專利名稱：抑制腫瘤生長的融合肽及其在制備抗腫瘤藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抑制腫瘤生長的融合肽以及該融合肽在制備抗腫
瘤藥物中的用途。具體而言，本發(fā)明涉及含有(PUMA) BH3的融合 肽，及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病。雖然隨著手術(shù)、化 療、放療水平的提高，惡性腫瘤患者的生存率已經(jīng)有了較大提高，但 仍然嚴重地威脅著患者的生命與健康。傳統(tǒng)的腫瘤化療手段針對腫瘤 的靶向性差、副作用大，尋找和發(fā)展具有高效腫瘤殺傷活性、腫瘤耙 向性的新治療藥物是征服惡性腫瘤這一頑癥面臨的迫切要求。腫瘤的 生物治療是繼手術(shù)、放療、化療方法之后的新興治療方法，具有廣闊 的發(fā)展前景。
細胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結(jié)束細胞生命的過程， 它的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、治療及預(yù)后息息相關(guān)。細胞凋亡機制的紊亂 導(dǎo)致惡性腫瘤細胞跨過細胞周期的檢驗點而無限制增長。PUMA (p53 up-regulated modulator of apoptosis)是2001年發(fā)J見的可被內(nèi)、外源性 p53快速誘導(dǎo)、具有強大促凋亡作用的Bd-2蛋白家族的一員。PUMA 基因定位于19q ，其cDNA長1.9kb，編碼一個由193個氨基酸殘基 組成的蛋白，該蛋白定位于線粒體膜上。PUMA以p53依賴和p53不 依賴兩條通路誘導(dǎo)凋亡，而且PUMA促凋亡的作用是快速、強大的。 表達PUMA的結(jié)直腸癌細胞DLD1比表達P53的DLD1細胞早9小時 出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)的改變。在U20S、 H1299及SH-SY5Y細胞中，無論 細胞的p53基因型如何，轉(zhuǎn)染PUMA后細胞生長均可被顯著抑制、克 隆形成減少。用基因敲除和RNA干擾方法研究發(fā)現(xiàn)，PUMA表達缺失 產(chǎn)生的實驗動物表型與p53缺失表型相似。我們目前的研究結(jié)果顯示 在凋亡通路中位于p53下游的PUMA在誘導(dǎo)凋亡方面所起的作用不亞于p53，但是對于該基因的調(diào)控機制、作用機理等方面的問題亟待深入 研究。
PUMA和Bik、 Bad、 Bid、 Bim、 Hrk/DP5及線蟲Eg-l等Bcl-2家 族中的促凋亡成員一樣，只存在一個BH3(Bcl-2Homology)結(jié)構(gòu)域，稱 為BH3僅有蛋白。BH3僅有蛋白是一類結(jié)構(gòu)上各不相同的Bcl-2蛋白 家庭的成員。遺傳學(xué)實驗顯示這些蛋白是從線蟲到小鼠細胞程序性死 亡的重要的起動因子。BH3僅有蛋白之間或者與其它Bcl-2家族成員之 間的共同點是它們都有一個由9個氨基酸殘基組成的BH3結(jié)構(gòu)域。結(jié) 構(gòu)突變分析顯示BH3結(jié)構(gòu)域?qū)τ诮Y(jié)合于Bcl-2樣凋亡抑制蛋白并啟動 凋亡所必須的。當BH3僅有蛋白通過其BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2及其相關(guān) 凋亡抑制蛋白上的溝槽相互作用時就會啟動凋亡過程。PUMA的BH3 結(jié)構(gòu)域(LRRMADDLN)，位于其氨基酸序列的141-149位，是其誘導(dǎo) 凋亡必不可少的，缺少此結(jié)構(gòu)域的PUMA突變體失去誘導(dǎo)凋亡的功能。 除此結(jié)構(gòu)域外，PUMA不存在其他已知的功能結(jié)構(gòu)域。PUMA通過BH3 結(jié)構(gòu)域與其他Bd-2家族蛋白相互作用，誘導(dǎo)細胞色素c釋放，激活 caspase-3 、 caspase-9 ，引起凋亡。鑒于PUMA的誘導(dǎo)凋亡的強大作 用并且缺失BH3結(jié)構(gòu)域的PUMA失去其誘導(dǎo)凋亡的作用，我們認為 PUMA-BH3可能具有較強的誘導(dǎo)凋亡的作用。BH3結(jié)構(gòu)域的功能及其 結(jié)構(gòu)特點使我們可以以BH3為基礎(chǔ)設(shè)計模擬藥物來阻斷特定的凋亡抑 制靶點，促使腫瘤細胞凋亡。
許多腫瘤具有p53途徑及其他PUMA上游調(diào)控分子的缺陷，進而 導(dǎo)致了在這些腫瘤細胞中BH3僅有蛋白Puma和Noxa等凋亡通路的功 能缺陷。這種情況下，直接指向Bd-2等促生存蛋白并抑制其功能的 BH3模擬藥物可能能夠有效地誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，達到治療腫瘤 的目的。兩種方法產(chǎn)生的BH3可能具有腫瘤治療應(yīng)用前景其一是利 用修飾的BH3小肽，Bid-BH3小肽經(jīng)修飾后能誘導(dǎo)白血病細胞發(fā)生凋 亡；其二是模擬BH3的結(jié)構(gòu)設(shè)計非肽類的有機化合物與Bcl-2等促生 存蛋白的溝槽結(jié)合，抑制其功能，達到促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡的目的。
肽藥物是一類前景光明的抗腫瘤藥物的發(fā)展方向，具有低毒性、 低組織蓄積性、高生物活性、特異結(jié)合相應(yīng)分子結(jié)構(gòu)等優(yōu)點。然而， 肽藥物在體內(nèi)的低生物利用度會限制其發(fā)揮應(yīng)有的生物學(xué)功能，因此
4也削弱了其對疾病的治療效果。提高肽類藥物在體內(nèi)的生物利用度， 是肽類抗腫瘤藥物研究急需解決的問題。在不影響肽藥物生物功能的 情況下盡量減少肽藥物的長度是目前該類藥物的發(fā)展方向(小肽藥 物)。小肽藥物不但能提高生物利用度，而且還減小了機體對藥物產(chǎn)生 免疫反應(yīng)的可能性。選擇特異性小肽作用于腫瘤發(fā)生時所需的調(diào)控因 子等，封閉其活性位點，可防止腫瘤發(fā)生?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)很多腫瘤相關(guān) 基因及腫瘤產(chǎn)生調(diào)控因子，篩選與這些靶點特異結(jié)合的多肽，已成為 尋找抗癌藥物的新熱點。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些能夠抑制腫瘤生長的小肽，
如抑制E2F/DNA結(jié)合的20-肽、抑制uPA/uPAR相互作用的13-肽、抑 制腫瘤轉(zhuǎn)移的具有RGD序列的小肽等。但單獨應(yīng)用肽藥物時其耙向性較差。
多種腫瘤細胞高表達一系列的細胞表面受體，而正常組織中的該 受體低表達。例如多種腫瘤類型中特異性高表達CXC (C-X-C motif) 趨化因子受體，乳腺癌中高表達HER2受體，卵巢癌中高表達促性腺 激素釋放激素(GnRH)受體。這些受體可以作為藥物特異性識別的耙 點。通過這些受體與其相應(yīng)受體的特異性識別，可大大提高轉(zhuǎn)導(dǎo)藥物 的效率。其中CXC趨化因子受體(CXCR4)在正常組織中表達較低， 而至少在23種腫瘤細胞中高表達，如結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、 卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、前列腺癌、急性骨髓性白血病、慢性 淋巴細胞性白血病、黑色素瘤、宮頸癌、結(jié)腸癌、腎癌或非霍奇金氏 淋巴瘤等，CXCR4的配體DV3含有11個氨基酸殘基 (LGASWHRPDKG)，具有體積小、方便合成等優(yōu)點，是藥物耙向性的 較理想選擇。但單純的受體/配體介導(dǎo)的藥物的攝取率非常低，并且 常將攝取的藥物傳遞入細胞內(nèi)吞作用途徑，導(dǎo)致蛋白藥物被降解。
蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)是一種將生物活性蛋白轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)部的新策略。最近發(fā) 現(xiàn)一些帶正電荷的肽轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(peptide transduction domains, PTD) 能以劑量依賴、受體非依賴的巨胞飲作用穿透細胞膜進入細胞漿，如 HIV-l反式激活因子(HIV-l TAT)、單純皰疹病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP22和聚 精氨酸poly-Arg等。PTD已經(jīng)能成功用于轉(zhuǎn)導(dǎo)生物活性蛋白、肽和核 酸等。HIV-1TAT是其中最令人矚目的一個PTD成員，其最短有效結(jié) 構(gòu)域為YGRKKRRQRRR，它不但能夠以接近100%的高效率在極短的時間內(nèi)(被轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白可在io分鐘內(nèi)在細胞內(nèi)出現(xiàn))轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶的蛋白
/肽、核酸、甚至納米金屬顆粒進入處于分裂期和非分裂期的各種哺乳 動物細胞，而且未發(fā)現(xiàn)任何毒性作用，TAT使轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白/肽通過巨胞 飲作用進入細胞。巨胞飲作用是非受體依賴的,以此種方式攝入的蛋白/ 肽比內(nèi)吞作用更容易釋放到胞漿中發(fā)揮作用。但這種巨胞飲作用是非
選擇性的內(nèi)吞作用，缺乏細胞的特異性，因此TAT通常用作體外細胞
的蛋白(核酸等)轉(zhuǎn)導(dǎo)或體內(nèi)非特異性的小分子藥物轉(zhuǎn)導(dǎo)。近兩年已
經(jīng)有研究者利用TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤抑制蛋白/肽殺傷腫瘤細胞的細胞培養(yǎng)實 驗和動物實驗，如p53、 TRAIL等，局部注射的TAT-蛋白/肽對于實驗 動物的移植瘤產(chǎn)生了良好的轉(zhuǎn)導(dǎo)及治療作用。
綜上所述，在現(xiàn)有技術(shù)中雖然有關(guān)于抗腫瘤的小肽用于抗腫瘤治 療的報道，但其均是單獨應(yīng)用或與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列融合使用或與針對腫 瘤細胞高表達的細胞受體的配體融合使用，尚未見到有將抗腫瘤的小 肽與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列和針對腫瘤細胞高表達的細胞受體的配體共同融合 以同時提高抗腫瘤小肽的生物利用度和耙向性的報道。

發(fā)明內(nèi)容
因此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，特別是現(xiàn)有抗腫瘤肽藥物 研發(fā)中的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種融合肽及其抑制腫瘤生長 的用途。
因此，本發(fā)明提供一種抑制腫瘤生長的融合肽，其特征在于包含
a) 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列；
b) 腫瘤細胞高表達的細胞表面受體序列的配體序列；和
c) 序號為SEQ. ID. NO. 3的小肽序列。
根據(jù)本發(fā)明的融合肽，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列選自HIV-1TAT、單純皰疹病 毒結(jié)構(gòu)蛋白VP22或聚精氨酸poly-Arg肽轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
根據(jù)本發(fā)明的融合肽，優(yōu)選的是，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列是序號為SEQ.ID. NO. 1的HIV-1 TAT。
根據(jù)本發(fā)明的融合肽，腫瘤細胞高表達的細胞表面受體序列的配 體序列選自CXC趨化因子受體、HER2受體或促性腺激素釋放受體的 配體。優(yōu)選的腫瘤細胞高表達的細胞表面受體序列的配體序列是序號為
SEQ. ID. NO. 2的CXC趨化因子受體的配體DV3。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述融合肽是序號為SEQ. ID. NO. 5
序列的融合肽。
本發(fā)明的另一個目的在于提供所述的融合肽在制備抗腫瘤藥物中 的用途。所述腫瘤選自結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng) 膠質(zhì)瘤、胰腺癌、前列腺癌、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白 血病、黑色素瘤、宮頸癌、結(jié)腸癌、腎癌或非霍奇金氏淋巴瘤。
換言之，在本發(fā)明技術(shù)方案中，本發(fā)明提供一種抑制腫瘤生長的 融合肽，其包含通過巨胞飲作用將抗腫瘤小肽高效率轉(zhuǎn)導(dǎo)入目標腫瘤 細胞的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列、提高所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列靶向性使特異地轉(zhuǎn)導(dǎo)入 高表達某種腫瘤細胞高表達的細胞表面受體的腫瘤細胞的配體序列以 及序號為SEQ. ID. NO. 3的能抑制腫瘤生長的小肽序列(PUMA)BH3。 通過融合所述三段序列，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)能力、對腫瘤細胞 的特異性和抗腫瘤小肽的抗腫瘤能力有機地聯(lián)合起來，達到了單獨應(yīng) 用抗腫瘤小肽或抗腫瘤小肽與其它兩種片段任一種單獨融合所達不到 的效果。
優(yōu)選地，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列選自HIV-1反式激活因子TAT、單純皰疹 病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP22或聚精氨酸poly-Arg肽轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序 列，最優(yōu)選地，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列是序號為SEQ.ID.NO. 1的HIV-1 TAT。
優(yōu)選地，腫瘤細胞高表達的細胞表面受體序列的配體序列是選自 CXC趨化因子受體、HER2受體或促性腺激素釋放受體序列的配體序 列，最優(yōu)選地，所述配體序列是序號為SEQ. ID. NO. 2的CXC趨化因 子受體的配體DV3。最優(yōu)選地，本發(fā)明融合肽是為SEQ. ID. NO. 5的 融合肽序列。本發(fā)明使用的序列見表l。
本發(fā)明的第二個目的是提供本發(fā)明融合肽在制備抗腫瘤藥物中的 用途，優(yōu)選地，所述腫瘤為實體瘤，包括例如結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、 乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、前列腺癌、急性骨髓性白血 病、慢性淋巴細胞性白血病、黑色素瘤、宮頸癌、結(jié)腸癌、腎癌或非 霍奇金氏淋巴瘤。


圖l:用60pMTAT-DV3-BH3與細胞共培養(yǎng)72hr后，每孔加10pL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)lhr， 450nm與630nm雙波長下測定各孔吸光度，計 算各組細胞的抑制率。結(jié)果表明設(shè)計的融合肽能抑制多種腫瘤細胞的 生長，而對永生化的正常細胞的生長沒有顯著影響。
圖2: 濃度為60|iM的(PUMA)BH3、 TAT-DV3禾卩TAT-DV3-BH3 分別與HCT116P53+/+、 HCT116P53;和HEK283細胞共培養(yǎng)72hr后，每 孔加10|aLCCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2hr， 450nm與630nm雙波長下測定各孔 吸光度，計算各組細胞的存活率；用單因素方差分析比較3條多肽對 各組細胞存活率，結(jié)果表明，(PUMA)BH3和TAT-BH3對各組細胞存 活率影響差異無顯著性(P>0.05),只有TAT-DV3-BH3能明顯抑制 HCT116P53+/4^Q HCT116P"一細胞生長，這兩組細胞的存活率分別為 33.29%和31.53%，而對照組細胞HEK293的存活率為119.75%，差異 有極顯著性(PO.Ol)。此圖表明只有融合肽TAT-DV3-BH3對腫瘤細 胞的生長有作用，而單獨BH3和TAT-DV3序列對腫瘤細胞的生長沒有 顯著影響。而且，融合肽TAT-DV3-BH3對永生化的人胚腎細胞HEK293 的生長沒有顯著影響，表明了對TAT-DV3-BH3對腫瘤細胞作用的特異 性。
圖3: TAT-DV3-BH3在細胞中的分布。紅色為線粒體染上了線粒 體特異染料Mito Tracker Red CMXRos ，綠色為帶FITC標記的肽；作 用0.5hr， TAT-DV3-BH3主要分布在細胞膜上，當作用時間延長至lhr 和24hr時，TAT-DV3-BH3主要分布在胞漿和胞膜上，胞核末見分布， 標尺代表10(im。此圖表明融合肽TAT-DV3-BH3可在較短時間內(nèi)進入 細胞，并且分布于線粒體分布區(qū)。(轉(zhuǎn)換為黑白圖片時可能會表現(xiàn)為不 同亮度的灰度)
圖4:不同多肽與HCT116P53+z+、HCT116P53-八和HEK293共培養(yǎng)72hr 后，收獲細胞，用70%乙醇固定細胞后經(jīng)流式細胞儀分析細胞凋亡率。 上圖為流式細胞儀分析細胞凋亡率直方圖，A-F為HCT116P^+各組， G—L為HCT116P53—A各組，M—R為HEK293各組；下圖為各組細胞凋 亡率條圖，60pM TAT-DV3-BH3處理結(jié)腸癌細胞凋亡率與其他所有組比較差異有極顯著性(PO.Ol)，其他各組間比較，差異無顯著性。此圖
表明TAT-DV3-BH3誘導(dǎo)細胞發(fā)生了凋亡。
圖5:熒光顯微鏡下觀察經(jīng)TAT-DV3-BH3處理的細胞凋亡形態(tài)的 變化。染色劑為DAPI。此圖顯示腫瘤細胞經(jīng)TAT-DV3-BH3處理后發(fā) 生凋亡后的形態(tài)學(xué)變化。
圖6: Western Blot分析不同濃度TAT-DV3-BH3處理結(jié)腸癌細胞 72h，分析Caspase9、 Caspase8酶原及其活性形式、Caspase3酶原水平， 證實了該融合肽激活了細胞凋亡通路。
圖7:裸鼠體重隨實驗時間變化。第0天為第1次注射前測量的體 積，注射時間為第1天至第7天，每次注射藥物前測量裸鼠體重，每 次測量各組體重差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，(P>0.05)，表明該融合肽的處理 未對實驗動物產(chǎn)生明顯的副作用。
圖8:腫瘤體積隨時間變化圖。第0天為第1次注射前測量的體積， 注射時間為第1天至第7天，測量體積時間為每次注射前，從第12天 開始，TAT-DV3-BH3組的瘤體積與其它3組體積差異有統(tǒng)計學(xué)意義， P<0.05。此圖表明TAT-DV3-BH3處理后的腫瘤生長受到明顯抑制。
圖9:各組裸鼠處死后瘤重比較。TAT-DV3-BH3組的瘤重與其它 3組瘤差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。
圖10:各組裸鼠處死后荷瘤及瘤塊排列。上圖為各組荷瘤裸鼠， 下圖為各組瘤塊排列。
圖ll:尾靜脈注射多肽后3hr，各組裸鼠經(jīng)三溴乙醇麻醉后置于活 體生物發(fā)光與熒光分析系統(tǒng)中排列。
圖12:尾靜脈注射后3hr，處死裸鼠取出腫瘤塊及各主要臟器自然 光下排列。
圖13:尾靜脈注射各多肽及PBS后3hr，處死裸鼠取出腫瘤塊及 各主要臟器置于活體生物發(fā)光與熒光分析系統(tǒng)中排列。此圖表明該融 合肽經(jīng)尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)后能靶向性地分布于體內(nèi)的腫瘤。
具體實施例方式
通過參考下述的一些具體實施例可進一步理解本發(fā)明，這些實施 例僅用于說明本發(fā)明，其無意于對本發(fā)明的范圍做出任何限制。顯然，
9可以對本發(fā)明做出多種改動和變化而不脫離本發(fā)明的實質(zhì)，因此，這 些改動和變化同樣在本申請要求保護的范圍內(nèi)。
實施例1多肽(PUMA)BH3、 TAT-DV3和TAT-DV3-BH3的合成 實驗結(jié)果顯示(PUMA)BH3結(jié)構(gòu)域的耙向融合肽可以抑制一些腫 瘤細胞的生長，表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性。因此，從上海吉爾生物科 技有限公司合成了含(PUMA)BH3結(jié)構(gòu)域的靶向融合肽及2段對照多 肽。所有合成多肽均通過反相高效液相色譜純化，純度均>95%，氨基 酸序列通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析驗證，并在各肽的N端添加FITC。 各肽名稱為(PUMA)BH3、 TAT-DV3禾B TAT-DV3-BH3，序列如表1所 示。
表l:
序列名稱
SEQ. ID. NO. 1 HIV誦1 TAT
SEQ. ID. NO. 2 DV3
SEQ. ID. NO. 3 (PUMA)BH3
SEQ. ID. NO. 4 TAT-DV3
SEQ. ID. NO. 5 TAT-BH3-DV3
實施例2融合肽TAT-DV3-BH3對細胞生長抑制實驗 從已知的CXCR4過表達的腫瘤細胞中選擇5株細胞人結(jié)腸癌細胞 HCT116P53+/，nHCT116P53^、人肺腺癌細胞系GLC-82、人乳腺癌細胞系 MDA-MA-231、人胃癌細胞系SGC-7901 ， 2株非腫瘤細胞人胚肺成纖 維細胞2BS和人胚腎成纖維細胞HEK293。其中2種結(jié)腸癌細胞一個是 P53野生型HCT116P53+ 另一個是P53缺失型HCT116P53—、如果我們合 成的多肽如同我們的設(shè)想，按PUMA (BH3)通路誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡的 話，那么多肽對這2株細胞的作用應(yīng)該是沒有明顯差異的，也就是說凋 亡的發(fā)生與P53的存在與否無關(guān)。用多肽TAT-DV3-BH3對以上7種人腫 瘤細胞進行細胞生長抑制實驗。具體操作參照Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan, Cat No: CK04-13)試劑盒說明書。簡單地說，細胞按5000/wdl接種于96孔板，培養(yǎng)24hr后吸去原培養(yǎng)液，分別加上終濃度為
60(aM的TAT-DV3-BH3;然后繼續(xù)培養(yǎng)72hr，吸去含有多肽培養(yǎng)液，每
孔再加100jiL (含CCK-8 lO)iL)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)lhr，用Bio-Rad 680
酶標儀，測定波長450nm、參比波長630nm，測定每孔的吸光度，存活
率(％)=100 X (A微纟『A別)/(A劇組-A加)，抑制率(％)=100-存活率(％)。結(jié)
果顯示，用60(iMTAT-DV3-BH3與各細胞共培養(yǎng)72hr后，HCT 116 P53V-
和HCT 116 P53+z+的抑制率分別為67.81。/。和65.72。/。， GLC-82為36.36。/。、
SGC-7901為35.25。/。、 MDA-MA-231為30.21。/。；而HEK293和2BS的抑制
率均為0%;結(jié)果見表2和圖1。
表2 60jiM TAT-DV3-BH3處理各組細胞存活率及抑制率 細 胞 抑制率(％;)~
HCT1161^- 67.81
HCT116P53+/+ 65.72
GLC-82 36.36
SGC-7901 35.25
MDA-MA-231 30.21 HEK293 0 2BS 0
從以上結(jié)果可知，多肽TAT-DV3-BH3對5株腫瘤細胞有明顯抑制 作用，抑制率介于30% 70%之間，對非腫瘤細胞HEK293和2BS沒 有表現(xiàn)出抑制作用，抑制率為0%，這說明我們合成的多肽對這些 CXCR4過表達腫瘤細胞有明顯抑制作用，對CXCR4低表達的非腫瘤 細胞HEK293及2BS沒有抑制作用，表明多肽TAT-DV3-BH3有抑制 腫瘤細胞生長活性，且表現(xiàn)出一定特異性。此外，因為多肽對 HCT116P53一和HCT116P53+z+抑制率相近，說明TAT-DV3-BH3對細胞的 作用與P53存在與否無關(guān)。
實施例3 (PUMA)BH3、 TAT-DV3和TAT-DV3-BH3對細胞生長的
影響
按5000個細胞/孔將HCT116P53+/+、 HCT116P53一和HEK283細胞接種于96孔板，培養(yǎng)24hr后吸去原培養(yǎng)液，分別加上終濃度為60pM的 (PUMA)BH3、 TAT-DV3禾P TAT-DV3-BH3;然后繼續(xù)培養(yǎng)72hr，吸去 含有多肽培養(yǎng)液，每孔再加100pL (含CCK-8 10|iL)培養(yǎng)液，繼續(xù)培 養(yǎng)lhr，用Bio-Rad 680酶標儀，測定波長450腿、參比波長630nm， 測定每孔的吸光度，存活率(。/。)^100X(A實驗組-A空白)/(A對照組-A 空白)，結(jié)果如表3，圖2。
表3濃度為60pM的各段肽對細胞存活率的影響
Cell(PUMA)BH3TAT-DV3TAT-DV3-BH3
HCT116P53+/+101.67±2.8889.01 ±0.3433.29±4.13
HCT116P53-/-m.94土3.86101.49±2.373〗.53 ±0.08
HEK29397.43 ±2.9498.06±3.69119.75±8.28
上述結(jié)果表明，無論是(PUMA)BH3單獨作用，還是用TAT-BH3 處理細胞都不能有效地抑制細胞的生長，而當這兩段肽合而為一成為 融合肽TAT-DV3-(PUMA)BH3時就能明顯抑帝lj HCT116P53+/+和 HCT116^^細胞生長，對非腫瘤細胞HEK293卻沒有抑制作用；說明 (PUMA)BH3與TAT-DV3的組合具有明顯的抑制腫瘤作用，而且具有 腫瘤特異性。
實施例4TAT-DV3-BH3進入細胞與在細胞內(nèi)分布
根據(jù)前面的實驗結(jié)果，TAT-DV3-BH3對HCT116P53^和 HCT116P"+z+細胞有明顯抑制作用，因此闡明其在細胞內(nèi)的分布對分析 其對腫瘤細胞可能的作用機理有一定幫助。
因為合成的多肽帶有FITC標記，用40ixM TAT-DV3-BH3與 HCT116P53一和HCT116P5W+及HEK293細胞共培養(yǎng)0.5hr、 lhr和24hr 后，分別再染線粒體特異性熒光染料Mito Tracker Red CMXRos (Invitrogen, USA， Cat.M7512)，然后于激光共聚集顯微鏡下觀察帶綠色 熒光的多肽在細胞中分布，從圖3可見，共培養(yǎng)0.5hr，多肽主要分布 在胞膜上，胞漿少見分布，胞核沒有分布；共培養(yǎng)延長至lhr時，除胞 膜有分布外，胞漿內(nèi)也有大量的分布，胞核未見有分布；當共培養(yǎng)時 間延長至24hr，多肽只分布在胞膜和胞漿，胞核仍未見有分布。
上述結(jié)果顯示TAT-DV3-BH3能很快從培養(yǎng)基中進入細胞內(nèi)，lhr
12已有大量多肽進入細胞漿，表明該多肽能快速滲入細胞，主要分布中 細胞漿中線粒體分布區(qū)，細胞核未見分布。
實施例5 TAT-DV3-BH3誘導(dǎo)HCT116P5"和HCT116P53悟細胞凋亡 (A)流式細胞術(shù)分析腫瘤細胞凋亡
為評價TAT-DV3-BH3對HCT116P53一和HCT116P53悟細胞生長的抑 制是否是由于細胞凋亡引起的，是否是由(PUMA)BH3所引發(fā)的效應(yīng)， 我們用TAT-DV3和(PUMA)BH3作為對照肽。細胞及劑量分組見表4。
表4流式細胞術(shù)分析腫瘤細胞凋亡率(％)比較
CellCon(O |_iM)TAT-DV3-BH3 (uM) 15 30TAT-DV3(闊 ( 60 60:PUMA)BH3(闊 60
HCTn6，汁 HCT116P53-'-HEK2937.12±1.21 6.19±1.28 7.99±1.343.58±1.32 7.01±1.87 3.12±1.32 17J±3.56 8.18±1.52 6.66士1.4330.80±2.08 30.30±2.69 9.61±1.873.52±0.75 5.80±1.26 6.60±2.002.86±0.45 5.40±1.01 10.60士2.60
結(jié)果表明無論是(PUMA)BH3，還是TAT-DV3對各細胞的凋亡作 用都不如TAT-DV3-BH3明顯，而且TAT-DV3-BH3對HCT116 P53+/1tl HCT116 Ps^的凋亡作用呈現(xiàn)出劑量信賴性。
流式細胞術(shù)分析了 TAT-DV3-BH3對3種細胞引起凋亡數(shù)量的變 化，另外，我們用DAPI染色方法在熒光顯微鏡下觀察了發(fā)生凋亡的細 胞形態(tài)的變化；用60pM TAT-DV3-BH3與HCT116P53—A和HCT116P53+/+ 細胞共培養(yǎng)48hr、 72hr后，分別用lpg/mLDAPI染色，然后熒光顯微 鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)的變化，參見圖4、圖5。從圖5中可以明顯發(fā) 現(xiàn)，對照組細胞核膜完整，染色質(zhì)均勻；48hr細胞核膜已有部分鮍縮， 染色質(zhì)出現(xiàn)固縮，同時出現(xiàn)邊緣化，表明48hr細胞已出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué) 特點；72hr細胞核膜完全碎裂，染色質(zhì)高度固縮并出現(xiàn)片段化，說明 72小時后細胞出現(xiàn)明顯凋亡形態(tài)特點；因此從形態(tài)學(xué)上可以認為多肽 TAT-DV3-BH3是可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌發(fā)生凋亡的。
實施例6細胞凋亡通路驗證
通過前面實驗說明，TAT-DV3-BH3確實對結(jié)腸癌細胞有抑制作用， 而且還能誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，為驗證其是否是通過線粒體凋亡通路進 行，我們采用Western Blotting對凋亡通路上關(guān)鍵蛋白Caspase9、Caspase8和Caspase3進行分析，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明對2株結(jié)腸癌細胞，隨 著多肽TAT-DV3-BH3濃度增大，Caspase3酶原水平是逐漸下降的，說 明Caspase3活性形式是逐漸升高的，這與流式細胞術(shù)分析細胞凋亡率 結(jié)果是一致的；Caspase9酶原水平隨著多肽濃度升高而降低，活性形 式卻隨著多肽濃度升高而升高，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性；Caspase8 酶原在各組細胞中無明顯變化趨勢，而其活性形式水平在各組中表達 很低，表明Caspase8在多肽作用下，被活化量很低，這些表明多肽 TAT-DV3-BH3誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞發(fā)生凋亡是通過Caspase9通路，而不是 通過Caspase8途徑進行的，即認為TAT-DV3-BH3是通過線粒體通路 誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡的，與PUMA的作用通路一致。
實施例7融合肽TAT-DV3-BH3對荷瘤裸鼠體內(nèi)抑瘤實驗
(A) 體內(nèi)成瘤實驗
取5只雌性Nu/Nu (Charles River Laboratories:NU-Foxnlnu)裸鼠， 合格證號SCXK(京)2007-0001)， 4 6周齡，體重為13 15g，每只 裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射體積為200jiL人結(jié)腸癌HCT116P53—A細胞懸液 (含1x107個細胞)，注射后每天觀察一次裸鼠成瘤情況；到第5天有 2只明顯成瘤，第7天有3只成瘤，到第9天有4只成瘤，之后仍只有 4只成瘤；當至20天時，處死裸鼠，取出它們的瘤塊，選擇相對較好 的瘤塊，將瘤塊修剪成1.5mm-2.0mm見方小塊分別移植到6只雌性 Nu/Nu裸鼠的右側(cè)腋窩皮下；當接種后29天，處死裸鼠，同樣將瘤塊 修剪成1.5-2.0mm見方小塊分別移植到36只雌性Nu/Nu裸鼠的右側(cè)腋 窩皮下，待瘤塊長到3-5mm后可進行肽藥物治療。
(B) 體內(nèi)抑瘤實驗
當瘤塊移植入裸鼠體內(nèi)后ll天，根據(jù)瘤塊大小和形狀選出28只荷 瘤裸鼠，按配伍設(shè)計分成4組PBS組、(PUMA)BH3組、TAT-DV3組和 TAT-DV3-BH3組。各肽均用PBS稀釋成1.2mM，每只裸鼠每天瘤內(nèi)注射 O.lmL肽或PBS，連續(xù)注射7天，注射前均測量裸鼠體重及瘤塊體積(體 積=長乂寬2/2)，單位為mm、注射期間及注射完后均是隔一天測量一 次裸鼠體重及瘤塊體積，當有裸鼠腫瘤長至20mm長或者有腫瘤出出潰 爛時就停止測量，然后處死裸鼠，取出腫瘤塊，稱量瘤重量。結(jié)果見圖7、圖8、圖9和圖10。
體內(nèi)抑瘤實驗結(jié)果顯示，整個實驗過程中，各組裸鼠體重間沒有
差異，P>0.05，可認為三組多肽組對裸鼠生長沒有明顯影響，未對治療 裸鼠產(chǎn)生明顯的毒副作用，也說明這三個多肽在該情況下應(yīng)用沒有明 顯毒副作用；TAT-DV3-BH3能明顯延緩荷瘤裸鼠的腫瘤生長，與對照 組和(PUMA)BH3及TAT-DV3組比較，裸鼠平均瘤體積從第12天(即 注射后第3次測量時)差異均有顯著性，PO.05;而(PUMA)BH3及 TAT-DV3組與對照組比較差異沒有顯著性，P>0.05;第20天處死裸鼠 測瘤重也得到與瘤體積同樣的結(jié)果；這表明無論(PUMA)BH3單獨用， 還是TAT-DV3單獨用，都不能抑制荷瘤裸鼠的腫瘤生長，而當TAT-DV3 與(PUMA)BH3連成一條多肽時，就能發(fā)揮抑瘤效應(yīng)，這與前面的體外 實驗結(jié)果相一致。
實施例8融合肽TAT-DV3-BH3在荷瘤裸鼠體內(nèi)分布實驗 取4只荷瘤裸鼠，從尾靜脈分別注射濃度為1.2mM的 TAT-DV3-BH3、 TAT-DV3、 (PUMA)BH3和PBS各O.lmL， 3hr后觀察 活體裸鼠體內(nèi)各多肽帶有的FITC綠色熒光。結(jié)果見圖ll、圖12和圖 13。
由于活體成像系統(tǒng)的敏感性和體內(nèi)藥物的濃度較低，在直接活體 的情況下未能清楚地顯示裸鼠體內(nèi)的綠色熒光；接著處死各裸鼠，取 出瘤塊和主要臟器，再置于活體成像系統(tǒng)中觀察，能清楚地顯示FITC 標記的多肽在裸鼠體內(nèi)各主要臟器的分布。尾靜脈注射3hr后，在活體 熒光分析系統(tǒng)中均不能見到明顯的綠色熒光，只是稍稍見到裸鼠表皮 皺褶處零星的本底綠色熒光；當將裸鼠處死后取出腫瘤塊和各主要臟 器置于成像系統(tǒng)中則可到明顯的綠色熒光，對照組注射PBS各臟器和 腫瘤塊均未見綠色熒光；TAT-DV3-BH3組、TAT-DV3組和BH3組只 在腫瘤塊和代謝器官肝臟、腎臟中可見到綠色熒光，其余臟器未見到 綠色熒光。結(jié)果表明該多肽能特異性地分布于體內(nèi)腫瘤中，并且可能 經(jīng)肝臟和腎臟代謝排出。序列表
a io>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所
〈120>抑制腫瘤生長的融合肽及其在制備抗腫瘤藥物中的川途
<130> 880104CG
〈160〉 5
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
〈211〉 11
<212> PRT
<213> 人
<400〉 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 1 5 10
〈210〉 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Gly Gly Gly Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Gly 1 5 10
〈210〉 3
<211> 12
〈212〉 PRT
<213> 人
<400> 3
Leu Arg Arg Met Ala Asp Asp Leu Asn Ala Gin Tyr 1 5 10
<210> 4
<211〉 25
〈212〉 PRT <213〉人T.序列<220〉
〈221>融合肽 <222> (1). (25)
<400〉 4
Tyr Gly Arg' Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Gly Gly Gly Leu Gly 1 5 10 15
Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Gly 20 25
<210〉 5
<211> 40
<212〉 PRT
<213〉 人工序列
<220〉
<221>融合肽 <222> (1)..(40)
〈400〉 5
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Gly Gly Gly Leu Gly 15 10 15
Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Gly Gly Gly Gly Leu Arg Arg Met 20 25 30
Ala Asp Asp Leu Asn Ala Gin Tyr 35 40
權(quán)利要求
1、一種抑制腫瘤生長的融合肽，其特征在于包含a)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列；b)腫瘤細胞高表達的細胞表面受體序列的配體序列；和c)序號為SEQ.ID.NO.3的小肽序列。
2、 如權(quán)利要求1所述的融合肽，其特征在于a)選自HIV-1 TAT、單 純皰疹病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP22或聚精氨酸poly-Arg肽轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
3、 如權(quán)利要求2所述的融合肽，其特征在于a)是序號為SEQ. ID. NO. 1的HIV-1 TAT。
4、 如權(quán)利要求1所述的融合肽，其特征在于b)選自CXC趨化因子受 體、HER2受體或促性腺激素釋放受體序列的配體序列。
5、 如權(quán)利要求4所述的融合肽，其特征在于b)是序號為SEQ. ID. NO. 2的CXC趨化因子受體序列的配體序列DV3。
6、 如權(quán)利要求l所述的融合肽，其特征在于所述融合肽序列是序號為 SEQ. ID. NO. 5的序列。
7、 如權(quán)利要求1所述的融合肽在制備抗腫瘤藥物中的用途。
8、 如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述腫瘤選自結(jié)腸癌、胃癌、 肺癌、乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、前列腺癌、急性骨髓 性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、黑色素瘤、宮頸癌、結(jié)腸癌、腎 癌或非霍奇金氏淋巴瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開一種抑制腫瘤生長的融合肽，以及該融合肽在制備抗腫瘤藥物中的用途。所述融合肽包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列、腫瘤細胞高表達的細胞表面受體序列的配體序列和序號為SEQ.ID.NO.3的小肽序列。通過融合，在保持蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列對蛋白的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的同時增強了轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向性，從而使抗腫瘤小肽高效特異地進入靶細胞，提高了抗腫瘤肽藥物的生物利用度、靶向性，減小了機體對藥物產(chǎn)生免疫反應(yīng)的可能性。
文檔編號C07K19/00GK101580548SQ20081009754
公開日2009年11月18日 申請日期2008年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月12日
發(fā)明者劉勇軍, 晨 林, 錢海利 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所