGA5_MMCoAR_3HIBDH中，將具有甲基丙二酰輔酶A還原酶和3HIBDH的插入片段克隆到通過(guò)用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI(和隨后的補(bǔ)平反應(yīng))和KpnI進(jìn)行消化而線性化的目標(biāo)載體pECXT99A(登錄號(hào)AY219684，圖24)中(所得到的載體pECXT99A_MMCoAR_3HIBDH，圖25)。
3.用pEKEx2MCM cgl和pEC-XT99A 3HIBDH varIIMMCoAR轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒桿菌細(xì)胞的制備如Tauch等人所描述的(Curr Microbiol.2002，45362-367)來(lái)進(jìn)行谷氨酸棒桿菌ATCC13032的感受態(tài)細(xì)胞的制備。借助于電穿孔來(lái)引入pE-KEx2MCM_cgl和pEC-XT99A_3HIBDH_varIIMMCoAR的DNA，并且將轉(zhuǎn)化體在Merck公司(Darmstadt，Deutschland)的腦心瓊脂(補(bǔ)充有50mg/l卡那霉素和5mg/l四環(huán)素)上進(jìn)行選擇(Liebl等人，F(xiàn)EMS Microbiol Lett.，1989，53299-303)。從轉(zhuǎn)化體中分離出質(zhì)粒DNA，并且借助于限制酶切消化來(lái)進(jìn)行表征。以這種方式，獲得了谷氨酸棒桿菌pEKEx2MCM_cgl/pEC-XT99A_3HIBDH_varIIMMCoAR。
4.進(jìn)行培養(yǎng)和制備3-羥基異丁酸將谷氨酸棒桿菌pEKEx2MCM_cgl/pEC-XT99A_3HIBDH_varIIMMCoAR的單個(gè)菌落接種在25ml含有15μg/l卡那霉素和5μg/l四環(huán)素的完全培養(yǎng)基(腦心培養(yǎng)基)中，并在30℃和200rpm下培養(yǎng)過(guò)夜。作為對(duì)照，使野生型在沒(méi)有抗生素的情況下生長(zhǎng)。
將培養(yǎng)物進(jìn)行離心(10分鐘，4℃，5292×g)并用鹽水(0.9％NaCl)進(jìn)行洗滌。將細(xì)胞重懸浮在25ml(在250ml燒瓶)含有抗生素(15μg/l卡那霉素和5μg/l四環(huán)素)的GCXII培養(yǎng)基中。用0.5mM(12.5μl的1M儲(chǔ)液)IPTG來(lái)誘導(dǎo)攜帶質(zhì)粒的菌株。
基本培養(yǎng)基CGXII(根據(jù)Keilhauer等人，J Bacteriol.1993，1755595-5603) 20g(NH4)2SO4 5g 尿素 1g K2HPO4 1g KH2PO4 42g MOPS 1ml MgSO4×7H2O(25g/100ml，過(guò)濾除菌) 1ml CaCl2×2H2O(1.32g/100ml，過(guò)濾除菌) 將所述鹽溶解在約800ml重蒸餾水中并用KOH將pH調(diào)整至7。為此，添加約20-25顆KOH丸粒，隨后用10N KOH滴定至pH 7。然后，用重蒸餾水將所述培養(yǎng)基成分補(bǔ)足至約900ml，并進(jìn)行高壓滅菌。
在高壓滅菌后，添加1ml痕量元素鹽溶液。
痕量元素鹽溶液 1g FeSO4×7H2O 1g MnSO4×H2O 0.1g ZnSO4×7H2O 0.02gCuSO4 0.002g NiCl2×6H2O 將所述鹽溶解在100ml去離子H2O中，并且在此用HCl進(jìn)行酸化(pH-試紙，約pH 1)。接著，對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌。
向該培養(yǎng)基中添加100ml 50％的葡萄糖(終濃度5％)，若為了得到4％的終濃度則添加80ml 50％的葡萄糖和20ml無(wú)菌的重蒸餾水。
給該培養(yǎng)基補(bǔ)充1ml生物素(20mg/100ml)、60μg/l輔酶B12(7小時(shí)后)、0.1mM丙酸鹽(22小時(shí)后)和痕量元素鹽溶液。
在27小時(shí)后，通過(guò)離子色譜法(具有自動(dòng)進(jìn)樣器的MetrohmCompact IC 761，流動(dòng)相8mM NaOH；柱Dionex AS15 4×250mm+前置柱AG15 4×50mm；柱溫25℃，流速1.4mL/分鐘；檢測(cè)器電導(dǎo)率；注射體積10μl；運(yùn)行時(shí)間30分鐘)在樣品中可以檢測(cè)到6mg/l的3-羥基異丁酸(圖26)。通過(guò)增添化學(xué)純的3-羥基異丁酸(30mg/l)來(lái)確認(rèn)所得3-羥基異丁酸的身份(圖27)。
5.將3-羥基異丁酸脫水成甲基丙烯酸在攪拌下向5ml根據(jù)上面實(shí)施例4所產(chǎn)生的3-羥基異丁酸溶液(0.2g/L)中摻入NaOH(0.06mg)。在真空下(300托)于185-195℃在攪拌和回流冷凝下使該溶液進(jìn)行溫育。在5小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)，每小時(shí)再次添加在5mL中的0.5mg 3-羥基異丁酸。該溶液包含0.4重量％的對(duì)甲氧基苯酚，以防止甲基丙烯酸聚合。在溫育24小時(shí)后，結(jié)束反應(yīng)。3-羥基異丁酸向甲基丙烯酸的轉(zhuǎn)化合計(jì)超過(guò)90％。通過(guò)蒸餾從該反應(yīng)批料中分離出甲基丙烯酸。
實(shí)施例4 在實(shí)施例4中，借助于由這樣的重組大腸桿菌細(xì)胞制備甲基丙烯酸來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，所述重組大腸桿菌細(xì)胞能夠經(jīng)由作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛和經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的丙烯酰輔酶A來(lái)形成3-羥基異丁酸。
為了用重組大腸桿菌細(xì)胞將C-源甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸，將七種不同酶的基因克隆到一系列表達(dá)質(zhì)粒中。為此，采用Duet載體(Merck，Deutschland)。這是具有四種表達(dá)載體的系統(tǒng)，這些表達(dá)載體都是彼此相容的，而且具有不同的抗生素抗性標(biāo)記。
1.具體而言，為了將甘油轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸，將編碼下列酶的基因克隆到表達(dá)載體中 a)來(lái)自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脫水酶(EC 4.2.1.30)(GD)。該酶催化甘油的依賴于腺苷酰鈷胺素的脫水而形成3-HPA(3-羥基丙醛)。它由3個(gè)亞基(GD-α、GD-β和GD-γ)組成，這些亞基在肺炎克雷伯氏菌中由處于一個(gè)操縱子中的3個(gè)基因(gldA、gldB和gldC)編碼。
b)來(lái)自肺炎克雷伯氏菌的再活化因子。由于甘油使依賴于腺苷酰鈷胺素的甘油脫水酶失活，因此為了將甘油轉(zhuǎn)化為3-HPA，另外還需要再活化因子的活性。來(lái)自肺炎克雷伯氏菌的用于甘油脫水酶的再活化因子由基因gdrA和gdrB編碼。
c)來(lái)自大腸桿菌的醛脫氫酶AldH。為了將3-HPA轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸(3-HP)，擴(kuò)增大腸桿菌aldH基因。
d)來(lái)自橙色綠屈撓菌的丙酰輔酶A合酶(Pcs)(由基因pcs編碼)。丙酰輔酶A合酶催化3-HP轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A。它為三功能酶，并且包含三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。?；o酶A合成酶(ACS)結(jié)構(gòu)域催化3-HP激活為3-羥基丙酰-CoA。在這之后，Pcs的烯酰-CoA水合酶(ECH)結(jié)構(gòu)域催化脫水為丙烯酰-CoA。最后，Pcs的烯酰-CoA還原酶(ECR)結(jié)構(gòu)域催化丙烯酰-CoA的依賴于NADPH的還原而形成丙酰-CoA。然而，該反應(yīng)對(duì)于所描述的計(jì)劃而言是不相關(guān)的，因?yàn)樵诖酥虚g產(chǎn)物丙烯酰-CoA會(huì)立即進(jìn)一步地被下一個(gè)酶(巴豆酰-CoA羧化酶/還原酶，見(jiàn)下文)轉(zhuǎn)化。
e)來(lái)自類球紅細(xì)菌的巴豆酰輔酶A羧化酶/還原酶(酶E62)(Ccr)(由基因ccR編碼)。Ccr的主要活性是將巴豆酰輔酶A還原羧化酶乙基丙二酰-CoA。然而，該酶顯示出寬的底物特異性，并非常有效地將丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶A。
f)來(lái)自Sulfolobus tokodaii的丙二酰-CoA還原酶(Mcr，E，和E3)(由基因Mcr編碼)。Mcr優(yōu)先催化依賴于NADPH的丙二酰輔酶A的還原而形成丙二酸半醛。然而，它還顯示出以甲基丙二酰輔酶A作為底物的副活性，并將其轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛。
g)來(lái)自嗜熱棲熱菌的3-羥基異丁酸脫氫酶(E4)(3-HIB-DH)(由基因MmsB編碼)。該酶催化甲基丙二酸半醛依賴于NADPH地可逆地轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸(3-HIB)。
2.在下文中詳細(xì)地描述了用于上面所描述的酶的異源過(guò)表達(dá)的克隆策略。
a)用于過(guò)表達(dá)甘油脫水酶再活化因子(GDRF)的質(zhì)粒pACYCDuet-KpGDRF的構(gòu)建首先，借助于PCR來(lái)擴(kuò)增基因gdrA(異名ORF4)和gdrB(異名ORF2b)，它們編碼肺炎克雷伯氏菌GDRF的兩個(gè)亞基。使用肺炎克雷伯氏菌菌株DSM2026的染色體DNA作為模板。
使用下面的寡核苷酸來(lái)擴(kuò)增gdrA orf4fw(SEQ ID NO26) 5′-TGAAGATCCTAGGAGGTTTAAACATATGCCGTTAATAGCCGGGATTG-3′ orf4Salrv(SEQ ID NO27) 5′-TATATAGTCGACTTAATTCGCCTGACCGGCCAG-3′ (SalI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)。
使用下面的寡核苷酸來(lái)擴(kuò)增gdrB orf2bPcifw(SEQ ID NO28) 5′-TATATAACATGTCGCTTTCACCGCCAGGC-3′ (PciI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出) orf2brv(SEQ ID NO29) 5′-CATATGTTTAAACCTCCTAGGATCTTCAGTTTCTCTCACTTAACGGCAGG-3′。
隨后，將所獲得的PCR產(chǎn)物通過(guò)交叉PCR(Crossover-PCR)而融合在一起。
為此，使用下面的寡核苷酸 orf2bNcofw(SEQ ID NO30) 5′-TATATACCATGGCGCTTTCACCGCCAGGC-3′ (NcoI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出) orf4Salrv(SEQ ID NO31) 5′-TATATAGTCGACTTAATTCGCCTGACCGGCCAG-3′ (SalI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)。
根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，借助于Qiagen，Hilden的QIAquick-PCR純化試劑盒來(lái)純化PCR產(chǎn)物(2220bp)，并連接到載體pCR-BluntII-TOPO中，從而獲得pCR-BluntII-Topo-KpGDRF載體。根據(jù)制造商Invitrogen Corporation，Carlsbad(Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑盒)的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行連接以及隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞中。
然后，通過(guò)用PciI和SalI消化pCR-BluntII-Topo-KpGDRF而將GDRF序列從該載體中切出，并連接到用NcoI和SalI切割的pACYC-Duet表達(dá)載體中，從而獲得pACYCDuet-KpGDRF(6142bp)。
b)用于過(guò)表達(dá)肺炎克雷伯氏菌甘油脫水酶(GD)和大腸桿菌醛脫氫酶aldH的質(zhì)粒pAS50_Ec_aldH的構(gòu)建肺炎克雷伯氏菌GD的三個(gè)亞基天然地組織在一個(gè)操縱子中(基因gldA、gldB和gldC)。借助于PCR來(lái)擴(kuò)增它們，其中仍使用肺炎克雷伯氏菌DSM2026的染色體DNA作為模板。
使用下面的寡核苷酸來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增 KpGDNdefw(SEQ ID NO32) 5′-TATATACATATGAAAAGATCAAAACGATTTGCAGTACTGG-3′ (NdeI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出) KpGDSalrv(SEQ ID NO33) 5′-TATATAGTCGACTTAGCTTCCTTTACGCAGCTTATGC-3′ (SalI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)。
將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到載體pCR-BluntII-TOPO中，從而獲得pCR-BluntII-Topo-KpGD載體。根據(jù)制造商Invitrogen Corporation，Carlsbad(Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑盒)的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行連接以及隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞中。
用XbaI(通過(guò)Klenow補(bǔ)平而使成為平端)和NdeI從載體pCR-BluntII-Topo-KpGD中切出GD編碼片段，并連接到用NdeI和EcoRV切割的pET-Duet表達(dá)載體中，從而獲得質(zhì)粒pAS50(8161bp)。
隨后，擴(kuò)增大腸桿菌aldH基因。為此，使用大腸桿菌K12的染色體DNA作為模板，使用下列寡核苷酸作為PCR引物 1228_ald_fp(SEQ ID NO34) 5′-AAAACATATGAATTTTCATCATCTGGCTTACTGG-3′ (NdeI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)，和 1228_ald_rp(SEQ ID NO35) 5′-AAAACATATGTATATTTCCTTCTTTCAGGCCTCCAGGCTTATCCAGATG-3′ (NdeI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)。
在凝膠上來(lái)純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后通過(guò)NdeI消化連接到質(zhì)粒pAS50的NdeI位點(diǎn)中，從而獲得質(zhì)粒pAS50_Ec_aldH(9666bp)。
c)用于過(guò)表達(dá)橙色綠屈撓菌丙酰輔酶A合酶(Pcs)以及類球紅細(xì)菌巴豆酰輔酶A羧化酶/還原酶(CCR)的質(zhì)粒pCDFDuet-1_Rs_ccR_Cau_pcs的構(gòu)建為了在大腸桿菌中異源表達(dá)CCR以及純化CCR，將所述基因克隆入表達(dá)載體pET3d中，從而獲得質(zhì)粒pTE13通過(guò)使用寡核苷酸ccr-fw(SEQ ID NO36) 5′-GGAGGCAACCATGGCCCTCGACGTGCAGAG-3′ (NcoI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)，和 ccr-rev(SEQ ID NO37) 5′-GAGACTTGCGGATCCCTCCGATCAGGCCTTGC-3′ (BamHI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出) 經(jīng)PCR來(lái)擴(kuò)增類球紅細(xì)菌ccr基因，其中使用類球紅細(xì)菌菌株2.4.1(DSMZ 158)的染色體DNA作為模板。將該P(yáng)CR產(chǎn)物作為NcoI/BamHI片段連接到用NcoI/BamHI切割的載體pET3d(Merck，Deutschland)中，從而獲得質(zhì)粒pTE13。
從pTE13中，將ccr基因作為NcoI/BamHI片段轉(zhuǎn)克隆到質(zhì)粒pCDFDuet-1(Merck，Deutschland)的NcoI/BamHI切割位點(diǎn)中，從而獲得質(zhì)粒pCDFDuet-1_Rs_ccr。
然后，用寡核苷酸 1228_Cau_pcs_fp(71)(SEQ ID NO38) 5′-AAAACATATGATCGACACTGCGCCCCTTGC-3′ (NdeI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)，和 1228_Cau_pcs_rp(74)(SEQ ID NO39) 5′-AAGACGTCCTACCGCTCGCCGGCCGTCC-3′ (AatII識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出) 通過(guò)PCR擴(kuò)增出橙色綠屈撓菌pcs基因，其中使用橙色綠屈撓菌菌株OK-70-fl(DSM 636)的染色體DNA作為模板。在通過(guò)凝膠提取進(jìn)行純化后，通過(guò)NdeI/AatII消化將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到經(jīng)相應(yīng)切割的載體pCDFDuet-1_Rs_ccr中，從而獲得質(zhì)粒pCDFDuet-1_Rs_ccR_Cau_pcs(10472bp)。
d)用于過(guò)表達(dá)Sulfolobus tokodaii丙二酰-CoA還原酶(Mcr)以及嗜熱棲熱菌3-羥基異丁酸脫氫酶(3-HIB-DH)的質(zhì)粒pCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg的構(gòu)建首先，通過(guò)基因合成來(lái)制備在谷氨酸棒桿菌的密碼子使用方面經(jīng)適應(yīng)調(diào)整的S.tokodaii基因mcr的變體(St_mcr_oCg)。在GeneArt公司(Deutschland)進(jìn)行合成，并且以質(zhì)粒pGA4_MMCoAR_ST(SEQ IDNO40)的形式提供人工基因St_mcr_oCg。使用pGA4_MMCoAR_ST DNA作為PCR模板，以便用寡核苷酸 1228_MMCoAR_fp(SEQ ID NO41) 5′-AACCATGGGCCGCACCCTGAAGG-3′ (NcoI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)，和 1228_MMCoAR_rp(SEQ ID NO42) 5′-AAGGATCCTTACTTTTCGATGTAGCCCTTTTCC-3′ (BamHI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出) 來(lái)擴(kuò)增人工基因St_mcr_oCg。在通過(guò)凝膠提取進(jìn)行純化后，用NcoI/BamHI消化擴(kuò)增產(chǎn)物，并連接到質(zhì)粒pCOLADuet_1(Merck，Deutschland)的相應(yīng)切割位點(diǎn)中，從而獲得質(zhì)粒pCOLADuet_St_mcr_oCg。
同樣地，通過(guò)基因合成(GeneArt，Deutschland)提供了在谷氨酸棒桿菌的密碼子使用方面經(jīng)適應(yīng)調(diào)整的嗜熱棲熱菌基因MmsB(編碼3-HIB-DH)的變體，即以質(zhì)粒pGA4_3HIBDH_TT(SEQ ID NO43)的形式。
使用pGA4_3HIBDH_TT作為PCR模板，以便用寡核苷酸1228_Tth_HIBDH_fp(SEQ ID NO44) 5′-AAAACATATGGAAAAGGTGGCATTCATCG-3′ (NdeI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)，和 1228_Tth_HIBDH_rp(SEQ ID NO45) 5′-AAAAGATCTTTAGCGGATTTCCACACCGCC-3′ (BglII識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出) 來(lái)擴(kuò)增人工基因Tth_HIBDH_oCg。在凝膠提取后，用NdeI/BglII切割擴(kuò)增產(chǎn)物，并連接到質(zhì)粒pCOLADuet_St_mcr_oCg的NdeI/BglII切割位點(diǎn)中，從而獲得質(zhì)粒pCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg(5620bp)。
e)然后，根據(jù)制造商的方案，將4種質(zhì)粒pACYCDuet-KpGDRF、pAS50_Ec_aldH、pCDFDuet-1_Rs_ccR_Cau_pcs和pCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg共轉(zhuǎn)化到商購(gòu)可得的通過(guò)化學(xué)方法成為感受態(tài)的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞(Merck，Deutschland)中。在補(bǔ)充有氨芐青霉素(25μg/ml)、氯霉素(17μg/ml)、卡那霉素(15μg/ml)和鏈霉素(25μg/ml)的LB瓊脂上進(jìn)行選擇。
f)在大腸桿菌中表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo) 將在上面e)中所描述的攜帶有質(zhì)粒的大腸桿菌菌株在經(jīng)修飾的M9培養(yǎng)基(6.8g/l Na2HPO4×2H2O；3g/l KH2PO4；0.5g/l NaCl；1g/l NH4Cl；1.25g/l酵母提取物；1％v/v甘油；15mg/l CaCl2×2H2O；250mg/l MgSO4×7H2O；1％v/v Gibco MEM維生素溶液；41.9g/l MOPE)中進(jìn)行培養(yǎng)。該培養(yǎng)基補(bǔ)充有氨芐青霉素(25μg/ml)、氯霉素(17μg/ml)、卡那霉素(15μg/ml)和鏈霉素(25μg/ml)。于37℃在溫控?fù)u床上進(jìn)行整個(gè)培養(yǎng)(預(yù)培養(yǎng)和主培養(yǎng))。首先，將菌株在5ml培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。然后，從過(guò)夜培養(yǎng)物中，以1∶20的比例將20ml培養(yǎng)基接種到100ml的帶擋板的燒瓶(Schikanekolben)中，并繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)達(dá)到大約0.8的OD600時(shí)，添加6μM鈷胺素和1μM IPTG，并繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。在該時(shí)間點(diǎn)，取出2.5ml細(xì)胞懸浮液，并貯存于-20℃直至進(jìn)行分析。
g)借助于離子色譜法(IC)和電導(dǎo)率檢測(cè)來(lái)進(jìn)行3-HIB的檢測(cè)和定量。為此，在室溫下解凍2.5ml的樣品，并離心(10分鐘，13,200rpm)。使用噴霧過(guò)濾器(Sprttzenfilter)(孔徑大小0.44μm)來(lái)純化上清液。用具有自動(dòng)進(jìn)樣器的Metrohm Compact IC 761進(jìn)行測(cè)量。流動(dòng)相8mM NaOH。柱Dionex AS15 4×250mm，前置柱AG154×50mm。柱溫25℃。流速1.4ml/分鐘。注射體積10μl。
h)將3-羥基異丁酸脫水成甲基丙烯酸在攪拌下向5ml濃縮的3-羥基異丁酸溶液(根據(jù)上面的在f)中所描述的方法而產(chǎn)生的)(0.2g/L)中摻入NaOH(0.06mg)。在真空下(300托)于185-195℃在攪拌和回流冷凝下使該溶液進(jìn)行溫育。在5小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)，每小時(shí)再次添加在5mL中的0.5mg 3-羥基異丁酸。該溶液包含0.4重量％的對(duì)甲氧基苯酚，以防止甲基丙烯酸聚合。在溫育24小時(shí)后，結(jié)束反應(yīng)。3-羥基異丁酸向甲基丙烯酸的轉(zhuǎn)化合計(jì)超過(guò)90％。通過(guò)蒸餾從該反應(yīng)批料中分離出甲基丙烯酸。
序列表
<110>Evonik Degussa GmbH
<120>用于制備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法
<130>2008P00165WO
<160>45
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>2214
<212>DNA
<213>谷氨酸棒桿菌ATCC 13032
<400>1
atgacgtcga tccctaattt ttcagacatc ccattgactg ctgagacacg tgcatcggag 60
tcacacaacg ttgacgccgg caaggtgtgg aacactcccg aaggcattga tgtcaagcgc120
gtattcacgc aggctgaccg cgacgaggcg caagcggcgg gacatccggt ggattctttg180
ccaggtcaaa agccatttat gcgcgggccg tacccaacta tgtacaccaa tcagccgtgg240
acgattcgcc agtacgcagg cttttcaacc gccgcggaat ccaatgcgtt ttatcggagg300
aaccttgctg cgggtcaaaa aggtttgtcg gttgcgttcg atctagcgac ccaccgcggt360
tatgactcgg ataatgagcg cgtggtcggc gatgtgggta tggccggcgt ggcgattgat420
tcgattttgg atatgcgtca gctgtttgat ggcattgatt tgtccagcgt gtcggtgtcg480
atgaccatga atggcgctgt gctgccgatt cttgcgttct atatcgtggc ggctgaggaa540
caaggtgtgg gtccggagca gcttgcgggc acgatccaga atgacatctt gaaagaattt600
atggtgcgca acacctatat ttatccgccg aagccgtcga tgcgcatcat ttccaacatc660
tttgagtaca cctccttgaa gatgccacgt tttaactcca tttcgatttc tggctatcac720
atccaggaag cgggagcgac tgccgatttg gagctggcct acactctggc ggatggtatt780
gaatacatcc gtgcaggtaa agaggtaggc cttgacgtgg ataagttcgc gcctcgtctg 840
tccttcttct ggggtatttc tatgtacacc ttcatggaga tcgcaaagct gcgtgcggga 900
cgactgctgt ggagcgagtt ggtggcaaaa ttcgatccga aaaacgccaa gtcccagtcg 960
ctgcgcacgc actcgcagac ctctggttgg tcgttgaccg cgcaggatgt gtacaacaac1020
gtcgcccgca ccgcgattga ggcgatggct gcaacccagg gccacaccca gtcgctgcac1080
accaatgcac ttgatgaggc gttggcgctg cccaccgatt tctctgctcg tatcgcccga1140
aacacccagc tgttgctgca gcaggaatct ggcacggtgc gtccagttga tccatgggcg1200
ggctcctatt acgtggagtg gttgaccaat gagctggcta accgcgcgcg caagcacatc1260
gatgaggtgg aggaagccgg cggaatggcg caggccaccg cgcagggaat tcctaagctg1320
cgcattgagg aatcagcggc acgcacccag gctcgcattg attccggccg ccaggcgctg1380
atcggcgtga atcgctacgt ggcggaagaa gatgaggaaa ttgaagtcct caaggttgac1440
aacaccaagg ttcgcgcaga acagttggct aaactcgcgc aactgaaagc agagcgcaac1500
gatgcggaag tcaaggctgc gctggatgcg ttgacagctg ctgcccgcaa cgagcataaa1560
gagccagggg atttggatca gaacctgctc aaacttgccg tcgatgctgc gcgcgcaaaa1620
gctaccattg gagagatctc cgatgctttg gaagttgtct ttggccgcca cgaagcagaa1680
atcaggacgc tgtctggcgt gtacaaggat gaggttggaa aggaaggcac agtgagcaac1740
gtcgaacgcg cgatcgccct ggctgacgcc tttgaggctg aggaaggccg ccgcccacgt1800
atctttattg ccaagatggg ccaggatgga catgaccgtg gacagaaggt tgtcgcgtct1860
gcctatgctg acctgggcat ggacgtggat gttggaccgc tgtttcaaac tccagccgaa1920
gctgcccgcg ccgccgtgga cgccgatgtt cacgtggtgg gtatgtcttc gctggcagca1980
ggccacctca ccttgctgcc cgagctgaag aaagaacttg cagctcttgg ccgcgatgac2040
attctggtca ccgtgggcgg cgtcattccg ccgggcgatt tccaggatct ctacgatatg2100
ggtgccgccg cgatttaccc tccaggaacc gtcatcgcgg agtcggcgat cgatctgatc 2160
acccgactcg ccgcacacct gggctttgac ctggatgtgg atgtgaatga gtga2214
<210>2
<211>737
<212>PRT
<213>谷氨酸棒桿菌ATCC 13032
<400>2
Met Thr Ser Ile Pro Asn Phe Ser Asp Ile Pro Leu Thr Ala Glu Thr
1 5 10 15
Arg Ala Ser Glu Ser His Asn Val Asp Ala Gly Lys Val Trp Asn Thr
20 25 30
Pro Glu Gly Ile Asp Val Lys Arg Val Phe Thr Gln Ala Asp Arg Asp
35 40 45
Glu Ala Gln Ala Ala Gly His Pro Val Asp Ser Leu Pro Gly Gln Lys
50 55 60
Pro Phe Met Arg Gly Pro Tyr Pro Thr Met Tyr Thr Asn Gln Pro Trp
65 70 75 80
Thr Ile Arg Gln Tyr Ala Gly Phe Ser Thr Ala Ala Glu Ser Asn Ala
85 90 95
Phe Tyr Arg Arg Asn Leu Ala Ala Gly Gln Lys Gly Leu Ser Val Ala
100 105 110
Phe Asp Leu Ala Thr His Arg Gly Tyr Asp Ser Asp Asn Glu Arg Val
115 120 125
Val Gly Asp Val Gly Met Ala Gly Val Ala Ile Asp Ser Ile Leu Asp
130 135 140
Met Arg Gln Leu Phe Asp Gly Ile Asp Leu Ser Ser Val Ser Val Ser
145 150 155 160
Met Thr Met Asn Gly Ala Val Leu Pro Ile Leu Ala Phe Tyr Ile Val
165 170 175
Ala Ala Glu Glu Gln Gly Val Gly Pro Glu Gln Leu Ala Gly Thr Ile
180 185 190
Gln Asn Asp Ile Leu Lys Glu Phe Met Val Arg Asn Thr Tyr Ile Tyr
195 200 205
Pro Pro Lys Pro Ser Met Arg Ile Ile Ser Asn Ile Phe Glu Tyr Thr
210 215 220
Ser Leu Lys Met Pro Arg Phe Asn Ser Ile Ser Ile Ser Gly Tyr His
225 230 235 240
Ile Gln Glu Ala Gly Ala Thr Ala Asp Leu Glu Leu Ala Tyr Thr Leu
245 250 255
Ala Asp Gly Ile Glu Tyr Ile Arg Ala Gly Lys Glu Val Gly Leu Asp
260 265 270
Val Asp Lys Phe Ala Pro Arg Leu Ser Phe Phe Trp Gly Ile Ser Met
275 280 285
Tyr Thr Phe Met Glu Ile Ala Lys Leu Arg Ala Gly Arg Leu Leu Trp
290 295 300
Ser Glu Leu Val Ala Lys Phe Asp Pro Lys Asn Ala Lys Ser Gln Ser
305 310 315 320
Leu Arg Thr His Ser Gln Thr Ser Gly Trp Ser Leu Thr Ala Gln Asp
325 330 335
Val Tyr Asn Asn Val Ala Arg Thr Ala Ile Glu Ala Met Ala Ala Thr
340 345 350
Gln Gly His Thr Gln Ser Leu His Thr Asn Ala Leu Asp Glu Ala Leu
355 360 365
Ala Leu Pro Thr Asp Phe Ser Ala Arg Ile Ala Arg Asn Thr Gln Leu
370 375 380
Leu Leu Gln Gln Glu Ser Gly Thr Val Arg Pro Val Asp Pro Trp Ala
385 390 395 400
Gly Ser Tyr Tyr Val Glu Trp Leu Thr Asn Glu Leu Ala Asn Arg Ala
405 410 415
Arg Lys His Ile Asp Glu Val Glu Glu Ala Gly Gly Met Ala Gln Ala
420 425 430
Thr Ala Gln Gly Ile Pro Lys Leu Arg Ile Glu Glu Ser Ala Ala Arg
435 440 445
Thr Gln Ala Arg Ile Asp Ser Gly Arg Gln Ala Leu Ile Gly Val Asn
450 455 460
Arg Tyr Val Ala Glu Glu Asp Glu Glu Ile Glu Val Leu Lys Val Asp
465 470 475 480
Asn Thr Lys Val Arg Ala Glu Gln Leu Ala Lys Leu Ala Gln Leu Lys
485 490 495
Ala Glu Arg Asn Asp Ala Glu Val Lys Ala Ala Leu Asp Ala Leu Thr
500 505 510
Ala Ala Ala Arg Asn Glu His Lys Glu Pro Gly Asp Leu Asp Gln Asn
515 520 525
Leu Leu Lys Leu Ala Val Asp Ala Ala Arg Ala Lys Ala Thr Ile Gly
530 535 540
Glu Ile Ser Asp Ala Leu Glu Val Val Phe Gly Arg His Glu Ala Glu
545 550 555 560
Ile Arg Thr Leu Ser Gly Val Tyr Lys Asp Glu Val Gly Lys Glu Gly
565 570 575
Thr Val Ser Asn Val Glu Arg Ala Ile Ala Leu Ala Asp Ala Phe Glu
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Arg Arg Pro Arg Ile Phe Ile Ala Lys Met Gly Gln
595 600 605
Asp Gly His Asp Arg Gly Gln Lys Val Val Ala Ser Ala Tyr Ala Asp
610 615 620
Leu Gly Met Asp Val Asp Val Gly Pro Leu Phe Gln Thr Pro Ala Glu
625 630 635 640
Ala Ala Arg Ala Ala Val Asp Ala Asp Val His Val Val Gly Met Ser
645 650 655
Ser Leu Ala Ala Gly His Leu Thr Leu Leu Pro Glu Leu Lys Lys Glu
660 665 670
Leu Ala Ala Leu Gly Arg Asp Asp Ile Leu Val Thr Val Gly Gly Val
675 680 685
Ile Pro Pro Gly Asp Phe Gln Asp Leu Tyr Asp Met Gly Ala Ala Ala
690 695 700
Ile Tyr Pro Pro Gly Thr Val Ile Ala Glu Ser Ala Ile Asp Leu Ile
705 710 715 720
Thr Arg Leu Ala Ala His Leu Gly Phe Asp Leu Asp Val Asp Val Asn
725 730 735
Glu
<210>3
<211>1071
<212>DNA
<213>Sulfolobus tokodaii
<400>3
atgaggagaa cattaaaagc cgcaatatta ggtgctactg gtttagtagg aatcgaatac 60
gtaagaatgc tatcaaatca tccttatatt aaaccagcat atttagctgg aaaaggttca120
gtgggtaaac cgtatggtga ggtagtaaga tggcaaacag taggacaagt tcctaaggaa180
atagctgata tggaaataaa accaactgat cctaagttaa tggatgatgt agacataata240
ttttctccat tacctcaagg tgctgctggc ccagtagaag aacaatttgc aaaagaagga300
ttccctgtga ttagtaattc accagatcat agatttgatc ctgatgttcc cttattggtt360
cctgaactaa atcctcatac tattagctta attgatgagc aaagaaaaag aagagaatgg420
aaaggattta tagtaactac accactatgc acagcccagg gtgcagcaat accattaggt 480
gctatattta aagattataa gatggatgga gcatttataa ctactattca atcgctatct 540
ggtgccggtt atccaggaat accatcatta gatgtagtag ataatatctt gcctttaggt 600
gatggatacg atgccaagac gataaaagag atcttcagaa ttttaagcga agttaagaga 660
aatgtagatg aacctaaatt agaagatgta agcttagcag caacaactca tagaatagct 720
actatacatg gtcattatga agtactatat gtatcgttca aagaggaaac tgctgctgaa 780
aaagttaagg agactttaga aaactttaga ggggaaccac aagatctaaa attaccaact 840
gcaccttcaa agccaattat cgttatgaat gaggatacaa gacctcaagt ctattttgat 900
agatgggctg gggatattcc aggaatgagt gtagttgtag gtagattaaa gcaagtgaat 960
aagagaatga taaggttagt atcattaatt cataacacgg tcagaggagc cgcaggagga1020
ggtatattag cagctgaatt acttgtcgaa aaaggatata ttgaaaagta a 1071
<210>4
<211>356
<212>PRT
<213>Sulfolobus tokodaii
<400>4
Met Arg Arg Thr Leu Lys Ala Ala Ile Leu Gly Ala Thr Gly Leu Val
1 5 10 15
Gly Ile Glu Tyr Val Arg Met Leu Ser Asn His Pro Tyr Ile Lys Pro
20 25 30
Ala Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Ser Val Gly Lys Pro Tyr Gly Glu Val
35 40 45
Val Arg Trp Gln Thr Val Gly Gln Val Pro Lys Glu Ile Ala Asp Met
50 55 60
Glu Ile Lys Pro Thr Asp Pro Lys Leu Met Asp Asp Val Asp Ile Ile
65 70 75 80
Phe Ser Pro Leu Pro Gln Gly Ala Ala Gly Pro Val Glu Glu Gln Phe
85 90 95
Ala Lys Glu Gly Phe Pro Val Ile Ser Asn Ser Pro Asp His Arg Phe
100 105 110
Asp Pro Asp Val Pro Leu Leu Val Pro Glu Leu Asn Pro His Thr Ile
115 120 125
Ser Leu Ile Asp Glu Gln Arg Lys Arg Arg Glu Trp Lys Gly Phe Ile
130 135 140
Val Thr Thr Pro Leu Cys Thr Ala Gln Gly Ala Ala Ile Pro Leu Gly
145 150 155 160
Ala Ile Phe Lys Asp Tyr Lys Met Asp Gly Ala Phe Ile Thr Thr Ile
165 170 175
Gln Ser Leu Ser Gly Ala Gly Tyr Pro Gly Ile Pro Ser Leu Asp Val
180 185 190
Val Asp Asn Ile Leu Pro Leu Gly Asp Gly Tyr Asp Ala Lys Thr Ile
195 200 205
Lys Glu Ile Phe Arg Ile Leu Ser Glu Val Lys Arg Asn Val Asp Glu
210 215 220
Pro Lys Leu Glu Asp Val Ser Leu Ala Ala Thr Thr His Arg Ile Ala
225 230 235 240
Thr Ile His Gly His Tyr Glu Val Leu Tyr Val Ser Phe Lys Glu Glu
245 250 255
Thr Ala Ala Glu Lys Val Lys Glu Thr Leu Glu Asn Phe Arg Gly Glu
260 265 270
Pro Gln Asp Leu Lys Leu Pro Thr Ala Pro Ser Lys Pro Ile Ile Val
275 280 285
Met Asn Glu Asp Thr Arg Pro Gln Val Tyr Phe Asp Arg Trp Ala Gly
290 295 300
Asp Ile Pro Gly Met Ser Val Val Val Gly Arg Leu Lys Gln Val Asn
305 310 315 320
Lys Arg Met Ile Arg Leu Val Ser Leu Ile His Asn Thr Val Arg Gly
325 330 335
Ala Ala Gly Gly Gly Ile Leu Ala Ala Glu Leu Leu Val Glu Lys Gly
340 345 350
Tyr Ile Glu Lys
355
<210>5
<211>1293
<212>DNA
<213>類球紅細(xì)菌
<400>5
atggccctcg acgtgcagag cgatatcgtc gcctacgacg cgcccaagaa ggacctctac 60
gagatcggcg agatgccgcc tctcggccat gtgccgaagg agatgtatgc ttgggccatc120
cggcgcgagc gtcatggcga gccggatcag gccatgcaga tcgaggtggt cgagacgccc 180
tcgatcgaca gccacgaggt gctcgttctc gtgatggcgg cgggcgtgaa ctacaacggc 240
atctgggccg gcctcggcgt gcccgtctcg ccgttcgacg gtcacaagca gccctatcac 300
atcgcgggct ccgacgcgtc gggcatcgtc tgggcggtgg gcgacaaggt caagcgctgg 360
aaggtgggcg acgaggtcgt gatccactgc aaccaggacg acggcgacga cgaggaatgc 420
aacggcggcg acccgatgtt ctcgcccacc cagcggatct ggggctacga gacgccggac 480
ggctccttcg cccagttcac ccgcgtgcag gcgcagcagc tgatgaagcg tccgaagcac 540
ctgacctggg aagaggcggc ctgctacacg ctgaccctcg ccaccgccta ccggatgctc 600
ttcggccaca agccgcacga cctgaagccg gggcagaacg tgctggtctg gggcgcctcg 660
ggcggcctcg gctcctacgc gatccagctc atcaacacgg cgggcgccaa tgccatcggc 720
gtcatctcag aggaagacaa gcgcgacttc gtcatggggc tgggcgccaa gggcgtcatc 780
aaccgcaagg acttcaagtg ctggggccag ctgcccaagg tgaactcgcc cgaatataac 840
gagtggctga aggaggcgcg caagttcggc aaggccatct gggacatcac cggcaagggc 900
atcaacgtcg acatggtgtt cgaacatccg ggcgaggcga ccttcccggt ctcgtcgctg 960
gtggtgaaga agggcggcat ggtcgtgatc tgcgcgggca ccaccggctt caactgcacc1020
ttcgacgtcc gctacatgtg gatgcaccag aagcgcctgc agggcagcca tttcgccaac1080
ctcaagcagg cctccgcggc caaccagctg atgatcgagc gccgcctcga tccctgcatg1140
tccgaggtct tcccctgggc cgagatcccg gctgcccata cgaagatgta taagaaccag1200
cacaagcccg gcaacatggc ggtgctggtg caggccccgc gcacggggtt gcgcaccttc1260
gccgacgtgc tcgaggccgg ccgcaaggcc tga 1293
<210>6
<211>430
<212>PRT
<213>類球紅細(xì)菌
<400>6
Met Ala Leu Asp Val Gln Ser Asp Ile Val Ala Tyr Asp Ala Pro Lys
1 5 10 15
Lys Asp Leu Tyr Glu Ile Gly Glu Met Pro Pro Leu Gly His Val Pro
20 25 30
Lys Glu Met Tyr Ala Trp Ala Ile Arg Arg Glu Arg His Gly Glu Pro
35 40 45
Asp Gln Ala Met Gln Ile Glu Val Val Glu Thr Pro Ser Ile Asp Ser
50 55 60
His Glu Val Leu Val Leu Val Met Ala Ala Gly Val Asn Tyr Asn Gly
65 70 75 80
Ile Trp Ala Gly Leu Gly Val Pro Val Ser Pro Phe Asp Gly His Lys
85 90 95
Gln Pro Tyr His Ile Ala Gly Ser Asp Ala Ser Gly Ile Val Trp Ala
100 105 110
Val Gly Asp Lys Val Lys Arg Trp Lys Val Gly Asp Glu Val Val Ile
115 120 125
His Cys Asn Gln Asp Asp Gly Asp Asp Glu Glu Cys Asn Gly Gly Asp
130 135 140
Pro Met Phe Ser Pro Thr Gln Arg Ile Trp Gly Tyr Glu Thr Pro Asp
145 150 155 160
Gly Ser Phe Ala Gln Phe Thr Arg Val Gln Ala Gln Gln Leu Met Lys
165 170 175
Arg Pro Lys His Leu Thr Trp Glu Glu Ala Ala Cys Tyr Thr Leu Thr
180 185 190
Leu Ala Thr Ala Tyr Arg Met Leu Phe Gly His Lys Pro His Asp Leu
195 200 205
Lys Pro Gly Gln Asn Val Leu Val Trp Gly Ala Ser Gly Gly Leu Gly
210 215 220
Ser Tyr Ala Ile Gln Leu Ile Asn Thr Ala Gly Ala Asn Ala Ile Gly
225 230 235 240
Val Ile Ser Glu Glu Asp Lys Arg Asp Phe Val Met Gly Leu Gly Ala
245 250 255
Lys Gly Val Ile Asn Arg Lys Asp Phe Lys Cys Trp Gly Gln Leu Pro
260 265 270
Lys Val Asn Ser Pro Glu Tyr Asn Glu Trp Leu Lys Glu Ala Arg Lys
275 280 285
Phe Gly Lys Ala Ile Trp Asp Ile Thr Gly Lys Gly Ile Asn Val Asp
290 295 300
Met Val Phe Glu His Pro Gly Glu Ala Thr Phe Pro Val Ser Ser Leu
305 310 315 320
Val Val Lys Lys Gly Gly Met Val Val Ile Cys Ala Gly Thr Thr Gly
325 330 335
Phe Asn Cys Thr Phe Asp Val Arg Tyr Met Trp Met His Gln Lys Arg
340 345 350
Leu Gln Gly Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gln Ala Ser Ala Ala Asn
355 360 365
Gln Leu Met Ile Glu Arg Arg Leu Asp Pro Cys Met Ser Glu Val Phe
370 375 380
Pro Trp Ala Glu Ile Pro Ala Ala His Thr Lys Met Tyr Lys Asn Gln
385 390 395 400
His Lys Pro Gly Asn Met Ala Val Leu Val Gln Ala Pro Arg Thr Gly
405 410 415
Leu Arg Thr Phe Ala Asp Val Leu Glu Ala Gly Arg Lys Ala
420 425 430
<210>7
<211>1233
<212>DNA
<213>銅綠假單胞菌
<400>7
atgagtgatt acgagccgtt gcgtctgcat gtcccggagc ccaccgggcg tcctggctgc 60
aagaccgact tttcctatct gcacctgtcc cccgccggcg aggtacgcaa gccgccggtg 120
gatgtcgagc ccgccgagac cagcgacctg gcctacagcc tggtacgtgt gctcgacgac 180
gacggccacg ccgtcggtcc ctggaatccg cagctcagca acgaacaact gctgcgcggc 240
atgcgggcga tgctcaagac ccgcctgttc gacgcgcgca tgctcaccgc gcaacggcag 300
aaaaagcttt ccttctatat gcaatgcctc ggcgaggaag ccatcgccac cgcccacacc 360
ctggccctgc gcgacggcga catgtgcttt ccgacctatc gccagcaagg catcctgatc 420
acccgcgaat acccgctggt ggacatgatc tgccagcttc tctccaacga ggccgacccg 480
ctcaagggcc gccagctgcc gatcatgtac tcgagcaagg aggcaggttt cttctccatc 540
tccggcaacc tcgccaccca gttcatccag gcggtcggct ggggcatggc ctcggcgatc 600
aagggcgaca cgcgcatcgc ctcggcctgg atcggcgacg gcgccaccgc cgagtcggac 660
ttccacaccg ccctcacctt cgcccatgtc taccgcgcgc cggtaatcct caacgtggtc 720
aacaaccagt gggcgatctc caccttccag gccatcgccg gcggcgaagg caccaccttc 780
gccaaccgtg gcgtgggctg cgggatcgcc tcgctgcggg tcgacggcaa tgacttcctg 840
gcggtctacg ccgcctccga gtgggccgcc gagcgcgccc ggcgcaacct cgggccgagc 900
ctgatcgaat gggtcaccta ccgcgccggc ccgcactcga cttcggacga cccgtccaag 960
taccgccccg ccgacgactg gaccaacttc ccgctgggcg acccgatcgc ccgcctgaag 1020
cggcacatga tcggcctcgg catctggtcg gaggaacagc acgaagccac ccacaaggcc 1080
ctcgaagccg aagtactggc cgcgcagaaa caggcggaga gccatggcac cctgatcgac 1140
ggccgggtgc cgagcgccgc cagcatgttc gaggacgtct atgcagaact gccggagcac 1200
ctgcgccggc aacgccagga gctcggggta tga 1233
<210>8
<211>1049
<212>DNA
<213>銅綠假單胞菌
<400>8
atgccatgaa cccgcaacac gagaacgccc agacggtcac cagcatgacc atgatccagg 60
cgctgcgctc ggcgatggac atcatgctcg agcgcgacga cgacgtggtg gtattcggcc 120
aggacgtcgg ctacttcggc ggcgtgttcc gctgcaccga aggcctgcag aagaaatacg 180
gcacctcgcg ggtgttcgat gcgccgatct ccgagagcgg catcatcggc gccgcggtcg 240
gcatgggtgc ctacggcctg cgcccggtgg tggagatcca gttcgccgac tacgtctacc 300
cggcctccga ccagttgatc tccgaggcgg cgcgcctgcg ctatcgctcg gccggcgact 360
tcatcgtgcc gatgaccgta cgcatgccct gtggcggcgg catctacggc gggcaaacgc 420
acagccagag cccggaggcg atgttcaccc aggtctgcgg cctgcgcacg gtgatgccgt 480
ccaaccccta cgacgccaag ggcctgctga tcgcctgcat cgagaacgac gacccggtga 540
tcttcctcga gcccaagcgc ctctacaacg gcccgttcga tggccaccac gaccgcccgg 600
tgacgccctg gtccaagcat ccggccagcc aggtgccgga cggctactac aaggtgccgc 660
tggacaaggc ggcgatcgtc cgccccggcg cggcgctgac cgtgctgacc tacggcacca 720
tggtctacgt ggcccaggcc gcggccgacg agaccggcct ggacgccgag atcatcgacc 780
tgcgcagcct ctggccgctg gacctggaaa ccatcgtcgc ctcggtgaag aagaccggcc 840
gctgcgtcat cgcccacgag gcgacccgca cctgcgggtt cggcgccgag ctgatgtcgc 900
tggtgcagga gcactgcttc caccacctgg aggcgccgat cgagcgcgtc accggttggg 960
acacccccta cccgcatgcc caggagtggg cgtatttccc cggccccgcg cgcgtcggcg 1020
cggcattcaa gcgtgtgatg gaggtctga 1049
<210>9
<211>924
<212>DNA
<213>銅綠假單胞菌
<400>9
atgtcgatgg ccgatcgtga tggcgtgatc tggtatgacg gtgaactggt gcagtggcgc 60
gacgcgacca cgcacgtgct gacccatacc ctgcactatg gaatgggcgt gttcgagggc120
gtgcgcgcct acgacacccc gcagggcacg gcgatcttcc gcctgcaggc gcataccgac180
cggctgttcg actccgcgca catcatgaac atgcagatcc cgtacagccg cgacgagatc240
aacgaggcga cccgcgccgc cgtgcgcgag aacaacctgg aaagcgccta tatccgcccg 300
atggtgttct acggaagcga aggcatgggc ctgcgcgcca gcggcctgaa ggtccatgtg 360
atcatcgccg cctggagctg gggcgcctac atgggcgagg aagccctgca gcaaggcatc 420
aaggtgcgca ccagttcctt cacccgccac cacgtcaaca tctcgatgac ccgcgccaag 480
tccaacggcg cctacatcaa ctcgatgctg gccctccagg aagcgatctc cggcggcgcc 540
gacgaggcca tgatgctcga tccggaaggc tacgtggccg aaggctccgg cgagaacatc 600
ttcatcatca aggatggcgt gatctacacc ccggaagtca ccgcctgcct gaacggcatc 660
actcgtaaca ctatcctgac cctggccgcc gaacacggtt ttaaactggt cgagaagcgc 720
atcacccgcg acgaggtgta catcgccgac gaggccttct tcactggcac tgccgcggaa 780
gtcacgccga tccgcgaagt ggacggtcgc aagatcggcg ccggccgccg tggcccggtc 840
accgaaaagc tgcagaaagc ctatttcgac ctggtcagcg gcaagaccga ggcccacgcc 900
gagtggcgta ccctggtcaa gtaa 924
<210>10
<211>1128
<212>DNA
<213>乙酸鈣不動(dòng)桿菌
<400>10
atgcaattta atgaagaaca gctattaatt caggatatgg cgaaaagttt tgccaatgaa 60
cagattaaat ctaatgcagc agaatgggat aagcatagca tttttccaaa agacgttttg 120
tcccaaatgg ggcaattggg ttttatggga atgctggtga gtgagaaatg gggcggatca 180
aatacaggaa atttagctta tgtgctggca cttgaagaaa tcgctgccgc agatggtgcg 240
acttcaacca ttatgagtgt acataattct gttggctgtg tacccattgc taaatttggt 300
acagaggagc aaaagcagaa atatctagtg cctttagcac aaggtgaaat gatcggtgca 360
tttgctttaa cggaaccaca tacaggttcc gatgccgcag ccattaaaac ccgagcaatt 420
aaacaaggtg atgaatggat tattaatggc gctaaacaat ttataacatc aggtcataat 480
gcgggcgtga ttattgtatt tgctgtgaca gatccgaatg cagggaaaaa agggctgagt 540
gcatttattg tgccgcgtga aaccttgggt tatgaggtga ttcgcaccga agaaaaattg 600
ggtttacatg cgtcagatac gtgccaaatt gctttaacgg atgttcgagt acatcacagc 660
ttaatgcttg gtcaggaagg tgagggacta aaaatagcat tgtctaatct ggaaggtggc 720
cgtattggga ttgcagcgca agccgttggt ttggcacgtg ctgcactaga agaagcgaca 780
aaatatgcca aagagcgtgt gacctttgga aagcctattt ttgagcatca ggcgttagcc 840
tttcgtttag ccagtatggc cacagaaatt gaagcagcac gacaattggt tcattacgca 900
gcgcggctta aagaagctgg aaaaccttgt ttaaatgaag catcaatggc gaaattattt 960
tcatctgaaa tggtcgaacg cgtatgttct gctgctttgc aaatctttgg tggctatggc 1020
tatttaaaag actttcccat cgagcgaatt tatcgtgatg cacgtatttg ccagatttat 1080
gaaggtacaa gtgatattca gcgtttagtg atagcaagaa gcctataa 1128
<210>11
<211>774
<212>DNA
<213>乙酸鈣不動(dòng)桿菌
<400>11
atgacattcg caacaatttt attggaaaaa cgtaagggtg tgggcttgat tacacttaac 60
cgtccaaaag cattaaatgc tttaaactca gaattaattt atgaaataaa tttagcctta 120
gacgatttag aaaatgatca aacgattggt tgtatcgtcc ttacaggttc agaaaaagcc 180
tttgccgcag gtgcggatat caaagaaatg gcagaattaa cttttccaaa tatttatttt 240
gatgattttt ttagtcttgc agatcgtatt gcacagcgtc gtaagccttt aattgccgca 300
gtgagtggtt atgctttagg tggtggctgt gagttagcac tcatgtgtga ctttatttat 360
tgtgccgaca atgccaagtt tgcactacca gaagtaactt taggtgtcat tcctggtatt 420
ggtggaacac agcgtctaac gcttgcaata ggcaaagcca aagccatgga aatgtgtttg 480
actgcacggc aaatgcaggc tgctgaggca gaacaaagtg gtttggtggc acgcgttttt 540
agtaaagaag aacttttaga acaaacctta caggctgccg aaaaaatagc ggaaaaatca 600
cgggtatcta ccataatgat taaagagtca attaatcgag cttttgaagt gagtttagca 660
gagggtttac gttttgagcg ccgaatgttc cattcagttt ttgcgacctt agatcagaaa 720
gaaggcatgc aagcatttat tgataaacgt ccagcccaat ttaaacatca ataa774
<210>12
<211>1029
<212>DNA
<213>乙酸鈣不動(dòng)桿菌
<400>12
atgactacta ctgacaatca tttactcatt gaacataaaa acgctttagg aacaattatt 60
ttaaatcgtc cagcgagtct gaacgcgcta tctctagaaa tgattaatgc gattcgtcaa 120
caagttgagg attggcaagg tgatgtaaat gttcaggcca tattaattaa atcaaatagt 180
cctaaagcat tttgtgcagg tggtgatatt cgctatcttt atgaaagtta taaaagtgga 240
tcagaagagt ataaagatta tttcattgct gaatatgaga tgctcaatag cattcgaacg 300
tctaaaaaaa cagtgattgt tttattggat ggatatgtat tgggtggtgg ttttggttta 360
gcacaggctt gtcatatctt ggtgagtagt gaaaaatcac gattttcaat gccagaaaca 420
gcaataggtt ttttcccaga tgttgcagcg acttatttct tatctcgttt agatgatgtt 480
ggggtatatt tggcactgac tggtgatcaa atcagtagta gtgatgcatt gtatttagat 540
ctgattgatt atcatgttcc gagtcagaat tttgagcgac tagaaaatgc attcagccaa 600
tcacagaact tagataaatt tcatattcag aagattattt ctgcttatat ctccagccct 660
gttcagagtg aactcagtct atggcttgaa gccattcgtc agcattttgg tcttaaaaat720
gtgcaagata tcgaagaaag tttgaaaaat gaacaagatc ccaactatca agtatggaca780
agtaaagtgt taaatacttt gcaacaacgt tcctctattg caaaaaaaac cagtttaaag840
ttacagctgc tagggcgtgg atggtcatta cagcaatgta tgcgtatcga gcgaaaatta900
caggatatct ggtttgaaca tggtgatatg attgagggtg ttcgagcgtt gattattgat960
aaagataaac aaccgcaatg gcagcagcat aatgcgactt tagataatat attaggccaa 1020
ttaggttag 1029
<210>13
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
atgcaattta atgaagaaca gctattaatt c 31
<210>14
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>14
cagtctgaaa tgactaacct aattggc 27
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
acggaattct gaaggagctg gcaactatg 29
<210>16
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
ttgtcgactt acttgaccag ggtacgcc 28
<210>17
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
acagatctgg aggcctgtca tgagtgatta c 31
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
atgggtaccc attcagacct ccatc 25
<210>19
<211>6960
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>新質(zhì)粒
<400>19
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattctga 120
aggagctggc aactatgtcg atggccgatc gtgatggcgt gatctggtat gacggtgaac 180
tggtgcagtg gcgcgacgcg accacgcacg tgctgaccca taccctgcac tatggaatgg 240
gcgtgttcga gggcgtgcgc gcctacgaca ccccgcaggg cacggcgatc ttccgcctgc 300
aggcgcatac cgaccggctg ttcgactccg cgcacatcat gaacatgcag atcccgtaca 360
gccgcgacga gatcaacgag gcgacccgcg ccgccgtgcg cgagaacaac ctggaaagcg 420
cctatatccg cccgatggtg ttctacggaa gcgaaggcat gggcctgcgc gccagcggcc 480
tgaaggtcca tgtgatcatc gccgcctgga gctggggcgc ctacatgggc gaggaagccc 540
tgcagcaagg catcaaggtg cgcaccagtt ccttcacccg ccaccacgtc aacatctcga 600
tgacccgcgc caagtccaac ggcgcctaca tcaactcgat gctggccctc caggaagcga 660
tctccggcgg cgccgacgag gccatgatgc tcgatccgga aggctacgtg gccgaaggct 720
ccggcgagaa catcttcatc atcaaggatg gcgtgatcta caccccggaa gtcaccgcct 780
gcctgaacgg catcactcgt aacactatcc tgaccctggc cgccgaacac ggttttaaac 840
tggtcgagaa gcgcatcacc cgcgacgagg tgtacatcgc cgacgaggcc ttcttcactg 900
gcactgccgc ggaagtcacg ccgatccgcg aagtggacgg tcgcaagatc ggcgccggcc 960
gccgtggccc ggtcaccgaa aagctgcaga aagcctattt cgacctggtc agcggcaaga 1020
ccgaggccca cgccgagtgg cgtaccctgg tcaagtaagt cgacaagctt gcggccgcat1080
aatgcttaag tcgaacagaa agtaatcgta ttgtacacgg ccgcataatc gaaattaata1140
cgactcacta taggggaatt gtgagcggat aacaattccc catcttagta tattagttaa1200
gtataagaag gagatataca tatggcagat ctggaggcct gtcatgagtg attacgagcc1260
gttgcgtctg catgtcccgg agcccaccgg gcgtcctggc tgcaagaccg acttttccta1320
tctgcacctg tcccccgccg gcgaggtacg caagccgccg gtggatgtcg agcccgccga1380
gaccagcgac ctggcctaca gcctggtacg tgtgctcgac gacgacggcc acgccgtcgg1440
tccctggaat ccgcagctca gcaacgaaca actgctgcgc ggcatgcggg cgatgctcaa1500
gacccgcctg ttcgacgcgc gcatgctcac cgcgcaacgg cagaaaaagc tttccttcta1560
tatgcaatgc ctcggcgagg aagccatcgc caccgcccac accctggccc tgcgcgacgg1620
cgacatgtgc tttccgacct atcgccagca aggcatcctg atcacccgcg aatacccgct1680
ggtggacatg atctgccagc ttctctccaa cgaggccgac ccgctcaagg gccgccagct1740
gccgatcatg tactcgagca aggaggcagg tttcttctcc atctccggca acctcgccac1800
ccagttcatc caggcggtcg gctggggcat ggcctcggcg atcaagggcg acacgcgcat1860
cgcctcggcc tggatcggcg acggcgccac cgccgagtcg gacttccaca ccgccctcac1920
cttcgcccat gtctaccgcg cgccggtaat cctcaacgtg gtcaacaacc agtgggcgat1980
ctccaccttc caggccatcg ccggcggcga aggcaccacc ttcgccaacc gtggcgtggg2040
ctgcgggatc gcctcgctgc gggtcgacgg caatgacttc ctggcggtct acgccgcctc2100
cgagtgggcc gccgagcgcg cccggcgcaa cctcgggccg agcctgatcg aatgggtcac2160
ctaccgcgcc ggcccgcact cgacttcgga cgacccgtcc aagtaccgcc ccgccgacga2220
ctggaccaac ttcccgctgg gcgacccgat cgcccgcctg aagcggcaca tgatcggcct2280
cggcatctgg tcggaggaac agcacgaagc cacccacaag gccctcgaag ccgaagtact2340
ggccgcgcag aaacaggcgg agagccatgg caccctgatc gacggccggg tgccgagcgc2400
cgccagcatg ttcgaggacg tctatgcaga actgccggag cacctgcgcc ggcaacgcca2460
ggagctcggg gtatgaatgc catgaacccg caacacgaga acgcccagac ggtcaccagc2520
atgaccatga tccaggcgct gcgctcggcg atggacatca tgctcgagcg cgacgacgac2580
gtggtggtat tcggccagga cgtcggctac ttcggcggcg tgttccgctg caccgaaggc2640
ctgcagaaga aatacggcac ctcgcgggtg ttcgatgcgc cgatctccga gagcggcatc2700
atcggcgccg cggtcggcat gggtgcctac ggcctgcgcc cggtggtgga gatccagttc2760
gccgactacg tctacccggc ctccgaccag ttgatctccg aggcggcgcg cctgcgctat2820
cgctcggccg gcgacttcat cgtgccgatg accgtacgca tgccctgtgg cggcggcatc2880
tacggcgggc aaacgcacag ccagagcccg gaggcgatgt tcacccaggt ctgcggcctg2940
cgcacggtga tgccgtccaa cccctacgac gccaagggcc tgctgatcgc ctgcatcgag3000
aacgacgacc cggtgatctt cctcgagccc aagcgcctct acaacggccc gttcgatggc3060
caccacgacc gcccggtgac gccctggtcc aagcatccgg ccagccaggt gccggacggc3120
tactacaagg tgccgctgga caaggcggcg atcgtccgcc ccggcgcggc gctgaccgtg3180
ctgacctacg gcaccatggt ctacgtggcc caggccgcgg ccgacgagac cggcctggac3240
gccgagatca tcgacctgcg cagcctctgg ccgctggacc tggaaaccat cgtcgcctcg3300
gtgaagaaga ccggccgctg cgtcatcgcc cacgaggcga cccgcacctg cgggttcggc3360
gccgagctga tgtcgctggt gcaggagcac tgcttccacc acctggaggc gccgatcgag3420
cgcgtcaccg gttgggacac cccctacccg catgcccagg agtgggcgta tttccccggc3480
cccgcgcgcg tcggcgcggc attcaagcgt gtgatggagg tctgaatggg taccctcgag3540
tctggtaaag aaaccgctgc tgcgaaattt gaacgccagc acatggactc gtctactagc3600
gcagcttaat taacctaggc tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg3660
gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaacctc aggcatttga gaagcacacg3720
gtcacactgc ttccggtagt caataaaccg gtaaaccagc aatagacata agcggctatt3780
taacgaccct gccctgaacc gacgaccggg tcatcgtggc cggatcttgc ggcccctcgg3840
cttgaacgaa ttgttagaca ttatttgccg actaccttgg tgatctcgcc tttcacgtag3900
tggacaaatt cttccaactg atctgcgcgc gaggccaagc gatcttcttc ttgtccaaga3960
taagcctgtc tagcttcaag tatgacgggc tgatactggg ccggcaggcg ctccattgcc4020
cagtcggcag cgacatcctt cggcgcgatt ttgccggtta ctgcgctgta ccaaatgcgg4080
gacaacgtaa gcactacatt tcgctcatcg ccagcccagt cgggcggcga gttccatagc4140
gttaaggttt catttagcgc ctcaaataga tcctgttcag gaaccggatc aaagagttcc4200
tccgccgctg gacctaccaa ggcaacgcta tgttctcttg cttttgtcag caagatagcc4260
agatcaatgt cgatcgtggc tggctcgaag atacctgcaa gaatgtcatt gcgctgccat4320
tctccaaatt gcagttcgcg cttagctgga taacgccacg gaatgatgtc gtcgtgcaca4380
acaatggtga cttctacagc gcggagaatc tcgctctctc caggggaagc cgaagtttcc4440
aaaaggtcgt tgatcaaagc tcgccgcgtt gtttcatcaa gccttacggt caccgtaacc4500
agcaaatcaa tatcactgtg tggcttcagg ccgccatcca ctgcggagcc gtacaaatgt4560
acggccagca acgtcggttc gagatggcgc tcgatgacgc caactacctc tgatagttga4620
gtcgatactt cggcgatcac cgcttccctc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc4680
atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa4740
caaatagcta gctcactcgg tcgctacgct ccgggcgtga gactgcggcg ggcgctgcgg4800
acacatacaa agttacccac agattccgtg gataagcagg ggactaacat gtgaggcaaa4860
acagcagggc cgcgccggtg gcgtttttcc ataggctccg ccctcctgcc agagttcaca4920
taaacagacg cttttccggt gcatctgtgg gagccgtgag gctcaaccat gaatctgaca4980
gtacgggcga aacccgacag gacttaaaga tccccaccgt ttccggcggg tcgctccctc5040
ttgcgctctc ctgttccgac cctgccgttt accggatacc tgttccgcct ttctccctta5100
cgggaagtgt ggcgctttct catagctcac acactggtat ctcggctcgg tgtaggtcgt5160
tcgctccaag ctgggctgta agcaagaact ccccgttcag cccgactgct gcgccttatc5220
cggtaactgt tcacttgagt ccaacccgga aaagcacggt aaaacgccac tggcagcagc5280
cattggtaac tgggagttcg cagaggattt gtttagctaa acacgcggtt gctcttgaag5340
tgtgcgccaa agtccggcta cactggaagg acagatttgg ttgctgtgct ctgcgaaagc5400
cagttaccac ggttaagcag ttccccaact gacttaacct tcgatcaaac cacctcccca5460
ggtggttttt tcgtttacag ggcaaaagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga5520
tcctttgatc ttttctactg aaccgctcta gatttcagtg caatttatct cttcaaatgt5580
agcacctgaa gtcagcccca tacgatataa gttgtaattc tcatgttagt catgccccgc5640
gcccaccgga aggagctgac tgggttgaag gctctcaagg gcatcggtcg agatcccggt5700
gcctaatgag tgagctaact tacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg5760
ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg5820
cgtattgggc gccagggtgg tttttctttt caccagtgag acgggcaaca gctgattgcc5880
cttcaccgcc tggccctgag agagttgcag caagcggtcc acgctggttt gccccagcag5940
gcgaaaatcc tgtttgatgg tggttaacgg cgggatataa catgagctgt cttcggtatc6000
gtcgtatccc actaccgaga tgtccgcacc aacgcgcagc ccggactcgg taatggcgcg6060
cattgcgccc agcgccatct gatcgttggc aaccagcatc gcagtgggaa cgatgccctc6120
attcagcatt tgcatggttt gttgaaaacc ggacatggca ctccagtcgc cttcccgttc6180
cgctatcggc tgaatttgat tgcgagtgag atatttatgc cagccagcca gacgcagacg6240
cgccgagaca gaacttaatg ggcccgctaa cagcgcgatt tgctggtgac ccaatgcgac 6300
cagatgctcc acgcccagtc gcgtaccgtc ttcatgggag aaaataatac tgttgatggg 6360
tgtctggtca gagacatcaa gaaataacgc cggaacatta gtgcaggcag cttccacagc 6420
aatggcatcc tggtcatcca gcggatagtt aatgatcagc ccactgacgc gttgcgcgag 6480
aagattgtgc accgccgctt tacaggcttc gacgccgctt cgttctacca tcgacaccac 6540
cacgctggca cccagttgat cggcgcgaga tttaatcgcc gcgacaattt gcgacggcgc 6600
gtgcagggcc agactggagg tggcaacgcc aatcagcaac gactgtttgc ccgccagttg 6660
ttgtgccacg cggttgggaa tgtaattcag ctccgccatc gccgcttcca ctttttcccg 6720
cgttttcgca gaaacgtggc tggcctggtt caccacgcgg gaaacggtct gataagagac 6780
accggcatac tctgcgacat cgtataacgt tactggtttc acattcacca ccctgaattg 6840
actctcttcc gggcgctatc atgccatacc gcgaaaggtt ttgcgccatt cgatggtgtc 6900
cgggatctcg acgctctccc ttatgcgact cctgcattag gaaattaata cgactcacta 6960
<210>20
<211>8757
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>新質(zhì)粒
<400>20
caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa 60
acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat 120
ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta 180
gaggatcgag atctcgatcc cgcgaaatta atacgactca ctatagggga attgtgagcg 240
gataacaatt cccctctaga aataattttg tttaacttta agaaggaatt caggagccct 300
tatgcaattt aatgaagaac agctattaat tcaggatatg gcgaaaagtt ttgccaatga 360
acagattaaa tctaatgcag cagaatggga taagcatagc atttttccaa aagacgtttt 420
gtcccaaatg gggcaattgg gttttatggg aatgctggtg agtgagaaat ggggcggatc 480
aaatacagga aatttagctt atgtgctggc acttgaagaa atcgctgccg cagatggtgc 540
gacttcaacc attatgagtg tacataattc tgttggctgt gtacccattg ctaaatttgg 600
tacagaggag caaaagcaga aatatctagt gcctttagca caaggtgaaa tgatcggtgc 660
atttgcttta acggaaccac atacaggttc cgatgccgca gccattaaaa cccgagcaat 720
taaacaaggt gatgaatgga ttattaatgg cgctaaacaa tttataacat caggtcataa 780
tgcgggcgtg attattgtat ttgctgtgac agatccgaat gcagggaaaa aagggctgag 840
tgcatttatt gtgccgcgtg aaaccttggg ttatgaggtg attcgcaccg aagaaaaatt 900
gggtttacat gcgtcagata cgtgccaaat tgctttaacg gatgttcgag tacatcacag 960
cttaatgctt ggtcaggaag gtgagggact aaaaatagca ttgtctaatc tggaaggtgg1020
ccgtattggg attgcagcgc aagccgttgg tttggcacgt gctgcactag aagaagcgac1080
aaaatatgcc aaagagcgtg tgacctttgg aaagcctatt tttgagcatc aggcgttagc1140
ctttcgttta gccagtatgg ccacagaaat tgaagcagca cgacaattgg ttcattacgc1200
agcgcggctt aaagaagctg gaaaaccttg tttaaatgaa gcatcaatgg cgaaattatt1260
ttcatctgaa atggtcgaac gcgtatgttc tgctgctttg caaatctttg gtggctatgg1320
ctatttaaaa gactttccca tcgagcgaat ttatcgtgat gcacgtattt gccagattta1380
tgaaggtaca agtgatattc agcgtttagt gatagcaaga agcctataac tgacctttgc1440
tgctgtattt ttatcataaa attaagataa ggattctaaa aatgacattc gcaacaattt1500
tattggaaaa acgtaagggt gtgggcttga ttacacttaa ccgtccaaaa gcattaaatg1560
ctttaaactc agaattaatt tatgaaataa atttagcctt agacgattta gaaaatgatc1620
aaacgattgg ttgtatcgtc cttacaggtt cagaaaaagc ctttgccgca ggtgcggata1680
tcaaagaaat ggcagaatta acttttccaa atatttattt tgatgatttt tttagtcttg1740
cagatcgtat tgcacagcgt cgtaagcctt taattgccgc agtgagtggt tatgctttag1800
gtggtggctg tgagttagca ctcatgtgtg actttattta ttgtgccgac aatgccaagt1860
ttgcactacc agaagtaact ttaggtgtca ttcctggtat tggtggaaca cagcgtctaa1920
cgcttgcaat aggcaaagcc aaagccatgg aaatgtgttt gactgcacgg caaatgcagg1980
ctgctgaggc agaacaaagt ggtttggtgg cacgcgtttt tagtaaagaa gaacttttag2040
aacaaacctt acaggctgcc gaaaaaatag cggaaaaatc acgggtatct accataatga2100
ttaaagagtc aattaatcga gcttttgaag tgagtttagc agagggttta cgttttgagc2160
gccgaatgtt ccattcagtt tttgcgacct tagatcagaa agaaggcatg caagcattta2220
ttgataaacg tccagcccaa tttaaacatc aataatagga tgaagcgatg actactactg2280
acaatcattt actcattgaa cataaaaacg ctttaggaac aattatttta aatcgtccag2340
cgagtctgaa cgcgctatct ctagaaatga ttaatgcgat tcgtcaacaa gttgaggatt2400
ggcaaggtga tgtaaatgtt caggccatat taattaaatc aaatagtcct aaagcatttt2460
gtgcaggtgg tgatattcgc tatctttatg aaagttataa aagtggatca gaagagtata2520
aagattattt cattgctgaa tatgagatgc tcaatagcat tcgaacgtct aaaaaaacag2580
tgattgtttt attggatgga tatgtattgg gtggtggttt tggtttagca caggcttgtc2640
atatcttggt gagtagtgaa aaatcacgat tttcaatgcc agaaacagca ataggttttt2700
tcccagatgt tgcagcgact tatttcttat ctcgtttaga tgatgttggg gtatatttgg2760
cactgactgg tgatcaaatc agtagtagtg atgcattgta tttagatctg attgattatc2820
atgttccgag tcagaatttt gagcgactag aaaatgcatt cagccaatca cagaacttag2880
ataaatttca tattcagaag attatttctg cttatatctc cagccctgtt cagagtgaac2940
tcagtctatg gcttgaagcc attcgtcagc attttggtct taaaaatgtg caagatatcg3000
aagaaagttt gaaaaatgaa caagatccca actatcaagt atggacaagt aaagtgttaa3060
atactttgca acaacgttcc tctattgcaa aaaaaaccag tttaaagtta cagctgctag3120
ggcgtggatg gtcattacag caatgtatgc gtatcgagcg aaaattacag gatatctggt3180
ttgaacatgg tgatatgatt gagggtgttc gagcgttgat tattgataaa gataaacaac3240
cgcaatggca gcagcataat gcgactttag ataatatatt aggccaatta ggttagtcat3300
ttcagactga agggcgagct caattcgaag cttgaaggta agcctatccc taaccctctc3360
ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat catcaccatc accattgagt ttgatccggc3420
tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc3480
ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat3540
atccggatat cccgcaagag gcccggcagt accggcataa ccaagcctat gcctacagca3600
tccagggtga cggtgccgag gatgacgatg agcgcattgt tagatttcat acacggtgcc3660
tgactgcgtt agcaatttaa ctgtgataaa ctaccgcatt aaagcttatc gatgataagc3720
tgtcaaacat gagaattaat tcttgaagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat3780
aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg3840
tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga3900
gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac3960
atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc4020
cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca4080
tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc4140
caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt gttgacgccg4200
ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac4260
cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca4320
taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg4380
agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac4440
cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gcagcaatgg4500
caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat4560
taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg4620
ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg4680
cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc4740
aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc4800
attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt4860
tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt4920
aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt4980
gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag5040
cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca5100
gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca5160
agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg5220
ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg5280
cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct5340
acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga5400
gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc5460
ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg5520
agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg5580
cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt5640
tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc5700
gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc5760
ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg caatggtgca ctctcagtac5820
aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gtatacactc cgctatcgct acgtgactgg5880
gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg5940
ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg6000
ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagctgcggt aaagctcatc agcgtggtcg6060
tgaagcgatt cacagatgtc tgcctgttca tccgcgtcca gctcgttgag tttctccaga6120
agcgttaatg tctggcttct gataaagcgg gccatgttaa gggcggtttt ttcctgtttg6180
gtcactgatg cctccgtgta agggggattt ctgttcatgg gggtaatgat accgatgaaa6240
cgagagagga tgctcacgat acgggttact gatgatgaac atgcccggtt actggaacgt6300
tgtgagggta aacaactggc ggtatggatg cggcgggacc agagaaaaat cactcagggt6360
caatgccagc gcttcgttaa tacagatgta ggtgttccac agggtagcca gcagcatcct6420
gcgatgcaga tccggaacat aatggtgcag ggcgctgact tccgcgtttc cagactttac6480
gaaacacgga aaccgaagac cattcatgtt gttgctcagg tcgcagacgt tttgcagcag6540
cagtcgcttc acgttcgctc gcgtatcggt gattcattct gctaaccagt aaggcaaccc6600
cgccagccta gccgggtcct caacgacagg agcacgatca tgcgcacccg tggccaggac6660
ccaacgctgc ccgagatgcg ccgcgtgcgg ctgctggaga tggcggacgc gatggatatg6720
ttctgccaag ggttggtttg cgcattcaca gttctccgca agaattgatt ggctccaatt6780
cttggagtgg tgaatccgtt agcgaggtgc cgccggcttc cattcaggtc gaggtggccc6840
ggctccatgc accgcgacgc aacgcgggga ggcagacaag gtatagggcg gcgcctacaa6900
tccatgccaa cccgttccat gtgctcgccg aggcggcata aatcgccgtg acgatcagcg6960
gtccaatgat cgaagttagg ctggtaagag ccgcgagcga tccttgaagc tgtccctgat7020
ggtcgtcatc tacctgcctg gacagcatgg cctgcaacgc gggcatcccg atgccgccgg7080
aagcgagaag aatcataatg gggaaggcca tccagcctcg cgtcgcgaac gccagcaaga7140
cgtagcccag cgcgtcggcc gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt7200
tggtggcggg accagtgacg aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa7260
gcgacaggcc gatcatcgtc gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga7320
gcgctgccgg cacctgtcct acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga7380
cgatagtcat gccccgcgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca7440
tcggtcgaga tcccggtgcc taatgagtga gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac7500
tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg7560
cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg7620
ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg7680
ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat7740
gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg7800
gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca7860
gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc7920
cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag7980
ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc8040
tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa8100
ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg8160
caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca8220
ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt 8280
tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg 8340
acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac 8400
tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc 8460
gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa 8520
acggtctgat aagagacacc ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca 8580
ttcaccaccc tgaattgact ctcttccggg cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg 8640
cgccattcga tggtgtccgg gatctcgacg ctctccctta tgcgactcct gcattaggaa 8700
gcagcccagt agtaggttga ggccgttgag caccgccgcc gcaaggaatg gtgcatg 8757
<210>21
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
attatcccat ggggagaaca ttaaaagc28
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
cgggatcctt acttttcaat atat24
<210>23
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
cggtcgacaa ggagatatag atatgactga tctcacaaag actgc 45
<210>24
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
cttaggcttt gtcgaacgcc tcc 23
<210>25
<211>870
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>新載體
<400>25
atggaaaagg tggcattcat cggcctgggc gcaatgggct acccaatggc aggtcacctg 60
gctcgccgct tcccaaccct ggtgtggaac cgcaccttcg aaaaggcact gcgccaccag 120
gaagagttcg gctccgaagc agtgccactg gaacgcgtgg ctgaagcacg cgtgatcttc 180
acctgcctgc caaccacccg cgaagtgtac gaagtggcag aagcactgta cccatacctg 240
cgcgaaggca cctactgggt ggatgcaacc tccggcgaac cagaagcatc ccgccgcctg 300
gctgaacgcc tgcgcgaaaa gggcgtgacc tacctggatg caccagtgtc cggtggcacc 360
tccggtgcag aagcaggcac cctgaccgtt atgctgggcg gtccagaaga agcagtcgaa 420
cgcgtccgcc cattcctggc ctacgcaaag aaggtggtcc acgtcggccc agttggtgca 480
ggccacgcag tgaaggcaat caacaacgca ctgctggccg tgaacctgtg ggcagcaggc 540
gaaggtctgc tggccctggt gaagcagggc gtgtccgcag aaaaggccct ggaagtgatc 600
aacgcatcct ccggccgctc caacgcaacc gaaaacctga tcccacagcg cgttctgacc 660
cgcgcattcc caaagacctt cgcactgggc ctgctggtga aggatctggg catcgcaatg 720
ggcgtgctgg atggcgaaaa ggcaccatcc ccactgctgc gcctggctcg cgaagtctac 780
gagatggcaa agcgcgaact cggcccagat gcagatcacg tggaagcact gcgcctgctc 840
gaacgctggg gcggtgtgga aatccgctaa 870
<210>26
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
tgaagatcct aggaggttta aacatatgcc gttaatagcc gggattg 47
<210>27
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
tatatagtcg acttaattcg cctgaccggc cag 33
<210>28
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
tatataacat gtcgctttca ccgccaggc29
<210>29
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
catatgttta aacctcctag gatcttcagt ttctctcact taacggcagg 50
<210>30
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
tatataccat ggcgctttca ccgccaggc29
<210>31
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>31
tatatagtcg acttaattcg cctgaccggc cag 33
<210>32
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>32
tatatacata tgaaaagatc aaaacgattt gcagtactgg40
<210>33
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
tatatagtcg acttagcttc ctttacgcag cttatgc 37
<210>34
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
aaaacatatg aattttcatc atctggctta ctgg 34
<210>35
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
aaaacatatg tatatttcct tctttcaggc ctccaggctt atccagatg49
<210>36
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
ggaggcaacc atggccctcg acgtgcagag 30
<210>37
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
gagacttgcg gatccctccg atcaggcctt gc 32
<210>38
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
aaaacatatg atcgacactg cgccccttgc 30
<210>39
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
aagacgtcct accgctcgcc ggccgtcc28
<210>40
<211>3967
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>新質(zhì)粒
<400>40
atgcgccgca ccctgaaggc agcaatcctg ggcgccaccg gcctggtggg catcgaatac 60
gtgcgcatgc tgtccaacca cccatacatc aagccagcat acctggccgg caagggctcc 120
gttggcaagc catacggcga agtggtgcgc tggcagaccg tgggccaggt gccaaaggaa 180
atcgcagata tggaaatcaa gccaaccgat ccaaagctga tggatgatgt ggatatcatc 240
ttctccccac tgccacaggg tgcagcaggc ccagtggaag aacagttcgc aaaggaaggc 300
ttcccagtga tctccaactc cccagatcac cgcttcgatc cagatgtgcc actgctggtg 360
ccagaactca acccacacac catctccctg atcgatgaac agcgcaagcg ccgcgaatgg 420
aagggcttca tcgtgaccac cccactgtgc accgcacagg gcgcagcaat cccactgggc 480
gcaatcttca aggattacaa gatggatggc gcattcatca ccaccatcca gtccctgtcc 540
ggcgcaggct acccaggtat cccatccctg gatgtggtgg ataacatcct gccactgggc 600
gatggctacg atgcaaagac catcaaggaa atcttccgca tcctgtccga agtgaagcgc 660
aacgtggatg aaccaaagct ggaagatgtg tccctggccg caaccaccca ccgcatcgca 720
accatccacg gccactacga agtgctgtac gtgtccttca aggaagaaac cgcagcagaa 780
aaggtgaagg aaaccctgga aaacttccgc ggcgaaccac aggatctgaa gctgccaacc 840
gcaccatcca agccaatcat cgtgatgaac gaagataccc gcccacaggt gtacttcgat 900
cgctgggcag gcgatatccc aggcatgtcc gtggtggtgg gccgcctgaa gcaggtgaac 960
aagcgcatga tccgcctggt gtccctgatc cacaacaccg ttcgcggcgc agcaggtggt1020
ggtatcctgg ccgcagaact cctggtggaa aagggctaca tcgaaaagta agaattccgc1080
gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg cgcttggcgt aatcatggtc1140
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg1200
aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt1260
gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg1320
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga1380
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat1440
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca1500
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc1560
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata1620
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc1680
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc1740
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga1800
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc1860
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag1920
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag1980
aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag2040
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca2100
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga2160
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat2220
cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga2280
gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg2340
tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga2400
gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gaaccacgct caccggctcc2460
agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac2520
tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc2580
agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc2640
gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc2700
catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt2760
ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc2820
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gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg3660
ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg3720
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<212>DNA
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<220>
<223>引物
<400>41
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<400>42
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<211>3766
<212>DNA
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<220>
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<400>43
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gaaggtctgc tggccctggt gaagcagggc gtgtccgcag aaaaggccct ggaagtgatc 600
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gaacgctggg gcggtgtgga aatccgctaa gaattccgcg agctccagct tttgttccct 900
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ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa1320
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tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat2580
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt2640
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc2700
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat2760
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ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt2880
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gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 3540
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<223>引物
<400>45
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權(quán)利要求
1.用于制備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法，其包括下列步驟
IA)通過(guò)包括下述步驟的方法來(lái)制備3-羥基異丁酸，即在從碳源形成3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的條件下，使細(xì)胞與包含碳水化合物、甘油、二氧化碳、甲烷、甲醇、L-纈氨酸或L-谷氨酸作為碳源的培養(yǎng)基相接觸，所述細(xì)胞相對(duì)于其野生型而言如此地經(jīng)基因工程改造，從而與其野生型相比，它能夠形成更多的3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸；任選地，從培養(yǎng)基中純化出3-羥基異丁酸；以及任選地，中和3-羥基異丁酸，
IB)使3-羥基異丁酸脫水從而形成甲基丙烯酸；以及任選地，使甲基丙烯酸酯化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為初產(chǎn)物的甲基丙二酸半醛來(lái)實(shí)現(xiàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)胞能夠經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的琥珀酰輔酶A來(lái)形成3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的酶E1的活性，所述酶E1催化琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶A。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述酶E1為甲基丙二酰輔酶A變位酶(EC 5.4.99.2)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中之一的方法，其中所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E2至E4中至少一種酶的活性
-酶E2，其催化甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸；
-酶E3，其催化甲基丙二酸轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛；
-酶E4，其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中，
酶E2為甲基丙二酰輔酶A水解酶(EC 3.2.1.17)，
酶E3為醛脫氫酶(EC 1.2.1.3)或醛氧化酶(EC 1.2.3.1)，和
酶E4為3-羥基異丁酸脫氫酶(EC 1.1.1.31)或3-羥基?；o酶A脫氫酶(EC 1.1.1.35)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3至5中之一的方法，其中所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E4、E5、E6和E7中至少一種酶的活性
-酶E6，其催化(R)-甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為(S)-甲基丙二酰輔酶A；
-酶E7，其催化(S)-甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A；
-酶E5，其催化丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛；
-酶E4，其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中，
酶E6為甲基丙二酰輔酶A差向異構(gòu)酶(EC 5.1.99.1)，
酶E7為甲基丙二酰輔酶A脫羧酶(EC 4.1.1.41)，
酶E5為甲基丙二酸半醛脫氫酶(EC 1.2.1.27)，和
酶E4為3-羥基異丁酸脫氫酶(EC 1.1.1.31)或3-羥基酰基輔酶A脫氫酶(EC 1.1.1.35)。
10.根據(jù)權(quán)利要求3至5中之一的方法，其中所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E4、E5和E7中至少一種酶的活性
-酶E7，其催化甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A；
-酶E5，其催化丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛；
-酶E4，其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中，
酶E7為甲基丙二酰輔酶A脫羧酶(EC 4.1.1.41)，
酶E5為甲基丙二酸半醛脫氫酶(EC 1.2.1.27)，和
酶E4為3-羥基異丁酸脫氫酶(EC 1.1.1.31)或3-羥基酰基輔酶A脫氫酶(EC 1.1.1.35)。
12.根據(jù)權(quán)利要求3至5中之一的方法，其中所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E28和E46中至少一種酶的活性
-酶E46，其催化L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為2-酮戊二酸；
-酶E28，其催化2-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中，
酶E46為谷氨酸合酶(EC 1.4.1.13或EC 1.4.1.14)、谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.1或EC 2.6.1.2)，和
酶E28為2-酮戊二酸合酶(EC 1.2.7.3)。
14.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)胞能夠經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的丙酰輔酶A來(lái)形成3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E4、E5和E47至E52中至少一種酶的活性
-酶E47，其催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A；
-酶E48，其催化丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酸半醛；
-酶E49，其催化丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸；
-酶E50，其催化3-羥基丙酸轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酰輔酶A；
-酶E51，其催化3-羥基丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙烯酰輔酶A；
-酶E52，其催化丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A；
-酶E5，其催化丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛；
-酶E4，其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中，
酶E4為3-羥基異丁酸脫氫酶(EC 1.1.1.31)或3-羥基?；o酶A脫氫酶(EC 1.1.1.35)，
酶E5為甲基丙二酸半醛脫氫酶(EC 1.2.1.27)，
酶E47為丙二酰輔酶A脫羧酶(EC 4.1.1.9)、丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(EC2.8.3.3)、甲基丙二酰輔酶A羧基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.1.3.1)或乙酰輔酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)，
酶E48為丙二酸半醛脫氫酶(EC 1.2.1.18)，
酶E49為3-羥基丙酸脫氫酶(EC 1.1.1.59)，
酶E50為3-羥基異丁酰輔酶A水解酶(EC 3.1.2.4)，
酶E51為烯酰輔酶A水合酶(EC 4.2.1.17)，和
酶E52為?；o酶A脫氫酶(EC 1.3.99.3)。
17.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)胞能夠經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的丙烯酰輔酶A來(lái)形成3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E2至E4、E56、E72和E73中至少一種酶的活性
-酶E72，其催化β-丙氨酸轉(zhuǎn)化為β-丙氨酰輔酶A；
-酶E73，其催化β-丙氨酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙烯酰輔酶A；
-酶E56，其催化丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶A；
-酶E2，其催化甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸；
-酶E3，其催化甲基丙二酸轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛；
-酶E4，其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中，
酶E72為輔酶A轉(zhuǎn)移酶(EC 2.8.3.1)或輔酶A合成酶，優(yōu)選地輔酶A轉(zhuǎn)移酶，
酶E73為β-丙氨酰輔酶A銨裂合酶(EC 4.3.1.6)，
酶E56為巴豆酰輔酶A脫羧酶，
酶E2為甲基丙二酰輔酶A水解酶(EC 3.1.2.17)，
酶E3為醛脫氫酶(EC 1.2.1.3)或醛氧化酶(EC 1.2.3.1)，和
酶E4為3-羥基異丁酸脫氫酶(EC 1.1.1.31)或3-羥基?；o酶A脫氫酶(EC 1.1.1.35)。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的形成經(jīng)由作為初產(chǎn)物的3-羥基異丁酰輔酶A來(lái)實(shí)現(xiàn)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述細(xì)胞能夠經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的異丁酰輔酶A來(lái)形成3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E76至E79、E60、E61和E8中至少一種酶的活性
-酶E76，其催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為2-乙酰乳酸；
-酶E77，其催化2-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2，3-二羥基異戊酸；
-酶E78，其催化2，3-二羥基異戊酸轉(zhuǎn)化為2-氧代異戊酸；
-酶E79，其催化2-氧代異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁酰輔酶A；
-酶E60，其催化異丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙烯酰輔酶A；
-酶E61，其催化甲基丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酰輔酶A；
-酶E8，其催化3-羥基異丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中，
酶E8為3-羥基異丁酰輔酶A水解酶(EC 3.1.2.4)，
酶E76為乙酰乳酸合酶(EC 2.2.1.6)，
酶E77為二羥基異戊酸脫氫酶(EC 1.1.1.86)，
酶E78為2，3-二羥基異戊酸脫水酶(EC 4.2.1.9)，
酶E79為2-氧代異戊酸脫氫酶(EC 1.2.1.25或EC 1.2.4.4)，
酶E60為?；o酶A脫氫酶(EC 1.3.99.3)、丁酰輔酶A脫氫酶(EC1.3.99.2)或2-甲基?；o酶A脫氫酶(EC 1.3.99.12)，和
酶E61為烯酰輔酶A水合酶(EC 4.2.1.17)。
24.根據(jù)權(quán)利要求21或22的方法，其中所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的下述酶E8、E60至E61和E79至E80中至少一種酶的活性
-酶E80，其催化L-纈氨酸轉(zhuǎn)化為2-氧代異戊酸；
-酶E79，其催化2-氧代異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁酰輔酶A；
-酶E60，其催化異丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙烯酰輔酶A；
-酶E61，其催化甲基丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酰輔酶A；
-酶E8，其催化3-羥基異丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中，
酶E8為3-羥基異丁酰輔酶A水解酶(EC 3.1.2.4)，
酶E60為酰基輔酶A脫氫酶(EC 1.3.99.3)、丁酰輔酶A脫氫酶(EC1.3.99.2)或2-甲基?；o酶A脫氫酶(EC 1.3.99.12)，
酶E61為烯酰輔酶A水合酶(EC 4.2.1.17)，
酶E79為2-氧代異戊酸脫氫酶(EC 1.2.1.25或EC 1.2.4.4)，和
酶E80為氨基酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.6.1.42)。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是通過(guò)用于制備經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞的方法可獲得的，所述方法包括下述步驟，即提高所述細(xì)胞中在權(quán)利要求2至25中所提及的酶中至少一種酶的活性。
27.用于制備聚甲基丙烯酸或聚甲基丙烯酸酯的方法，其包括下列步驟
IIIA)通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1至26中之一的方法來(lái)制備甲基丙烯酸，
IIIB)甲基丙烯酸的自由基聚合，
其中，任選地，在自由基聚合之前或之后，甲基丙烯酸的羧基基團(tuán)或甲基丙烯酸鹽的羧酸根基團(tuán)可以至少部分地被酯化。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于制備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法，其包括下列步驟IA)通過(guò)包括下述步驟的方法來(lái)制備3-羥基異丁酸，即在從碳源形成3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸的條件下，使細(xì)胞與包含碳水化合物、甘油、二氧化碳、甲醇、L-纈氨酸或L-谷氨酸作為碳源的培養(yǎng)基相接觸，所述細(xì)胞相對(duì)于其野生型而言如此地經(jīng)基因工程改造，從而與其野生型相比，它能夠形成更多的3-羥基異丁酸或基于3-羥基異丁酸的聚羥基鏈烷酸；任選地，從培養(yǎng)基中純化出3-羥基異丁酸；以及任選地，中和3-羥基異丁酸；IB)使3-羥基異丁酸脫水從而形成甲基丙烯酸；以及任選地，使甲基丙烯酸酯化。本發(fā)明還涉及用于制備聚甲基丙烯酸或聚甲基丙烯酸酯的方法。
文檔編號(hào)C07C57/04GK101679187SQ200880018364
公開(kāi)日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年5月30日優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日
發(fā)明者A·馬克斯, M·珀特, S·布赫霍爾茨, A·梅, H·西格特, B·艾爾伯, G·福克斯, L·埃格林申請(qǐng)人:贏創(chuàng)羅姆有限責(zé)任公司

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技術(shù)研發(fā)人員：Ａ.馬克斯;Ｍ.珀特;Ｓ.布赫霍爾茨;Ａ.梅;Ｈ.西格特;Ｂ.艾爾伯;Ｇ.?？怂?Ｌ.埃格林
技術(shù)所有人：贏創(chuàng)羅姆有限責(zé)任公司
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用于制備甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法