抑制calm1與egfr在協(xié)同抑制腫瘤中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了抑制CALM1與EGFR在協(xié)同治療腫瘤中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了一種抑制劑組合的用途所述抑制劑組合包括鈣調(diào)蛋白的編碼基因CALM1（calmodulin1）抑制劑和表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermalgrowth factor receptor,EGFR）抑制劑，并且所述組合用于制備協(xié)同治療腫瘤的藥物組合物。本發(fā)明抑制劑組合能夠有效地協(xié)同抑制腫瘤(尤其是肺癌和腸癌)的生長(zhǎng)，可在靶向治療腫瘤中得到廣泛應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】抑制CALM1與EGFR在協(xié)同抑制腫瘤中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地涉及人CALMl與EGFR基因或其蛋白的協(xié)同腫 瘤治療用途及其相關(guān)藥物。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前腫瘤的基因治療已經(jīng)取得了蓬勃快速的發(fā)展，但是迄今為止，仍然存在很多 需要解決的問(wèn)題。目前用于腫瘤基因治療的基因太少，能抑制腫瘤生長(zhǎng)的基因?yàn)閿?shù)不多，急 需提供更多可利用的基因。另外，由于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過(guò)程是一個(gè)多基因參與、涉 及多條信號(hào)通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，因此單個(gè)基因治療或單一治療方法往往療效有限。
[0003] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)、挖掘并鑒定在臨床上有重要價(jià)值的基因，探索多個(gè)具 有不同抗腫瘤作用機(jī)理的基因聯(lián)合治療以及將多基因靶向藥物聯(lián)合治療。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種CALMl基因協(xié)同EGFR治療腫瘤的用途。
[0005] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種抑制劑組合的用途，所述抑制劑組合包括鈣調(diào)蛋 白的編碼基因 CALMl(calmodulini)抑制劑和表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermalgrowth factor rec印tor，EGFR)抑制劑，并且所述組合用于制備協(xié)同治療腫瘤的藥物組合物。
[0006] 在另一優(yōu)選例中，所述的CALMl來(lái)自于哺乳動(dòng)物，更佳地為嚙齒類動(dòng)物（如小鼠、 大鼠）或人；和/或
[0007] 所述的EGFR來(lái)自于哺乳動(dòng)物，更佳地為嚙齒類動(dòng)物（如小鼠、大鼠）或人。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤包括肺癌、腸癌、胃癌、肝癌、膽囊癌、胰腺癌、乳腺 癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的CALMl抑制劑包括：CALMl的抗體、CALMl核酸的反義 RNA、siRNA、shRNA以及CALMl的活性抑制劑；和/或
[0010] 所述的EGFR抑制劑包括EGFR的抗體、EGFR核酸的反義RNA、siRNA、ShRNA以及 EGFR的活性抑制劑。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的CALMl抑制劑為siRNA、shRNA。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的CALMl抑制劑序列如SEQ ID NO. : 1-2所示。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的EGFR抑制劑包括西妥昔、吉非替尼（gefitinib)、拉帕替 尼（IapatinibX
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的化療劑包括順鉬、紫杉醇、阿霉素。
[0015] 本發(fā)明第二方面，提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括CALMl抑制劑、 EGFR抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還包括化療劑。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的CALMl抑制劑包括：CALMl的抗體、CALMl核酸的反義 RNA、siRNA、shRNA以及CALMl的活性抑制劑；和/或
[0018] 所述的EGFR抑制劑包括EGFR的抗體、EGFR核酸的反義RNA、siRNA、shRNA以及 EGFR的活性抑制劑。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的CALMl抑制劑為siRNA、shRNA。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的CALMl抑制劑序列如SEQ ID NO. : 1-2所示。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的EGFR抑制劑包括西妥昔、吉非替尼（gefitinib)、拉帕替 尼（IapatinibX
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的化療劑包括順鉬、紫杉醇、阿霉素。
[0023] 本發(fā)明第三方面，提供了一種抑制劑組合，所述組合由鈣調(diào)蛋白的編碼基因 CALMl 抑制劑和表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑構(gòu)成。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的CALMl抑制劑包括表達(dá)靶向于CALMl的siRNA或shRNA 的表達(dá)盒或載體；和/或所述的EGFR抑制劑包括表達(dá)靶向于CALMl的siRNA或shRNA的表 達(dá)盒或載體。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒或載體同時(shí)表達(dá)一種以上的抑制劑。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒自5'端至3'依次可操作性連接有以下元件
[0027] 啟動(dòng)子-X-Y-終止密碼子；
[0028] 其中，所述的X或Y元件為選自SEQ ID NO. : 1-2的siRNA;
[0029] 且X與Y不相同。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體含有本發(fā)明第三方面所述的表達(dá)盒。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體包括質(zhì)粒、病毒載體。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的病毒載體包括慢病毒載體、腺病毒載體、皰疫病毒載體、 痘病毒載體、或腺相關(guān)病毒載體。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體還包括一個(gè)或多個(gè)選自下組的表達(dá)調(diào)控元件： 復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記、報(bào)告基因、終止子或其組合。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的選擇標(biāo)記為藥物抗性基因。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物抗性基因是耐受選自下組的抗生素的基因：氨芐西 林、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素、四環(huán)素、氣霉素以及新霉素。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的報(bào)告基因?yàn)榫幋a選自下組蛋白的基因：綠色熒光蛋白 (GFP)、青色熒光蛋白（CFP)、黃色熒光蛋白（YFP)、紅色熒光蛋白（dsRFP)、熒光素酶（Luc)、 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT)、β-半乳糖苷酶（LacZ)以及β-葡萄糖醛酸酶（Gus)。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤包括肺癌、腸癌、胃癌、肝癌、膽囊癌、胰腺癌、乳腺 癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌。
[0038] 本發(fā)明第四方面，提供了一種體外非治療性的協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包 括步驟：向腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入如本發(fā)明第三方面所述抑制劑組合和/或本發(fā)明第二 方面所述的藥物組合物，從而協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0039] 本發(fā)明第五方面，提供了一種治療腫瘤方法，其特征在于，向所需對(duì)象施用安全有 效量的本發(fā)明第二方面所述的藥物組合物。
[0040] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1顯示了 GV115質(zhì)粒DNA圖譜。
[0042] 圖2顯示了 GV113質(zhì)粒DNA圖譜。
[0043] 圖3顯示了 CALMlshRNA質(zhì)粒鑒定圖：
[0044] 1# :陰性對(duì)照（ddH20) ;2# :陰性對(duì)照（空載自連對(duì)照組）
[0045] 3# :Marker 自上而下依次為 5kb，3kb，2kb，I. 5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，IOObp
[0046] 4# ?8# :CALMlshRNAl_5 號(hào)轉(zhuǎn)化子鑒定。
[0047] 圖4顯示了 EGFR shRNA質(zhì)粒鑒定圖：
[0048] 1# :陰性對(duì)照（ddH20)
[0049] 2# :陰性對(duì)照（空載自連對(duì)照組）
[0050] 3# :Marker 自上而下依次為 5kb，3kb，2kb，I. 5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，IOObp
[0051] 4# ?8# :EGFR shRNAl-5 號(hào)轉(zhuǎn)化子鑒定。
[0052] 圖5顯示了 CALMlshRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同時(shí)浸染人肺癌H1299細(xì)胞 5天后，顯著抑制細(xì)胞增殖。
[0053] 圖6顯示了 CALMl shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同時(shí)浸染人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞 5天后，顯著抑制細(xì)胞增殖。
[0054] 圖7顯示了對(duì)比例中測(cè)試同時(shí)抑制EGFR基因和PAK7基因?qū)δ[瘤抑制結(jié)果，顯示 二者并不具備協(xié)同作用。

【具體實(shí)施方式】
[0055] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)了抑制CALMl基因與EGFR基因 在治療腫瘤方面（尤其是肺癌和腸癌）有良好的協(xié)同作用。聯(lián)合運(yùn)用CALMl與EGFR的抑 制劑能夠有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，其效果遠(yuǎn)優(yōu)于二者的加合作用，而將CALMl抑制劑與其他 癌癥相關(guān)基因的抑制劑聯(lián)用，并無(wú)良好的協(xié)同作用。本發(fā)明人還提供了一種新的抑制CALMl 和EGFR的載體。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0056] CALMl 基因
[0057] I丐調(diào)蛋白的編碼基因 CALMl (calmodulinl)位于14號(hào)染色體q24_q31 (NM_006888)，含有6個(gè)外顯子，總長(zhǎng)度約為11Kb。CALMl蛋白是鈣結(jié)合受體蛋白，是生物體 內(nèi)鈣離子進(jìn)行細(xì)胞間信息傳遞、完成細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、分化、增殖及神經(jīng)遞質(zhì)、血管和肌肉等生 理生化活性所必須結(jié)合的受體蛋白。
[0058] EGFR
[0059] 表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermalgrowth factor receptor, EGFR) EGFR 是一種跨膜 蛋白質(zhì)（NM_201282)，屬于ErbB受體家族成員，其配體（EGF、TGF-a等）與EGFR胞外段結(jié) 合使之二聚化，由此導(dǎo)致胞內(nèi)段酪氨酸激酶活化以及一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì) 胞增殖，血管生成，轉(zhuǎn)移并抑制細(xì)胞凋亡(梁后杰，鄒嵐.EGFR靶向藥物治療晚期結(jié)直腸癌 最新進(jìn)展.中國(guó)處方藥2009; 84:58-61.)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。大量研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因 在多種腫瘤組織中過(guò)表達(dá)或異?；罨瑥亩鼓[瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。EGFR已 成為經(jīng)臨床驗(yàn)證的多種類型腫瘤的治療祀點(diǎn)（Ciardiello F, Tortora G. EGFR antagonists in cancer treatment. N Engl J Med2008;358:1160-1174.)。
[0060] PAK7 基因
[0061] p21活化激酶（p21_activated kinase, PAK)家族是進(jìn)化上高度保守的蘇氨酸/絲 氨酸激酶。PAK家族蛋白參與許多重要的細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、生 存和凋亡、細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等。
[0062] 根據(jù)PAK家族成員的同源程度可將其分為兩個(gè)亞組：A組(包括PAK1-3)和B組(包 括PAK4-6)。PAK5也稱作PAK7,是最后被克隆的PAK家族成員，定位于染色體20pl2位，編 碼80kD蛋白。該蛋白含⑶C42/Racl相互作用樣式和GTPase結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PAK7可被p21 激活并進(jìn)一步激活下游的MPK信號(hào)通路，具有自我磷酸化和自我激活的能力。PAK7蛋白定 位在線粒體膜上，于112位絲氨酸磷酸化BAD蛋白，也能在激活蛋白激酶AKT后于136位 絲氨酸磷酸化Bcl-2家族的促凋亡蛋白BAD，從而實(shí)現(xiàn)直接和間接對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制。研究 還發(fā)現(xiàn)，PAK7蛋白可在細(xì)胞核和線粒體之間穿梭，而精確的亞細(xì)胞定位對(duì)其發(fā)揮抑制凋亡 作用至關(guān)重要。
[0063] 在臨床中發(fā)現(xiàn)PAK7在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，且隨著惡性程度增加表達(dá)水平提高，并 通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和遷移促進(jìn)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。
[0064] 有研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合抑制PAK7、MAP3K7和CK2,可獲得累加的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，PAK7有望 成為胰腺癌的一個(gè)有效治療祀點(diǎn)。
[0065] 然而本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明，同時(shí)抑制EGFR基因與PAK7基因，并無(wú)任何協(xié)同抑制腫瘤作 用。
[0066] RNAi、siRNA、shRNA
[0067] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"RNAi"（RNA interference, RNA干擾）是指在進(jìn)化過(guò)程中高 度保守的、由雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)的、高效特異性降解同源mRNA的現(xiàn)象。由于使用RNAi 技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和 傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。dsRNA介導(dǎo)的RNAi現(xiàn)象在真菌、果蠅、擬南芥、 錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚等多種真核生物中均有發(fā)現(xiàn)，而且在植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默 (posttranscriptional gene silencing, PTGS)、共抑制（cosuppression)及 RNA 介導(dǎo)的病 毒抗性、真菌的抑制（quelling)現(xiàn)象也均屬于RNAi在不同物種的表現(xiàn)形式。
[0068] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"siRNA"(Small interfering RNA, siRNA)是指一種小 RNA 分子 (約21-25個(gè)核苷酸），可由Dicer (RNA酶III家族中對(duì)雙鏈RNA具有特異性的酶）從其前體 (比如dsRNA、shRNA等）加工而成，也可由化學(xué)方法合成或由其它蛋白加工產(chǎn)生。siRNA是 siRISC的主要成員，激發(fā)與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA被迅速切割降解，導(dǎo)致目標(biāo)基因的沉默，因 此成為RNAi中的關(guān)鍵功能分子。
[0069] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"表達(dá)盒"是指包含本發(fā)明RNAi前體的編碼序列以及與所述編 碼序列操作性相連的啟動(dòng)子和終止信號(hào)的表達(dá)盒，所述表達(dá)盒在轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生本發(fā)明的RNAi 前體。本文所用的術(shù)語(yǔ)"RNAi前體"是指可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中加工產(chǎn)生siRNA的RNA分 子，具體地說(shuō)，是由Dicer、Ago2或其它類似蛋白選擇性加工從而產(chǎn)生成熟的siRNA,進(jìn)而實(shí) 施 RNAi。
[0070] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"shRNA"是short hairpin RNA的縮寫，即，"短發(fā)夾RNA"。shRNA 包括兩個(gè)短反向互補(bǔ)序列，中間由一頂端環(huán)（loop)序列分隔的，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由細(xì)胞內(nèi) 源的RNA聚合酶IIKRNA polymerase IID啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)錄，shRNA序列的末端連接5-6個(gè)T 作為RNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄終止子。在活體中產(chǎn)生"小干擾RNA"（siRNA)的一種辦法是，將 siRNA序列作為"短發(fā)夾"的一部分克隆進(jìn)質(zhì)粒載體中。當(dāng)送入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，該發(fā)夾序列被 表達(dá)出來(lái)，形成一個(gè)帶有頂端環(huán)結(jié)構(gòu)的"雙鏈RNA"(shRNA)，被細(xì)胞內(nèi)的Dicer和Ag 〇2等蛋 白所識(shí)別和加工，產(chǎn)生有功能的siRNA。
[0071] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"miRNA"(micr〇RNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約20-24個(gè)核 苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在動(dòng)植物中參與對(duì)大量基因的表達(dá)調(diào)控。到目前為止，在動(dòng)植 物以及病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)四千多種miRNA分子。大多數(shù)miRNA基因以單拷貝、多拷貝或基因 簇（cluster)的形式存在于基因組中。每種miRNA可以調(diào)控多個(gè)祀基因，而幾種miRNA也 可以共同參與調(diào)節(jié)同一基因，組成復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。據(jù)推測(cè)，miRNA調(diào)節(jié)著人類一半以上基 因的表達(dá)。miRNA存在多種形式，最原始的是pri-miRNA ;pri-miRNA經(jīng)過(guò)Drosha加工后， 成為pre-miRNA，即miRNA前體，長(zhǎng)度大約為50-90個(gè)核苷酸；pre-miRNA再經(jīng)過(guò)Dicer酶酶 切后，成為長(zhǎng)約20-24個(gè)核苷酸的成熟miRNA。miRNA主要通過(guò)抑制翻譯和加速mRNA的脫 腺苷酸化抑制靶基因表達(dá)，其機(jī)制有別于siRNA介導(dǎo)的mRNA降解。
[0072] 表達(dá)載體
[0073] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"指的是能將感興趣的多聚核苷酸序列轉(zhuǎn)移到目標(biāo)細(xì) 胞的載體。此類載體能自我復(fù)制或結(jié)合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體(宿主細(xì)胞有，例如原核細(xì)胞、酵 母、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物個(gè)體、和植物個(gè)體等)，并可在適合本發(fā)明多聚核苷 酸轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)含有啟動(dòng)子。表達(dá)載體可包含結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控其表達(dá)的啟動(dòng)子，此外，還有能 在宿主細(xì)胞中起作用的各種調(diào)控元件。本領(lǐng)域熟知，生物活體(如動(dòng)物）的表達(dá)載體類型及 所用調(diào)控元件的種類可根據(jù)所用宿主細(xì)胞的類型而改變。
[0074] 可用于本發(fā)明的病毒載體沒(méi)有特別限制，可以是任何能夠利用病毒具有傳送其基 因組的特點(diǎn)，將遺傳物質(zhì)帶入其他細(xì)胞，進(jìn)行感染的病毒載體?？砂l(fā)生于完整活體或是細(xì)胞 培養(yǎng)中。包括慢病毒載體、腺病毒載體、皰疫病毒載體、痘病毒載體。在本發(fā)明中，一種優(yōu)選 的表達(dá)載體是慢病毒載體。
[0075] 藥物組合物以及給藥方式
[0076] 本發(fā)明還提供一種可用于協(xié)同治療腫瘤的組合物。
[0077] 本發(fā)明藥物組合物包括本發(fā)明上述的，（a)藥學(xué)上可接受的載體；和
[0078] 選自下組的物質(zhì)作為活性成分：
[0079] (b) CALMl抑制劑和EGFR抑制劑；或
[0080] (c)上述的表達(dá)載體。
[0081] 此外，本發(fā)明藥物組合物還可以包括任選的實(shí)體腫瘤化療劑。所述的化療劑包括 (但不限于）順鉬、紫杉醇、阿霉素等。
[0082] "藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。 [0083] 術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分 的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可 含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤(rùn)滑 齊U、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑。 [0084] 通常，將所述表達(dá)載體或假病毒顆粒和藥學(xué)上可接受的載體混合后，即可獲得的 本發(fā)明的藥物組合物。
[0085] 本發(fā)明所述的組合物的給藥方式?jīng)]有特別限制，代表性的例子包括（但并不限 于）：靜脈注射、皮下注射、肌肉注射等。
[0086] 本發(fā)明的有益效果：
[0087] 1.共同抑制CALMl基因和EGFR基因能夠協(xié)同作用于抗腫瘤治療，較抑制CALMl和 EGFR的加合作用而言，具有更顯著的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。
[0088] 2. CALMl基因可以作為EGFR基因協(xié)同治療靶標(biāo)，CALMl靶向慢病毒可以作為EGFR 基因靶向藥物的協(xié)同治療藥物，將二者的抑制劑作為靶向治療腫瘤的藥物，可有效地協(xié)同 抑制腫瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤凋亡。
[0089] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0090] 實(shí)施例1 :針對(duì)人CALMl基因和EGFR基因 RNAi慢病毒的制備
[0091] 構(gòu)建針對(duì)人CALMl基因和EGFR基因 RNAi慢病毒載體
[0092] 從 Genbank 調(diào)取 CALMl (NM_006888)和 EGFR 基因（NM_201282)信息；利用上海吉 凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司的設(shè)計(jì)軟件Genechem設(shè)計(jì)針對(duì)CALMl基因和EGFR基因的有效的 siRNA靶點(diǎn)。初步篩選得到具有明顯抑制CALMl基因表達(dá)功能的siRNA (SEQ ID NO. 1)和 明顯抑制EGFR基因表達(dá)功能的siRNA序列（SEQ ID NO. 2)。通過(guò)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)行 BLAST分析，確定其不對(duì)任何其它基因產(chǎn)生干擾作用。
[0093] 表IsiRNA序列（正義鏈）
[0094]

【權(quán)利要求】
1. 一種抑制劑組合的用途，其特征在于，所述抑制劑組合包括鈣調(diào)蛋白的編碼 基因CALM1 (calmodulinl)抑制劑和表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermalgrowth factor rec印tor，EGFR)抑制劑，并且所述組合用于制備協(xié)同治療腫瘤的藥物組合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CALM1來(lái)自于哺乳動(dòng)物，更佳地為嚙 齒類動(dòng)物（如小鼠、大鼠）或人；和/或 所述的EGFR來(lái)自于哺乳動(dòng)物，更佳地為嚙齒類動(dòng)物（如小鼠、大鼠）或人。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤包括肺癌、腸癌、胃癌、肝癌、膽 囊癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌。
4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CALM1抑制劑包括：CALM1的抗體、 CALM1核酸的反義RNA、siRNA、shRNA以及CALM1的活性抑制劑；和/或 所述的EGFR抑制劑包括EGFR的抗體、EGFR核酸的反義RNA、siRNA、shRNA以及EGFR 的活性抑制劑。
5. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CALM1抑制劑序列如SEQ ID NO. :1-2所示；和/或所述的EGFR抑制劑包括西妥昔、吉非替尼（gefitinib)、拉帕替尼 (lapatinib)。
6. -種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括CALM1抑制劑、EGFR抑制劑和 藥學(xué)上可接受的載體。
7. 如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物還包括化療劑。
8. -種抑制劑組合，其特征在于，所述組合由鈣調(diào)蛋白的編碼基因CALM1抑制劑和表 皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑構(gòu)成。
9. 如權(quán)利要求8所述的抑制劑組合，所述的CALM1抑制劑包括表達(dá)靶向于CALM1的 siRNA或shRNA的表達(dá)盒或載體；和/或所述的EGFR抑制劑包括表達(dá)靶向于CALM1的siRNA 或shRNA的表達(dá)盒或載體。
10. -種體外非治療性的協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其特征在于，包括步驟：向腫 瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入如權(quán)利要求8所述抑制劑組合和/或權(quán)利要求6所述的藥物組合 物，從而協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104368001SQ201310349990
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月12日
【發(fā)明者】朱向瑩, 金楊晟, 瞿紅花, 曹躍瓊 申請(qǐng)人:上海金鑒生物科技有限公司