專利名稱：：溴酚化合物在制備治療血栓性心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療心腦血管疾病的藥物，具體地說是一種海洋溴酚化合物的制備方法、藥理活性及藥學(xué)用途。該化合物作為凝血酶(T7^w^/")抑制劑，可用于治療各種血栓性缺血造成的心腦血管疾病。
背景技術(shù)：
：心腦血管疾病與糖尿病、腫瘤等是目前對人類健康威脅最大的三類疾病，其中心腦血管疾病位于這三大疾病之首，原因是其不僅具有很高的致死率，而且其發(fā)病后導(dǎo)致患者的致殘率也極高。中國是世界上心腦血管疾病發(fā)病率最高的國家，有心腦血管患者3000多萬，其中癱瘓?jiān)诖舱哌_(dá)1200萬人，每年死亡400多萬人，所以預(yù)防和治療心腦血管疾病已成為擺在我們面前的一項(xiàng)嚴(yán)重而艱巨的任務(wù)，并被世界衛(wèi)生組織列為當(dāng)前全組織范圍總體工作重點(diǎn)之一。血栓形成是心腦血管缺血性疾病的重要病理基礎(chǔ)之一，抗血栓形成是預(yù)防和治療多種血栓缺血性心腦血管疾病的重要手段。血栓的形成是復(fù)雜的生理、病理過程，其中凝血因子、抗凝因子、纖溶系統(tǒng)以及血液流變學(xué)改變等都起重要的作用。正常狀態(tài)下，血液不會自行凝固，當(dāng)血管壁受損，血流緩慢，血小板聚集性、血液凝血活性和黏度增高時(shí)就易形成血栓，進(jìn)而引起各種缺血性心腦血管疾病，因此尋找理想抗血栓形成的藥物，對于心腦血管疾病的防治具有重要意義。凝血酶Thrombin(EC3.4.21.5)是一種多功能絲氨酸蛋白水解酶，具有與胰凝乳蛋白酶相似的序列和結(jié)構(gòu)，對賴氨酸或精氨酸具有親和特異性，在心腦血管疾病的病變過程中發(fā)揮著重要的作用。凝血酶是血栓形成的關(guān)鍵因素，影響血凝過程中的級聯(lián)反應(yīng)、纖維蛋白沉積和血小板活化等；凝血酶抑制劑能阻斷凝血酶及其受體在動(dòng)脈粥樣硬化和腦水腫為基本病變的病變過程，因此，作為抗栓以及溶栓藥物中重要靶點(diǎn)的凝血酶，尋找其高效特異性的抑制劑，可為預(yù)防和治療心血管疾病提供新的途徑，以期發(fā)現(xiàn)強(qiáng)活性新結(jié)構(gòu)的抗心腦血管疾病海洋新藥。21世紀(jì)人類生存和發(fā)展的巨大壓力，迫使人們加快合理開發(fā)海洋資源的步伐，如何進(jìn)行海洋天然活性物質(zhì)的深度開發(fā)與利用，開發(fā)針對人類重大疾病的新藥，是合理利用我國生物資源的戰(zhàn)略需求。海洋是生命的起源地，海藻是海洋中最大的植物類群，是海洋生物鏈中能夠通過光合作用合成自身必要物質(zhì)的主要自養(yǎng)生物類群。在海洋獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境中，海藻屬于被吞食的弱者，為了對付海洋食草動(dòng)物的大量吞食來維護(hù)自身的生存繁衍，大多海藻能產(chǎn)生一些很有特色的活性物質(zhì)。發(fā)明人從一種海洋紅藻中得到一個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的溴酚類化合物，體外活性篩選中發(fā)現(xiàn)其具有極強(qiáng)的Thrombin酶抑制活性，抑制率高達(dá)99.8%(陽性對照Argatruban抑制率為95.3%);采用動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)活性測試，分別測定藥物的半數(shù)致死量LD5。、凝血時(shí)間、凝血酶原時(shí)間和白陶土部分凝血活酶時(shí)間；檢測了藥物對三氯化鐵(FeCl3)誘導(dǎo)血栓形成和實(shí)驗(yàn)性動(dòng)靜脈旁路血栓形成的影響，結(jié)果表明該化合物在體內(nèi)具有顯著的抗凝血功能和抗血栓形成療效，可用于治療各種血栓性心腦血管疾病，如急性冠脈綜合癥(acutecoronarysyndrome,ACS)、急性心肌梗塞(Acutemyocardialinfarction,AMI)、肺血栓栓塞癥(pulmonarythromboembolism,PTE)、深青爭脈血栓(deepvenousthrombosis,DVT)i動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種溴酚類化合物在制備治療抗血栓形成作用藥物中的應(yīng)用，所述溴酚類化合物具有凝血酶(7^w^/w)抑制活性，可用于治療各種由于血栓性缺血造成的心腦血管疾病。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為溴酚類化合物在制備治療抗血栓形成作用藥物中的應(yīng)用。所述溴酚類化合物為3-(2,3-二溴-4,5-二羥基苯)-4-溴-5，6-二羥基-1,3-二氫異苯并呋喃及其藥物學(xué)上可接受的鹽、酯或醚；抗血栓形成作用藥物可為各種血栓性缺血造成的心腦血管疾病藥物。溴酚化合物結(jié)構(gòu)如下-.3-(2，3-二溴-4，5-二羥基苯)-4-溴-5，6-二羥基-1,3-二氫異苯并呋喃3—(2，3-dibromo畫4，5國dihydroxy-phenyl)-4-bromo-5，6-dihydroxy-l，3-dihydroiso-benzofuran本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)、生物資源豐富我國是海洋大國，擁有豐富的海洋生物資源，褐藻小粘膜藻分布尤其廣泛，其中富含溴酚類化合物。(2)、療效顯著作為極具海洋特色的多鹵代化合物，溴酚類藥物是一種新型、高效的凝血酶抑制劑，在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)出顯著的抗血栓形成作用，具有很好的抗心腦血管疾病療效。(3)、副作用小溴酚類藥物來源于海洋褐藻，屬純天然生物制品，相比化學(xué)合成類藥物，具有高效低毒的優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施方式(一)、溴酚化合物的提取、分離及結(jié)構(gòu)鑒定風(fēng)干的小粘膜藻樣品粉碎后用95%乙醇提取，提取液減壓濃縮;濃縮物用蒸餾水懸浮后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮。乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮梯度洗脫，直至二者體積比為l:1,改用氯仿-甲醇梯度洗脫，最后用95%乙醇洗脫，薄層色譜檢査，合并成分相似的洗脫液，減壓濃縮得24個(gè)部分"L24。L『L,5[石油醚丙酮=5:1]洗脫部分經(jīng)過SephadexLH-20色譜、硅膠色譜和反相HPLC等分離純化技術(shù)得到純化合物，經(jīng)波譜分析，此化合物為3-(2，3-二溴-4,5-二羥基苯)-4-溴-5,6-二羥基-1,3-二氫異苯并呋喃(中文)；3-(2,3-dibromo-4，5-dihydroxy-phenyl)-4-bromo-5,6-dihydroxy-1,3-dihydroiso-benzofUran(英文)。上述化合物具有以下理化特性紅色粉末(Me2CO),d4H9Br30s，Mp:132134°C，[a]^+6。(MeOH，c0.16);HREIMSw/z493.7971(ca/o/.forC14H979Br305,493.8000);EIMSw/z500/498/496/494[M]+(8/36/35/10%)，297/295/293(35/77/40)，231/229(100/98);IRv=cm":3415，3386,2866,1595,1464,1408，1358,1308,1277，1163，1024,858,812;^-NMRXMe^CX,500MHz)&6.88(1H,s,H-6')，6.45(1H,s，H-7),6.31(1H,s，H-6),5.03(1H,d,J=12.0Hz，H-7'a),4.94(1H,d，《/=12.0Hz,H-7T);13C-NMR(Me2CO-4，125MHz)山147.0(s,C誦5')，145.4(s,C畫5)，145.3(s，C-4)，143.5(s,C-4')，133.5(s,C-l'),133.2(s,C畫l),132.8(s,C畫2'),117.5(s,C-2),115.2(d，C-6),113.8(s,C-3),107.5(d,C-6'),105.0(s，C-3'),87.9(d,C-7),73.5(t,C國7')。溴酚化合物衍生物的合成[鈉鹽制備](1)藥品3-(2,3-二溴-4，5-二羥基苯)-4-溴-5,6-二羥基-1，3-二氫異苯并呋喃、乙醇、40。/。的NaOH溶液；(2)儀器燒杯、pH酸度計(jì)、恒溫槽；(3)制備方法稱取200mg樣品溶解在50mL乙醇中，然后加侖濃度為40%的NaOH溶液200mL.用7(TC水浴保溫8h,減壓濃縮，采用正相硅膠色譜(氯仿丙酮=3:l為洗脫劑)進(jìn)行分離、純化，得紅色結(jié)晶compound2(25mg)，產(chǎn)率為10.6%，HREIMSw/z581.7297(ca/a/.forC14H579Br3Na305,581.7278)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>[酯化反應(yīng)](1)藥品3-(2,3-二溴-4，5-二羥基苯)-4-溴-5,6-二羥基-1，3-二氫異苯并呋喃、乙酸酐、濃硫酸；(2)儀器燒杯、三口燒瓶、磁力攪拌加熱器；(3)制備方法在200mL的圓底燒瓶中，依次加入3-(2,3-二溴-4,5-二羥基苯)-4-溴-5,6-二羥基-1,3-二氫異苯并呋喃20011^，乙酸酐(120mL)，加熱回流4h.反應(yīng)變?yōu)槌吻?，繼續(xù)反應(yīng)2h，冷卻后，加大量水使過量的乙酸酐完全水解成乙酸，再用氯仿萃取，分出有機(jī)層，無水硫酸鎂干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，采用正相硅膠色譜(氯仿丙酮=3:l為洗脫劑)進(jìn)行分離、純化，得油狀物compound3(36mg)，產(chǎn)率為13.4%，HREIMSw/z661.8487(ca/cdforC22H1779Br309，661.8423)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>[醚化反應(yīng)](1)藥品3-(2,3-二溴-4,5-二羥基苯)-4-溴-5，6-二羥基-1,3-二氫異苯并呋喃、硫酸二甲酯、氫氧化鉀、丙酮、碳酸氫鈉、蒸餾水、乙酸乙酯；(2)儀器燒杯、三口燒瓶、磁力攪拌加熱器；(3)制備方法取200mg3-(2，3-二溴-4,5-二羥基苯)-4-溴-5,6-二羥基-1，3-二氫異苯并呋喃于100mL三口燒瓶中，加入50mL丙酮攪拌使其溶解，再加入一定量的KOH，劇烈攪拌，硫酸二甲酯逐滴加入，20min內(nèi)滴完，反應(yīng)完畢后把丙酮減壓蒸出，回收。剩余物加溫?zé)?%NaHC03，蒸餾水各10mL洗滌，得粗產(chǎn)品，乙酸乙酯中重結(jié)晶得淡紅色晶體compound4(8。6mg)，產(chǎn)率為3.7%，HREIMSm/z549.8632(ca/cdforC18H1779Br305，549.8626)。(二)、人源凝血酶Thrombin活性抑制活性測試Thrombin是一種多功能絲氨酸蛋白水解酶，作為抗栓及溶栓藥物的重要靶點(diǎn)，尋找其高效選擇性的抑制劑，可為預(yù)治心腦血管疾病提供新的途徑。將待測藥物樣品加入到內(nèi)含凍干人凝血酶國家標(biāo)準(zhǔn)品的酶反應(yīng)體系中進(jìn)行孵育；加入特異性的底物Ac-FVR-AMC，室溫下Envision多標(biāo)記微孔板檢測儀動(dòng)態(tài)檢測RFU(relativefluorescenceunit,相對熒光強(qiáng)度)的變化，計(jì)算藥物對Thrombin的抑制率和IC5Q，Argatroban作為陽性為對照。(三)、藥物急性毒性觀察實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，測定溴酚化合物對昆明小鼠死亡率0%-100%的劑量窗；設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行半數(shù)致死量LDso的測定，連續(xù)觀察14天，記錄中毒癥狀、外觀特征及死亡情況。(四)、溴酚化合物抗凝血活性測試1、小鼠凝血時(shí)間的測定玻片法昆明小鼠，隨機(jī)分組，給藥;于末次給藥后lh進(jìn)行凝血時(shí)間測定。末次給藥1h后毛細(xì)管眼眶取血，滴于載玻片，血滴直徑約5mm，立即用秒表記時(shí)；用清潔的4號注射針頭自血滴邊緣向里輕輕撥動(dòng)，觀察有無血絲挑起；從采血開始至挑起血絲止即為凝血時(shí)間。2、大鼠凝血酶原時(shí)間測定試管法Wistar大鼠，抽取心血，枸櫞酸鈉抗凝；離心分離血漿，用于凝血酶原時(shí)間測定和白陶土部分凝血活酶時(shí)間測定。兔腦粉0.3g，加入生理鹽水和草酸鈉溶液中，45'C保溫一定時(shí)間，即凝血活酶；配制不同濃度的化合物溶液，分別加入凝血活酶、CaCl2溶液以及大鼠血漿，混勻，開始i卜時(shí)。每隔2秒傾斜試管1次，直至液面不動(dòng)，此記錄時(shí)間即為凝血酶原時(shí)間。3、白陶土部分凝血活酶時(shí)間的測定試管法部分凝血活酶用巴比妥緩沖液按比例稀釋，加入等量白陶土懸液混合，即白陶土部分凝血活酶。配制不同濃度的化合物溶液，分別加入大鼠血漿和白陶土部分凝血活酶試液，37。C水浴3min，然后加入預(yù)熱的CaCl2溶液，立即計(jì)時(shí)，直至白陶土顆粒聚集變粗，凝固成塊為止，此記錄時(shí)間即為大鼠白陶土部分凝血活酶時(shí)間。(五)、溴酚化合物對三氯化鐵(FeCb)誘導(dǎo)血栓形成的影響wistar大鼠，隨機(jī)分組，給藥后10min造模；大鼠麻醉后，暴露右側(cè)位于嗅束及大腦下靜脈之間的一段MCA，置一小片塑料薄膜保護(hù)血管周圍腦組織，將吸有FeCl3液的小片定量濾紙片貼在該段MCA上，持續(xù)30min后去掉濾紙片，生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回籠飼養(yǎng)；參照ZeaLonga評定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度的行為學(xué)評價(jià)。(六)、溴酚化合物對實(shí)驗(yàn)性大鼠動(dòng)靜脈旁路血栓形成的影響wistar大鼠，隨機(jī)分組，給藥；末次給藥后lh進(jìn)行動(dòng)靜脈旁路血栓形成實(shí)驗(yàn)，用烏拉坦麻醉動(dòng)物，分離右頸總動(dòng)脈動(dòng)脈和左頸外靜脈，在三段聚乙烯管的中段放入一根長5cm的4號手術(shù)絲線，將肝素生理鹽水溶液充滿聚乙烯管管腔，將管兩端分別插入右頸總動(dòng)脈和左頸外靜脈以形成瘺管，立即放開動(dòng)脈夾，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)15min，中斷血流，迅速取出絲線稱重，總重量減去絲線即血栓濕重按下列公式計(jì)算血栓形成抑制率。抑制率(％)=(對照組血栓重-給藥組血栓重)/對照組血栓重xlOO%，施例l溴酚化合物的提取、分離及結(jié)構(gòu)鑒定采集并風(fēng)干褐藻小粘膜藻丄eaAas/a"朋a樣品8.25kg(干重)，用95%乙醇提取三次，每次72小時(shí)；提取液40。C下減壓濃縮的乙醇提取物710g，濃縮物用蒸餾水懸浮后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮，得乙酸乙酯相浸膏125g，正丁醇相浸膏70g。乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮梯度洗脫，直至二者體積比為l:1，改用氯仿-甲醇梯度洗脫，最后用95%乙醇洗脫，薄層色譜檢査，合并成分相似的洗脫液，減壓濃縮得24個(gè)部分LiL24。L!-Lis[石油醚丙酮=5:l]洗脫部分經(jīng)過SephadexLH-20色譜、硅膠色譜和反相HPLC等分離純化技術(shù)得到純化合物18mg，經(jīng)波譜分析，此化合物為3-(2,3-二溴-4,5-二羥基苯)-4-溴-5,6-二羥基-l,3-二氫異苯并呋喃。實(shí)施例2人源凝血酶Thrombin活性抑，j活性測試在酶標(biāo)板小孔中加入5)ig/mL待測藥物緩沖液50pL和2.7|ig/mL標(biāo)準(zhǔn)人凝血酶液10pL，混勻后孵育15min;加入4mmol/L特異性的底物Ac-FVR-AMC10jiL,充分混勻，室溫下Envision多標(biāo)記微孔板檢測儀動(dòng)態(tài)檢測RFU(relativefluorescenceunit,相對熒光強(qiáng)度)的變化；此即抑制凝血酶RFU。將緩沖液取代待測藥物緩沖液，其余步驟同上，即抑制凝血酶RFU。為抑制凝血酶和抑制凝血酶RFU的測定可以在同一塊酶標(biāo)板上進(jìn)行，計(jì)算藥物對Thrombin的抑制率和IC5Q(Argatroban作為陽性為對照)。表1人<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>[實(shí)驗(yàn)結(jié)論]:化合物對人源凝血酶Thrombin有顯著的抑制作用，其抑制率高于陽性對照藥物Argatruban,可用于血栓性心腦血管疾病的防治。實(shí)施例3藥物急性毒性觀察實(shí)驗(yàn)50只昆明小鼠，體重1822g，隨機(jī)分成5組，雌雄各半，分籠；適應(yīng)性飼養(yǎng)3d;第四天給藥前禁食16h，飲水不限，依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(藥物對小鼠死亡率0。/。100。/。的劑量窗為150mg/kg400mg/kg)確立劑量為164.8mg/kg、191.4mg/kg、222.3mg/kg、258.2mg/kg、300mg/kg灌胃ig，觀察14d，記錄出現(xiàn)癥狀及死亡情況。表2溴酚化合物對小鼠灌胃的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table2Theacutetoxicityofbromophenolinmice<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]:計(jì)算得藥物對小鼠灌胃的半數(shù)致死量LD5^213.55mg/kg，95%可信限=195.88~232.81mg/kg。實(shí)施例4溴酚化合物抗凝血活性測試(1)、動(dòng)物分組及處理昆明雄性小鼠20只，體重1822g，隨機(jī)分為4組空白對照組、低、中、高劑量組。藥物采用少量乙醇溶解，用生理鹽水稀釋至不同濃度。劑量組小鼠分別灌胃不同劑量的藥物溶液0.5mL/只(劑量分別為5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)，對照組小鼠則灌胃同體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)10d，于末次給藥后lh進(jìn)行凝血時(shí)間測定。Wistar大鼠10只，體重300350g，抽取心血，加入3.8%枸櫞酸鈉1:9抗凝；離心10min，分離血漿，用于凝血酶原時(shí)間測定和白陶土部分凝血活酶時(shí)間的測定。(2)、小鼠凝血時(shí)間的測定玻片法末次給藥lh后毛細(xì)管眼眶取血，滴于載玻片，血滴直徑約5mm，立即用秒表記時(shí)；用清潔的4號注射針頭自血滴邊緣向里輕輕撥動(dòng)，觀察有無血絲挑起；從采血開始至挑起血絲止即為凝血時(shí)間。表2藥物對小鼠凝血時(shí)間的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表中*表示與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.05):溴酚化合物能夠明顯延長小鼠凝血時(shí)間，呈現(xiàn)劑量依賴性，且與空白劑量組比較，中、高劑量組呈現(xiàn)顯著性差異。(3)、大鼠凝血酶原時(shí)間測定試管法稱取兔腦粉0.3g，加入生理鹽水4.9mL和0.1mol/L的草酸鈉溶液O.lmL，45。C水浴，每5min搖動(dòng)l次，15min后即得凝血活酶。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組(生理鹽水)、低、中、高劑量組(劑量分別為5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg的溴酚化合物)；將上述各組溶液0.2mL加入到不同試管中，37'C水浴，然后分別依次加入0.1mL凝血活酶、0.1mL的CaCl2溶液(0.025mol/mL)和0.1mL大鼠血漿，混勻，立刻開始計(jì)時(shí);每隔2s傾斜試管l次，直至液面不動(dòng)，此記錄時(shí)間即為凝血酶原時(shí)間，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。(4)、白陶土部分凝血活酶時(shí)間的測定試管法部分凝血活酶用巴比妥緩沖液按l:50的比例稀釋，加入等量的4%白陶土懸液混合，即白陶土部分凝血活酶。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組(生理鹽水)、低、中、高劑量組(劑量分別為5mg/kg,10mg/kg，20mg/kg的溴酚化合物)；將上述各組溶液0.2mL加入到不同試管中，依次加入0.1mL大鼠血漿和0.1mL白陶土部分凝血活酶試液，于37"C水浴3min，然后加入37"C預(yù)熱的0.1mL的CaCl2溶液(0.025mol/mL)，立即開始計(jì)時(shí)，直至白陶土顆粒聚集變粗，凝固成塊為止，此記錄時(shí)間即為大鼠白陶土部分凝血活酶時(shí)間。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。表3藥物對大鼠凝血酶原時(shí)間和白陶土部分凝血活酶時(shí)間的影響Table3TheeffectsofthebromophenolontheprothrombintimeandKPTTinratsp±s，n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表中*表示與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.05)[實(shí)驗(yàn)結(jié)論]:藥物能夠顯著抑制內(nèi)源性途徑和外源性途徑的凝血酶(Thrombin)的產(chǎn)生，且對其外源性途徑的抑制作用大于內(nèi)源性途徑，其抑制機(jī)理主要是抑制凝血酶的活性，而不是抑制凝血酶的產(chǎn)生過程。實(shí)施例5溴酚化合物對三氯化鐵(FeCb)誘導(dǎo)血栓形成的影響(1)、動(dòng)物分組及處理Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為6組，模型組(ig生理鹽水，以FeCl3造模)、假手術(shù)組(ig生理鹽水，不用FeCh，其余操作同其它組)、高、中、低劑量給藥組(分別ig溴酚藥物5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，F(xiàn)eCl3造模)和陽性藥對照組(iv肝素500U/kg，F(xiàn)eCl3造模)。(2)、MCA血栓形成模型制備血管內(nèi)膜被FeCl3損傷后，暴露出內(nèi)皮下膠原纖維，誘發(fā)血小板的黏附、聚集，形成血栓，其主要成分是血小板、紅細(xì)胞及纖維蛋白等。各組均于給藥或生理鹽水后10min造模。用烏拉坦(1.2g/kg,ip)麻醉大鼠，按Tamura法暴露右側(cè)位于嗅束及大腦下靜脈之間的一段MCA，置一小片塑料薄膜保護(hù)血管周圍腦組織，將吸有50。/。FeCl3溶液5^iL的小濾紙片貼于該段MCA，30min后去掉濾紙片，生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回籠詞養(yǎng)。(3)、造模后24h行為學(xué)評分參照ZeaLonga評定進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度的評價(jià)0級，無缺陷；l級，不能伸展對側(cè)前肢；2級，對側(cè)前肢屈曲；3級，輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4級，嚴(yán)重的轉(zhuǎn)圈；5級，對側(cè)癱瘓。表4MCA血栓形成后24h行為學(xué)評分Table4Scoreofbehavioralscienceat24hafterMCA(X±s，n=10)組別齊(j量行為學(xué)評分假手術(shù)組-0模型組-4.6±1.21藥物低劑量組5mg/kg3.8±1.02藥物中劑量組10mg/kg2.6±1.01藥物高劑量組20mg/kg1.5±0.98*陽性對照組500U/kg1.2±0.89*表中*表示與模型組比較有顯著性差異(PO.05):模型組術(shù)后出現(xiàn)不同程度的對側(cè)前肢內(nèi)收、肩內(nèi)旋、肌張力降低，推右肩向?qū)?cè)移動(dòng)，抵抗阻力降低，甚至出現(xiàn)不停向一側(cè)轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象；藥物各劑量組癥狀均有減輕，高劑量組與模型組相比有顯著性差異，且溴酚藥物對行為學(xué)的改善具有明顯的量效關(guān)系；陽性對照組行為學(xué)評分與模型組相比具有顯著性差異；假手術(shù)組未見行為學(xué)改變。實(shí)施例6溴酚化合物對實(shí)驗(yàn)性大鼠動(dòng)靜脈旁路血栓形成的影響(1)、動(dòng)物分組及處理Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為4組，空白對照組(ig生理鹽水)、高、中、低劑量給藥組(分別ig溴酚藥物5mg/kg,、10mg/kg，、20mg/kg);每曰1次，連續(xù)10d，末次給藥后lh動(dòng)靜脈旁路血栓形成實(shí)驗(yàn)，觀察血栓重量及血栓形成抑制率。(2)、動(dòng)靜脈旁路血栓形成實(shí)驗(yàn)用烏拉坦麻醉動(dòng)物(1.2g/kg,ip)，將大鼠背位固定于37'C恒溫解剖臺，分離右頸總動(dòng)脈動(dòng)脈和左頸外靜脈，在三段聚乙烯管的中段放入一根長5cm的4號手術(shù)絲線，將肝素生理鹽水溶液(50U/mL)充滿聚乙烯管管腔，將管兩端分別插入右頸總動(dòng)脈和左頸外靜脈以形成瘺管，立即放開動(dòng)脈夾，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)15min，中斷血流，迅速取出絲線稱重，總重量減去絲線即血栓濕重按下列公式計(jì)算血栓形成抑制率。抑制率(％)=(空白對照組血栓重-給藥組血栓重)/空白對照組血栓重表5藥物對動(dòng)-靜脈旁路血栓重量的影響Table5Theeffectsofbromophenolonweightsofartery-venousthrombosisinrats(x±"n=10)組別劑量(mg/kg)血栓重量(mg)，魂空白對照組-28.5±3.2-藥物低劑量組525.2±3.711.6藥物低劑量組1022.8±3.820.0藥物低劑量組2019.8±3.4*30.5表中*表示與模型組比較有顯著性差異(P<0.05):藥物能夠明顯抑制動(dòng)-靜脈旁路血栓形成，且呈劑量依賴性。其中高劑量組血栓濕重同空白對照組比較呈顯著性差異。權(quán)利要求1.溴酚化合物在制備治療血栓性心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。2.溴酚化合物在制備治療血栓性心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述溴酚化合物為3-(2,3-二溴-4,5-二羥基苯)-4-溴-5,6-二羥基-l,3-二氫異苯并呋喃及其藥物學(xué)上可接受的鹽、酯或醚。全文摘要本發(fā)明涉及治療心腦血管疾病的藥物，具體地說是溴酚類化合物在制備治療抗血栓形成作用藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明溴酚類化合物具有凝血酶(Thrombin)抑制活性，可用于治療各種由于血栓性缺血造成的心腦血管疾病。文檔編號C07D307/00GK101283997SQ20071001432公開日2008年10月15日申請日期2007年4月13日優(yōu)先權(quán)日2007年4月13日發(fā)明者史大永,曉范,袁兆慧,鳳許,韓麗君申請人:中國科學(xué)院海洋研究所