專利名稱：：花菁類化合物及其在生物樣品染色中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及熒光染料。具體地講，本發(fā)明涉及適合用于生物樣品染色的花菁類化合物，包含所述花菁類化合物的組合物及其在生物樣品染色中的用途。
背景技術(shù)：
：有核紅細(xì)胞(Nucleatedredbloodcells，NRBC)是未完全成熟的紅細(xì)胞，可以分為早、中、晚有核紅細(xì)胞，通常存在于骨髓等造血組織或器官中。當(dāng)外周血中有核紅細(xì)胞數(shù)量增加時(shí)，可能是機(jī)體貧血、缺氧等生理和病理代償反應(yīng)。最近的研究證實(shí)，母體外周血中存在少量胎兒的有核紅細(xì)胞。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在某些妊娠病理狀態(tài)下，如發(fā)熱、妊娠高血壓征、胎兒宮內(nèi)缺氧等，母體外周血中的胎兒有核紅細(xì)胞有增多的情況。因此，測(cè)量NRBC具有重要的臨床意義。以往，臨床中采用手工鏡檢法分析和鑒定有核紅細(xì)胞。該方法費(fèi)時(shí)且在較大程度上依賴檢驗(yàn)員的經(jīng)驗(yàn)和主觀判斷。70年代發(fā)展了流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry,簡(jiǎn)稱為FCM)，該技術(shù)利用流式細(xì)胞儀可對(duì)細(xì)胞等生物粒子進(jìn)行定量、快速、客觀多參數(shù)相關(guān)檢測(cè)分析。血液自動(dòng)分析裝置應(yīng)用了流式細(xì)胞術(shù)，利用核染色技術(shù)可以將NRBC與其他細(xì)胞類型區(qū)分開。這樣，可以在一般檢查室進(jìn)行血液細(xì)胞的分類和計(jì)數(shù)，大大提高了檢測(cè)的效率。美國(guó)專利US5298426公開了一種兩步法分析NRBC的熒光法。采用兩步法降低了測(cè)試了效率。美國(guó)專利US5559037提出了基于流式細(xì)胞技術(shù)的NRBC和白細(xì)胞分析方法。在該方法中利用的核酸染料為溴化乙錠，它和核酸形成的復(fù)合物在光照過程中容易產(chǎn)生光漂白，同時(shí)該物質(zhì)能誘發(fā)癌變，靈敏度較低，對(duì)儀器的操作者和環(huán)境構(gòu)成了一定的威脅。美國(guó)專利US5879900公開了基于流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)血液中NRBC、破壞的白細(xì)胞及白細(xì)胞分類的方法。該方法包括先向待測(cè)血液樣本中加入熒光標(biāo)記的抗體，不僅增加了檢測(cè)的成本，也使檢測(cè)步驟復(fù)雜。美國(guó)專利US6197593提出了一種采用SYTO系列作為核酸染料，對(duì)血液樣品中的網(wǎng)織紅細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和紅細(xì)胞進(jìn)行分類的方法。這類染料的合成工藝路線長(zhǎng)。因此，需要繼續(xù)開發(fā)出新的熒光染料，以滿足對(duì)生物樣品進(jìn)行準(zhǔn)確、快速檢測(cè)的需要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一方面提供了一種具有通式I結(jié)構(gòu)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中&、尺2各自獨(dú)立選自C卜18烷基0)016、18烷基0R6和芐基，其中芐基由選自以下的取代基任選取代卣素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基，并且&和R2不同時(shí)為芐基；R6每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立為H、C卜18烷基或者苯基，其中苯基由選自以下的取代基任選取代鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基；X為CH2、C(CH3)2、0、S或Se;R3、R4和R5各自獨(dú)立選自H、鹵素、氰基、羥基、(V18烷基、C卜18烷基磺酸基、磺酸基和C卜5烷基C00R7;R7為H或C卜6的烷基;Z—為陰離子。本發(fā)明還一方面提供一種綴合物，所述綴合物包含上述式I化合物。本發(fā)明另一個(gè)方面還提供用于生物樣品染色的組合物，所述組合物包含上述式I化合物或其綴合物。本發(fā)明再一方面還提供了本發(fā)明式I化合物或其綴合物在對(duì)生物樣品進(jìn)行染色中的用途。本發(fā)明的化合物具有以下性質(zhì)無核酸時(shí)自身幾乎沒有熒光，與核酸形成復(fù)合物后時(shí)熒光強(qiáng)度迅速增加并且光譜在近紅外區(qū)，避免背景熒光的干擾，有助于提高檢測(cè)結(jié)果的精確度，同時(shí)可在流式細(xì)胞分析儀上用作各種生物樣品的染色劑；可以在640nm附近被激發(fā)且其波長(zhǎng)在4(TC可以保持穩(wěn)定，與使用的半導(dǎo)體激光器工作波長(zhǎng)相匹配；具有良好的光照穩(wěn)定性，在水溶液中可以較快的降解，對(duì)儀器操作者和環(huán)境均友好；合成工藝路線較短，原料易得，成本低。本發(fā)明的這些特征和優(yōu)點(diǎn)以及其他特征和優(yōu)點(diǎn)在參考以下附圖和本發(fā)明的具體實(shí)施方式之后將變得顯而易見。圖1是化合物Dye-1在不同環(huán)境溫度下放置48小時(shí)后的吸收光譜。使用儀器為紫外可見光分光光度計(jì)，型號(hào)為Uvmini-1240。圖2是化合物Dye-1在醇溶液中光照不同時(shí)間后的吸收光譜。使用儀器為紫外可見光分光光度計(jì)，型號(hào)為Uvmini-1240。圖3是化合物Dye-1在磷酸鹽緩沖液中光照不同時(shí)間后的吸收光譜。使用儀器為紫外可見光分光光度計(jì)，型號(hào)為Uvmini-1240。圖4是用化合物Dye-1作為有核紅細(xì)胞測(cè)定試劑，測(cè)定血液的前方散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為前向散射光強(qiáng)度。圖5是用化合物Dye-2作為有核紅細(xì)胞測(cè)定試劑，測(cè)定血液的前方散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為前向散射光強(qiáng)度。圖6是用化合物Dye-3作為有核紅細(xì)胞測(cè)定試劑，測(cè)定血液的前方散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為前向散射光強(qiáng)度。圖7是用化合物Dye-4作為有核紅細(xì)胞測(cè)定試劑，測(cè)定血液的前方散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為前向散射光強(qiáng)度。圖8是用化合物Dye-5作為有核紅細(xì)胞測(cè)定試劑，測(cè)定血液的前方散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為前向散射光強(qiáng)度。圖9是用化合物Dye-6作為有核紅細(xì)胞測(cè)定試劑，測(cè)定血液的前方散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。橫坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為前向散射光強(qiáng)度。具體實(shí)施方式除另有說明外，否則本文中使用的術(shù)語具有以下含義。本文中使用的術(shù)語"烷基"，無論是單獨(dú)使用還是與其他基團(tuán)結(jié)合使用，指包含l-18、優(yōu)選l-12、更優(yōu)選l-8、最優(yōu)選1-6個(gè)碳原子的直鏈烷基和支鏈烷基。如提及單個(gè)烷基如"正丙基"，則只特指直鏈烷基，如提及單個(gè)支鏈烷基如"異丙基"，則只特指支鏈烷基。例如，"C卜e烷基"包括C卜4烷基、(V3烷基、甲基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。類似的規(guī)則也適用于本說明書中使用的其它基團(tuán)。本文中使用的術(shù)語"鹵素"包括氟、氯、溴和碘。本文中使用的術(shù)語"生物樣品"包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、核酸和血液中的有核紅細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語"芳基"是指含有3至20個(gè)碳原子的芳族單環(huán)或2或3環(huán)稠環(huán)基團(tuán)，任選還含有1至3個(gè)選自N、0和S的雜原子。本文中使用的術(shù)語"雜環(huán)基"是指含有3至20個(gè)碳原子的非芳族單環(huán)或2或3環(huán)稠環(huán)基團(tuán)，任選還含有1至3個(gè)選自N、0和S的雜原子。本文中使用的術(shù)語"磺酸基"是指_S03H基團(tuán)或_S03—M基團(tuán)，其中M為相反離子，包括例如堿金屬離子(例如K+離子)或堿土金屬離子。"烷基磺酸基"是指上述"磺酸基"通過上述"烷基"與分子的其他部分連接的基團(tuán)。本發(fā)明一方面提供了一種具有通式I結(jié)構(gòu)的化合物R，R2其中&、尺2各自獨(dú)立選自C卜18烷基0)016、18烷基0R6和芐基，其中芐基由選自以下的取代基任選取代卣素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基，并且&和R2不同時(shí)為芐基；R6每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立為H、C卜18烷基或者苯基，其中苯基由選自以下的取代基任選取代鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基；X為CH2、C(CH3)2、0、S或Se;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>R3、R4和R5各自獨(dú)立選自H、鹵素、氰基、羥基、18烷基、C卜18烷基磺酸基、磺酸基和C卜5烷基C00R7;R7為H或C卜6的烷基；Z—為陰離子。優(yōu)選&、&各自獨(dú)立選自C卜6烷基COORp(V6烷基0R6和芐基，且&和R2不同時(shí)為芐基。優(yōu)選R6每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立為H、C卜6烷基或者苯基。優(yōu)選R3、R4和R5各自獨(dú)立為H、鹵素、氰基、羥基、(V6烷基、(V6烷基磺酸基、磺酸基或C卜5烷基C00R7。優(yōu)選X為C(CH3)2、0或S。優(yōu)選Z—為選自鹵素離子、C104—、PF6—、CF3S03—、BF4—、乙酸根或?qū)妆交撬岣?fù)離子的陰離子。優(yōu)選本發(fā)明的化合物為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>本發(fā)明實(shí)施例的化合物可作為本文中所述的鹽形式直接用于生物樣品的染色?；蛘?，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明實(shí)施例化合物可作為式I化合物的衍生物的形式使用，所述衍生物包括但不限于綴合物。典型地，綴合物在熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)中使用。本文中使用的"綴合物"是指本發(fā)明化合物通過共價(jià)鍵與其它分子連接而形成的化合物?？膳c本發(fā)明化合物綴合的分子可為與細(xì)胞或細(xì)胞成分特異性結(jié)合的分子，包括但不限于抗體、抗原、受體、配體、酶、底物、輔酶等。通常，測(cè)試樣品與綴合物溫育一段時(shí)間，使得該綴合物與測(cè)試樣品中的某些細(xì)胞或細(xì)胞成分特異性結(jié)合，該綴合物與細(xì)胞或細(xì)胞成分的結(jié)合也可被稱為染色。該染色步驟可依次進(jìn)行多次，或用多種綴合物同時(shí)進(jìn)行多種染色。染色完成后，樣品在熒光激活細(xì)胞分選儀中進(jìn)行分析，其中激發(fā)光源激發(fā)綴合物中的本發(fā)明化合物，而測(cè)定裝置測(cè)定由激發(fā)的化合物產(chǎn)生的發(fā)射光?；蛘?，在另一個(gè)實(shí)施方案中，該綴合物還可用于固相免疫測(cè)試，例如夾心型免疫測(cè)試。固相免疫測(cè)試的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，可由標(biāo)準(zhǔn)教科書獲得。本發(fā)明的綴合物可用作固相免疫測(cè)試中的各種合適成分。本發(fā)明的化合物的制備方法本發(fā)明化合物可通過本領(lǐng)域熟知的通用方法合成得到。具體地講，本發(fā)明化合物部分中間體可通過如下流程合成得到。由未取代或取代的式II或III化合物為原料，分別與式IV(或R2X(X為F、Cl、Br或I)的鹵化物反應(yīng)式II式III得到式IV和式V的季銨鹽中間體<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>式IV式V其中Rp&、X、Al環(huán)和A2環(huán)分別如式I化合物中所述定義。例如，通過如下反應(yīng)得到各種相應(yīng)的季銨鹽中間體。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>RiR2式I其中X、Y、&、R2、Z—、Al環(huán)和A2環(huán)如上定義，連接分子可為方酸、異佛爾酮等化合物。例如，本發(fā)明部分目標(biāo)化合物可通過如下流程合成OOPh17所得化合物可通過本領(lǐng)域公知的分離和純化技術(shù)回收，以達(dá)到需要的純度。本發(fā)明中使用的各種原料均可市售獲得，或者可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法或現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法由本領(lǐng)域公知的原料簡(jiǎn)單地制備得到。本發(fā)明的組合物本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案還提供包含上述式I化合物或其綴合物的組合物，所述組合物用于生物樣品的染色。所述生物樣品選自肽、蛋白質(zhì)、核酸和血液中的有核紅細(xì)胞。所述蛋白質(zhì)選自抗體、抗體片斷和單鏈抗體。所述核酸選自脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、適體和肽核酸(PNA)。本發(fā)明的組合物除包含式I化合物或其綴合物外，還可包含生物樣品染色所需要的其它組分，例如溶劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑等。本發(fā)明的組合物可作為水溶液形式存在，或者可作為臨用前用水配制為溶液的其它合適形式存在。本發(fā)明化合物或組合物的應(yīng)用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案還提供使用上述式I化合物或包含式I化合物的組合物以染色生物樣品的方法，該方法包括使上述式I化合物或其綴合物或包含式I化合物的組合物與生物樣品接觸的步驟。本文中使用的術(shù)語"接觸"可包括在溶液或固相中接觸。特點(diǎn)由以上描述以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常識(shí)，可了解本發(fā)明化合物的各種優(yōu)點(diǎn)，包括但不限于以下(1)本發(fā)明提供的化合物最大激發(fā)波長(zhǎng)在640nm左右，且不隨著溫度變化而變化，與使用的紅色半導(dǎo)體激光器的波長(zhǎng)相匹配。(2)本發(fā)明化合物/核酸復(fù)合物發(fā)射波長(zhǎng)在600nm-900nm的近紅外區(qū)，避免了生物自身的熒光背景干擾，有助于提高檢測(cè)結(jié)果的精確度。(3)本發(fā)明提供的化合物具有一定的光照穩(wěn)定性。(4)本發(fā)明提供的化合物可在流式細(xì)胞分析儀上用做血液中有核紅細(xì)胞染色劑。(5)本發(fā)明提供的化合物在水溶液中具有快速降解的特點(diǎn)，對(duì)儀器的操作者和環(huán)境均友好。實(shí)施例以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出詳細(xì)說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本發(fā)明不限于此。實(shí)施例1Dye-l的合成向配有回流冷凝器、磁力加熱攪拌器的lOOmL三口燒瓶中加入O.lmol2，3，3_三甲基吲哚、0.25mol6-溴己酸乙酯和25mL鄰二氯苯作為溶劑，在氬氣保護(hù)下回流反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)體系冷卻至室溫后向其中加入適量乙酸乙酯，超聲振蕩使產(chǎn)物析出，在乙酸乙酯中研磨后過濾，得到深棕紅色塊狀物，直接用于下步反應(yīng)。取該棕紅色產(chǎn)物0.01mol、方酸0.005mol和8mL苯、6mL正丁醇、6mL吡啶作為溶劑一起放入50mL三口燒瓶中，在氬氣保護(hù)下攪拌并加熱至回流，反應(yīng)6小時(shí)后停止。冷卻至室溫后向其中加入過量乙醚使產(chǎn)物析出，過濾，并用適量乙醚洗滌后干燥，得到深藍(lán)色固體。該深藍(lán)色固體通過硅膠柱層析的方法進(jìn)行純化，用洗脫液乙酸乙酯石油醚=5:05:l梯度洗脫，收集藍(lán)色組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后在45t:條件下真空干燥箱中干燥24小時(shí)，得到標(biāo)題化合物，為藍(lán)色具金黃色金屬光澤的固體物，收率33%。[O109]最大吸收峰637nm(甲醇/乙二醇)MS(EI)C42H53BrN206m/z:681.9[M_Br]+。實(shí)施例2Dye-2的合成EtOOC精確稱量0.002mo11_芐基_2，3，3_三甲基_3H_吲哚啉氯鹽、丙二醛縮二苯胺鹽酸鹽O.0022mol加入到25mL三口燒瓶中，分別加入醋酸和醋酸酐各4mL，在氬氣保護(hù)下攪拌并加熱到回流，反應(yīng)4小時(shí)后停止，冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去部分溶劑后向其中加入過量乙醚使產(chǎn)物析出，過濾，固體物用少量乙酸乙酯淋洗三次以除去未反應(yīng)的丙二醛縮二苯胺鹽酸鹽，得到棕色固體。取該棕色產(chǎn)物0.OOlmol和0.0012mol1_(己酸乙酯基)-2，3，3-三甲基-3H-吲哚鄰溴鹽放入三口燒瓶中，加入醋酸酐和吡啶各3mL作為溶劑，在氬氣保護(hù)下攪拌并加熱到回流，40分鐘后停止反應(yīng)，向其中加入0.OOllmol的氟硼化鈉溶于3mLDMF中得到的溶液，再加熱攪拌15分鐘。冷卻至室溫后向其中加入過量乙醚，產(chǎn)物析出，過濾后干燥，得到深藍(lán)色固體。該深藍(lán)色固體通過硅膠柱層析的方法進(jìn)行純化，用洗脫液二氯甲烷甲醇=5:o5:l梯度洗脫，收集藍(lán)色組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后在45t:條件下真空干燥箱中干燥24小時(shí)，得到標(biāo)題化合物，收率36%。最大吸收峰641nm(甲醇/乙二醇)MS(EI)C40H47BF4N202m/z:587.8[M_BF4]+。實(shí)施例3Dye-3的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>向配有回流冷凝器、磁力加熱攪拌器的250mL三口燒瓶中加入0.05mol2，3，3_三甲基吲哚，O.20mol4-溴丁酸乙酯和10mL甲苯作為溶劑，在氬氣保護(hù)下回流反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)體系冷卻至室溫后向其中加入適量乙酸乙酯，超聲波振蕩使產(chǎn)物析出，在乙酸乙酯中研磨后過濾，得到深棕紅色塊狀物，直接用于下一步反應(yīng)。取該棕紅色產(chǎn)物0.08mol、異佛爾酮0.004mol和5mL醋酸酐、5mL吡啶作為溶劑一起放入25mL三口燒瓶中，在氬氣保護(hù)下攪拌并加熱至回流，反應(yīng)4小時(shí)后停止。冷卻至室溫后向其中加入過量乙醚使產(chǎn)物析出，過濾，并用適量乙醚洗滌后干燥，得到深藍(lán)色固體。該深藍(lán)色固體通過硅膠柱層析的方法進(jìn)行純化，用洗脫液乙酸乙酯石油醚=100:0ioo:15梯度洗脫，收集藍(lán)色組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后在45t:條件下真空干燥箱中干燥24小時(shí)，得到標(biāo)題化合物，收率40%。最大吸收峰639nm(甲醇/乙二醇)MS(EI)C42H55BrN204m/z:651.9[M_Br]+。實(shí)施例4Dye-4的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>向配有回流冷凝器、磁力加熱攪拌器的lOOmL三口燒瓶中加入0.lmol5_磺酸鉀基-2，3，3-三甲基吲哚、0.25mol6-溴己酸乙酯和25mL鄰二氯苯作為溶劑，在氬氣保護(hù)下回流反應(yīng)36小時(shí)。反應(yīng)體系冷卻至室溫后向其中加入適量乙醚，超聲振蕩使產(chǎn)物析出，在乙酸乙酯中研磨后過濾，得到深棕紅色塊狀物，直接用于下步反應(yīng)。取該深棕紅色產(chǎn)物O.08mol，克酮酸0.004mol和6mL苯、4mL正丁醇、4mL吡啶作為溶劑一起放入50mL三口燒瓶中，在氬氣保護(hù)下攪拌并加熱至回流，反應(yīng)6小時(shí)后停止。冷卻至室溫后向其中加入過量乙醚使產(chǎn)物析出，過濾，并用適量乙醚洗滌后干燥，得到深藍(lán)綠色固體。該深藍(lán)綠色固體通過反相&8硅膠柱層析的方法進(jìn)行純化，用洗脫液甲醇水=o:iooi:4梯度洗脫，收集藍(lán)色組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后在45t:條件下真空干燥箱中干燥24小時(shí)，得到標(biāo)題化合物，為藍(lán)色具金屬光澤固體，收率37%。最大吸收峰637nm(甲醇/乙二醇)MS(EI)C43H51KN2013S2m/z:868.1[M-K]。實(shí)施例5Dye-5的制備.S03K精確稱量0.002mo15_磺酸鉀基_1_(4_甲氧基節(jié)基)_2，3，3_三甲基_3H_噴哚啉鹽，丙二醛縮二苯胺鹽酸鹽O.0022mol加入到25mL單口燒瓶中，分別加入醋酸和醋酸酐各4mL，在氬氣保護(hù)下攪拌并加熱到回流，反應(yīng)4小時(shí)后停止，冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去部分溶劑后向其中加入過量乙醚使產(chǎn)物析出，過濾，固體物用少量乙酸乙酯淋洗三次以除去未反應(yīng)的縮合劑，得到棕黃色固體。取該棕黃色產(chǎn)物O.OOlmol和O.0012mol3_(己酸乙酯基)_1，1，2-三甲基-lH-苯并[e]吲哚溴鹽放入三口燒瓶中，加入醋酸酐和吡啶各4mL作為溶劑，在氬氣保護(hù)下攪拌并加熱到回流，40分鐘后停止反應(yīng)，向其中加入含有0.0012mol氟硼化鈉的3mLDMF溶液，繼續(xù)反應(yīng)20分鐘，冷卻至室溫后向其中加入過量乙醚，產(chǎn)物析出，過濾后干燥，得到得到深藍(lán)色固體。該深藍(lán)色固體通過硅膠柱層析的方法進(jìn)行純化，用洗脫液二氯甲烷甲醇=5:05:l梯度洗脫，收集藍(lán)色組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后在45t:條件下真空干燥箱中干燥24小時(shí)，得到標(biāo)題化合物，為具有金屬光澤的藍(lán)色固體，收率29%。最大吸收峰642nm(甲醇/乙二醇)MS(EI)C45H5。BF4KN206Sm/z:747.0[M—BF4]+。實(shí)施例6Dye-6的制備向配有回流冷凝器、磁力加熱攪拌器的250mL三口燒瓶中加入0.05mol2，3，3-三甲基吲哚、0.lOmol2-溴乙氧基苯和10mL鄰二氯苯作為溶劑，在氬氣保護(hù)下回流反應(yīng)28小時(shí)。反應(yīng)體系冷卻至室溫后向其中加入適量乙酸乙酯，超聲波振蕩使產(chǎn)物析出，在乙酸乙酯中研磨后過濾，得到棕紅色塊狀物，直接用于下步反應(yīng)。取該棕紅色產(chǎn)物0.005mol，異佛爾酮0.0025mol和4mL苯、3mL正丁醇、3mL吡啶作為溶劑一起放入50mL三口燒瓶中，在氬氣保護(hù)下攪拌并加熱至回流，反應(yīng)6小時(shí)后停止。冷卻至室溫后向其中加入過量乙醚使產(chǎn)物析出，過濾，并用適量乙醚洗滌后干燥，得到深藍(lán)色固體。該深藍(lán)色固體通過硅膠柱層析的方法進(jìn)行純化，用洗脫液乙酸乙酯石油醚=5:05:l梯度洗脫，收集藍(lán)色組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后在45t:條件下真空干燥箱中干燥24小時(shí)，得到標(biāo)題化合物，收率33%。最大吸收峰638nm(甲醇/乙二醇)MS(EI)C46H51BrN202m/z:663.9[M-Br]+。實(shí)施例7本發(fā)明實(shí)施例化合物吸收峰測(cè)定精確稱取一定量的本發(fā)明實(shí)施例化合物充分溶解在2.5mL甲醇/乙二醇(體積比例50:50)中，配制成濃度為5mM的溶液，取5uL該溶液稀釋在2mL甲醇/乙二醇溶液中，遮光密閉條件下分別放置在0t:、2(TC和4(TC和6(TC環(huán)境中48小時(shí)，然后在紫外-可見光分光光度計(jì)(型號(hào)Uvmini-1240)上測(cè)定其最大吸收峰位置。Dye-l在不同溫度下放置后的吸收峰如圖l所示。從圖中可以得知，其最大吸收峰位置不隨溫度的變化而發(fā)生漂移，從而可以很好的與激光器的激發(fā)波長(zhǎng)相匹配。表1給出dye-l、dye-2、dye-4、dye-5、dye-6在不同溫度下放置48小時(shí)后的最大吸收峰-變化。表l24<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>對(duì)比表中的數(shù)據(jù)得知，本發(fā)明實(shí)施例化合物在不同的溫度下放置48小時(shí)后最大吸收峰不發(fā)生變化。實(shí)施例8M日月輔證洽驗(yàn)ZJ享麵巾白權(quán)急斜牛測(cè)lg將化合物Dye-l配成1X10—5M的乙醇溶液裝入可以密封的石英比色皿中。使用50g/L的亞硝酸鈉溶液盛于一個(gè)長(zhǎng)方體玻璃缸中做截止濾光器，濾去波長(zhǎng)小于400nm的紫外光。另外，亞硝酸鈉溶液也能起到冷阱的作用，使樣品的溫度保持常溫。測(cè)定樣品的初始吸光度值后，選用500W碘鎢燈作為光源，距離樣品20cm處，通電光照，計(jì)時(shí)。間隔2、4、8、12、20、40小時(shí)后，分別測(cè)量樣品光照后的吸光度值。如圖2所示，經(jīng)過一段時(shí)間的光照后，化合物Dye-l沒有顯示明顯的褪色現(xiàn)象，這說明該化合物具有一定的光穩(wěn)定性，可以穩(wěn)定的在乙醇溶液中儲(chǔ)存。所用儀器為紫外可見分光光度計(jì)，型號(hào)為Uvmini-1240。實(shí)施例9本發(fā)明實(shí)施例化合物在磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中的光穩(wěn)定件測(cè)l定將化合物Dye-1配成IX10—5M的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液裝入可以密封的比色皿中。使用50g/L的亞硝酸鈉溶液盛于一個(gè)長(zhǎng)方體玻璃缸中做截止濾光器，濾去波長(zhǎng)小于400nm的紫外光。另外，亞硝酸鈉溶液也能起到冷阱的作用，使樣品的溫度保持常溫。測(cè)定樣品的初始吸光度值后，選用500W碘鎢燈作為光源，距離樣品20cm處，通電光照，計(jì)時(shí)。間隔2、4、6、8、10、20小時(shí)后，分別測(cè)量樣品光照后的吸光度值。如圖3所示，該化合物在PBS溶液中光照2小時(shí)褪色率就達(dá)到了73%，光照4小時(shí)后褪色率為87%，光照6小時(shí)后褪色率超過了90%，說明在磷酸鹽緩沖液中該化合物的穩(wěn)定性較差，在很短的時(shí)間內(nèi)就可以分解成無色的物質(zhì)。所用儀器為紫外可見分光光度計(jì)，型號(hào)為Uvmini-1240。結(jié)合實(shí)施例8可以看出，該類化合物固體顆粒以及在醇溶液中具有良好的光穩(wěn)定性，有利于穩(wěn)定的保存和使用。使用后化合物處于磷酸鹽緩沖溶液體系中，則表現(xiàn)出良好的光不穩(wěn)定性，可以在較短的時(shí)間內(nèi)分解成無色的物質(zhì)，從而顯示出對(duì)使用者和環(huán)境的友好性。實(shí)施例10化合物Dye-l作為有核紅細(xì)胞測(cè)試試劑在2mL含有化合物Dye_l的有核紅細(xì)胞測(cè)定試劑中加入10uL經(jīng)過抗凝劑處理的血液，調(diào)制成測(cè)試樣品，吸入經(jīng)過適當(dāng)改造的流式細(xì)胞分析儀(中國(guó)專利CN101000306A深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，測(cè)定樣品的前方低角散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度和散射光強(qiáng)度辨別試樣中的嗜堿性細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和白細(xì)胞并分類計(jì)數(shù)，算出它們的細(xì)胞比率。有核紅細(xì)胞比率通常用每ioo個(gè)白細(xì)胞出現(xiàn)的有核紅細(xì)胞的百分率標(biāo)示，單位記為"個(gè)/100WBC"。圖4顯示了有核紅細(xì)胞熒光與白細(xì)胞熒光的對(duì)比，其中有核紅細(xì)胞在總白細(xì)胞中所占的比例為5.9%。實(shí)施例11化合物Dye-2作為有核紅細(xì)胞測(cè)試試劑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>在2mL含有化合物Dye_2的有核紅細(xì)胞測(cè)定試劑中加入10uL經(jīng)過抗凝劑處理的血液，調(diào)制成測(cè)試樣品，吸入經(jīng)過適當(dāng)改造的流式細(xì)胞分析儀(中國(guó)專利CN101000306A深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，測(cè)定樣品的前方低角散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度和散射光強(qiáng)度辨別試樣中的嗜堿性細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和白細(xì)胞并分類計(jì)數(shù)，算出它們的細(xì)胞比率。有核紅細(xì)胞比率通常用每ioo個(gè)白細(xì)胞出現(xiàn)的有核紅細(xì)胞的百分率標(biāo)示，單位記為"個(gè)/100WBC"。圖5顯示了有核紅細(xì)胞熒光與白細(xì)胞熒光的對(duì)比，其中有核紅細(xì)胞在總白細(xì)胞中所占的比例為3.2%。實(shí)施例12仆,，Dve-3條裕亥會(huì)T麵測(cè)li式i式齊llEtOOCCOOEt在2mL含有化合物Dye-3的有核紅細(xì)胞測(cè)定試劑中加入10uL經(jīng)過抗凝劑處理的血液，調(diào)制成測(cè)試樣品，吸入經(jīng)過適當(dāng)改造的流式細(xì)胞分析儀(中國(guó)專利CN101000306A深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，測(cè)定樣品的前方低角散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度和散射光強(qiáng)度辨別試樣中的嗜堿性細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和白細(xì)胞并分類計(jì)數(shù)，算出它們的細(xì)胞比率。有核紅細(xì)胞比率通常用每ioo個(gè)白細(xì)胞出現(xiàn)的有核紅細(xì)胞的百分率標(biāo)示，單位記為"個(gè)/100WBC"。圖6顯示了有核紅細(xì)胞熒光與白細(xì)胞熒光的對(duì)比，其中有核紅細(xì)胞在總白細(xì)胞中所占的比例為1.3%。實(shí)施例13仆,，Dve-4條裕亥會(huì)T麵測(cè)li式i式齊ll在2mL含有化合物Dye_4的有核紅細(xì)胞測(cè)定試劑中加入10uL經(jīng)過抗凝劑處理的血液，調(diào)制成測(cè)試樣品，吸入經(jīng)過適當(dāng)改造的流式細(xì)胞分析儀(中國(guó)專利CN101000306A深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，測(cè)定樣品的前方低角散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度和散射光強(qiáng)度辨別試樣中的嗜堿性細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和白細(xì)胞并分類計(jì)數(shù)，算出它們的細(xì)胞比率。有核紅細(xì)胞比率通常用每ioo個(gè)白細(xì)胞出現(xiàn)的有核紅細(xì)胞的百分率標(biāo)示，單位記為"個(gè)/100WBC"。圖7顯示了有核紅細(xì)胞熒光與白細(xì)胞熒光的對(duì)比，其中有核紅細(xì)胞在總白細(xì)胞中所占的比例為0.9%。實(shí)施例14化合物Dye-5作為有核紅細(xì)胞測(cè)試試劑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>在2mL含有化合物Dye_5的有核紅細(xì)胞測(cè)定試劑中加入10uL經(jīng)過抗凝劑處理的血液，調(diào)制成測(cè)試樣品，吸入經(jīng)過適當(dāng)改造的流式細(xì)胞分析儀(中國(guó)專利CN101000306A深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，測(cè)定樣品的前方低角散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度和散射光強(qiáng)度辨別試樣中的嗜堿性細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和白細(xì)胞并分類計(jì)數(shù)，算出它們的細(xì)胞比率。有核紅細(xì)胞比率通常用每100個(gè)白細(xì)胞出現(xiàn)的有核紅細(xì)胞的百分率標(biāo)示，單位記為"個(gè)/100WBC"。圖8顯示了有核紅細(xì)胞熒光與白細(xì)胞熒光的對(duì)比，其中有核紅細(xì)胞在總白細(xì)胞中所占的比例為2.5%。實(shí)施例15仆,，Dve-6條裕亥會(huì)T麵測(cè)li式i式齊ll在2mL含有化合物Dye_6的有核紅細(xì)胞測(cè)定試劑中加入10uL經(jīng)過抗凝劑處理的血液，調(diào)制成測(cè)試樣品，吸入經(jīng)過適當(dāng)改造的流式細(xì)胞分析儀(中國(guó)專利CN101000306A深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，測(cè)定樣品的前方低角散射光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度和散射光強(qiáng)度辨別試樣中的嗜堿性細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和白細(xì)胞并分類計(jì)數(shù)，算出它們的細(xì)胞比率。有核紅細(xì)胞比率通常用每ioo個(gè)白細(xì)胞出現(xiàn)的有核紅細(xì)胞的百分率標(biāo)示，單位記為"個(gè)/100WBC"。圖9顯示了有核紅細(xì)胞熒光與白細(xì)胞熒光的對(duì)比，其中有核紅細(xì)胞在總白細(xì)胞中所占的比例為2.3%。已通過上述各實(shí)施方案和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，在不偏離本發(fā)明宗旨和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明作出各種修改、變更和替換。權(quán)利要求一種具有通式I結(jié)構(gòu)的化合物其中R1、R2各自獨(dú)立選自C1-18烷基COOR6、C1-18烷基OR6和芐基，其中芐基由選自以下的取代基任選取代鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、鹵代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基，并且R1和R2不同時(shí)為芐基；R6每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立為H、C1-18烷基或者苯基，其中苯基由選自以下的取代基任選取代鹵素、羥基、巰基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、雜環(huán)基、鹵代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基；X為CH2、C(CH3)2、O、S或Se；Y為-CH2-CH＝CH-、各自獨(dú)立為R3、R4和R5各自獨(dú)立選自H、鹵素、氰基、羥基、C1-18烷基、C1-18烷基磺酸基、磺酸基和C1-5烷基COOR7；R7為H或C1-6的烷基；Z-為陰離子。F2008102171409C0000011.tif,F2008102171409C0000012.tif,F2008102171409C0000013.tif,F2008102171409C0000021.tif,F2008102171409C0000022.tif,F2008102171409C0000023.tif2.權(quán)利要求1的化合物，其中&、12各自獨(dú)立選自(V6烷基C00Re、C卜6烷基0R6和芐基，且I^和&不同時(shí)為芐基。3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的化合物，其中R6每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立為H、C卜6烷基或者苯基。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的化合物，其中R3、R4和Rs各自獨(dú)立為H、鹵素、氰基、羥基、6烷基、C卜6烷基磺酸基、磺酸基或C卜5烷基C00R7。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的化合物，其中X為C(CH》2、0或S。\6.<image>imageseeoriginaldocumentpage3</image>7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的化合物，其中Z—為選自鹵素離子、C1(V、PF6—、CF3S03—、BF4—、乙酸根或?qū)妆交撬岣?fù)離子的陰離子。8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的化合物，所述化合物為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>9.一種綴合物，所述綴合物包含權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的化合物。10.—種用于生物樣品染色的組合物，其中所述組合物包含權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的化合物或權(quán)利要求9的綴合物。11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述生物樣品選自肽、蛋白質(zhì)、核酸和血液中的有核紅細(xì)胞。12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述蛋白質(zhì)選自抗體、抗體片斷和單鏈抗體。13.權(quán)利要求ll的組合物，其中所述核酸選自脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、適體和肽核酸(PNA)。14.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的化合物、權(quán)利要求9的綴合物或權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)的組合物在對(duì)生物樣品進(jìn)行染色中的用途。全文摘要提供了一種用于生物樣品染色的式I表示的花菁類化合物，其中R1、R2、X、Y、A1和A2如說明書中的定義。該類化合物具有良好的光照穩(wěn)定性，最大吸收峰位置在640nm附近，且不隨環(huán)境溫度的變化而變化，與核酸結(jié)合后化合物/核酸復(fù)合物熒光強(qiáng)度增加迅速，光譜在近紅外區(qū)，在流式細(xì)胞分析儀中作為核酸染色劑使用可以有效降低背景熒光的干擾，提高檢測(cè)的精度。同時(shí)所提供的化合物可以作為血液中有核紅細(xì)胞的染色劑使用。文檔編號(hào)C07D209/10GK101723874SQ200810217140公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2008年10月31日優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日發(fā)明者徐兵,邵建輝申請(qǐng)人:深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司