專利名稱：H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術領域，涉及一種H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原 表位及其應用。
背景技術：
流感病毒屬正粘病毒科，為單股負鏈、分節(jié)段RNA病毒，基因組由8個節(jié)段組成， 編碼IO種病毒蛋白，根據(jù)流感病毒內(nèi)部蛋白抗原型的不同分為甲(A)、乙(B)、丙(C) 三型，又根據(jù)流感病毒表面蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶抗原性的不同將A型流感 病毒分為不同的血清亞型，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)15種不同的HA亞型(Hl-H15)。 H3型流感病毒 可感染人、禽、豬、馬等多種哺乳動物，1968年H3N2型流感病毒曾造成突發(fā)性流感大 流行，嚴重危害公共安全。
血凝素是流感病毒最主要的表面抗原，它能夠誘導機體產(chǎn)生相應的中和抗體以中和 病毒的感染。血凝素以三聚體的形式鑲嵌在病毒包膜上，每個單體由兩個經(jīng)二硫鍵連接 的蛋白亞單位組成，它們來自于一條前體鏈(HA0)，經(jīng)蛋白水解酶的切割而形成，分 別命名為HA1和HA2， HA1負責病毒與宿主細胞受體的結合與吸附，病毒吸附完成以 后，病毒粒子通過宿主細胞的內(nèi)吞作用進入細胞，在體內(nèi)酸性環(huán)境中，HA2的疏水性融 合多肽轉移到內(nèi)體膜的靶位上，介導內(nèi)體膜與病毒包膜的融合。每個HA單體都由球形 的頭部和頸部組成，其中球部在HA1亞單位內(nèi)，頸部由全部HA2和部分HA1亞單位組 成。
隨著多肽疫苗研究的進展，H3型流感病毒HA的抗原表位逐漸成為研究的熱點。 抗原表位的定位常規(guī)方法是首先對抗原進行化學降解、修飾獲得多肽片段，或合成一系 列來源于抗原的多肽片段，通過檢測這些多肽片段與相關抗體的結合活性而得到。這些 方法比較費時費力并且只能尋找到序列表位。也有人用化學合成肽庫的方法篩選抗原表 位，但篩選難度較大，目的肽段不易富集，并且也不能篩選到空間構象表位。
目前對H3亞型流感病毒血凝素序列表位的研究已取得很大進展，已發(fā)現(xiàn)并經(jīng)證實 的T細胞表位(HA127-133)和B細胞表位(HA91-108)等。對B細胞表位而言，空
間構象表位的意義遠大于序列表位。然而至今仍未有對H3型流感病毒HA空間構象表 位的報道。
噬菌體展示技術產(chǎn)生于1985年，Missouri大學的Smith博士首先在Science上報道 了利用絲狀噬菌體在體外表達外源基因，并使外源基因表達產(chǎn)物融合在噬菌體的外殼蛋 白中形成融合蛋白，呈現(xiàn)在噬菌體表面。目前能用于蛋白質/多肽展示的噬菌體系統(tǒng)除絲 狀噬菌體展示系統(tǒng)外還有入噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)和T7噬菌體展示系統(tǒng)。
噬菌體展示技術的要點是在噬菌體衣殼蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表 達在噬菌體顆粒的表面，并使表達產(chǎn)物保持良好的空間構象；利用靶分子，采用適當?shù)?淘洗方法(親和一洗脫一擴增一親和的循環(huán)步驟)，洗去非特異型結合的噬菌體，使特 異性結合的噬菌體富集，最終從文庫中篩選出能結合靶分子的目的噬菌體；外源多肽或 蛋白質表達在噬菌體的表面，其編碼基因作為重組噬菌體基因組中的一部分可通過噬菌 體DNA序列測序得到，這樣就使表達蛋白(表現(xiàn)型)和編碼基因(基因型)之間完美 地結合起來，使研究者可以在基因分子克隆的基礎上有效的實現(xiàn)蛋白質構象的體外控 制，從而在體外獲得具有良好生物學活性的表達產(chǎn)物。
常規(guī)的抗原表位定位方法費時費力且不能獲得空間構象表位。而通過將抗原的基因 片段進行隨機降解后與噬菌體的外殼蛋白基因融合表達而構成一個展示于噬菌體表面 的表位庫或直接用商業(yè)化的噬菌體肽庫，以抗原特異性抗體來進行篩選，然后分析能與 特異性抗體結合的噬菌體肽的序列，再將其與天然抗原序列相比較，就很容易確定抗原 表位的位置及序列。噬菌體展示技術更是確定空間構象類抗原表位的有效方法。以固定 化的抗體為篩選分子，可獲得與抗體高親和力的肽段，肽段核心序列很可能是和抗體互 補決定區(qū)相結合的特異性天然抗原表位序列相同或類似，即模擬了天然蛋白質的連續(xù)表 位。若篩選到與抗體高特異性結合的肽段完全不同于天然抗原序列，則稱這些肽段為模 擬表型(mimotype)，它模擬天然蛋白一級結構上不連續(xù)的氨基酸經(jīng)過空間折疊而形成 的表位結構。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位。該抗原表 位是一種用噬菌體展示肽庫與抗重組HA1兔血清IgG結合，篩選得到的由12個氨基酸 殘基構成的短肽。
本發(fā)明的另一目的是提供上述H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位在制備 H3型流感病毒的診斷試劑中的應用。
本發(fā)明的目的是通過下列技術措施實現(xiàn)的
一種H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位，該抗原表位是由12個氮基酸殘
基構成的短肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.l所示。
所述H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位的融合蛋白。
編碼所述H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位的核苷酸序列。
所述的H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位，是模擬H3型流感病毒血凝
素HA1亞基膜外球狀區(qū)的一種空間構象抗原表位。
所述的H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位在制備H3型流感病毒的診斷
試劑中的應用。
本發(fā)明提供的H3型流感病毒HA空間構象模擬抗原表位是采用抗重組流感病毒 HA1兔血清IgG與肽庫結合篩選得到。原核表達流感病毒HA1，制備抗重組流感病毒 HA1的兔血清IgG，通過逐漸減少包被的抗重組HA1兔血清IgG的濃度并提高漂洗液 中吐溫-20的濃度，逐漸加大篩選壓力使洗脫下的噬菌體與靶分子結合的親和力越來越 高，特異性越來越強，最終得到與抗重組HA1兔血清IgG高特異性緊密結合的噬菌體 克隆。
本發(fā)明的技術途經(jīng)是首先用分子生物學方法擴增流感病毒血凝素片段HA1的基因 hal進行原核表達，純化重組HA1，免疫新西蘭兔，分離抗血清制備抗重組HA1兔血清 IgG。以純化的抗重組HA1兔血清IgG包被酶標板，用噬菌體12肽庫進行篩選，通過 調整包被濃度和漂洗液逐漸加大篩選壓力，經(jīng)過4輪篩選和ELISA鑒定獲得親和力強、 特異性高的噬菌體克隆，DNA測序并進行序列分析。通過免疫印跡鑒定、生物軟件 DNAstar比對和swiss-model數(shù)據(jù)庫同源模建等方法，確定H3型流感病毒HA空間構象 模擬抗原表位序列。
制備本發(fā)明H3型流感病毒HA空間構象模擬抗原表位的技術解決方案詳述如下 用含10%新生牛血清的DEME培養(yǎng)液培養(yǎng)MDCK細胞，當培養(yǎng)瓶中貼壁的MDCK 細胞長滿培養(yǎng)瓶底部面積的70 80 %時，接種流感病毒 A/Swine/Guangdong/6/2004(H3N2)株進行擴增，經(jīng)反復凍融，取含病毒上清，抽提總RNA， 設計特異性引物，運用分子生物學方法克隆得到流感病毒血凝素片段HAl基因hal，導
入原核表達質粒，轉化宿主菌，構建成工程菌，通過對含此質粒的工程菌誘導表達，獲 得目的蛋白并進行純化即為重組H3型流感病毒HA1 。將純化的重組HA1加佐劑乳化， 三次免疫新西蘭兔，分離抗血清，經(jīng)過硫酸銨分級沉淀和DEAE纖維素層析法純化抗重
組HA1的兔血清IgG。
以純化的抗重組HA1兔血清IgG包被酶標板，用噬菌體十二肽庫進行淘篩。將抗 重組HA1兔IgG以100pg/mL的濃度包被酶標板，4'C過夜，加入封閉液，用TBST沖 洗，每孔加入稀釋的噬菌體隨機肽庫與抗重組HA1兔IgG結合，室溫孵育l小時，甩 掉液體，用含0.1 Xtween-20(v/v)的TBST緩沖液漂洗，最后用洗脫液洗下特異性結合的 噬菌體，取少量進行噬菌體滴度測定，其余的轉入新鮮菌液(ER2738)中進行擴增，收 獲擴增的噬菌體，滴定后投入下一輪篩選。后面三輪篩選中，包被的抗重組HA1兔血 清IgG濃度逐漸降低，同時逐漸減少噬菌體與包被蛋白作用的時間，并且漂洗液中tween 的濃度提高到0.5X(v/v)。
經(jīng)過4輪結合一洗脫一擴增的淘篩，挑取第四輪洗脫物單克隆噬菌體用間接ELISA 法進行特異性檢測挑取單個藍色噬菌體克隆接種到含E.coli ER2738的LB培養(yǎng)液中擴 增，PEG沉淀回收噬菌體。以空的M13噬菌體作對照，將噬菌體單克隆擴增上清，加 入到包被有抗重組HA1兔血清IgG的酶標板上，以HRP標記的鼠抗M13抗體為二抗， OPD為底物進行顯色。用競爭ELISA法進一步鑒定噬菌體克隆特異性。將純化的重組 HA1與等體積的噬菌體培養(yǎng)上清混合，加入包被抗重組HA1兔血清IgG的酶標板中， 以HRP標記的鼠抗M13抗體為二抗，OPD為底物進行顯色，酶標儀檢測，計算競爭率。
斑點雜交法排除融合PET32a載體硫氧還蛋白的干擾。將純化的重組HA1和純化的 PET32a空載體硫氧還蛋白分別點于硝酸纖維素膜上，將不同稀釋度的陽性噬菌體上清 與等體積l: 100倍稀釋的兔抗重組HAl血清IgG混合與硝酸纖維素膜共孵育，加HRP 標記的羊抗兔抗體，.DAB顯色，觀察結果。
將與抗重組HA1兔血清IgG特異性結合的噬菌體克隆進行擴增，提取單鏈噬菌體 DNA模板，測序鑒定。對DNA測序結果進行分析，根據(jù)噬菌體密碼子表翻譯出插入噬 菌體載體中的12氨基酸序列，即與抗重組HA1兔血清IgG特異性結合的十二肽。經(jīng)過 同源模建和生物軟件分析確定該十二肽為H3型流感病毒血凝素的一個新的空間構象表 位。該模擬表位的8個保守氨基酸殘基用ds viewer軟件標出。
利用常規(guī)免疫學方法(如噬菌體ELISA法或免疫斑點等方法)，直接以展示H3型 流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位的噬菌體作為抗原，通過測定該模擬抗原表位與 H3型流感病毒血凝素抗體的結合能力，檢測H3型流感病毒感染者或實驗動物血清、體 液、組織中的抗H3型流感病毒血凝素抗體。
本發(fā)明篩選到一個新的H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位，它模擬了位
于H3型流感病毒HA1膜外區(qū)的空間構象表位，它具有如下氨基酸序列-H-P-V-T-Y-Q-F-Q小Y-T-T (SEQ ID NO.l )，能模擬重組HA1與抗重組HA1兔血清IgG 特異性結合。用生物軟件DNAstar比對該短肽與9個H3型流感病毒HA多肽序列的同 源性，該12肽中有8個氨基酸殘基在H3型流感病毒血凝素HAl亞基球狀區(qū)中相對保 守但并不連續(xù)。以此確定該12肽為模擬的空間構象表位。 本發(fā)明有益效果
本發(fā)明首次將噬菌體肽庫技術用于H3型流感病毒的空間構象表位篩選。本發(fā)明將 HA1進行原核表達，制備純化的抗重組HAl兔血清IgG，包被酶標板，進行數(shù)輪優(yōu)化 的生物淘篩過程和特異性鑒定，通過對特異性噬菌體單鏈模板進行DNA測序，根據(jù) Ph.D,12 Phage Display Peptide Library試劑盒中提供的噬菌體專用密碼子表翻譯出展示 于噬菌體表面的12肽氨基酸殘基序列。經(jīng)過生物學軟件DNAstar比對和Swiss-model 蛋白質數(shù)據(jù)庫同源模建分析，獲得模擬H3型流感病毒血凝素膜外球狀區(qū)的空間構象抗 原表位。該模擬抗原表位可用于制備H3型流感病毒的診斷試劑。


圖l:純化原核表達的流感病毒血凝素片段HA1 SDS-PAGE電泳M，低分子量蛋 白marker; 1 7， Ni+柱親和層析純化的各收集管中H3型IV血凝素HAl 。
圖2:純化的抗重組HAl兔血清IgG SDS-PAGE電泳M，低分子量蛋白marker; 1，硫酸銨結合纖維素層析法純化后的抗重組HA1兔血清IgG。
圖3:生物淘篩流程圖。
圖4:陽性噬菌體克隆單鏈模板的DNA電泳分析M， DNAmarkerDL2000; l 20，第四輪淘篩后20個藍色噬菌體克隆單鏈模板。 圖5:免疫印跡檢測陽性噬菌體克隆的特異性。
1. PBS+等體積1:50倍稀釋的抗重組HA1兔血清IgG;
2. 105CFU/mL陽性噬菌體克隆+等體積1:50倍稀釋的抗重組HA1兔血清IgG;
3. 101GCFU/mL陽性噬菌體克隆+等體積1:50倍稀釋的抗重組HA1兔血清IgG;
4. 1015CFU/mL陽性噬菌體克隆+等體積1:50倍稀釋的抗重組HA1兔血清IgG。 圖6: H3型流感病毒血凝素氨基酸序列與陽性噬菌體克隆12肽序列比對。 圖7:組HA1同源模建與分子結構預測。
O)lHaOA的三維空間構象結構圖； (b)重組HAl的三維空間構象結構圖
(c) 12肽模擬空間構象抗原表位在重組HA1球狀區(qū)的標記與定位。
具體實施例方式
結合

本發(fā)明的具體實施方法如下 實施例l、流感病毒血凝素片段HA1的原核表達
1) 流感病毒血凝素片段HA1基因hal的克隆在長成單層的MDCK細胞上，接 種H3型流感病毒A/Swine/Guangdong/6/2004(H3N2)株，37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 小時，當出現(xiàn)明顯細胞病變時，收集細胞，反復凍融裂解細胞，離心去沉淀，取上清。 用Trizol試劑(invitrogen公司產(chǎn)品)抽提總RNA ，根據(jù)流感病毒 A/Swine/Guangdong/6/2004(H3N2)株血凝素基因序列(Gene ID: AY852277)設計一對引 物，依次在反轉錄酶(Invitrogen公司產(chǎn)品)和Taq酶(Takara公司產(chǎn)品)的作用下進 行RT-PCR,獲得hal基因，DNA測序鑒定。兩條引物序列分別為
5 ，-AGCGAATTCTTATGTCTGGCTTTCGC-3' ( SEQ ID N0.2 ) 5'-CTTCTCGAGAACCGTCCATCATTCCCTC-3， (SEQ ID N0.3 )。
2) 重組流感病毒血凝素片段HA1的原核表達將克隆獲得并經(jīng)測序鑒定的hal基 因片段用EcoR I和Xhol I進行雙酶切，酶切體系為50|il (EcoR I 2.5pl， Xhol I 2.5pl， TAKARA公司10XH緩沖液5 pl， hal基因片段25^1，滅菌超純水15pl)， 37'C反應3h， 將酶切產(chǎn)物進行1.0%低熔點瓊脂糖(熔點65°C)凝膠電泳，長波紫外燈下對照DNA 分子量標準，迅速切下1066bp條帶，按膠回收試劑盒(申能博彩公司產(chǎn)品)說明書回 收酶切產(chǎn)物。將原核表達載體PET32 (Novagen公司產(chǎn)品)同樣用EcoR I和Xhol I進 行雙酶切，回收5880bp的線性化片段。將純化回收的hal基因片段和回收的線性化的 PET32連接，連接體系為lO)il (連接酶lpl， IOX連接緩沖液lpl，線性化PET322nl， hal基因4^1，滅菌超純水2|il)， hal基因片段和線性化PET32載體的比例為2~5:1, 16 。C連接16h。連接產(chǎn)物命名為PET32-hal。轉化至克隆宿主菌DH5 a感受態(tài)中，測序鑒 定。提取質粒PET32-hal ，轉化入表達宿主菌ROSSETTA中，涂LB平板(Amp+)。
3) 重組流感病毒血凝素片段重組HA1的純化將含有PET32-hal重組質粒的 ROSSETTA工程菌，接種LB (Amp+)培養(yǎng)液，37。C搖床200rpm至對數(shù)生長期
(OD600=0.4-0.5)，加入終濃度0.8mM的IPTG 37。C搖床200rpm誘導3小時，10，000rpm 離心10min收獲菌體，用原菌液體積1/10的1 X binding buffer重懸，超聲破碎(400W， 工作2s，間隔2s， 10min/100mL菌體)，10，000rpm離心10min去沉淀。上清過Ni+親和 層析柱，分步收集洗脫液1.5mL/管，SDS-PAGE電泳鑒定重組蛋白純度及含量(見圖1)。
經(jīng)灰度掃描定量，親和層析后重組HA1的純度達到95%以上。 實施例2、抗重組HA1兔血清IgG的純化與鑒定
1) 純化的重組HA1免疫新西蘭兔純化的重組HA1用O.OIM， pH7.4的PBS調整 濃度至200pg/mL，與等體積的弗氏佐劑混合，乳化，背部皮下多點注射法免疫新西蘭 兔，首免后兩周進行二免，二免后兩周進行三免。二免和三免使用等體積的弗氏不完全 佐劑進行乳化，同樣進行背部皮下多點注射。經(jīng)三次免疫后測抗體瓊擴效價，當效價達 到1:32時，心臟采血，分離血清。
2) 抗重組HAl兔血清IgG的純化用飽和硫酸銨分級沉淀(硫酸銨飽和度分別為 50% 、 33 %和33 % )結合DEAE纖維素層析法純化兔血清IgG， SDS-PAGE電泳鑒定IgG 純度，紫外分光確定IgG濃度，純化后抗重組HA1兔血清IgG電泳圖上僅有約25kD的 輕鏈和約50kD的重鏈(見圖2)。
實施例3、噬菌體隨機肽庫篩選
1) 噬菌體隨機肽庫是BioLabs公司商品化的M13噬菌體十二肽庫(Ph. D,12TM Phage Display Peptide Library Kit)
2) 篩選方法將稀釋于包被液(pH9.6的碳酸鹽緩沖液)中的抗重組HA1兔血清 IgG(100嗎/mL)包被酶標板，4'C過夜，加入封閉液(3% BSA)4'C 2-3小時，用TBST洗 滌，甩干洗滌液。每孔加入稀釋的噬菌體隨機肽庫，每輪加入的噬菌體數(shù)量均應在 2xl01CM1CFU，室溫孵育1小時，甩掉液體，用含0.1^tween-20(v/v)的TBST緩沖液漂 洗，最后用100^1 pH 2.2甘氨酸緩沖液洗脫與抗重組HA1兔血清IgG特異性結合的噬 菌體，并立即用10jal pH 9.8 Tris緩沖液中和，取10|il進行噬菌體滴度測定，其余噬菌 體轉入新鮮菌液(ER2738 OD二0.2 0.4)中進行擴增，37°C 4-5小時后，4。C， 10,000 rpm 離心10min，取上清重復離心一次，用PEG沉淀收獲噬菌體，經(jīng)梯度稀釋滴定后投入下 一輪篩選(見圖3)。第二輪篩選時抗抗重組HA1兔IgG的包被濃度為50ng/mL， TBST 漂洗液中吐溫-20濃度為0.5% (v/v)。第三輪篩選時抗抗重組HA1兔IgG的包被濃度 為20pg/mL， TBST漂洗液中吐溫-20濃度為0.5X (v/v)。第四輪篩選時抗抗重組HA1 兔IgG的包被濃度為10嗎/mL， TBST漂洗液中吐溫濃度為0.5% (v/v)。
實施例4、噬菌體滴度的測定每輪篩選都必需對投入和洗脫下來的噬菌體進行滴定，計算產(chǎn)率。將待測噬菌體梯 度(1:10-1:1012)稀釋，加到含有E.coli ER2738(OD為0.2~0.4)的LB中，孵育1-5分鐘， 加入熔化的45。C頂層瓊脂中，立即均勻鋪于含X-gaI和IPTG的底層LB瓊脂板上。37 'C過夜，計數(shù)藍色克隆數(shù)并計算噬菌體滴度。生物淘篩的產(chǎn)率根據(jù)該公式進行計算產(chǎn) 率=洗出噬菌體數(shù)/投入噬菌體數(shù)。隨著淘篩的進行，洗脫下來的噬菌體與抗重組HA1 兔血清IgG的親和力越來越高，產(chǎn)率也逐漸升高，與重組HA1結合陽性的噬菌體克隆 得到富集(表l)。
表l
克隆形成單位第一輪第二輪第三輪第四輪
投入噬菌體數(shù)4X 10102.4X10101.5X10111X1011
洗出噬菌體數(shù)9X1041.8X1051.15X1071.4X106
洗出/投入2.25X10-67.5 X10-67.66X10-51.4X10-5
實施例5、噬菌斑的擴增及噬菌體陽性克隆的鑒定
挑取在LB (Tet/IPTG/X-gal)平板上生長的ER2738單克隆于LB (Tet抗性)培養(yǎng) 液中，37。C搖床250rpm擴增至OD,二0.4 0.5，用LB (Tet抗性)培養(yǎng)液1:10稀釋， 每個試管中加入2mL。第四輪淘篩后的洗脫產(chǎn)物經(jīng)梯度稀釋滴定，挑取在LB平板
(Tet/IPTG/X-gal)上生長的單個藍色噬菌體克隆接種到含2mL E.coli ER2738的LB培 養(yǎng)液中，37。C搖床250rpm4-5h。離心棄沉淀，上清用PEG沉淀噬菌體，并用等體積TBS 重懸。將擴增重懸于TBS的噬菌體加入到包被抗重組HA1兔血清IgG的酶標板
(10|ag/mL)上，以空的M13KE噬菌體作對照，37'C孵育lh， TBST漂洗三次，加入 1:5000倍稀釋的HRP標記的鼠抗M13抗體，37。C孵育lh，漂洗后加OPD底物顯色， 酶標儀檢測OD490。以P/N>2.1者判為陽性，將獲得的20個陽性克隆進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(表 2)。
實施例6、陽性噬菌體克隆DNA序列的測定與分析
參照Ph. D,12TM Phage Display Peptide Library Kit的噬菌體單鏈DNA模板抽提方 法提取ssDNA。用大腸桿菌ER2738對20個陽性噬菌體克隆進行擴增，當含有四環(huán)素 的LB培養(yǎng)液中的大腸桿菌ER2738株處于對數(shù)生長初期(OD,二0.4 0.5)時，取5mL 該菌液加入50^il單克隆噬菌體上清，37°C， 250rpm搖4.5-5h;培養(yǎng)液4。C， 10,000 rpm，
離心5min，取上清重復離心一次，再取80%上清。取lmL噬菌體上清加入400|al PEG， 4'C 10min沉淀噬菌體；4。C， 12,000 rpm離心10min，獲得噬菌體沉淀；加入200W Loddie Buffer (10mM Tris-HCl, pH8.0, lmMEDTA,4MNal，常溫避光保存)，重懸噬菌體；加入 500h1無水乙醇，混勻室溫放置10min， 12,000rpm離心10min，棄上清，用70%乙醇洗 滌沉淀，室溫干燥5min，將沉淀溶于30nl滅菌超純水中，取5pl進行電泳分析(見圖4)， 剩余的噬菌體單鏈模板用M13 -96 gIII測序引物進行sanger雙脫氧法核酸序列自動測 序，M13 -96 gill測序引物序列為5，-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3， (SEQ ID N0.4)。 結果顯示挑取的20個陽性噬菌體克隆插入的核酸序列完全一致，編碼鏈序列均為 5，-CATCCTACGACTTATCAGTATACGATTTATGTTACT-3， (SEQ ID N0.5)，根據(jù)噬菌 體肽庫說明書中提供的M13噬菌體密碼子表，翻譯出展示于陽性噬菌體表面的12肽為 NH2-His-Pro-Thr-Thr-Tyr-Gln-Tyr-Thr-Ile-Tyr-Val-Thr-COOH (SEQ ID NO. 1 )。
實施例7、陽性噬菌體克隆的特異性檢測
1) 競爭ELISA:將稀釋于包被液(pH9.6的碳酸鹽緩沖液)中的抗重組HAl兔血 清IgG (100嗎/ml)包被96孔酶標板，4'C過夜，封閉。純化的重組HA1或抗重組HA1 兔血清IgG與等體積的噬菌體培養(yǎng)上清混合，加入酶標板中37。C孵育lh。 TBST漂洗三 次，加入HRP標記的鼠抗M13單克隆抗體，37'C孵育lh,漂洗后加底物OPD顯色15 分鐘，顯色結束后用2M硫酸終止顯色反應，酶標儀檢測OD490。按如下公式計算競爭 抑制率[(A1-A2)/A1]X100， Al為無抑制物競爭時的OD490, A2為有抑制物競爭時 的OD490。陽性噬菌體克隆與重組HA1之間的特異性結合可被兔抗重組HA1血清IgG 和重組HA1所抑制，競爭抑制率分別為43.0%和40.8% (如表2)。
表2
噬菌體上清 夾心ELISA IgG競爭抑制 HA1競爭抑制
挑取噬菌體克隆 0.635 ±0.063a0.362(43,0%, 0.376(40.8%)~ M13KE 0.137±0.033 0.116(-) 0.159(-)
aA490平均值i標準差(樣本數(shù)=20) b競爭抑制率
2) 免疫印跡分別將純化的重組HA1和PET32a載體硫氧還蛋白(PET32a載體轉 入大腸桿菌ROSSETTA中，以0.8MIPTG誘導，超聲破碎，上清過Ni+親和柱純化)點 于硝酸纖維素膜上，37°C干燥10min，用5%脫脂奶粉室溫封閉lh， PBS洗膜三次'
分別用PBS、 IX 105CFU/mL、 1 X 101QCFU/mL和1 X 1015CFU/mL的陽性噬菌體與等體 積的h IOO倍稀釋的兔抗重組HAI血清IgG混合，孵育硝酸纖維素膜4。C過夜，洗膜 后，加HRP標記的羊抗兔抗體，溫育lh， PBS洗膜三次，加DAB顯色，觀察結果(見 圖5)。
實施例8、序列比對和同源模建分析
從Genebank上搜索不同來源的H3型流感病毒血凝素氨基酸序列，用DNAstar軟 件包中的MegAlign，將重組HA1和另外8個H3型IV HA的氨基酸序列與噬菌體陽性 克隆的12肽序列進行比對。結果發(fā)現(xiàn)12肽中的8個氨基酸殘基與包括 A/Swine/Guangdong/6/2004(H3N2)株在內(nèi)的9個不同來源的H3型IV HA序列一致，但 并不連續(xù)(圖6)。以A/Swine/Guangdong/6/2004(H3N2)株流感病毒血凝素氨基酸序列為 例，這8個保守的氨基酸分別是HIS(192)、 PRO(193)、 THR(195)、 TYR(203)、 GLN(218)、 ILE(240)、 TYR(241)、 THR(243)。雖然8個保守的氨基酸殘基中包含了 HP-T和IY-T兩 個基序，但由于一級結構上不連續(xù)性且距離較遠(大約在50個氨基酸殘基的范圍內(nèi))， 因此不能確定為序列表位。
將重組HA1的氨基酸序列遞交到Swiss-model數(shù)據(jù)庫中，尋找已知空間構象的同源 蛋白。理論上，當靶蛋白與同源蛋白一級結構相似性高于35%時，可進行同源模建，一 級結構相似性越高，同源模建所得的空間構像結果越可靠。通過Swiss-model數(shù)據(jù)庫中 的搜索，蛋白1HaOA與重組HA1的序列同源性高達84%， 1HaOA的空間構象已經(jīng)由 X-射線晶體衍射法確定，根據(jù)1HaOA的三維空間構象結構圖，對重組HA1進行同源模 建，得到重組HA1的三維結構圖像文件，用Rasmol打開，并用ds viewer進行氨基酸 分析，標記出8個保守的氨基酸殘基，確定淘篩到的12肽序列模擬了 H3型流感病毒血 凝素HA1 —級結構上不連續(xù)的氨基酸經(jīng)過空間折疊而形成的表位結構，并確定該空間 構象表位位于HA1球狀區(qū)(見圖7)。
實施例9、衣殼蛋白gIII融合了 HA 12肽空間構象模擬抗原表位的噬菌體的擴增 噬菌體12肽庫是通過把隨機12肽與噬菌體表面的gIII蛋白融合，將12肽表達在噬
菌體衣殼蛋白gIII的N末端形成12肽一glII融合蛋白，再經(jīng)過噬菌體衣殼蛋白的裝配，
將12肽展示于噬菌體顆粒的表面。
用大腸桿菌ER2738對展示H3型流感病毒血凝素12肽空間構象模擬抗原表位的噬 菌體克隆進行擴增，當含有四環(huán)素的LB培養(yǎng)液中的大腸桿菌ER2738株處于對數(shù)生長 初期(OD,^0.4 0.5)時，取20mL該菌液加入20(Hil單克隆噬菌體上清，37°C， 250rpm 搖4.5-5h;培養(yǎng)液4。C， 10,000 rpm，離心5min，取上清重復離心一次，再取80%上清。 每毫升噬菌體上清加入400nlPEG，4'C 10min沉淀噬菌體；4。C， 12,000 rpm離心10min， 獲得噬菌體沉淀，用4ml生理鹽水懸起。每個噬菌體衣殼蛋白gIII的N端都融合了 H3 型流感病毒血凝素12肽空間構象模擬抗原表位。
實施例10 、 H3型流感病毒感染的診斷試劑盒的構建
直接以人工合成的SEQIDNo.l所示的模擬抗原表位12肽作為抗原，包被96孔酶 標板，37°C 2小時，PBST洗板三次，用5X脫脂奶粉4。C封閉過夜；棄封閉液，PBST 洗板3次，每孔加入100^1 1:400倍稀釋的經(jīng)H3型流感病毒HA1蛋白免疫的兔血清， 同時以等量1:400倍稀釋的免疫前兔血清做陰性對照，免疫血清和陰性對照血清各做3 個重復孔，37'C孵育2小時，PBST洗板3次，每孔加入lOOpl 1:1000倍稀釋的HRP標 記的羊抗兔抗體，37'C溫育lh， PBST洗板三次，以TMB顯色試劑盒進行顯色，酶標 儀檢測各孔OD45Q。免疫兔血清平均0045()為0.352，陰性對照血清平均OD45Q為0.083， 符合P/N〉2.1的判斷標準。
〈110〉中國藥科大學
<120> H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位及其應用 〈歸5
〈210〉 1 〈211〉 12 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223> H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位 <400〉 1
His Pro Thr Thr Tyr Gin Tyr Thr lie Tyr Val Thr 1 5 10
〈210> 2 〈211> 26 <212> DNA <213〉人工序列 <220>
<223>人工引物序列 <400> 2
agcgaattct tatgtctggc tttcgc 26
<210> 3
<211> 28 <212>腿 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉人工引物序列
〈400〉 3
cttctcgaga accgtccatc attccctc 28
〈210> 4
〈211> 20
〈212> DNA <213>人工序列 〈220〉
〈223〉人工引物序列
〈400〉 4
ccctcatagt tagcgt犯cg 20
〈210> 5
〈211〉 36
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220〉
〈223〉 H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位編碼序列
〈400> 5
catc ctacga cttatcagta tacgatttat gttact 3權利要求
1、一種H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位，該抗原表位是由12個氨基酸殘基構成的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、 權利要求1所述H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位的融合蛋白。
3、 編碼權利要求1所述H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位的核苷酸序列。
4、 如權利要求1所述H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位，其特征在于該 抗原表位是模擬H3型流感病毒血凝素HA1亞基膜外球狀區(qū)的一種空間構象抗原表位。
5、 如權利要求1所述的H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位在制備H3型 流感病毒的診斷試劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于多肽生物技術領域，公開了H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位及其應用。該H3型流感病毒血凝素空間構象模擬抗原表位肽的序列為SEQ ID No.1。本發(fā)明利用抗重組HA1兔血清IgG篩選噬菌體12肽庫，用噬菌體ELISA、DNA測序、免疫印跡、軟件分析等方法對挑取的克隆進行分析，最終在隨機噬菌體12肽庫中篩選到能夠與抗重組HA1兔血清IgG特異性結合的小肽。本發(fā)明提供的空間構象模擬抗原表位可制備H3型流感病毒感染的診斷試劑盒。
文檔編號C07K14/435GK101186644SQ200710191019
公開日2008年5月28日 申請日期2007年12月5日 優(yōu)先權日2007年12月5日
發(fā)明者娟 于, 儲春麗, 刁振宇, 姚文娟, 云 張, 董莉莉, 鄧小昭, 輝 鐘 申請人:中國藥科大學