專利名稱：一種h1n1豬流感病毒血凝素模擬抗原表位及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種能模擬Hmi豬流感病毒血凝素抗原 表位的12肽及其在制備Hmi豬流感病毒抗體檢測(cè)試劑上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流感病毒(Influenza virus)屬正粘液病毒科，流感病毒屬，為單股負(fù)鏈RNA病 毒，由大小不等的8個(gè)獨(dú)立片段組成。根據(jù)病毒抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒 分為甲、乙、丙三型。甲型流感病毒根據(jù)血凝素(H)和神經(jīng)酰胺酶(N)的不同又分為許多 亞型，H可分為15個(gè)亞型(Hl H16)，N有9個(gè)亞型(附 N9)，其中感染人和豬的主要 是A型流感病毒H1N1、H2N2、H3N2。已有研究表明，豬能感染多種流感病毒，是流感病毒的 “混合器”。2009年甲型Hmi流感病毒在人際間大規(guī)模流行，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。 遺傳分析顯示,這個(gè)病毒就含有豬流感的基因成分CTransmission and Reassortment of Pandemic HlNl/2009Influenza A Virus in Swine. D. Vijaykrishna, et al，SCIENCE VOL 328 18JUNE 2010)。Him亞型引起的豬流感已有近百年歷史，1918年美國(guó)首次報(bào)道，1930 年Shope從豬體中首次分離到Hmi亞型豬流感病毒，即A/Swine/Iowa/30 (HlNl)。豬流感 病毒(Swine influenza virus, SIV)基因組大約為 13. 6kb，其中血凝素(hemagglutinin， HA)基因在流感病毒傳染的過(guò)程中與識(shí)別靶細(xì)胞表面受體在穿膜過(guò)程中起重要作用，刺激 機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體可以抵抗病毒感染。目前Hmi豬流感病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷主要基于核 酸RT-PCR和熒光定量RT-PCR，缺乏簡(jiǎn)便特異的免疫學(xué)診斷方法。因此，研制抗體檢測(cè)相關(guān) 試劑，對(duì)Hmi型流感病毒的研究、診斷、治療及控制具有重要意義。免疫學(xué)研究表明，引起免疫應(yīng)答的主要成份是蛋白抗原，而起決定作用的又是蛋 白抗原上的抗原決定簇即抗原表位。血凝素(hemagglutinin，HA)是流感病毒的主要外膜 蛋白，是流感病毒最重要的蛋白抗原之一。HA具有免疫原性，能使人體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但 其容易變異，是流感流行的主要原因之一，也是流感病毒檢測(cè)的靶標(biāo)之一。隨著人們?cè)絹?lái)越 對(duì)Hmi豬流感病毒的關(guān)注，HlNl豬流感病毒血凝素抗原表位的獲得和應(yīng)用也成為研究焦 點(diǎn)。由于基因工程技術(shù)和免疫學(xué)的發(fā)展，人們能夠鑒定抗原表位，并且可對(duì)其氨基酸序列進(jìn) 行分析研究，使得抗原表位的獲得成為可能。噬菌體展示技術(shù)是一項(xiàng)十九世紀(jì)初發(fā)展起來(lái)的新的基因操作技術(shù)，它將外源多肽 或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子 的DNA則位于病毒粒子內(nèi)。使大量多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶 分子(抗體、酶、細(xì)胞表面受體等)的多肽配體通過(guò)淘選得以快速鑒定(Identification and Charaterization of Peptides Mimicking theEpitopes of Metal loprotease of Schistosoma Japonicum，CMI，2005，2 (3))。從噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)中篩選抗原表位的基本原理 是生物淘選，可使用純化的單克隆抗體、陽(yáng)性血清IgG或重組表達(dá)蛋白為靶分子進(jìn)行淘選， 可以篩選出與原始抗原序列完全相同的線性表位抗原，也能篩選出與原始抗原序列不完全 相同但功能相似的構(gòu)象表位抗原，即模擬表位抗原(Schistosoma japonicum Jsolationandldentification of Peptides Mimicking Ferritin Epitopes from Phage Display Library. ActaBiochimica et Biophysica Sinica. 2004,36(3))。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選一種Hmi豬流感病毒血凝素模擬抗原表位。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述Hmi豬流感病毒血凝素模擬抗原表位在制備 HlNl豬流感病毒血清學(xué)診斷試劑中的應(yīng)用，使得Hmi豬流感的檢測(cè)更加快速，簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確。—種Hmi豬流感病毒血凝素模擬抗原表位，是由12個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的短肽，其 氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示SEQ ID NO 1 =Gly-Leu-Leu-Arg-Ser-Leu-Thr-Tyr-Glu-Ala-Val-Argo編碼所述的Hmi豬流感病毒血凝素模擬抗原表位的核苷酸序列包括SEQ IDNO 2 5' -GGT CTT TTG CGT TCT TTG ACT TAT GAG GCT GTG CGT-3，。所述的Hmi豬流感病毒血凝素模擬抗原表位能制備Hmi豬流感病毒抗體檢測(cè)試 劑，如試劑盒等。本發(fā)明中Hmi豬流感病毒血凝素模擬抗原表位是通過(guò)用Hmi豬流感病毒血凝素 免疫小鼠血清IgG對(duì)噬菌體12肽庫(kù)(New England Biolabs公司產(chǎn)品)進(jìn)行篩選得到的。 通過(guò)逐漸減少包被的Hmi豬流感病毒血凝素免疫小鼠血清IgG的濃度并提高漂洗液中吐 溫-20的濃度，逐漸加大篩選壓力使洗脫下的噬菌體與Hmi豬流感病毒血凝素免疫小鼠血 清IgG的親和力越來(lái)越高，特異性越來(lái)越強(qiáng)，通過(guò)3輪篩選最終得到與Hmi豬流感病毒血 凝素免疫小鼠血清IgG高特異性結(jié)合的噬菌體。經(jīng)噬菌體陽(yáng)性鑒定、單克隆化后提取噬菌 體克隆單鏈DNA，測(cè)序后按噬菌體專用密碼子表翻譯出展示于噬菌體表面的12肽氨基酸殘 基序列。通過(guò)免疫印跡鑒定、生物軟件等方法的分析，確定為HlN 1豬流感病毒血凝素空間 構(gòu)象模擬抗原表位。制備本發(fā)明Hmi豬流感病毒血凝素空間構(gòu)象模擬抗原表位的過(guò)程為1、以Hmi豬流感病毒血凝素免疫小鼠血清IgG 100 μ g/mL包被酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜， 加入封閉液，用TBST洗滌后，每孔加入稀釋的噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)，室溫孵育1小時(shí)，倒掉液 體，用含0. 1% tween-20的TBST緩沖液洗滌，用洗脫液洗下特異性結(jié)合的噬菌體，取少量 進(jìn)行噬菌體滴度測(cè)定，其余的轉(zhuǎn)入新鮮菌液E. coliER2738 (OD600為0. 5左右)中進(jìn)行擴(kuò)增， PEG-8000/氯化鈉沉淀回收噬菌體，擴(kuò)增的噬菌體在測(cè)定滴度后用于下一輪篩選。后面2 輪篩選中，包被的Hmi豬流感病毒血凝素免疫小鼠血清IgG濃度逐漸降低，同時(shí)漂洗液中 tween-20的濃度提高到0. 5%。2、經(jīng)過(guò)3輪結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增的淘篩，對(duì)第三輪洗脫液鋪板，挑取單個(gè)噬菌體克 隆接種到含E. coliER2738的培養(yǎng)液中擴(kuò)增，PEG-8000/氯化鈉沉淀回收噬菌體。用噬菌體 ELISA法對(duì)噬菌體進(jìn)行陽(yáng)性鑒定用擴(kuò)增的單克隆噬菌體(以野生型M13噬菌體作對(duì)照)加 入到包被有Hmi豬流感病毒血凝素免疫小鼠血清IgG的酶標(biāo)板上，以HRP標(biāo)記的鼠抗M13 抗體(New England Biolabs公司產(chǎn)品)為二抗，TMB為底物進(jìn)行顯色。用dot-ELISA法進(jìn) 一步鑒定噬菌體克隆特異性將單個(gè)噬菌體克隆點(diǎn)在PDF膜上(以野生型M13噬菌體作對(duì) 照)，與Hmi豬流感病毒血凝素免疫小鼠血清IgG孵育，以HRP標(biāo)記的抗鼠IgG為二抗，DAB4為底物進(jìn)行顯色，觀察結(jié)果。3、對(duì)鑒定為陽(yáng)性的噬菌體克隆，提取噬菌體單鏈DNA模板，測(cè)序鑒定。對(duì)DNA測(cè)序 結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)噬菌體密碼子表翻譯出插入噬菌體載體中的12氨基酸序列，即與Hmi 豬流感病毒血凝素免疫小鼠血清IgG特異性結(jié)合的十二肽。經(jīng)過(guò)與GenBank中已公布的Hmi豬流感病毒血凝素蛋白序列進(jìn)行對(duì)比，未發(fā)現(xiàn)有 同源性，說(shuō)明本發(fā)明所提供的十二肽為Hmi豬流感病毒血凝素的一個(gè)空間構(gòu)象表位，而非 線性表位。本發(fā)明公開的短肽可以通過(guò)本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域中常規(guī)的化學(xué)合成等方法制備。利用ELISA方法，用獲得的展示Hmi豬流感病毒血凝素空間構(gòu)象模擬抗原表位的 噬菌體作為抗原，檢測(cè)Hmi豬流感病毒感染血清、體液中的抗Hmi流感病毒血凝素抗體。本發(fā)明獲得的新的Hmi豬流感病毒血凝素空間構(gòu)象模擬抗原表位，它具有如下 氨基酸序列=Gly-Leu-Leu-Arg-Ser-Leu-Thr-Tyr-Glu-Ala-Val-Arg (SEQ IDN0. 1)，能模擬 HlNl豬流感病毒血凝素與Hmi流感病毒血凝素免疫小鼠血清IgG特異性結(jié)合。本發(fā)明利用重組的Hmi豬流感病毒HA制備、純化的抗重組HA小鼠血清IgG，包 被酶標(biāo)板，進(jìn)行3輪生物淘篩過(guò)程和特異性鑒定，通過(guò)對(duì)特異性噬菌體單鏈DNA模板進(jìn)行測(cè) 序，根據(jù)Ph.D.-12Phage Display Peptide Library試劑盒中提供的噬菌體專用密碼子表 翻譯出展示在M13噬菌體表面的12肽氨基酸殘基序列。經(jīng)過(guò)生物學(xué)軟件DNAstar比對(duì)分 析，獲得模擬HlN 1豬流感病毒血凝素的空間構(gòu)象抗原表位。該模擬抗原表位可用于制備 HlNl豬流感病毒的診斷試劑，如試劑盒等。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于提供了一種Hmi豬流感病毒血凝素模擬抗原表位。其可以應(yīng) 用于制備Hmi豬流感病毒血清學(xué)診斷試劑，不僅為Hmi豬流感的檢測(cè)提供了新的方法，而 且與以往的檢測(cè)方法相比，更加快速，簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，尤其適合于大批量樣品的快速檢測(cè)。


圖1 真核表達(dá)Hmi豬流感病毒血凝素純化后的SDS-PAGE電泳圖；M 蛋白分子量marker圖2 純化的抗重組Hmi豬流感病毒血凝素小鼠血清IgG SDS-PAGE電泳圖；M，蛋白分子量蛋白marker (kDa)；1和2為硫酸銨結(jié)合纖維素層析法純化后的小鼠血清IgG ；圖3 噬菌體克隆的陽(yáng)性鑒定1和2 陽(yáng)性對(duì)照；3禾Π 4 陰性對(duì)照；5-10 噬菌體克?。粓D4 =HlNl豬流感表達(dá)血凝素蛋白噬菌體模擬表位的特異性分析HlNl豬流感病毒感染血清能識(shí)別本發(fā)明獲得的噬菌體pill融合蛋白，出現(xiàn)特異 性條帶，而野生型Μ13噬菌體不被識(shí)別；2和3均為表達(dá)SEQ ID NO 1的噬菌體克隆。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
實(shí)施例1流感病毒血凝素HA的表達(dá)1)流感病毒血凝素HA基因的克隆和重組表達(dá)載體的構(gòu)建參照GenBank發(fā)表的 HlNl 豬流感 HA 基因序列(GU086049. 1，A/swine/Guangdong/628/2006 (HlNl)),設(shè)計(jì)合 成HA基因的特異性上下游引物，在上下游引物的5’端分別引入的BamH I.Hind 111酶 切位點(diǎn)，用下劃線表示，并在下游引物引入6XHis標(biāo)簽，用方框表示。上游引物為5’ -CG CGGATCCGCGACCGCAAATGCAGAC-3，；下游引物為5，-GCGAAGCTTCTA |CTGATGGTGATGGTGATGGATCGCCAAAATTTGGTAAATCC-3，。擴(kuò)增片段大小為1563bp。用Trizol試劑提取病毒總 RNA后，用上述引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)寶生物(大連)膠回收試劑盒回收后與 PFastBacGP67B轉(zhuǎn)座載體用BamH I、Hind 111雙酶切后分別回收，連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 ToplO，測(cè)序鑒定陽(yáng)性重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒。將陽(yáng)性重組轉(zhuǎn)座載體pFastBaCGP67B-Hmi轉(zhuǎn)化含有 桿狀病毒穿梭載體bacmid的DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體kicmid-HlNl，用 PCR進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。2) HlNl豬流感表達(dá)血凝素蛋白的表達(dá)純化按照hvitrogen Bac-to BacBaculovirus Expression System試劑盒進(jìn)行，將重組bacmid-Hmi在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn) 染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sf9昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)收獲含有Hmi豬流感病毒血凝素基因的重組桿狀病 毒。最后用重組桿狀病毒感染sf9細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。培養(yǎng)7 后收集細(xì)胞，提取蛋白。用8M 尿素變性后用組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑進(jìn)行純化(圖1)。重組HlN 1豬流感表達(dá)血凝素蛋 白大小為58kDa。實(shí)施例2抗重組Hmi豬流感病毒血凝素小鼠血清IgG的制備和純化1)小鼠血清IgG的制備將純化的重組Hmi豬流感病毒血凝素蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化，背部 皮下多點(diǎn)免疫BalB/C小鼠，每只50 μ g。2周和4周后重復(fù)免疫2次，使用弗氏不完全佐劑 作乳化劑。第三次免疫7天后眼眶靜脈采血，分離血清。2)小鼠血清IgG的純化
用飽和硫酸銨分級(jí)沉淀結(jié)合DEAE纖維素層析法純化小鼠血清IgG。用SDS-PAGE 分析純度(圖幻，用分光光度計(jì)測(cè)定濃度。實(shí)施例3噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)篩選1)噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)New England Biolabs公司商品化的M13噬菌體12肽庫(kù) (購(gòu)自上海吉泰新繹生物科技有限公司，其為代理商)Ph.D.-12TMPhage DisplayPept ide Library02)免疫小鼠IgG對(duì)隨機(jī)肽庫(kù)的篩選將小鼠抗Hmi豬流感病毒血凝素血清IgG用 包被液(PH9. 6的碳酸鹽緩沖液)稀釋成100 μ g/mL包被酶標(biāo)板，每空100 μ L，4°C過(guò)夜，用 TBST洗滌后加入封閉液封閉37°C封閉池，用TBST洗滌3次后，每孔加入用TBS稀釋的噬菌 體隨機(jī)12肽庫(kù)100 μ L (含2 X IO11CFU)，室溫孵育1小時(shí)，倒掉液體，用含0. 1 % tween-20的 TBST緩沖液洗滌10次，用100 μ L洗脫液(ρΗ2. 2甘氨酸緩沖液)洗下特異性結(jié)合的噬菌體， 取10 μ L進(jìn)行噬菌體滴度測(cè)定，其余的轉(zhuǎn)入新鮮菌液Ε. coli ER2738 (OD600為0. 5左右)中 進(jìn)行擴(kuò)增。37°C擴(kuò)增4h后，4°C IOOOOrpm離心lOmin，取上清，加入1/5體積的PEG-8000/ 氯化鈉4°C過(guò)夜沉淀回收噬菌體。4°C IOOOOrpm離心IOmin棄上清，沉淀用TBS懸浮。擴(kuò) 增的噬菌體在測(cè)定滴度后用于下一輪篩選。后面2輪篩選中，包被的Hmi豬流感病毒血凝IgG濃度分別為50 μ g/mL和25 μ g/mL,同時(shí)漂洗液中tween-20的濃度提 高到0. 5%。實(shí)施例4噬菌體滴度的測(cè)定將獲得的噬菌體作梯度稀釋(IO1-IO15)，取10 μ L加到含有E. col iER2738 (OD6tltl為 0.5左右)的0. ImL LB中孵育lOmin，加入到1000 μ L熔化的45°C頂層瓊脂中，立即均勻鋪 于含X-gal和IPTG的LB瓊脂板上(含四環(huán)素)，37°C過(guò)夜，計(jì)數(shù)藍(lán)色噬斑數(shù)并計(jì)算噬菌體滴度。經(jīng)測(cè)定，第一輪洗脫液的噬菌體滴度為4. 6X104，第二輪洗脫液的滴度為 3. 9 X 105，第三輪洗脫液的滴度為1.2X107。說(shuō)明噬菌體和小鼠抗Hmi豬流感病毒血凝素 血清IgG結(jié)合越來(lái)越高，使噬菌體得到富集。實(shí)施例5噬菌斑的擴(kuò)增及噬菌體陽(yáng)性克隆的鑒定1)噬菌體單克隆化和擴(kuò)增挑取第3輪篩選洗脫液測(cè)定滴度后的LB平板上生 長(zhǎng)的藍(lán)色噬菌斑接種到2mL含有E. coliER2738 (OD600為0. 5左右)的LB培養(yǎng)液中，37°C 250rpm振蕩培養(yǎng)4. 5h。離心棄沉淀，上清加入1/5體積的PEG-8000/氯化鈉4°C過(guò)夜沉淀。 40C IOOOOrpm離心IOmin棄上清，沉淀用TBS懸浮。2)噬菌體ELISA鑒定陽(yáng)性噬菌體將擴(kuò)增重懸于TBS的噬菌體克隆100 μ L加入 到包被Hmi豬流感病毒血凝素免疫小鼠血清IgG(10 μ g/mL, 100 μ L/空)的酶標(biāo)板上，以 野生型M13噬菌體作對(duì)照，37°C孵育lh，TBST漂洗三次，加入1 5000倍稀釋的HRP標(biāo)記 的鼠抗M13噬菌體抗體，37°C孵育30min，漂洗3次后加TMB底物顯色，終止后酶標(biāo)儀檢測(cè) OD4500噬菌體OD值大于陰性對(duì)照2倍的為陽(yáng)性。對(duì)隨機(jī)挑取的40個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行了檢 測(cè)，其中有39個(gè)為陽(yáng)性。3)噬菌體克隆dot-ELISA的鑒定選取噬菌體ELISA中OD值最大的5個(gè)噬菌體陽(yáng)性克隆和1個(gè)為陰性的噬菌體克 隆進(jìn)行dot-ELISA鑒定。將單個(gè)噬菌體克隆(5 X IO15CFU)點(diǎn)在PDF膜上(以野生型M13噬 菌體作對(duì)照)，干后在5%脫脂牛奶中封閉lh，與Hmi豬流感病毒血凝素免疫小鼠血清IgG 孵育，以HRP標(biāo)記的抗鼠IgG為二抗，DAB為底物進(jìn)行顯色，觀察結(jié)果(圖3)。實(shí)施例6、陽(yáng)性噬菌體克隆DNA序列的測(cè)定與分析按照BioLabs 公司 M13 噬菌體 12 肽庫(kù) Ph. D. -12 Phage Display Peptide LibraryKit說(shuō)明書中噬菌體單鏈DNA提取方法，提取噬菌體ELISA鑒定為陽(yáng)性的39個(gè)噬 菌體克隆的單鏈DNA。由寶生物(大連)有限公司測(cè)序，測(cè)序引物為M13-96gIII，序列為 5‘ -CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3‘。測(cè)序結(jié)果顯示，39個(gè)陽(yáng)性噬菌體中共獲得4種不同的核酸 序列，其中35個(gè)陽(yáng)性噬菌體克隆擁有相同的插入核酸序列GGT CTT TTG CGT TCT TTG ACT TAT GAG GCT GTG CGT (SEQ ID NO :2)，其編碼的氨基酸序列為Gly-Leu-Leu-Arg-Ser_Leu -Thr-Tyr-Glu-Ala-Val-Arg(SEQ IDNO :1)。本發(fā)明以該序列為優(yōu)選序列。經(jīng)過(guò)與GenBank中已公布的Hmi豬流感病毒血凝素蛋白序列進(jìn)行對(duì)比，未發(fā)現(xiàn)有 同源性，說(shuō)明該表位肽為Hmi豬流感病毒血凝素的一個(gè)空間構(gòu)象表位，而非線性表位。實(shí)施例7 HlNl豬流感病毒血凝素蛋白模擬抗原表位的特異性檢測(cè)噬菌體肽庫(kù)展示技術(shù)將12短肽融合表達(dá)在噬菌體gill蛋白的N端，在通過(guò)衣殼 蛋白的裝配而展示在噬菌體表面。因此，如果插入的12肽能特異性的與某種抗體結(jié)合，那7么通過(guò)ffestern-blot分析就會(huì)在噬菌體gill蛋白位置出現(xiàn)特異性條帶。本發(fā)明將表達(dá)SEQ ID NO 1的噬菌體克隆擴(kuò)增后(含IO15個(gè)噬菌體顆粒)與SDS 上樣緩沖液混合，置沸水中煮:3min后，在非還原條件下進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印至 硝酸纖維膜上。用5%的脫脂奶粉將膜封閉a^PBS-T漂洗3次。用Hmi豬流感病毒感染 血清作一抗，HRP標(biāo)記的馬抗豬IgG作二抗，DAB顯色。結(jié)果表面噬菌體克隆經(jīng)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后，表達(dá)SEQID NO 1的噬菌體在67kDa處出現(xiàn)條帶，而野生型M13則未出現(xiàn)條帶(圖4)，顯示了其含有插入 短肽的PlII融合蛋白能被Hmi豬流感病感染血清識(shí)別，而野生型M13的pill蛋白不能 被Hmi豬流感病感染血清，這說(shuō)明表達(dá)SEQ ID N0:1的噬菌體PlII融合蛋白中的外源 12肽模擬了 Hmi豬流感病毒血凝素的抗原表位。識(shí)別條帶出現(xiàn)在67kD處，這與PlII蛋 白的實(shí)際分子量(42kD)不符，但與文獻(xiàn)報(bào)道一致(Schistosoma japonicum =Isolation and Identification ofPeptides Mimicking Ferritin Epitopes from Phage Display Library. ActaBiochimica et Biophysica Sinica. 2004，36 (3))。引起這一現(xiàn)象的原因可 能是同處噬菌體尾部的PlII蛋白和PVI蛋白沒(méi)有分開(兩者分子量之和恰好為67kD)。實(shí)施例8 HlNl豬流感病毒感染抗體檢測(cè)試劑盒的研制直接以人工合成的SEQ ID NO 1所示的模擬抗原表位12肽作為抗原，包被96孔 酶標(biāo)板(5 μ g/空，每孔100 μ , 37 0C 2h，PBST洗板三次，用5%脫脂奶粉37°C封閉Ih ；棄 封閉液，PBST洗板3次，每孔加入100 μ L 1 400倍稀釋的Hmi豬流感表達(dá)血凝素小鼠 免疫血清，以正常小鼠血清做陰性對(duì)照，免疫血清和陰性對(duì)照血清各做25個(gè)重復(fù)孔，37°C 孵育》i，PBST洗板3次，每孔加入100 μ L 1 5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的抗鼠抗體，37°C溫 育45min，PBST洗板三次，以TMB為顯底物進(jìn)行顯色，酸終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD徹。 免疫小鼠血清平均OD450為0. 564，陰性對(duì)照血清平均OO45tl為0. 091。判定標(biāo)準(zhǔn)為樣品OD450 大于陰性對(duì)照2倍的，為陽(yáng)性。利用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)本申請(qǐng)人保存的M37份豬血清進(jìn)行了 Hmi豬流感 病毒抗體的檢測(cè)，共檢出陽(yáng)性血清樣本67份。將這67份陽(yáng)性血清用IDEXX公司Hmi豬流 感病毒抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，均為陽(yáng)性，符合率為100%。<110>湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心<120> 一種Hmi豬流感病毒血凝素模擬抗原表位及其應(yīng)用<130> 無(wú)<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>12<212>PRT<213>Artificial<220><223>人工合成多肽<400>1Gly Leu Leu Arg Ser Leu Thr Tyr Glu Ala Val Arg
1510<210>2<211>36<212>DNA<213>M13 phage<400>2ggtcttttgc gttctttgac ttatgaggct gtgcgt369
權(quán)利要求
1.一種Hmi豬流感病毒血凝素模擬抗原表位，其特征在于，是由12個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成 的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示SEQ ID NO 1 :Gly-Leu-Leu-Arg-Ser-Leu-Thr-Tyr-Glu-Ala-Val_Arg0
2.編碼權(quán)利要求1所述的Hmi豬流感病毒血凝素模擬抗原表位的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于序列為SEQID NO :2:5’ -GGTCTT TTG CGT TCT TTG ACT TAT GAG GCT GTG CGT-3，。
4.權(quán)利要求ι所述的Hmi豬流感病毒血凝素模擬抗原表位在制備Hmi豬流感病毒診 斷試劑中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的Hmi豬流感病毒血凝素模擬抗原 表位用于制備檢測(cè)Hmi豬流感抗體的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種H1N1豬流感病毒血凝素模擬抗原表位及其應(yīng)用，屬于分子免疫學(xué)領(lǐng)域。其利用噬菌體肽庫(kù)展示技術(shù)，獲得了H1N1豬流感病毒血凝素空間構(gòu)象的模擬抗原表位，該表位是由12個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的短肽。本發(fā)明還公開了該模擬表位在H1N1豬流感病毒感染診斷試劑方面的應(yīng)用，其可以使H1N1豬流感的檢測(cè)更加快速，簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102050868SQ20101058398
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者候義宏, 唐連飛, 孟芳, 朱忠武, 歐陽(yáng)振宇, 禹思宇, 肖家勇, 胡宇東, 趙和平 申請(qǐng)人:湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心