專利名稱：含有磷酸酯模擬物的多聚核苷酸的制作方法

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及核酸化學(xué)領(lǐng)域的新物質(zhì)及其制備過(guò)程。這些物質(zhì)是所謂的磷酸酯模擬物，其中羥基被相應(yīng)的模擬物所取代。
具體而言本發(fā)明涉及新類型的修飾寡聚核苷酸及其制備方法。

背景技術(shù)：
之前已描述了各種方法以制備帶有修飾磷酸殘基的核苷酸或寡聚核苷酸。
通常利用亞磷酰胺化學(xué)在固相上制備合成(脫氧)寡聚核苷酸。具有規(guī)定尺寸的有孔玻璃珠通常用作所述固相(以下縮寫(xiě)為CPG＝可控孔度玻璃)。第一單體通過(guò)可切割基團(tuán)與所述載體相連，從而在所述固相合成完成后切割下游離的寡聚核苷酸。此外，所述第一單體含有被保護(hù)的羥基，在此情況下通常采用二甲氧基三苯甲基(DMT)作為所述保護(hù)基團(tuán)。所述保護(hù)基團(tuán)可以通過(guò)酸處理除去。然后，在循環(huán)過(guò)程中，在5′端，也帶有DMT保護(hù)基團(tuán)的(脫氧)核糖核苷的3′亞磷酰胺衍生物繼續(xù)與每次情況下都不含有DMT保護(hù)基團(tuán)的反應(yīng)性基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)。作為另外一種選擇，3′二甲氧基三苯甲基保護(hù)的5′亞磷酰胺用于反向寡聚核苷酸合成。特別地，還可以采用H-膦酸酯策略以在所述磷酸骨架上引入修飾，例如來(lái)制備放射性標(biāo)記的硫代磷酸酯。也已經(jīng)公知用于制備經(jīng)修飾的或者經(jīng)標(biāo)記的寡聚核苷酸的多種策略根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)采用三官能載體材料制備在3′端進(jìn)行標(biāo)記的寡聚核苷酸(US 5,290,925，US 5,401,837)。其中所述標(biāo)記基團(tuán)通過(guò)C3～12連接子被連接到亞磷酰胺上的經(jīng)標(biāo)記的亞磷酰胺通常用于制備在5′端進(jìn)行標(biāo)記的寡聚核苷酸(US 4,997,928，US5,231,191)。此外，也可以在個(gè)別堿基上(US 5,241,060，US 5,260,433，US 5,668,266)或者通過(guò)引入內(nèi)部非核苷連接子(US 5,656,744，US6,130,323)對(duì)寡聚核苷酸進(jìn)行修飾。
作為另外一種選擇，可以通過(guò)硫代磷酸酯的合成后標(biāo)記(Hodges，R.R.，等Biochemistry 28(1989)261-7)或者通過(guò)對(duì)官能化亞磷酰胺進(jìn)行后標(biāo)記(Agrawal，S.，Methods in Mol.Biology 26(1993)，Protocols forOligonucleotide Conjugates，Humana Press，Totowa，NJ，Chapter 3)對(duì)核苷間磷酸酯進(jìn)行標(biāo)記。然而，由于所述亞磷酰胺和磷酸硫酯的不穩(wěn)定性，這些方法尚未被接受。
從現(xiàn)有技術(shù)還已知可以在寡聚核苷酸的核苷間磷酸殘基上引入修飾。在最主要的情況下為硫代磷酸酯(Burgers，P.M.，和Eckstein，F(xiàn).，Biochemistry 18，(1979)592-6)，甲基膦酸酯(Miller，P.S.，等，Biochemistry 18(1979)5134-43)或硼烷磷酸酯(WO 91/08213)。為制備甲基膦酸酯寡聚核苷酸需要合成特別的單體。與之相比，可以用傳統(tǒng)亞磷酰胺或H-膦酸酯來(lái)合成硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯，在此情況下可以在寡聚核苷酸合成之中或者之后通過(guò)使用與三價(jià)H-膦酸酯或與膦酸三酯進(jìn)行反應(yīng)的特殊試劑直接將所述硼烷或硫修飾引入。盡管所有這些方法都形成經(jīng)修飾的寡聚核苷酸，但為此所需要的合成化學(xué)并不允許在寡聚核苷酸合成時(shí)在所述寡聚核苷酸鏈的磷酸骨架上直接引入能以此方式被檢測(cè)到的標(biāo)記或官能團(tuán)。
Baschang，G.，和Kvita，V.，Angewandte Chemie 85(1)(1973)43-44描述了核苷酸磷酸三酯與疊氮化物諸如甲基磺?；B氮化物進(jìn)行反應(yīng)制備三烷基(芳基)酰亞胺磷酸酯，然而其卻是不穩(wěn)定的和易分解的。
Nielsen，J.，和Caruthers，M.H.，J.Am.Chem.Soc.110(1988)6275-6276描述了在烷基疊氮化物存在下帶有2-氰基-1，1-二甲基乙基保護(hù)基的脫氧核苷亞磷酸酯的反應(yīng)。此外，作者建議該原理適用于制備在磷酸殘基上進(jìn)行修飾的核苷酸而無(wú)需說(shuō)明利用所公開(kāi)的具有特別優(yōu)勢(shì)的方法制備了何種類型的修飾。特別地，作者建議了烷基殘基的引入。
WO 89/091221公開(kāi)了N-烷基亞磷酰胺或其他在至少一個(gè)磷酸殘基上用N-烷基取代的寡聚核苷酸，它們是在合適的烷基胺的存在下通過(guò)用碘氧化核苷亞磷酸酯(帶有保護(hù)基團(tuán))而制備的。
WO 03/02587公開(kāi)了經(jīng)修飾的寡聚核苷酸的制備，其中通過(guò)胺化將H-磷酸酯轉(zhuǎn)變?yōu)榘被姿狨ァ?br> 因此，所有這些公開(kāi)描述了含有氨基磷酸酯替代磷酸殘基的分子的制備。然而，由于胺基在酸性環(huán)境中質(zhì)子化并隨之被水取代，因此含有氨基磷酸酯的分子易水解。
此外，WO 01/14401提出了核苷酸結(jié)構(gòu)單元或寡聚核苷酸，其中磷酸殘基被N-ClO3、N-NO2或N-SO2R取代。根據(jù)WO 01/14401的教導(dǎo)，這些物質(zhì)可以通過(guò)將脫氧核苷的游離羥基與氨基膦酰氯在嘧啶的存在下進(jìn)行反應(yīng)而制備。然而，該類型的制備復(fù)雜，耗時(shí)并且不適用于核苷酸或寡聚核苷酸的例行合成。
因此，形成本發(fā)明的基礎(chǔ)的技術(shù)性目的是制備經(jīng)改進(jìn)的標(biāo)記寡聚核苷酸和提供其制備的簡(jiǎn)單方法。


發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明涉及化合物，其優(yōu)選為至少含有一次以下結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸
其中A表示核苷酸或核苷酸鏈的5′端，或者其表示與固相相連的連接子，以及 B表示核苷酸或核苷酸鏈的3′端或者其表示連接子 D是OH或CH3，以及 Acc是電子受體或以殘基R取代的電子受體且R是任何有機(jī)取代基。
所述電子受體Acc優(yōu)選地選自包括以下的組 - -CN， - -SO2-R′，其中R′含有至少一個(gè)氨基取代的烷基，任選地取代的芳基或任選地取代的雜環(huán)， - 和缺電子六元N+-雜環(huán)，其中至少一個(gè)氮原子被烷基化并位于鄰位或?qū)ξ?，并且其中這些雜環(huán)可以任選地以R取代。
特別優(yōu)選的寡聚核苷酸，其中的R或R′單獨(dú)或者與所述電子受體一起含有可檢測(cè)單元或官能團(tuán)。
這些寡聚核苷酸是根據(jù)本發(fā)明的方法制備的，該方法的特征在于具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的三價(jià)磷衍生物
其中E表示或者甲基或者受保護(hù)的羥基， 其中A表示核苷酸或核苷酸鏈的5′端或者表示與固相相連的連接子和 其中B表示核苷酸或核苷酸鏈的3′端或表示連接子， 與具有以下結(jié)構(gòu)的疊氮化物反應(yīng)， N＝N＝N-Acc 其中Acc是電子受體或以殘基R取代的電子受體且R是任何有機(jī)取代基。
所述電子受體Acc優(yōu)選地選自包括以下基團(tuán)的組 - -CN，-SO2-R - 和缺電子六元N+-雜環(huán)，其中至少一個(gè)氮原子被烷基化并位于鄰位或?qū)ξ?，并且其中這些雜環(huán)可以任選地以R取代。
在制備本發(fā)明的寡聚核苷酸的具體實(shí)施方式
中 a)3′亞磷酰胺首先與新生成的寡聚核苷酸鏈的5′OH端進(jìn)行反應(yīng)并隨后 b)與具有以下結(jié)構(gòu)的疊氮化物反應(yīng) N＝N＝N-Acc 其中Acc是電子受體或以殘基R取代的電子受體且R是任何有機(jī)取代基。
其中R含有可檢測(cè)單元或官能團(tuán)的方法是特別優(yōu)選的。
以此方式制備的本發(fā)明的寡聚核苷酸可用于其中需要任何形式的雜交對(duì)象尤其是衍生化的或者標(biāo)記的雜交對(duì)象的所有應(yīng)用。
特別地，這些寡聚核苷酸可用作檢測(cè)某些標(biāo)靶序列的雜交探針。
另一潛在用途涉及使用根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行修飾的寡聚核苷酸以反義寡聚核苷酸或siRNA的形式阻止基因表達(dá)。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明的基本思路 本發(fā)明的目的是以簡(jiǎn)單的方式制備其中含有經(jīng)修飾的磷酸殘基以及因此也優(yōu)選含有可檢測(cè)標(biāo)記的核苷酸和寡聚核苷酸。
本發(fā)明的中心思路與如下相關(guān)，即由三價(jià)磷原子開(kāi)始并使其與試劑按照形成穩(wěn)定磷酸酯模擬物的方式進(jìn)行反應(yīng)。為此目的，根據(jù)本發(fā)明，含有至少一個(gè)帶有保護(hù)基團(tuán)的羥基的磷原子與具有結(jié)構(gòu)N＝N＝N-Acc的疊氮化物反應(yīng)，其中Acc是電子受體或以殘基R取代的電子受體且R是任何有機(jī)取代基。這導(dǎo)致形成了五價(jià)磷原子，其中強(qiáng)吸電子性電子受體基團(tuán)通過(guò)N原子與之共價(jià)鍵聯(lián)。相對(duì)比于現(xiàn)有技術(shù)已知的氨基磷酸酯化合物，該基團(tuán)確保了以此方式制備的化合物是共振穩(wěn)定的并且不易被水解。
該本發(fā)明的根本思路可應(yīng)用于其中形成三價(jià)磷作為中間體的所有方法。
在采用亞磷酰胺的傳統(tǒng)的寡聚核苷酸合成中，含有三價(jià)磷原子的膦酸三酯形成為中間產(chǎn)物。第一和第二酯鍵表示核苷之間的鍵。所述磷原子通過(guò)第三酯鍵連接到受保護(hù)的羥基諸如例如β-氰基乙氧基。替代用碘進(jìn)行氧化，根據(jù)本發(fā)明所述新生成的寡聚核苷酸隨后能與適合的疊氮化物在以下過(guò)程中進(jìn)行反應(yīng)通過(guò)在切割氮的同時(shí)將-N-Acc共價(jià)鍵聯(lián)至磷原子從而將所述三價(jià)磷原子氧化為五價(jià)原子。
寡聚核苷酸合成可繼續(xù)按照現(xiàn)有技術(shù)已知的進(jìn)行。獲得穩(wěn)定的寡聚核苷酸鏈作為最終產(chǎn)物，其在一個(gè)或多個(gè)核苷酸間磷酸殘基上以幾乎任意方式進(jìn)行了修飾。
定義 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，一些所使用的術(shù)語(yǔ)定義如下 反應(yīng)性基團(tuán)指能在合適的條件下與其他分子反應(yīng)并同時(shí)形成共價(jià)鍵的分子基團(tuán)。反應(yīng)性基團(tuán)的例子有羥基、氨基、巰基、肼基、羥氨基、二烯基、炔基和羧酸基團(tuán)。
保護(hù)基團(tuán)是指能與一個(gè)分子的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)使得，作為多步合成反應(yīng)的部分，僅有一個(gè)特定的非保護(hù)的反應(yīng)性基團(tuán)能與所需的反應(yīng)對(duì)象進(jìn)行反應(yīng)的分子。經(jīng)常用于保護(hù)羥基的保護(hù)基團(tuán)的例子是β-氰基乙基、三烷基硅基和烯丙基。用于保護(hù)氨基的保護(hù)基團(tuán)有三氟乙?；蛙碳籽豸驶?Fmoc)。其他可能的保護(hù)基團(tuán)總結(jié)在標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)中(Greene，T.W.，Protective groups in organic synthesis.Wiley IntersciencePublications John Wiley&Sons(1981)New York，Chichester，Brisbane，Toronto；Souveaux，E.，Methods in Mol.Biology，Vol.26，Protocols forOligonucleotide Conjugates，Humana Press，Totowa，NJ，1994，Chapter 1，ed.S.Agrawal)。
連接子是指長(zhǎng)度為1～30個(gè)碳原子的碳鏈。這樣的連接子鏈中也可以附加地含有一個(gè)或多個(gè)氮、氧、硫和/或磷原子。連接子也可以是支化的例如也可以是枝狀的。連接子將核苷酸或核苷酸鏈與任選地被保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的可檢測(cè)單元或反應(yīng)性基團(tuán)連接起來(lái)。
可檢測(cè)單元可理解為是指利用分析方法所能檢測(cè)到的物質(zhì)。例如它們可以是能被質(zhì)譜、免疫學(xué)或利用NMR檢測(cè)到的單元。特別地，可檢測(cè)單元也可以是能被光學(xué)方法諸如熒光和UV/VIS光譜檢測(cè)到的物質(zhì)，諸如熒光素、若丹明和金顆粒。它們也包括嵌入劑和小溝結(jié)合物(minorgroove binder)，其也對(duì)融化行為產(chǎn)生影響并且其熒光由于雜交而發(fā)生變化。
亞磷酰胺是指含有三價(jià)磷原子的分子，其能夠與核苷或核苷衍生物的5′端進(jìn)行偶聯(lián)。因此亞磷酰胺可用在寡聚核苷酸合成中。除用于鏈延長(zhǎng)的(脫氧)核苷酸亞磷酰胺之外，也有帶有標(biāo)記的亞磷酰胺衍生物以類似的方法在寡聚核苷酸合成中或者結(jié)束時(shí)用以標(biāo)記所述寡聚核苷酸(Beaucage，S.L.，Methods in Molecular Biology 20(1993)33-61，ed.S.Agrawal；Wojczewski，C.，等，Synlett 10(1999)1667-1678)。
與本發(fā)明相關(guān)，術(shù)語(yǔ)“寡聚核苷酸”不僅僅包括(脫氧)寡聚核糖核苷酸也包括含有一個(gè)或多個(gè)核苷酸類似物的寡聚核苷酸，所述核苷酸衍生物具有在磷酸骨架(諸如例如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯)、糖(諸如2′-O-烷基衍生物、3′和/或5′氨基核糖、LNA、HNA、TCA)上的修飾或者具有經(jīng)修飾的堿基諸如7-氮雜嘌呤(7-deazapurine)。就此而言，本發(fā)明也包括含有非核苷類似物的共軛體和嵌合體諸如PNA或其他生物聚合物例如肽。此外，本發(fā)明的寡聚核苷酸還可以含有一個(gè)或多個(gè)非核苷單元，例如位于每個(gè)位置的間隔子例如六乙二醇或Cn(n＝3.6)間隔子。
術(shù)語(yǔ)“電子受體”包括傾向于結(jié)合孤電子對(duì)的原子結(jié)構(gòu)。其一種測(cè)量為Hammett常數(shù)。本發(fā)明涉及其中Hammett常數(shù)σp超過(guò)特定值0.30，優(yōu)選為0.45并特別優(yōu)選為0.60的具體實(shí)施方式
。
此外所述電子受體必須相容于寡聚核苷酸合成中的所有化學(xué)反應(yīng)，即 -其應(yīng)當(dāng)不被碘氧化 -其必須對(duì)二氯乙酸和三氯乙酸為惰性和 -其必須對(duì)堿尤其是氨為惰性和 -其應(yīng)當(dāng)不與三價(jià)氨基磷酸酯反應(yīng)。
滿足這些條件的電子受體的例子是 -NO2、SO2-R、-CN、-CO-R、pyrinidinyl、吡啶基、噠嗪基、六氟苯基、苯并三唑基(Hansch，C.，等，Chem.Reviews 91(1991)165-195)。此外，這些受體也可以以烯基方式或者苯基方式與所述氮原子相連。
術(shù)語(yǔ)“取代”指被稱之為被取代的結(jié)構(gòu)含有位于任意位置的其他殘基，該位置并未詳細(xì)指明。術(shù)語(yǔ)“任選地取代的”指以此方式指代的結(jié)構(gòu)包括具有其他殘基或者不具有其他殘基的實(shí)施方式。
術(shù)語(yǔ)“氨基取代的烷基”包括含有至少一個(gè)氨基的C1-C30直鏈或支鏈烷基，其中該氨基受保護(hù)或者通過(guò)連接子與可檢測(cè)單元相連。
術(shù)語(yǔ)“六元N+-雜環(huán)”包括在sp2氮上烷基化的N-雜環(huán)，從而使得所述雜環(huán)的總電荷為正。其例子是吡啶鎓鹽、嘧啶鎓鹽和喹啉鎓鹽。這些雜環(huán)在本領(lǐng)域中已知為缺電子的。
術(shù)語(yǔ)“核苷酸鏈”理解為含有通過(guò)磷酸酯部分而5′-3′相連的至少兩個(gè)核苷殘基的分子或分子的一部分。
本發(fā)明的化合物 本發(fā)明包括至少含有一次以下結(jié)構(gòu)的任何化合物
其中 A表示核苷酸或核苷酸鏈的5′端，或者其表示與固相相連的連接子，以及 B表示核苷酸或核苷酸鏈的3′端或者其表示連接子。Acc是電子受體或以殘基R取代的電子受體且R是任何有機(jī)取代基。此外，此殘基必須相容于核苷酸合成中發(fā)生的所有化學(xué)反應(yīng)，即 -其應(yīng)當(dāng)不被碘氧化 -其必須對(duì)二氯乙酸和三氯乙酸為惰性和 -其必須對(duì)堿尤其是氨為惰性和 -其應(yīng)當(dāng)不與三價(jià)氨基磷酸酯反應(yīng)。
然而，起初本身并不相容的殘基可通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的保護(hù)基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)樵诠丫酆塑账岷铣傻幕瘜W(xué)條件下表現(xiàn)為惰性的衍生物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)當(dāng)理解的是所述寡聚核苷酸的-OH基團(tuán)通常以去質(zhì)子狀態(tài)存在。
此外，本發(fā)明還包括具有以下結(jié)構(gòu)的甲基膦酸酯
其定義如上。
在第一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物是寡聚核苷酸。在這樣的寡聚核苷酸中，A表示核苷酸或核苷酸鏈的5′端，和/或B表示核苷酸和核苷酸鏈的3′端。因此，A和B一起含有至少兩個(gè)核苷酸殘基。
根據(jù)所述寡聚核苷酸的目的用途，如上所描述的結(jié)構(gòu)可以出現(xiàn)一次、兩次、許多次或者甚至在存在于所述寡聚核苷酸中的所有磷酸酯基上出現(xiàn)。所述寡聚核苷酸內(nèi)的磷酸殘基是所謂的核苷間磷酸酯，因此 A表示第一核苷的5′端和 B表示所述核苷酸鏈內(nèi)第二核苷的3′端。
此外，本發(fā)明的結(jié)構(gòu)可以位于寡聚核苷酸的3′端或5′端。如果它們位于所述寡聚核苷酸的5′端，則 A表示所述核苷酸鏈的5′端和 B或者是任選地受保護(hù)的羥基或者是連接子，所述連接子可任選地含有可檢測(cè)基團(tuán)或另一反應(yīng)性基團(tuán)，并且能用以將可檢測(cè)基團(tuán)引入所述寡聚核苷酸。
如果所述電子受體含有也表示可檢測(cè)基團(tuán)的取代基，根據(jù)本發(fā)明存在的寡聚核苷酸可以在5′端帶有兩個(gè)標(biāo)記。
如果本發(fā)明的結(jié)構(gòu)位于核苷酸鏈的3′端，則 B表示所述寡聚核苷酸鏈的3′端和 A或者是羥基或者是與固相連接的連接子，其中所述固相優(yōu)選為可控孔度玻璃諸如在例行核苷酸合成中作為起始材料的那些。
在本發(fā)明的寡聚核苷酸內(nèi)的單個(gè)核苷可以含有任何類型的核苷或經(jīng)修飾的核苷或核苷衍生物。所述糖單元通常為對(duì)于DNA寡聚核苷酸而言是脫氧核糖或者對(duì)于RNA寡聚核苷酸而言是核糖。在本發(fā)明的寡聚核苷酸中含有的核堿基可以是天然堿基諸如腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷及其衍生物或者所謂的通用堿基諸如硝基吲哚。本發(fā)明的寡聚核苷酸可含有任何通過(guò)酰胺鍵與各自的磷酸酯相連的電子受體。特別地，可以采用以下的電子受體基團(tuán) a)-CN， b)-SO2-R′，其中R′含有至少一個(gè)具有氨基取代的烷基，任選地取代的芳基或任選地取代的雜環(huán)， c)缺電子六元N+-雜環(huán)，其中至少一個(gè)氮原子被烷基化并位于鄰位或?qū)ξ唬⑶移渲羞@些雜環(huán)可以任選地以R取代。
本發(fā)明還明確地包括SO2-R′的實(shí)施例，其中R′是氨基取代的烷基、任選地取代的芳基或任選地取代的雜環(huán)。
在本發(fā)明的寡聚核苷酸中所有所述的電子受體的存在，導(dǎo)致形成可應(yīng)用于各種廣泛用途的經(jīng)修飾的寡聚核苷酸。然而，含有任何有機(jī)基團(tuán)R的所有電子受體是特別令人感興趣的，這是因?yàn)?，在本申?qǐng)所描述的合成方法的范圍內(nèi)，它們使之能以簡(jiǎn)單的方式制備含有任何有機(jī)殘基的經(jīng)修飾的寡聚核苷酸。
因此本發(fā)明也特別涉及其中電子受體以殘基R取代的寡聚核苷酸，所述以殘基R取代的電子受體含有可檢測(cè)單元作為R或者作為另外一種選擇，含有官能團(tuán)作為R，通過(guò)后標(biāo)記在所述寡聚核苷酸合成之后可以將可檢測(cè)基團(tuán)與之偶聯(lián)。作為另外一種選擇，本發(fā)明還包括其中電子受體為可檢測(cè)單元的一部分的實(shí)施方式。作為另外一種選擇，所述殘基R自身可以是可檢測(cè)單元或官能團(tuán)。
如此標(biāo)記的寡聚核苷酸可有利地用于分子生物學(xué)中多種不同的應(yīng)用，諸如在實(shí)時(shí)PCR中。所述可檢測(cè)標(biāo)記優(yōu)選為熒光染料或熒光猝滅分子。相應(yīng)的可以用作可檢測(cè)單元的染料和分子對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍的這些染料和分子的例子是熒光素、若丹明、青色素、羰花青和偶氮和聚偶氮化合物。
本發(fā)明還涉及具有以上所述結(jié)構(gòu)的實(shí)時(shí)PCR探針，其中至少一個(gè)熒光標(biāo)記通過(guò)酰胺/電子受體基團(tuán)的方式與所述寡聚核苷酸鏈的磷酸酯原子相連。這樣的探針的例子是FRET雜交探針(WO 97/46707)或者所謂的單標(biāo)記探針(WO 02/14555)。就此而論，特別優(yōu)選其中在核苷間磷酸殘基上具有根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)部修飾的寡聚核苷酸探針。
就此而論，本發(fā)明還特別涉及其中含有兩個(gè)可檢測(cè)單元的雙標(biāo)記寡聚核苷酸。這樣的探針的例子是TaqMan探針(US 5,804,375)和分子信標(biāo)(molecular beacons)(US 5,118,801)。就此而論，本發(fā)明涉及其中第一熒光標(biāo)記通過(guò)酰胺/電子受體基團(tuán)的方式與所述寡聚核苷酸鏈的核苷間磷酸酯原子相連，及第二檢測(cè)單元存在于所述寡聚核苷酸的5′端或3′端的雙標(biāo)記寡聚核苷酸。具有這種標(biāo)記的分子及它們的制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。
在另一方面，本發(fā)明涉及具有以下結(jié)構(gòu)的化合物
其中A表示與固相相連的連接子， B表示優(yōu)選帶有受保護(hù)的反應(yīng)性基團(tuán)或可檢測(cè)單元的連接子 E或者是甲基或者是受保護(hù)的羥基， Acc是電子受體或以殘基R取代的電子受體且R是任何有機(jī)取代基。
至于B，所述優(yōu)選的受保護(hù)的反應(yīng)性基團(tuán)是二甲氧基三苯甲基(DMT)保護(hù)的羥基。至于E，所述優(yōu)選的保護(hù)基是β-氰乙基。
這樣的化合物可以用作寡聚核苷酸合成的起始材料，其中下一個(gè)氨基磷酸酯與所述化合物的剩余羥基反應(yīng)。此外，在A表示具有額外臂的三官能連接子時(shí)，可能在其3′端制得具有雙標(biāo)記的寡聚核苷酸，其特征在于一個(gè)標(biāo)記通過(guò)所述Acc取代基引入，而第二個(gè)標(biāo)記通過(guò)與所述連接子相連的其他部分引入。
本發(fā)明的寡聚核苷酸的制備 本發(fā)明還涉及制備經(jīng)修飾的寡聚核苷酸的方法，并且特別涉及制備如上描述的寡聚核苷酸的方法。
一般而言，本發(fā)明涉及制備經(jīng)修飾的寡聚核苷酸的方法，所述經(jīng)修飾的寡聚核苷酸的方法的特征在于具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的三價(jià)磷衍生物三價(jià)磷衍生物，
其中，E表示或者甲基或者受保護(hù)的羥基，優(yōu)選為受β-氰乙基保護(hù) A表示核苷酸或核苷酸鏈的5′端或者表示與固相相連的連接子和 B表示核苷酸或核苷酸鏈的3′端或表示連接子， 與具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的疊氮化物進(jìn)行反應(yīng)， N＝N＝N-Acc 其中Acc是電子受體或以殘基R取代的電子受體且R是任何有機(jī)取代基。
特別優(yōu)選β-氰乙基、甲基、烯丙基或甲硅烷基作為保護(hù)基團(tuán)。作為另外一種選擇，根據(jù)本發(fā)明也可以制備甲基膦酸酯，其中E是CH3。
根據(jù)本發(fā)明，所述疊氮化物可含有任何電子接受基團(tuán)。這些基團(tuán)然后與相應(yīng)的磷原子相連。特別地，可以使用以下電子接受基團(tuán) a)-CN， b)-SO2-R， c)缺電子六元N+-雜環(huán)，其中至少一個(gè)氮原子被烷基化并位于鄰位或?qū)ξ?，并且其中這些雜環(huán)可以任選地以R取代。
本發(fā)明的方法也可以例行地特別用于傳統(tǒng)寡聚核苷酸的合成中。因此，本發(fā)明也涉及具有以下步驟的方法 a)將3′亞磷酰胺與新生成的寡聚核苷酸鏈的5′OH端進(jìn)行反應(yīng) b)與具有以下結(jié)構(gòu)的疊氮化物反應(yīng) N＝N＝N-Acc 其中Acc是電子受體或以殘基R取代的電子受體且R是任何有機(jī)取代基。
在此情況下，所述新生成的寡聚核苷酸鏈的5′OH端可以是5′末端核苷酸的5′端或者是與CPG相連的連接子的游離OH基團(tuán)。
傳統(tǒng)寡聚核苷酸化學(xué)開(kāi)始于反應(yīng)性固相載體材料。固相載體材料是指聚合性物質(zhì)，形成含有反應(yīng)性基團(tuán)的固相，其上可以固定其他分子。在寡聚核苷酸合成的情況下，所述載體材料通常是具有規(guī)定孔徑的有孔玻璃珠，所謂的可控孔度玻璃顆粒(CPG)。作為另外一種選擇，也可能采用聚苯乙烯殘基和其他有機(jī)聚合物和共聚物(Ghosh，P.K.，等，J.Indian.Chem.Soc.75(1998)206-218)。如果所述寡聚核苷酸在合成后應(yīng)當(dāng)保持固定在所述基材上，玻璃以及半導(dǎo)體芯片也能用作所述固相載體材料。這樣的固相載體材料是商售可獲得的。
所述載體可以以所謂的含有可切割鍵的連接子基團(tuán)的方式與受保護(hù)基團(tuán)諸如DMT(二甲氧基三苯甲基)保護(hù)的末端反應(yīng)性羥基殘基相連。含有可切割鍵的連接子基團(tuán)是指位于所述三官能間隔子和所述固相載體材料之間并通過(guò)簡(jiǎn)單化學(xué)反應(yīng)能被切割的那些基團(tuán)。它們可以是含有可切割酯鍵的琥珀?；虿蒗；蚱渌B接子基團(tuán)。其他連接子基團(tuán)為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知(Ghosh，P.K.，等，J.Indian.Chem.Soc.75(1998)206-218)。
這些連接子基團(tuán)對(duì)于采用所述載體材料從而合成在所述合成結(jié)束后將存在于水溶液中的寡聚核苷酸而言是必需的。相反，如果所述核苷酸在合成結(jié)束后應(yīng)當(dāng)保留在所述載體材料表面以制造核酸陣列(US5,624,711，Shchepinov，M.S.，等，Nucl.Acids.Res.25(1997)1155-1161)時(shí)，可切割連接子基團(tuán)并非必須，更優(yōu)選為不可切割的連接子基團(tuán)。
為引入本發(fā)明的結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸合成的詳細(xì)內(nèi)容如下 在通過(guò)酸處理脫掉所述DMT保護(hù)基之后形成反應(yīng)性羥基，在其上可形成3′-5′方向的鏈延長(zhǎng)。然后，帶有DMT保護(hù)基和其他本領(lǐng)域已知的堿基保護(hù)基的(脫氧)核糖核苷的3′亞磷酰胺衍生物，在四唑的存在下，隨后在所述5′端與每個(gè)不含有所述DMT保護(hù)基的反應(yīng)性基團(tuán)偶聯(lián)。在該方法中形成含有三價(jià)磷原子的中間體作為中間產(chǎn)物，其通過(guò)反應(yīng)與連接在一起的核苷中的每一個(gè)形成酯鍵，與在所使用的亞磷酰胺中已經(jīng)存在的受保護(hù)的羥基形成第三酯鍵。例如可以由β-氰乙基、甲基、烯丙基或甲硅烷基形成的保護(hù)基隨后在所述寡聚核苷酸合成結(jié)束之后用氨進(jìn)行切割，在所述過(guò)程中堿基保護(hù)基和與所述CPG的連接子也被切割。
代替利用碘進(jìn)行氧化，根據(jù)本發(fā)明，所述新生成的寡聚核苷酸與具有以下結(jié)構(gòu)的疊氮化物在將磷酸酯模擬物引入所述核苷酸鏈的位置處進(jìn)行反應(yīng) N＝N＝N-Acc 其中Acc是電子受體或以殘基R取代的電子受體且R是任何有機(jī)取代基。所描述的合成化學(xué)使之能基本上引入任何殘基R，特別是引入任何類型的熒光染料。
Acc疊氮化物諸如酰疊氮化物和磺酰疊氮化物的制備簡(jiǎn)單并且已長(zhǎng)期被人所知(Review

，S.，等，Angewandte Chemie 117(2205)5320-5374，3.4 and 3.5.2)。它們優(yōu)選為采用疊氮化鈉由酰氯或磺酰氯或者采用亞硝酸由酰肼制得。
染料磺酰疊氮化物也例如用在染色方法中(例如DE 19650252)。通過(guò)使疊氮化鈉與溴化氰在乙腈中反應(yīng)可以簡(jiǎn)便地制得疊氮化氰(McMurry，J.E.，等，J.Organic Chemistry 38(16)(1973)2821-7)。通過(guò)用疊氮化物親核取代鹵素或者由雜芳基酰肼(heteroaryl hydrazine)可以制得雜芳基疊氮化物。前提條件為吸電子的氮相對(duì)于疊氮基處于對(duì)位或鄰位，這是由于如此才能形成共振穩(wěn)定的磷酸酯模擬物。就此而論，鄰位或?qū)ξ籒-烷基吡啶疊氮化物是特別適合的。一些酰疊氮化物、磺酰疊氮化物和吡啶疊氮化物也是商售可得的。
另外，本發(fā)明還涉及其中所述殘基R是可檢測(cè)單元的如上所述的方法。R優(yōu)選為熒光染料或熒光猝滅分子。
本發(fā)明的某些實(shí)施方式涉及雙標(biāo)記寡聚核苷酸探針的制備，其中一個(gè)標(biāo)記優(yōu)選為根據(jù)本發(fā)明的方法引入所述寡聚核苷酸內(nèi)部，而另一標(biāo)記根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)已知的方法優(yōu)選在5′或3′端引入所述寡聚核苷酸。
在5′末端核苷酸的核糖的5′位置的5′標(biāo)記的情況下，根據(jù)傳統(tǒng)方法采用染料標(biāo)記的亞磷酰胺在所述寡聚核苷酸合成結(jié)束時(shí)進(jìn)行所述引入(Beaucage，S.L.，Methods in Molecular Biology 20(1993)33-61，S.Agrawal Publishers)。
通過(guò)除所述三苯甲基化羥基之外已經(jīng)含有可檢測(cè)標(biāo)記的商售可獲得的CPG作為反應(yīng)性固相載體實(shí)現(xiàn)所述3′端的標(biāo)記。在切割所述DMT保護(hù)基之后，可以在目前處于游離的羥基開(kāi)始標(biāo)準(zhǔn)寡聚核苷酸合成。
作為另外一種選擇，對(duì)于更多5′或3′標(biāo)記可以采用現(xiàn)有技術(shù)已知的用于后標(biāo)記的方法(US 5,002,885，US 5,401,837)。
本發(fā)明也涉及在所述標(biāo)準(zhǔn)寡聚核苷酸合成之前制備的本發(fā)明的合成的中間體。在此情況下，優(yōu)選依然連接于所述固相并且沒(méi)有脫保護(hù)和可以含有堿性間隔子基團(tuán)的中間體。優(yōu)選本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的CPG作為磷酸酯CPG用于所述制備，這是由于3′磷酸化寡聚核苷酸在所述寡聚合成后形成。在去三苯甲基化之后，所述磷酸酯CPG與間隔子亞磷酰胺在活化劑存在下進(jìn)行反應(yīng)所述形成的三價(jià)磷中間體隨之與含有可檢測(cè)單元的Acc疊氮化物反應(yīng)。這些合成中間體可被保存并用作通用3′標(biāo)記的三官能CPG。
本發(fā)明還涉及亞磷酰胺的合成，所述亞磷酰胺含有受保護(hù)的N-Acc基團(tuán)以替代例如β-氰乙基保護(hù)的氧從而使之能合成N-Acc-硫代磷酸酯或二-N-Acc-磷酸酯模擬物。這樣的合成策略適用于個(gè)別情況，例如制備含有P＝N-CN的寡聚核苷酸。
在能與疊氮化物進(jìn)行反應(yīng)的甲基膦酸酯的合成中也形成了三價(jià)磷中間體。甲基亞磷酰胺也是商售可得的。
在用于標(biāo)準(zhǔn)寡聚核苷酸以及特別用于類似物的反向合成策略中，例如用于N3′-＞P5′寡聚核苷酸的合成中(EP 1 155 027)，也形成了能根據(jù)本發(fā)明與疊氮化物反應(yīng)的含有三價(jià)磷的中間體。相應(yīng)的亞磷酰胺是商售可得的。
應(yīng)用范圍 本發(fā)明的合成策略使之能制備各種在磷酸骨架上進(jìn)行修飾的寡聚核苷酸。所述修飾的程度，所述修飾的多樣性和電荷由其預(yù)期用途所決定。
例如，本發(fā)明的寡聚核苷酸可用于與天然DNA和RNA進(jìn)行雜交以例如捕獲或檢測(cè)含有P-N＝Acc磷酸酯模擬物的寡聚核苷酸自身或者與普通磷酸酯形成的嵌合體也可成功地在擴(kuò)增反應(yīng)中用作引物。
這樣的寡聚核苷酸探針是各種應(yīng)用的基礎(chǔ)，例如實(shí)時(shí)PCR、FISH、印跡技術(shù)、測(cè)序(Jung，P.M.，等，Nucleic Acid Amplification TechnologiesBioTechniques Books，Div.Eaton Publishing(1997)Editors H.H.Lee，S.A.Morse，O.Olsvik；Bustin，Stephen A.and Nolan，Tania.Chemistries.IULBiotechnology Series(2004)，5(A-Z of Quantitative PCR)，215-278)。
根據(jù)本發(fā)明標(biāo)記的寡聚核苷酸特別適用作各種實(shí)時(shí)PCR形式的熒光標(biāo)記探針 雙標(biāo)記探針通常用于所述分子信標(biāo)形式(US 5,118,801)和TaqMan探針形式(US 5,210,015、US 5,538,848和US 5,487,972、US 5,804,375)，其中一個(gè)標(biāo)記優(yōu)選為內(nèi)部引入，而第二標(biāo)記位于所述探針的5′或3′端。特別有利的是基于亞磷酰胺化學(xué)采用本發(fā)明的方法作為寡聚核苷酸合成的部分進(jìn)行所述探針的內(nèi)部標(biāo)記。在所述探針的5′或3′端的第二可檢測(cè)單元也可以通過(guò)所描述的本發(fā)明方法中的一種或者利用現(xiàn)有技術(shù)已知的方法引入到相應(yīng)的探針中。
5′-端標(biāo)記的探針和3′-端標(biāo)記的探針通常用于FRET雜交探針形式(Matthews，J.A.，and Kricka，L.J.，Analytical Biochemistry 169(1988)1-25)，(Bernard，P.S.，等，Analytical Biochemistry 255(1998)101-107)。在此情況下，特別有利的是基于亞磷酰胺化學(xué)采用本發(fā)明的方法作為寡聚核苷酸合成的部分實(shí)現(xiàn)所述探針的5′-標(biāo)記。
本發(fā)明使之能以簡(jiǎn)單的方式制備官能化寡聚核苷酸，其中所述電子受體Acc用含有官能團(tuán)的殘基R進(jìn)行修飾，所述官能團(tuán)受到對(duì)于所述寡聚合成而言合適的保護(hù)。如果該殘基是氨基或羥氨基，則它們能用于例如通過(guò)在環(huán)氧修飾的表面上定點(diǎn)制造寡聚核苷酸陣列(Seliger，H.，等，Current Pharmaceutical Biotechnology 4(2003)379-395)。相比而言，巰基能用于在金表面或者金顆粒上的固定。在此情況下，當(dāng)以簡(jiǎn)便的方式引入數(shù)個(gè)巰基以實(shí)現(xiàn)捕獲探針在所述金表面的穩(wěn)定結(jié)合時(shí)，根據(jù)本發(fā)明是特別有利的。如果受保護(hù)的OH基團(tuán)作為官能團(tuán)引入，則也可以制備支化的或者枝化的聚核苷酸。
這些官能團(tuán)尤其是氨基也可以通過(guò)將其與染料的活性酯在所述寡聚合成之后進(jìn)行反應(yīng)從而用以制備標(biāo)記寡聚核苷酸。然而，更有利的是根據(jù)本發(fā)明的方法在寡聚核苷酸合成中直接引入可檢測(cè)單元。
由于本發(fā)明的寡聚核苷酸能耐受核酸酶，因此它們適用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)以阻止基因表達(dá)，即本發(fā)明的寡聚核苷酸用作反義寡聚核苷酸或者用作siRNA活性成分的一部分。在此情況下，所述修飾可經(jīng)過(guò)選擇使得它們有助于細(xì)胞吸收和/或改善與目標(biāo)核酸的結(jié)合。隨后通過(guò)Northern印跡分析、單步或兩步實(shí)時(shí)RT-PCR方法或通過(guò)雜交到合適的微陣列上的方法可以監(jiān)測(cè)相應(yīng)目標(biāo)基因表達(dá)的阻斷。
此外，本發(fā)明的寡聚核苷酸可用作可檢測(cè)單元和蛋白質(zhì)之間的親水連接子或者作為明確質(zhì)量的標(biāo)記。此外，能建立起核酸適體物質(zhì)庫(kù)，在此情況下利用不同的磺酰疊氮化物和酰疊氮化物或雜芳基疊氮化物在所述合成中可以將不同的殘基R引入到所述磷酸酯上。隨后可以測(cè)試所述庫(kù)與蛋白質(zhì)或其他生物分子的結(jié)合。優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的核酸適體的一點(diǎn)是本發(fā)明的方法使之能制備大量的不同附加的修飾，并且能以簡(jiǎn)便的方式進(jìn)行測(cè)試。
通過(guò)以下實(shí)施例、公開(kāi)和序列方案更詳細(xì)地闡述本發(fā)明，其保護(hù)范圍源自于專利權(quán)利要求。所描述的方法應(yīng)當(dāng)理解為實(shí)施例，即使在進(jìn)行修改之后其依然描述了本發(fā)明的目的。
提供以下實(shí)施例和序列表以幫助理解本發(fā)明，其真實(shí)范圍在所附權(quán)利要求中闡明。應(yīng)當(dāng)理解可以在所闡述的過(guò)程中進(jìn)行修改而不背離本發(fā)明的精神。
實(shí)施例 實(shí)施例1 經(jīng)修飾的dT(P(＝NSO2PhNHAc)dT的合成 所述二聚體合成在ABI 394合成儀上以10μmol的規(guī)模進(jìn)行。商售可得的dT CPG載體用作所述固體載體。所有用于標(biāo)準(zhǔn)合成的化學(xué)品均獲得自Glen Research。
含有碘的傳統(tǒng)氧化劑溶液被0.1M的在無(wú)水乙腈中的p-NAc苯基磺酰疊氮化物溶液所代替。所述氧化時(shí)間延長(zhǎng)至16分鐘。
在室溫下，使用33％氨水耗時(shí)2小時(shí)將產(chǎn)物從所述載體上切割下來(lái)，并在Poros Oligo R3 4.6×50mm柱上通過(guò)反相色譜進(jìn)行分離。色譜緩沖液A0.1M在水中的乙酸三乙銨溶液，pH 6.8，緩沖液B0.1M在水/乙腈1∶1中的乙酸三乙銨溶液，梯度2分鐘0％B～100％B，在45分鐘內(nèi)。洗脫液的UV吸收在260nm處進(jìn)行測(cè)量。在所需要的產(chǎn)品中含有主要色譜洗脫份。在真空離心機(jī)中除去溶劑。所述殘留物溶解在再蒸餾水中并在真空中再次蒸發(fā)。該過(guò)程重復(fù)三次。所述殘留物隨后溶解在再蒸餾水中并凍干。
1H NMR(Bruker DPX 300)在D2O中7.82d[2H，aryl]，7.56d[2Haryl]，7.47s[1H，C6-H]，7.40[1H，C6-H]，6.21m[1H，H1′]，6.21m[1H，H1′]，6.07m[1H，H1′]，4.38m[1H，H3′]， 4.10[m，4H，H4′，H5′]2.38-2.24m[4H，H2′]，2.22[3H，CH3]，2.16[3H，CH3]，2.14[3H，CH3] 31P NMR(Bruker DPX 300)在D2O中2.14 質(zhì)譜(ESI-MS)計(jì)算值742.66測(cè)量值[M-H]741.73 實(shí)施例2 T(P(＝NSO2PhNHAc)T9寡聚核苷酸的合成 所述寡聚核苷酸合成在ABI 394合成儀上以1μmol的規(guī)模進(jìn)行。商售可得的dT CPG載體用作所述固相。所有用于標(biāo)準(zhǔn)合成的化學(xué)品均獲得自Glen Research。
在第一合成循環(huán)中，含有碘的氧化劑被0.1M的在無(wú)水乙腈中的p-NAc苯基磺酰疊氮化物溶液所代替。所述氧化時(shí)間延長(zhǎng)至16分鐘。其余dT亞磷酰胺的連接根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。
在室溫下，使用33％氨水耗時(shí)2小時(shí)將產(chǎn)物從所述載體上切割下來(lái)，并在Poros Oligo R3 4.6×50mm柱上通過(guò)反相色譜進(jìn)行分離。色譜緩沖液A0.1M在水中的乙酸三乙銨溶液，pH 6.8，緩沖液B0.1M在水/乙腈1∶1中的乙酸三乙銨溶液，梯度2分鐘0％B～100％B，在45分鐘內(nèi)。洗脫液的UV吸收在260nm處進(jìn)行測(cè)量。在所需要的產(chǎn)品中含有主要色譜洗脫份。在真空離心機(jī)中除去溶劑。所述殘留物溶解在再蒸餾水中并在真空中再次蒸發(fā)。該過(guò)程重復(fù)三次。所述殘留物隨后溶解在再蒸餾水中并凍干。
質(zhì)譜(ESI-MS)計(jì)算值3176.25測(cè)量值[M-H]3176.0 實(shí)施例3 熒光素標(biāo)記的寡聚核苷酸的合成 5′AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC熒光素-3′，其中每個(gè)P＝O被P＝N-pPh-NAc取代(SEQ.ID.NO4) 所述寡聚核苷酸合成在ABI 394合成儀上以1μmol的規(guī)模進(jìn)行。商售可得的LightCycler熒光素CPG(Roche Applied Science)用作所述載體材料。所有用于標(biāo)準(zhǔn)合成的化學(xué)品均獲得自Glen Research。使用來(lái)自Proligo的帶有叔丁基苯氧基-乙酰保護(hù)基的亞磷酰胺(已知為“tac”或“Expedite”單體)。
標(biāo)準(zhǔn)方案用于所述合成，其中所述含有碘的氧化劑被0.1M的在無(wú)水乙腈中的p-NAc苯基磺酰疊氮化物溶液所代替。所述氧化時(shí)間延長(zhǎng)至16分鐘。
在室溫下，使用33％氨水耗時(shí)2小時(shí)將產(chǎn)物從所述載體上切割下來(lái)，并在Poros Oligo R3 4.6×50mm柱上通過(guò)反相色譜進(jìn)行分離。色譜緩沖液A0.1M在水中的乙酸三乙銨溶液，pH 6.8，緩沖液B0.1M在水/乙腈1∶1中的乙酸三乙銨溶液，梯度2分鐘0％B～100％B，在45分鐘內(nèi)。洗脫液的UV吸收在260nm處進(jìn)行測(cè)量。在所需要的產(chǎn)品中含有主要色譜洗脫份。在真空離心機(jī)中除去溶劑。所述殘留物溶解在再蒸餾水中并在真空中再次蒸發(fā)。該過(guò)程重復(fù)三次。所述殘留物隨后溶解在再蒸餾水中并凍干。
質(zhì)譜(ESI-MS)計(jì)算值11839測(cè)量值[M-H]11839.9 實(shí)施例4 嵌合寡聚核苷酸的合成，其中在特定的位置P＝O被P＝N-Acc取代 所述合成在ABI 394合成儀上以1μmol的規(guī)模進(jìn)行。為了不必在合成中更換氧化劑，所述合成程序經(jīng)修改使得N3-Acc溶液可以裝在額外的堿基位置上。由于所述程序設(shè)定的限制，所述疊氮化物與所述活化劑一起反應(yīng)。這對(duì)所述修飾沒(méi)有影響。所述N3 Acc與所述三價(jià)磷中間體的反應(yīng)時(shí)間為5分鐘。
所有用于標(biāo)準(zhǔn)合成的化學(xué)品均獲得自Glen Research。使用來(lái)自Proligo的帶有叔丁基苯氧基-乙酰保護(hù)基的亞磷酰胺(已知為“tac”或“Expedite”單體)。如上所述進(jìn)行純化。
載體熒光素CPGN3-Accp-NAc苯基磺酰疊氮化物(SigmaAldrich)。
合成了以下各自具有相同的SEQ ID NO4的探針并隨后用質(zhì)譜進(jìn)行分析 pl是P＝N-pPh-NAc模擬物 實(shí)施例5 本發(fā)明的3′-末端標(biāo)記 a)二甲基氨基偶氮苯磺酰疊氮化物的制備 0.71g(2.19mmol)二甲基氨基偶氮苯磺酰氯溶解在10ml丙酮中。緩慢滴加142mg(2.19mmol)疊氮化鈉在2ml水中的溶液，同時(shí)在冰上冷卻并攪拌。在0℃下攪拌2小時(shí)并隨后在室溫下攪拌2小時(shí)。然后將32mg疊氮化鈉(0.5mmol)在500μl水中的溶液加入并在室溫下攪拌1小時(shí)。(TLC硅膠CH2Cl2)。然后將200ml二氯甲烷加入到所述懸浮液中并過(guò)濾。濾出物用水晃動(dòng)兩次，用5％碳酸氫鈉溶液晃動(dòng)一次，然后用水晃動(dòng)兩次。所分離出的有機(jī)相用硫酸鈉干燥。在浴溫＜20℃下，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸餾除去溶劑。殘留物懸浮在2ml乙腈中并過(guò)濾。該殘留物用乙醚洗滌。
粗產(chǎn)率為280mg。所述疊氮化物直接用在DNA合成儀上或者用以制備載體而無(wú)需進(jìn)一步純化。
b)用于寡聚核苷酸合成的二甲基氨基偶氮苯磺酰載體的制備 CPG-1caa-NHC(＝O)-CH2-CH2-C(＝O)-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-O-P(O-CH2-CH2-CN)(＝N-SO2-Ph-p-N＝N-Ph-p-NMe2)-O CH2-CH2-CH2-ODMTr 1.2g含磷連接CPG裝樣49μmol/g裝在Schlenk frit上并在氬氣下用無(wú)水乙腈進(jìn)行洗滌。然后用0.1M在二氯甲烷中的二氯乙酸進(jìn)行洗滌直至所述濾出物為無(wú)色。隨后，用無(wú)水乙腈進(jìn)行徹底的洗滌。隨后，用2ml 0.25M在乙腈(活化劑)中的二氰基咪唑洗滌并立即加入2ml 0.1M所述間隔子C3亞磷酰胺溶液。然后將所述懸浮液放置3分鐘。在氬氣壓力下進(jìn)行過(guò)濾。然后，用2ml活化劑進(jìn)行洗滌，并再次用2ml活化劑洗滌并立即加入2ml 0.1M所述間隔子C3亞磷酰胺溶液。然后，所述制備持續(xù)12分鐘。在氬氣壓力下過(guò)濾除去溶劑，加入2ml 0.1M的在二氯甲烷中的二甲基氨基偶氮苯磺酰疊氮化物溶液，并將所述混合物放置15分鐘。最終用100ml二氯甲烷洗滌經(jīng)修飾的CPG，隨后用100ml無(wú)水乙腈洗滌，并在真空下干燥。
c)采用所述二甲基氨基偶氮苯磺酰載體進(jìn)行寡聚核苷酸合成 5′熒光素-GCA CCA GAT CCA CGC CCT TGA TGAGC-O-CH2-CH2-CH2-O(O2)P(＝N-SO2-Ph-p-N＝N-Ph-p-NMe2) 所述寡聚核苷酸合成在ABI 394合成儀上以1μmol的規(guī)模進(jìn)行。得自實(shí)施例5a的二甲基氨基偶氮苯磺酰-CPG用作載體材料。6-羧基熒光素亞磷酰胺(Glen Research，Report No.10(GR10-1)(1997)1-12)用于所述5′-標(biāo)記。
所有其他用于標(biāo)準(zhǔn)合成的化學(xué)品獲得自Glen Research。如實(shí)施例4所述，使用來(lái)自Proligo的帶有叔丁基苯氧基-乙酰保護(hù)基的亞磷酰胺(已知為“tac”或“Expedite”單體)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行合成。所述切割和純化也如4中所述進(jìn)行。
質(zhì)譜(ESI-MS)計(jì)算值8973測(cè)量值[M-H]8973.1 實(shí)施例6 實(shí)時(shí)PCR和熔化曲線分析 在LightCycler

儀器(Roche Diagnostics GmbH)上進(jìn)行因子VDNA的定量實(shí)時(shí)PCR以及隨后的熔化曲線分析以分析磷酸酯模擬物對(duì)雜交的影響。引物與一對(duì)熒光素/LightCycler紅640 FRET雜交探針聯(lián)合使用。所述引物和5′LightCycler紅640探針保持恒定。來(lái)自實(shí)施例4的在磷酸酯上進(jìn)行修飾的各種3′熒光素探針和用作參照的未經(jīng)修飾的熒光素探針被用作FRET供體探針。評(píng)估了對(duì)交叉點(diǎn)和對(duì)熔點(diǎn)的影響，所述交叉點(diǎn)為擴(kuò)增效率的量度。
按如下制備用于因子V DNA片段的擴(kuò)增的20μl的PCR反應(yīng)混合物。
含有因子V野生型基因和突變體的106份拷貝的質(zhì)粒(Gene BankAccession No.M_014335) 13mM MgCl2 500nM各自具有SEQ ID NO1和2的引物 200nM各自具有SEQ ID NO3和4的FRET雜交探針 依照制造商說(shuō)明書(shū)，LightCycler DNA Master Hyb探針試劑盒(Roche Applied Science，Cat.No.2158825)用于所有其他PCR成分。
以下序列用作引物和探針 SEQ ID NO1 正向引物 5′GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A SEQ ID NO2 反向引物 5′TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA SEQ ID NO3 FRET受體探針 5′LC-紅640 AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGTCCT ATT SEQ ID NO4 FRET供體探針 5′AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC-熒光素 以下溫度程序用于在所述LightCycler 1.2(Roche Applied Science)上的擴(kuò)增。

采用二階導(dǎo)數(shù)閾值法對(duì)超過(guò)45次循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，其中在專用于所述LigthCycler紅640發(fā)射的檢測(cè)通道(在640nm)測(cè)量熒光信號(hào)，并采用算術(shù)背景修正模式對(duì)初始信號(hào)進(jìn)行歸一化。
在所述擴(kuò)增后，根據(jù)LightCycler手冊(cè)(Roche Applied Sciences)的說(shuō)明進(jìn)行熔化曲線分析。采用以下溫度程序
如上在640nm通道上對(duì)絕對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)量，并隨后由此計(jì)算一階導(dǎo)數(shù)。
在下表列出了交叉點(diǎn)作為采用不同經(jīng)修飾的供體探針的擴(kuò)增效率的量度。所述表也列出了用于所述因子V野生型序列和所述因子V突變序列的各種供體探針的測(cè)量熔點(diǎn)。
pl是P＝N-pPh-NAc模擬物 如表中所示，所述交叉點(diǎn)并未由于根據(jù)本發(fā)明引入修飾而受到明顯影響，即所述PCR效率未變。
此外，在所述一倍或兩倍修飾探針的情況下沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)所測(cè)量的熔點(diǎn)的影響。而且，多重修飾探針僅僅表現(xiàn)出不超過(guò)4℃的熔點(diǎn)的適度變化，因此保持了配對(duì)錯(cuò)誤識(shí)別的能力。
實(shí)施例7 實(shí)時(shí)PCR和熔化曲線分析 a)麗絲胺疊氮化物(＝若丹明B)的制備 195mg(3.0mmol)疊氮化鈉在5ml水中的溶液在0℃下滴加到577mg(1mmol)硫代若丹明B酸氯化物在20ml丙酮中的溶液中。所述混合物在0℃下攪拌2小時(shí)，然后在室溫下攪拌6小時(shí)。將所述混合物轉(zhuǎn)移到分液漏斗中并加入300ml水和300ml二氯甲烷。分離有機(jī)相并用100ml水洗滌兩次。所述有機(jī)相用硫酸鈉干燥。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸餾除去溶劑。殘留物(140mg)無(wú)需進(jìn)一步純化而用于寡聚核苷酸合成。
b)SEQ ID NO3 FRET受體探針Ap*GG GAT CTG CTC TTA CAGATT AGA AGT AGT CCT ATT-p的合成，p*＝P＝NS(O)2-若丹明-B 所述寡聚核苷酸合成在ABI 394合成儀上以1μmol的規(guī)模進(jìn)行。商售可得的磷連接CPG(Glen Research)用作載體材料。所有用于標(biāo)準(zhǔn)合成的化學(xué)品獲得自Glen Research。使用來(lái)自Proligo的帶有叔丁基苯氧基-乙酰保護(hù)基的亞磷酰胺(已知為“tac”或“Expedite”單體)。
標(biāo)準(zhǔn)方案(三苯甲基脫掉)用于所述合成，其中在最后一個(gè)循環(huán)中所述氧化劑被0.1M在無(wú)水乙腈中的麗絲胺疊氮化物溶液所代替，并且氧化時(shí)間延長(zhǎng)至16分鐘。
在室溫下，使用33％氨水耗時(shí)2小時(shí)將產(chǎn)物從所述載體上切割下來(lái)，并在Poros Oligo R3 4.6×50mm柱上通過(guò)反相色譜進(jìn)行分離。色譜緩沖液A0.1M在水中的乙酸三乙銨溶液，pH 6.8，緩沖液B0.1M在水/乙腈1∶1中的乙酸三乙銨溶液，梯度2分鐘0％B～100％B，在45分鐘內(nèi)。洗脫液的UV吸收在260nm處進(jìn)行測(cè)量。在所需要的產(chǎn)品中含有主要色譜洗脫份。在真空離心機(jī)中除去溶劑。所述殘留物溶解在再蒸餾水中并在真空中再次蒸發(fā)。該過(guò)程重復(fù)三次。所述殘留物隨后溶解在再蒸餾水中并凍干。質(zhì)譜(ESI-MS)計(jì)算值11710測(cè)量值[M-H]11710.5。
c)實(shí)時(shí)PCR 為描述在實(shí)時(shí)PCR中的適用性，在LightCycler 2.0進(jìn)行因子V DNA的實(shí)時(shí)PCR。引物與一對(duì)熒光素/麗絲胺FRET雜交探針聯(lián)合使用，其中麗絲胺(若丹明B)用作FRET受體。記錄定量曲線，并且cp值作為所述目標(biāo)核酸的濃度的函數(shù)進(jìn)行測(cè)定。
根據(jù)實(shí)施例6進(jìn)行了對(duì)因子V DNA片段的104份拷貝擴(kuò)增和106份拷貝擴(kuò)增的實(shí)時(shí)PCR和熔化曲線分析。為此使用了未經(jīng)進(jìn)一步修飾的實(shí)施例6(SEQ ID NO4)的熒光素供體探針和實(shí)施例7b(SEQ ID NO3)的FRET受體探針。

在所述610nm檢測(cè)通道對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。采用610/530背景修正模式對(duì)原始信號(hào)進(jìn)行歸一化。對(duì)于106份拷貝測(cè)得cp值為22，對(duì)于104份拷貝測(cè)得cp值為26。
所述野生型的熔點(diǎn)測(cè)定為64.69℃，而所述突變體的熔點(diǎn)測(cè)定為56.24℃(106份拷貝)。
實(shí)施例8 帶有經(jīng)修飾的引物的實(shí)時(shí)PCR 在LightCycler

儀器(Roche Diagnostics GmbH)上進(jìn)行人類因子V DNA的定量實(shí)時(shí)PCR以分析磷酸酯模擬物對(duì)引物延長(zhǎng)的影響。將P＝N-pPh-NAc模擬物引入用于人類因子V DNA擴(kuò)增的引物對(duì)的不同位置。所述經(jīng)修飾的引入根據(jù)實(shí)施例4進(jìn)行制備。通過(guò)實(shí)施例3的反相色譜在帶有三苯甲基的模式下完成純化。通過(guò)用80％乙酸處理20分鐘進(jìn)行去三苯甲基化。
根據(jù)實(shí)施例6該引物與一對(duì)熒光素/LightCycler紅640 FRET雜交探針聯(lián)合使用。所述熒光素探針和5′LightCycler紅640探針(Seq.Id.No3和4)保持恒定。測(cè)試了經(jīng)修飾的或未經(jīng)修飾的引物的各種組合。未經(jīng)修飾的引物用作參照。評(píng)估了對(duì)交叉點(diǎn)的影響，所述交叉點(diǎn)為擴(kuò)增效率的量度。
采用二階導(dǎo)數(shù)閾值法對(duì)超過(guò)45次循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，其中在專用于所述LigthCycler紅640發(fā)射的檢測(cè)通道(在640nm)測(cè)量熒光信號(hào)，并采用算術(shù)背景修正模式對(duì)初始信號(hào)進(jìn)行歸一化。
如上在640nm通道上對(duì)絕對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)量，并隨后由此計(jì)算一階導(dǎo)數(shù)。在下表中列出交叉點(diǎn)作為使用不同經(jīng)修飾的引物時(shí)擴(kuò)增效率的量度。
pl是P＝N-pPh-NAc模擬物 如表中所示，所述交叉點(diǎn)并未由于在所述引物中根據(jù)本發(fā)明引入修飾而受到明顯影響，這顯示出即所述PCR效率幾乎未變。
實(shí)施例9 含有吡啶鎓鹽磷酸酯模擬物(pyridinium phosphatmimetikum)的熒光素標(biāo)記的寡聚核苷酸的合成 根據(jù)SEQ.ID.NO4的寡聚核苷酸的合成在ABI 394合成儀上以1μmol的規(guī)模進(jìn)行。商售可得的LightCycler熒光素CPG(Roche AppliedScience)用作所述載體材料。所有用于標(biāo)準(zhǔn)合成的化學(xué)品均獲得自GlenResearch。使用來(lái)自Proligo的帶有叔丁基苯氧基-乙酰保護(hù)基的亞磷酰胺(已知為“tac”或“Expedite”單體)。
所述合成使用實(shí)施例4的方案，其中在第二次循環(huán)中，0.1M的1，2，6-三甲基吡啶鎓鹽4-疊氮化物(RareChem AQ N6 1054)在無(wú)水乙腈中的溶液用作氧化劑，并且所述氧化時(shí)間延長(zhǎng)至16分鐘。這形成含有以下結(jié)構(gòu)的中間體
在室溫下，使用33％氨水耗時(shí)2小時(shí)將產(chǎn)物從所述載體上切割下來(lái)，并在Poros Oligo R3 4.6×50mm柱上通過(guò)反相色譜進(jìn)行分離。色譜緩沖液A0.1M在水中的乙酸三乙銨溶液，pH 6.8，緩沖液B0.1M在水/乙腈1∶1中的乙酸三乙銨溶液，梯度2分鐘0％B～100％B，在45分鐘內(nèi)。洗脫液的UV吸收在260nm處進(jìn)行測(cè)量。在所需要的產(chǎn)品中含有主要色譜洗脫份。在真空離心機(jī)中除去溶劑。所述殘留物溶解在再蒸餾水中并在真空中再次蒸發(fā)。該過(guò)程重復(fù)三次。所述殘留物隨后溶解在再蒸餾水中并凍干。
質(zhì)譜(Maldi-MS Applied Biosystems Voyager System 6327)計(jì)算值7641.32測(cè)量值[M-H]7639.59 實(shí)施例10 dA(P(＝NSO2PhNHAc)dT二核苷酸相比未經(jīng)修飾的dAdT在不同溫度和pH下的穩(wěn)定性 根據(jù)實(shí)施例1合成并純化dA(P(＝NSO2PhNHAc)dT。dAdT也根據(jù)實(shí)施例1進(jìn)行合成，但使用標(biāo)準(zhǔn)氧化劑(在THF中的0.02 M碘)。
所述二聚體在不同pH值7.0、8.0和9.0的10mM Tris緩沖液中暴露于不同時(shí)間和溫度下。樣品在室溫(大約24℃)下放置24小時(shí)，或者在95℃分別放置60分鐘和16小時(shí)，在實(shí)驗(yàn)前后分別取出150μl的等分試樣并將100μl體積注入HPLC中。
用Waters 2690分離模塊在X-Bridge分析柱(2.5μm，4.6×50mm i.d.)通過(guò)反相HPLC對(duì)分解進(jìn)行監(jiān)測(cè)。使用Waters 2690檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)(260nm)。用95％梯度的乙腈以流速1.0ml/min泵入0.1M乙酸三乙銨(pH6.8)作為流動(dòng)相。通過(guò)監(jiān)測(cè)所述二聚體信號(hào)的保留時(shí)間(rt)(軟件Millenium，Waters)并確定其是否有不同于所述核苷酸二聚體的保留時(shí)間的其他峰出現(xiàn)，來(lái)判定所述二聚體的分解率。結(jié)果列在下表中

這些未經(jīng)修飾的二聚體在pH 7.0、8.0和9.0下，在室溫下24小時(shí)穩(wěn)定，在95℃下1小時(shí)穩(wěn)定，在pH 7.0和pH8.0下，在95℃下16小時(shí)之后開(kāi)始分解。所述經(jīng)修飾的二聚體在pH 7.0、8.0和9.0下，在室溫下24小時(shí)穩(wěn)定，在95℃下1小時(shí)穩(wěn)定，在pH 7.0下，在95℃下16小時(shí)之后開(kāi)始分解。
序列表
<110>Roche Diagnostics GmbH
F.Hoffmann-La Roche AG
<120>含有磷酸酯模擬物的多聚核苷酸
<130>23428 WO
<150>EP 05025499
<151>2005-11-23
<160>4
<170>PatentIn版本3.2
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>引物
<400>1
gagagacatc gcctctgggc ta22
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>引物
<400>2
tgttatcaca ctggtgctaa 20
<210>3
<211>36
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>探針
<400>3
agggatctgc tcttacagat tagaagtagt cctatt36
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>探針
<400>4
aatacctgta ttcctcgcct gtc 2權(quán)利要求
1.含有至少一次以下結(jié)構(gòu)的化合物
其中A表示核苷酸或核苷酸鏈的5′端，或者其表示與固相相連的連接子，以及
B表示核苷酸或核苷酸鏈的3′端或者其表示連接子
D是OH或CH3，以及
Acc是電子受體或以殘基R取代的電子受體且R是任何有機(jī)取代基，并且，Acc選自由以下組成的組
(i)-CN，
(ii)-SO2-R′，其中R′含有至少一個(gè)氨基取代的烷基，任選地取代的芳基或任選地取代的雜環(huán)，
(iii)具有至少一個(gè)位于鄰位或?qū)ξ坏耐榛疦-原子的六元N+-雜環(huán)，所述雜環(huán)選自由吡啶鎓、嘧啶鎓和Chinolinium組成的組。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R或R′單獨(dú)或者與所述電子受體一起含有可檢測(cè)單元或官能團(tuán)。
3.如權(quán)利要求1～2所述的寡聚核苷酸，其特征在于A和B一起含有至少兩個(gè)核苷酸殘基。
4.制備經(jīng)修飾的寡聚核苷酸的方法，其特征在于具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的三價(jià)磷衍生物
其中，E表示或者甲基或者受保護(hù)的羥基，
其中A表示核苷酸或核苷酸鏈的5′端或者表示與固相相連的連接子和
其中B表示核苷酸或核苷酸鏈的3′端或表示連接子，
與具有以下結(jié)構(gòu)的疊氮化物進(jìn)行反應(yīng)，
N＝N＝N-Acc
其中Acc是電子受體或以殘基R取代的電子受體且R是任何有機(jī)取代基，并且Acc選自由以下組成的組
(i)-CN，
(ii)-SO2-R′，其中R′含有至少一個(gè)氨基取代的烷基，任選地取代的芳基或任選地取代的雜環(huán)，
(iii)具有至少一個(gè)位于鄰位或?qū)ξ坏耐榛疦-原子的六元N+-雜環(huán)，所述雜環(huán)選自由吡啶鎓、嘧啶鎓和Chinolinium組成的組。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，包括以下步驟
a)將3′亞磷酰胺與新生成的寡聚核苷酸鏈的5′OH端進(jìn)行反應(yīng)
b)與具有以下結(jié)構(gòu)的疊氮化物反應(yīng)
N＝N＝N-Acc
其中Acc是電子受體或以殘基R取代的電子受體且R是任何有機(jī)取代基，并且Acc選自由以下構(gòu)成的組
(i)-CN，
(ii)-SO2-R′，其中R′含有至少一個(gè)氨基取代的烷基，任選地取代的芳基或任選地取代的雜環(huán)，
(iii)具有至少一個(gè)位于鄰位或?qū)ξ坏耐榛疦-原子的六元N+-雜環(huán)，所述雜環(huán)選自由吡啶鎓、嘧啶鎓和Chinolinium組成的組。
6.如權(quán)利要求4～5所述的方法，其中R或R′是可檢測(cè)單元。
7.如權(quán)利要求1～3所述的寡聚核苷酸作為雜交對(duì)象的用途。
8.如權(quán)利要求7所述作為雜交探針的用途。
9.如權(quán)利要求7所述在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中阻止基因表達(dá)的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的寡聚核苷酸及其制備方法，其中所述寡聚核苷酸含有至少一次結(jié)構(gòu)P＝N-Acc，其中Acc是電子受體或以殘基R取代的電子受體且R是任何有機(jī)取代基。
文檔編號(hào)C07H21/00GK101312985SQ200680043667
公開(kāi)日2008年11月26日 申請(qǐng)日期2006年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月23日
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