專利名稱：：一種胸腺素β4的固相合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物化學
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種胸腺素(34的固相合成方法。
背景技術(shù)：
：胸腺素P4化學名N-乙?；?絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酰-天冬氨酰-蛋氨酰-丙氨酰-谷氨酰-異亮氨酰-谷氨酰-賴氨酰-苯丙氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-絲氨酰-賴氨酰-亮氨酰-賴氨酰-賴氨酰-蘇氨酰-谷氨酰-蘇氨酰-谷氨酰氨酰-谷氨酰-賴氨酰-天冬酰胺酰-脯氨酰-亮氨酰-脯氨酰-絲氨酰-賴氨酰-谷氨酰-蘇氨酰-異亮氨酰-谷氨酰-谷氨酰胺酰-谷氮酰-賴氨酰-谷氨酰胺酰-丙氨酰-甘氨酰-谷氨酰-絲氨酸。肽的序列為Ac-Ser陽Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys隱Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu曙Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln隱Ala-Gly-Glu-Ser-OH分子式C212H35。N56078S分子量4963.49Thymosin-P4是肌動蛋白的隱蔽蛋白，作為肌動蛋白解聚和重聚的的動力原,調(diào)控肌動蛋白的動力學變化，影響一些蛋白分子的合成與表達。Thymosin-(34廣泛分布在胚乳動物包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的組織之中，在不同系統(tǒng)之中發(fā)揮不同的生物學作用，在神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育和損傷過程中都有較高的表達，現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn):它可以參與突觸的形成、軸突生長、細胞的遷移、調(diào)節(jié)樹突野可塑性的變化等生物學過程。1963年，R.B.Merrifidd創(chuàng)立了將氨基酸的C末端固定在不溶性樹脂上，然后在此樹脂上依次縮合氨基酸，延長肽鏈、合成蛋白質(zhì)的固相合成法。多肽的固相合成與液相合成相比優(yōu)點在于(O大大簡化了反應(yīng)后處理操作不溶性載體鍵合的聚合物只要簡單的反復過濾和洗滌，即可從可溶性的溶劑和副產(chǎn)物中分離出來，省時，省力；(2)可充分利用熱力學和動力學因素促進反應(yīng)可溶性試劑可以過量以使反應(yīng)完全和獲得高產(chǎn)率，過量的試劑可簡單的用溶劑沖洗，過濾清除；(3)逐步合成更為簡化，因為所有的反應(yīng)都可以在一個容器中迸行，因而也避免了反應(yīng)中間體轉(zhuǎn)移的手續(xù)和損失；(4)樹脂再生，如果選擇適當?shù)逆溄臃肿雍土呀鈼l件，高分子樹脂可再生重復使用。但是對于大于30個氨基酸的長鏈肽來說，固相逐一連接氨基酸會遇到一些比較嚴重的問題，肽在達到一定的長度和條件后，會在固相樹脂載體上產(chǎn)生折疊或者片層等二級結(jié)構(gòu)，肽鏈產(chǎn)生交聯(lián)或者聚合，使得活性氨基位點被深藏或包埋，從而增加了位阻，大大影響氨基酸的縮合率，另外逐一偶聯(lián)所需要的反應(yīng)時間冗長，氨基酸消旋的幾率也相應(yīng)極大的增加，從而使得產(chǎn)物中雜質(zhì)多并且異常難以純化。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種反應(yīng)時間短、縮合率高、易于純化、產(chǎn)物純度高的胸腺素P4的固相合成方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種胸腺素(34的固相合成方法，其特征在于所述方法為(1)以所述胸腺素(34的肽鏈自N端連續(xù)切分得到的812個氨基酸長度的片段D、片段C、片段B、片段A作為固相分段合成目的片段，以王樹脂為固相載體，依次進行縮合反應(yīng)連接保護氨基酸，得到A肽全保護樹脂；分別以2-chlorotritylchlorideresin為固相載體，依次進行縮合反應(yīng)連接保護氨基酸，得到片段B肽全保護樹脂、片段C肽全保護樹脂和片段D肽全保護樹脂；(2)分別切割片段B肽全保護樹脂、片段C肽全保護樹脂和片段D肽全保護樹脂，得到片段B全保護肽、片段C全保護肽和片段D全保護肽；(3)依次將片段B全保護肽、片段C全保護肽和片段D全保護肽連接至A肽全保護樹脂，得到胸腺素卩4的全保護肽樹脂；(4)用醋酸酐乙?；叵偎豍4的全保護肽樹脂，用三氟乙酸切割樹脂，得到粗肽；(5)粗肽溶于5%醋酸水溶液，經(jīng)Qs填料的反相高效液相色譜柱純化，洗脫、濃縮、干燥，得到所述胸腺素卩4。所述及的王樹脂化學結(jié)構(gòu)為HOCH。~、>~OCH二所述及的2-chlorotritylchlorideresin結(jié)構(gòu)如下:本發(fā)明的方法是將大的長鏈肽分解成為多部分的小的短鏈肽，通過合成得到側(cè)鏈全保護的短肽鏈片段，再將各個短肽鏈片段單元組裝起來得到最終的長肽產(chǎn)物。這種方法一方面避免了長肽在合成過程中產(chǎn)生的交聯(lián)聚合問題，另外多個短肽片段可以同時并行合成，大大縮短了總的合成時間，再者短肽可以得到相對純度較高的中間體產(chǎn)物，從而使得最終產(chǎn)物的雜質(zhì)相對較少，并且容易分離純化。具體的，所述方法包括如下順序步驟(1)以王樹脂為固相載體，依次進行縮合反應(yīng)連接如下保護氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，得至ljA肽全保護樹月旨Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-王樹脂；(2)以2-chlorotritylchlorideresin為固相載體，依次進行縮合反應(yīng)連接如下保護氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc陽Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc陽Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，得至'JB肽全保護樹脂F(xiàn)moc-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Pro-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin全保護樹脂；(3)以2-chlorotritylchlorideresin為固相載體，依次進行縮合反應(yīng)連接如下保護氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)陽OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，得到C肽全保護樹月旨Fmoc-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin全保護樹脂；(4)以2-chlorotritylchlorideresin為固相載體，依次進行縮合反應(yīng)連接如下保護氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，得到D肽全保護樹脂F(xiàn)moc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Met-Ala-Glu(OtBu)-Ile-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin全保護樹脂；(5)用三氟甲醇、二氯甲烷體積比1:4的混合溶液分別切割B肽全保護樹月旨，C肽全保護樹脂和D肽全保護樹脂，分別得到片段B全保護肽Fmoc-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Pro-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-GIu(OtBu)-OH，片段C全保護肽Fmoc-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-OH禾Q片段D全保護肽Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Met-Ala-Glu(OtBu)-Ile-Glu(OtBu)-OH;(6)以N,N-二異丙基碳二亞胺和1-羥基苯并三氮唑為肽合成縮合劑，依次將片段B全保護肽、片段C全保護肽、片段D全保護肽連接至A肽全保護樹脂上，得到胸腺素(34的全保護肽樹脂F(xiàn)moc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Met-Ala-Glu(OtBu)-Ile-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)曙Pro-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)畫Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Ile-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-王樹脂；(7)用醋酸酐于DMF溶液中乙?；叵偎?34的全保護肽樹脂，用三氟乙酸切割樹脂，得到粗肽；(8)粗肽溶于5%醋酸水溶液，經(jīng)ds填料的反相高效液相色譜柱純化，洗脫、濃縮、干燥，得到所述胸腺素f34。所述步驟(7)中乙酰化步驟為胸腺素|34的全保護肽樹脂于10%的醋酸酐/DMF溶液中，室溫反應(yīng)1小時。所述步驟(7)中，乙?；娜Ｗo肽樹脂于三氟醋酸、1,2-乙二硫醇、苯甲硫醚、苯酚、水、三異丙基硅烷體積比70:10:10:5:3:2的混合溶液中，室溫反應(yīng)3小時，得到粗肽。所述步驟(1)為以王樹脂為固相載體，在體積比7:8的2,6-二氯苯甲酰氯和吡啶存在下，于DMF溶劑中，連接Fmoc-Ser(tBu)-OH至王樹脂上得到Fmoc-Ser(tBu)-王樹脂，再進行程序反應(yīng)，依次連接如下保護氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Glu(OtBu)-Gln(Trt)畫Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-王樹脂。所述步驟(2)為以2-chlorotritylchlorideresin為固相載體，在N，N-二異丙基乙胺存在下、于二氯甲垸溶劑中，連接Fmoc-Glu(OtBu)-OH至2-chlorotritylchlorideresin上得到Fmoc-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin，再進行程序反應(yīng)，依次連接如下保護氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，得到Fmoc-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Pro-Leu-Pro曙Ser(tBu)曙Lys(Boc)-Glu(OtBu)-2陽chlorotritylchlorideresin全保護樹脂。所述步驟(3)為以2-chlorotritylchlorideresin為固相載體，在N，N-二異丙基乙胺存在下、于二氯甲烷溶劑中，連接Fmoc-Glu(OtBu)-OH至2-chlorotritylchlorideresin上f導至UFmoc-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin，再進4亍禾呈序反應(yīng)，依次連接如下保護氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)隱OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc陽Phe-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，得至UFmoc-Lys(Boc)畫Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)畫Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin全保護樹脂。所述步驟(4)為以2-chlorotritylchlorideresin為固相載體，在N,N-二異丙基乙胺存在下、于二氯甲烷溶劑中，連接Fmoc-Glu(OtBu)-OH至2-chlorotritylchlorideresin上得到Fmoc-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin，再進行程序反應(yīng)，依次連接如下保護氨基酸Fmoc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asp(O氾u)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)陽OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，得到Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Met-Ala-Glu(OtBu)-Ile-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin全保護樹脂。所述程序反應(yīng)步驟為先用20。/。的哌啶/DMF溶液室溫處理脫去Fmoc-保護基；再加入1~5當量的Fmoc-保護氨基酸、15當量的HBTU和15當量的N，N-二異丙基乙胺，攪拌，室溫反應(yīng)25小時，連接Fmoc-保護氨基酸；所述HBTU用N，N-二甲基甲酰胺溶解后加入。具體的，所述程序反應(yīng)步驟為①洗滌用二氯甲垸和甲醇交替洗滌23次，二氯甲烷用量為57mL/g樹脂，甲醇用量為57mL/g樹脂；②脫保護基用20。/。的哌啶/DMF溶液室溫下處理，脫去Fmoc-保護基；③洗滌用二氯甲烷和乙醇交替洗滌2~3次，二氯甲烷用量為57mL/g樹脂，甲醇用量為57mL/g樹脂；④連接保護基加入15當量的Fmoc-保護氨基酸，15當量的HBTU，所述HBTU用N，N-二甲基甲酰胺溶解后加入，然后加入1~5當量的N，N-二異丙基乙胺，攪拌，室溫反應(yīng)25小時；⑤洗滌用二氯甲垸和甲醇交替洗滌23次，二氯甲烷用量為57mL/g樹脂，乙醇用量為57mL/g樹脂。本發(fā)明的方法可以使得長肽的合成同時多線并行合成，總合成時間短、效率高并，產(chǎn)物分離純化簡單、純度高。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此.-實施例1:Fmoc-Ser(tBu)-王樹脂的制備操作(1)王樹脂12.5g(5mmol)(天津南開和成科技有限公司)放于多肽合成反應(yīng)器中，用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌后，加入DMF溶漲30min后抽去，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH3.8g用50mlDMF溶解后加入反應(yīng)器中，加入3.2ml吡啶，滴加2.8ml2，6-二氯苯甲酰氯，滴加完畢后，室溫反應(yīng)2小時，用DMF洗滌三次，甲醇洗滌1次，二氯甲垸洗滌3次，甲醇洗滌三次，抽干得到Fmoc-Ser(tBu)-王樹脂14.3g。實施例2:Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)匿Gln(Trt)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-王樹脂(A肽全保護樹脂)的制備操作(1)Fmoc-Ser(tBu)-王樹脂14.3g放于多肽合成反應(yīng)器中，用二氯甲烷、甲醇各80ml交替洗2次，2分鐘/次，抽干。加入20W哌啶/DMF溶液80ml，室溫攪拌反應(yīng)20分鐘，抽干。樹脂用二氯甲烷、甲醇80ml交替洗3次，2分鐘/次，抽干。(2)將Fmoc保護氨基酸及O-苯并三氮唑-N,N，N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU，上海延長生化科技發(fā)展有限公司)8.0g用50mlDMF溶液溶解后，再加入N,N-二異丙基乙胺4.4ml，混勻后加入樹脂中，室溫攪拌3小時。(3)抽干。樹脂用二氯甲烷、甲醇各60ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4)重復步驟(1)~(3)至偶聯(lián)完畢所有的氨基酸。(5)得A肽全保護樹脂23.3g，收率94%。氨基酸用量如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例3:Fmoc-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin的制備操作2-chlorotritychlorideresin100g(120mmol)加入至1000ml固相合成反應(yīng)器中，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH204g用600ml二氯甲烷溶解后，加入N，N-二異丙基乙胺(D正A)167ml，攪拌混勻后加入到固相合成反應(yīng)器中，室溫反應(yīng)1小時。抽干。樹脂用二氯甲烷、甲醇800ml交替洗3次，2分鐘/次，抽千。得到Fmoc-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin143.7g。實施例4:Fmoc-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)匿Lys(Boc)-Asn(Trt)-Pro-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin(B肽全保護樹脂)的制備操作(1)Fmoc-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin40g(20mmol)放于多肽合成反應(yīng)器中，用二氯甲烷、甲醇各250mi交替洗2次，2分鐘/次，抽干。加入20%(v/v)哌啶/DMF溶液250ml，室溫攪拌反應(yīng)20分鐘，抽干。樹脂用二氯甲垸、甲醇250ml交替洗3次，2分鐘/次，抽干。(2)將Fmoc保護氨基酸及O-苯并三氮唑-N,N,N'，N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)32.1g用120mlDMF溶液溶解后，再加入N,N-二異丙基乙胺17.2ml，混勻后加入樹脂中，室溫攪拌3小時。(3)抽干。樹脂用二氯甲烷、甲醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4)重復步驟(1)(3)至偶聯(lián)完畢所有的氨基酸。(5)得B肽全保護樹脂80.2g,收率91%。氨基酸用量如下表序列氨基酸名稱用量(克)1Fmoc-Lys(Boc)-OH46.82Fmoc-Ser(tBu)-OH38,43Fmoc-Pro-OH33.84Fmoc-Leu-OH35,45Fmoc-Pro-OH33.8<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施例5:Fmoc-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin(C肽全保護樹脂)的制備操作(1)Fmoc-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin40g(20mmol)放于多肽合成反應(yīng)器中，用二氯甲垸、甲醇各250ml交替洗2次，2分鐘/次，抽干。加入20。/。哌啶/DMF溶液250ml，室溫攪拌反應(yīng)20分鐘，抽干。樹脂用二氯甲垸、甲醇250ml交替洗3次，2分鐘/次，抽干。(2)將Fmoc保護氨基酸及O-苯并二氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)32.1g用120mlDMF溶液溶解后，再加入N,N-二異丙基乙胺17.2ml，混勻后加入樹脂中，室溫攪拌3小時。(3)抽干。樹脂用二氯甲烷、甲醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4)重復步驟(1)~(3)至偶聯(lián)完畢所有的氨基酸。(5)得C肽全保護樹脂80.1g，收率93%。氨基酸用量如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例6:Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)畫Met-Ala-Glu(OtBu)-Ile-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin(D肽全保護樹脂)的制備操作(1)Fmoc-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin40g(20mmol)放于多肽合成反應(yīng)器中，用二氯甲烷、甲醇各250ml交替洗2次，2分鐘/次，抽干。加入20%(v/v)哌啶/DMF溶液250ml，室溫攪拌反應(yīng)20分鐘，抽干。樹脂用二氯甲烷、甲醇250ml交替洗3次，2分鐘/次，抽干。(2)將Fmoc保護氨基酸及O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)32.1g用120mlDMF溶液溶解后，再加入N，N-二異丙基乙胺17.2ml，混勻后加入樹脂中，室溫攪拌3小時。(3)抽干。樹脂用二氯甲烷、甲醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4)重復步驟(1)(3)至偶聯(lián)完畢所有的氨基酸。(5)得D肽全保護樹脂70.3g，收率94%。氨基酸用量如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例7:Fmoc-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Pro-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-OH(B全保護肽)制備操作B肽全保護樹脂80.2g放于2000ml圓底燒瓶中，加入三氟乙醇(TFE):二氯甲烷(DCM)(休積比1:4)1200ml,室溫下攪拌2小時，過濾，樹脂用DCM洗滌后，合并濾液，旋蒸濃縮得Fmoc-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Pro-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-OH43.3g，收率卯％。實施例8:Fmoc-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)隱Ser(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-OH(C全保護肽)制備操作C肽全保護樹脂80.1g放于2000ml圓底燒瓶中，加入三氟乙醇(TFE):二氯甲烷(DCM)(體積比1:4)1200ml，室溫下攪拌2小時，過濾，樹脂用DCM洗滌后，合并濾液，旋蒸濃縮得Fmoc-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-OH41,9g，收率91%。實施例9:Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Met-Ala-Glu(OtBu)-Ile-Glu(OtBu)-OH(D全保護肽)制備操作D肽全保護樹脂70.3g放于2000ml圓底燒瓶中，加入三氟乙醇(TFE):二氯甲烷(DCM)(體積比1:4)1050ml,室溫下攪拌2小時，過濾，樹脂用DCM洗Fmoc畫Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Met-Ala-Glu(O氾u)-Ile-Glu(OtBu)-OH31.7g，收率91%。得蒸并合后滌實施例10:Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)隱Met-Ala-Glu(OtBu)-Ile-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(O氾u)-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Pro-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Ile-Glu(OtBu)-Gln(Trt)畫Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-王樹脂的制備操作將A肽全保護樹脂23.3g加入至固相反應(yīng)器中，用二氯甲烷、甲醇各150ml交替洗2次，2分鐘/次，抽干。加入20%(v/v)哌啶/DMF溶液150ml，室溫攪拌反應(yīng)20分鐘，抽干。樹脂用二氯甲烷、甲醇150ml交替洗3次，2分鐘/次，抽干。(2)將B全保護肽片段43.3g及l(fā)-羥基苯并三氮唑(HOBt)2.7g用100ml二甲基亞砜(DMSO)溶液溶解后，再加入N,N-二異丙基碳二亞胺3.1ml，混勻后加入樹脂中，室溫攪拌6小時。(3)抽干。樹脂用一氯甲烷、甲醇各120ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4)重復步驟(1)(3)至全保護肽片段C，D偶聯(lián)完畢。得Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Met-Ala-Glu(OtBu)-Ile-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Pro-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Ile-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-王樹脂43.9g。實施例11:胸腺素(34全肽樹脂制備操作(1)將肽全保護樹脂43.9g加入至固相反應(yīng)器中，用二氯甲烷、甲醇各250ml交替洗2次，2分鐘/次，抽干。加入20%(v/v)哌啶/DMF溶液250ml，室溫攪拌反應(yīng)20分鐘，抽干。樹脂用二氯甲烷、甲醇250ml交替洗3次，2分鐘/次，抽干。(2)加入10%(v/v)醋酸酐/DMF200ml，室溫反應(yīng)1小時，樹脂用二氯甲垸、甲醇各120ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。得到胸腺素(34全肽樹脂43.6g，收率71%。實施例13:Ac-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-1le-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-OH粗肽制備操作將胸腺素(34全肽樹脂43.6g加入到1000ml圓底燒瓶中，加入三氟醋酸:l，2-乙二硫醇苯甲硫醚苯酚水三異丙基硅垸=70:10:10:5:3:2(體積比)的混合溶液450ml，室溫，攪拌反應(yīng)2小時，用40ml三氟醋酸洗滌樹脂后，合并濾液，濾液傾入4000ml冰乙醚中，即析出大量的白色固體,過濾，收集白色固體，干燥,得胸腺素(34粗肽16.1g。收率65°/。。實施例13:胸腺素卩4純化操作胸腺素(34粗品純化裝置C18制備柱(50x300mm)洗脫液A:0.1%(v/v)TFA/H20洗脫液B:甲醇流速200ml/min紫外檢測波長:230nm操作(1)胸腺素34粗品肽溶于5%(v/v)的醋酸水溶液(2)用0.45pm微孔濾膜過濾，(3)濾液上樣，(4)2023%(v/v)甲醇-水流動相梯度洗脫，(5)收集目的肽餾分，(6)濃縮，冷凍千燥，(7)得胸腺素(34白色固體12.2g。產(chǎn)物經(jīng)MS質(zhì)譜確認，總收率49%。權(quán)利要求1、一種胸腺素β4的固相合成方法，其特征在于所述方法為(1)以所述胸腺素β4的肽鏈自N端連續(xù)切分得到的8～12個氨基酸長度的片段D、片段C、片段B、片段A作為固相分段合成目的片段，以王樹脂為固相載體，依次進行縮合反應(yīng)連接保護氨基酸，得到A肽全保護樹脂；分別以2-chlorotritylchlorideresin為固相載體，依次進行縮合反應(yīng)連接保護氨基酸，得到片段B肽全保護樹脂、片段C肽全保護樹脂和片段D肽全保護樹脂；(2)分別切割片段B肽全保護樹脂、片段C肽全保護樹脂和片段D肽全保護樹脂，得到片段B全保護肽、片段C全保護肽和片段D全保護肽；(3)依次將片段B全保護肽、片段C全保護肽和片段D全保護肽連接至A肽全保護樹脂，得到胸腺素β4的全保護肽樹脂；(4)用醋酸酐乙?；叵偎卅?的全保護肽樹脂，用三氟乙酸切割樹脂，得到粗肽；(5)粗肽溶于5％醋酸水溶液，經(jīng)C18填料的反相高效液相色譜柱純化，洗脫、濃縮、干燥，得到所述胸腺素β4。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括如下順序步驟(1).以王樹脂為固相載體，依次進行縮合反應(yīng)連接如下保護氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，得到A肽全保護樹脂F(xiàn)moc-Thr(tBu)-Ile-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-王樹脂；(2).以2-chlorotritylchlorideresin為固相載體，依次進行縮合反應(yīng)連接如下保護氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，得至UB肽全保護樹月旨Fmoc-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Pro-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin全保護樹脂；(3).以2-chlorotritylchlorideresin為固相載體，依次進行縮合反應(yīng)連接如下保護氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，得到C肽全保護樹月旨Fmoc-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin全保護樹脂；(4).以2-chlorotritylchlorideresin為固相載體，依次進行縮合反應(yīng)連接如下保護氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，得到D肽全保護樹脂F(xiàn)moc-Ser(tBu)畫Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-M改-Ala-Glu(OtBu)-Ile-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin全保護樹脂;(5).用三氟甲醇、二氯甲烷體積比l:4的混合溶液分別切割B肽全保護樹脂，C肽全保護樹脂和D肽全保護樹脂，分別得到片段B全保護肽Fmoc-Thr(tBu)-Gln(Trt)誦Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Pro-Leu畫Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-OH，片段C全保護肽Fmoc-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-OH禾B片段D全保護肽Fmoc-Ser(tBu)-Asp(O但u)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)畫Met-Ala-Glu(OtBu)-Ile-Glu(OtBu)-OH;(6).以N,N-二異丙基碳二亞胺和1-羥基苯并三氮唑為肽合成縮合劑，依次將片段B全保護肽、片段C全保護肽、片段D全保護肽連接至A肽全保護樹脂上，得到胸腺素P4的全保護肽樹脂F(xiàn)moc-Ser(tBu)匿Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(OtBu)-Met-Ala-Glu(OtBu)-Ile畫Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Leu畫Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Pro-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Ile-Glu(OtBu)-Gln(Trt)畫Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-王樹脂；(7).用醋酸酐于DMF溶液中乙?；叵偎豈的全保護肽樹脂，用三氟乙酸切割樹脂，得到粗肽；(8).粗肽溶于5%醋酸水溶液，經(jīng)C18填料的反相高效液相色譜柱純化，洗脫、濃縮、干燥，得到所述胸腺素P4。3、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(7)中乙?；襟E為胸腺素04的全保護肽樹脂于10。/。的醋酸酐/DMF溶液中，室溫反應(yīng)1小時。4、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(7)中，乙酰化的全保護肽樹脂于三氟醋酸、1，2-乙二硫醇、苯甲硫醚、苯酚、水、三異丙基硅烷體積比70:10:10:5:3:2的混合溶液中，室溫反應(yīng)3小時，得到粗肽。5、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)為以王樹脂為固相載體，在體積比7:8的2,6-二氯苯甲酰氯和吡啶存在下，于DMF溶劑中，連接Fmoc-Ser(tBu)-OH至王樹脂上得到Fmoc-Ser(tBu)-王樹脂，再進行程序反應(yīng)，依次連接如下保護氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)畫OH，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Ala-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-王樹脂。6、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(2)為以2-chlorotritylchlorideresin為固相載體，在N，N-二異丙基乙胺存在下、于二氯甲烷溶劑中，連接Fmoc-Glu(OtBu)-OH至2-chlorotritylchlorideresin上得到Fmoc-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin，再進4亍禾呈序反應(yīng)；依次連接如下保護氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc扁Leu-OH，F(xiàn)moc-Pro隱OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc畫Gu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc畫Thr(tBu)-OH，得到Fmoc-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Pro-Leu-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin全保護樹脂。7、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(3)為以2-chlorotritylchlorideresin為固相載體，在N，N-二異丙基乙胺存在下、于二氯甲烷溶劑中，連接Fmoc-Glu(OtBu)-OH至2-chlorotritylchlorideresin上得到Fmoc-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin，再進行程序反應(yīng)，依次連接如下保護氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc隱Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc陽Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，得至UFmoc-Lys(Boc)-Phe-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)扁Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin全保護樹脂。8、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(4)為以2-chlorotritylchlorideresin為固相載體，在N，N-二異丙基乙胺存在下、于二氯甲烷溶劑中，連接Fmoc-Glu(OtBu)-OH至2-chlorotritylchlorideresin上得到Fmoc-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin，再進行程序反應(yīng)，依次連接如下保護氨基酸Fmoc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc匿Ala-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc畫Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，得到Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)誦Pro層Asp(OtBu)-Met-Ala-Glu(OtBu)-Ile-Glu(OtBu)-2-chlorotritylchlorideresin全保護樹月旨。9、如權(quán)利要求58之一所述的方法，其特征在于所述程序反應(yīng)步驟為先用20e/。的哌啶/DMF溶液室溫處理脫去Fmoc-保護基；再加入1~5當量的Fmoc-保護氨基酸、15當量的HBTU和15當量的N,N-二異丙基乙胺，攪拌，室溫反應(yīng)2~5小時，連接Fmoc-保護氨基酸；所述HBTU用N,N-二甲基甲酰胺溶解后加入。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述程序反應(yīng)步驟為①洗滌用二氯甲垸和甲醇交替洗滌23次，二氯甲烷用量為57mL/g樹脂，甲醇用量為57mL/g樹脂；②脫保護基用20y。的哌啶/DMF溶液室溫下處理，脫去Fmoc-保護基；③洗滌用二氯甲烷和乙醇交替洗滌23次，二氯甲烷用量為57mL/g樹脂，甲醇用量為57mL/g樹脂；④連接保護基加入l5當量的Fmoc-保護氨基酸，15當量的HBTU，所述HBTU用N,N-二甲基甲酰胺溶解后加入，然后加入15當量的N，N-二異丙基乙胺，攪拌，室溫反應(yīng)25小時；⑤洗滌用二氯甲烷和甲醇交替洗滌23次，二氯甲烷用量為57mL/g樹脂，乙醇用量為57mL/g樹脂。全文摘要本發(fā)明涉及一種胸腺素β4的固相合成方法，所述方法是將大的長鏈肽分解成為多部分的小的短鏈肽，通過合成得到側(cè)鏈全保護的短肽鏈片段，再將各個短肽鏈片段單元組裝起來得到最終的長肽產(chǎn)物。這種方法一方面避免了長肽在合成過程中產(chǎn)生的交聯(lián)聚合問題，另外多個短肽片段可以同時并行合成，大大縮短了總的合成時間，再者短肽可以得到相對純度較高的中間體產(chǎn)物，從而使得最終產(chǎn)物的雜質(zhì)相對較少，并且容易分離純化。文檔編號C07K1/00GK101412755SQ20071030130公開日2009年4月22日申請日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日發(fā)明者李新宇,趙德中申請人:杭州諾泰制藥技術(shù)有限公司