專利名稱：去除初純質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)中內(nèi)毒素的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及基因疫苗、基因治療所用質(zhì)粒的純化工藝及蛋白質(zhì)的純化工藝，更具體說，涉及去除初純質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)中內(nèi)毒素的方法。
背景技術(shù)：
采用“裸工程質(zhì)?！钡暮怂嵋呙缡墙瓿霈F(xiàn)的、目前正在研發(fā)的最新一代或第三代疫苗，研究顯示其對第一、第二代疫苗基本無效的傳染病如齲病、艾滋病、結(jié)核病、瘧疾等的預(yù)防和乙型肝炎的治療具有獨特的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。核酸疫苗誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答能力的獨特優(yōu)點彌補(bǔ)了第一、第二代疫苗的不足，而且這些顯著優(yōu)點正是防治上述疾病所必須的，對此國際上已獲得共識。另外，腫瘤的免疫治療也主要依賴細(xì)胞免疫力，其核酸疫苗的研制也是當(dāng)今熱點之一。除了作為核酸疫苗外，質(zhì)粒也可用于基因治療和(表達(dá))抗體治療。因而質(zhì)粒純化技術(shù)的研究目前已從實驗室階段向?qū)嵱卯a(chǎn)業(yè)化階段發(fā)展。
質(zhì)粒是大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)能獨立于染色體進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的環(huán)形DNA。工程質(zhì)粒是將大腸桿菌質(zhì)粒經(jīng)基因工程改造，在其中插入了編碼病原體的保護(hù)性抗原蛋白的基因，和優(yōu)選的免疫增強(qiáng)性細(xì)胞因子。將純化的工程質(zhì)粒注射入人體肌肉等部位，能在相關(guān)抗原加工處理細(xì)胞(Antigen Present Cell，APC)或肌肉細(xì)胞中表達(dá)所編碼的抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)來抵御病原體。
目前研制的針對不同人類病原體的精心制備的工程質(zhì)粒，基本上都采用美國FDA推薦的可用于人體的卡那霉素抗性大腸桿菌質(zhì)粒pVAX1改造而成，其中除病原體基因和細(xì)胞因子不同外，整個結(jié)構(gòu)大同小異。從培養(yǎng)的工程大腸桿菌中抽提質(zhì)粒首先要破裂細(xì)菌使質(zhì)粒釋放出來，但是在釋放質(zhì)粒的同時還釋放出大量大腸桿菌自身的RNA、基因組DNA、細(xì)菌蛋白質(zhì)、脂類、細(xì)胞壁成分和內(nèi)毒素等雜質(zhì)，而質(zhì)粒只占其中的千分之一左右，因此需要采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)提取質(zhì)粒去除雜質(zhì)。大規(guī)模破裂細(xì)菌的方法有機(jī)械和化學(xué)方法，而目前多采用化學(xué)方法即堿裂解法，其質(zhì)粒破壞少回收率高(見盧圣棟主編“現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)”，第二版，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，1999年12月，北京；和J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯“分子克隆實驗指南”，第三版，2002年8月，科學(xué)出版社出版，北京，中有關(guān)章節(jié))。
本發(fā)明者在2004年12月21日提交的發(fā)明專利申請“改進(jìn)的堿裂解法提取基本純質(zhì)粒的方法及多層層析裝置”(申請?zhí)?0041093322.1)已就初純質(zhì)粒制備過程中的牛胰腺RNA酶替代物、離子交換層析和濃縮生產(chǎn)工藝進(jìn)行了實用性改進(jìn)，獲得了優(yōu)良結(jié)果，但初純質(zhì)粒中所含高度污染的內(nèi)毒素必須去除才能適合人體應(yīng)用。
另外，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)各種細(xì)胞因子、生長因子、白細(xì)胞介素、干擾素、激素、抗體等蛋白質(zhì)已有二、三十年，其中不少采用大腸桿菌作為宿主菌，或利用噬菌體加宿主菌生產(chǎn)，因而也存在內(nèi)毒素污染問題。但由于內(nèi)毒素與蛋白質(zhì)性質(zhì)相差較大，蛋白污染的內(nèi)毒素不多，含量為數(shù)千至數(shù)萬EU/mg，而這些蛋白生產(chǎn)工藝中采用的沉淀、多步凝膠層析、親和層析、超濾等多個步驟已足夠逐漸去除內(nèi)毒素，故一般不需再次去除內(nèi)毒素。然而實驗室小量制備蛋白時，有時需要去除其中的內(nèi)毒素，以利于細(xì)胞培養(yǎng)、動物實驗等用途。
內(nèi)毒素是熱源物質(zhì)，注入動物體內(nèi)可引起動物發(fā)熱等毒性作用，并大大降低質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及細(xì)胞表達(dá)抗原的效率。內(nèi)毒素(endotoxin)是革蘭陰性菌(GNB)細(xì)胞壁外膜上的特有結(jié)構(gòu)，其本質(zhì)是脂多糖(LPS)。在化學(xué)結(jié)構(gòu)上主要由兩大部分組成，即多糖(polysaccharide)和類脂A(lipid A)，多糖又可分為0-特異性多糖鏈(0-spcificpolysaccharide chain)和核心寡聚糖(core oligosaccharide)兩部分，結(jié)構(gòu)見附

圖1，圖1中A為光滑型LPS結(jié)構(gòu)，由三部分組成，0-特異性側(cè)鏈(m)、核心(外核+內(nèi)核)(II)和類脂A(I)；B為粗糙型LPS結(jié)構(gòu)，由兩部分組成，核心(外核+內(nèi)核)(II)和類脂A(I)。不同的革蘭氏陰性細(xì)菌，其LPS的化學(xué)組成又有一定的差別，但都含有類脂A部分。類脂A是LPS的活性中心，也是其毒性的基礎(chǔ)，主要由氨基葡萄糖、磷酸10、18碳的長脂肪酸組成，在生理條件下，具有疏水性和電負(fù)性。鱟試劑和內(nèi)毒素的反應(yīng)主要是與脂質(zhì)A結(jié)合。內(nèi)毒素在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿下都頗穩(wěn)定。對于可用于人體的質(zhì)粒，要求極高，即每毫克質(zhì)粒中內(nèi)毒素含量小于100EU，甚至小于10EU。
由于不同核酸疫苗的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)大同小異，又同樣采用大腸桿菌作為工程菌進(jìn)行培育增殖，其生產(chǎn)和提純方法也基本相同，這與蛋白質(zhì)疫苗的制備和純化條件各異不同相比，具有很大的優(yōu)點，即建立的提取純化方法將具有通用性。
傳統(tǒng)的去除內(nèi)毒素的方法有加熱、蒸餾、過濾、反相滲透、活性碳粉、各種柱層析方法，這些方法能去除或滅活部分內(nèi)毒素，但都很難將內(nèi)毒素一次性徹底去除，甚至經(jīng)過多個步驟后，最終仍達(dá)不到臨床試驗級的要求。
目前通常采用的去除生物制品中內(nèi)毒素的方法有TritonX-114霧點法和層析法。其中，霧點法可用于去除蛋白及質(zhì)粒中污染的內(nèi)毒素(Clement Bordier，JBiological Chemistry，2561604-07，1981；Aida Y&Pabst MJ，J Immunol Methods，132191-195，1990；Cotten M，Baker A，Sallik M等Gene Therapy，1239-46，1994)，然而這些文獻(xiàn)披露的方法在操作過程中需要轉(zhuǎn)換溫度，操作難于控制，且它們均未報導(dǎo)可去除內(nèi)毒素至何種水平。本發(fā)明者經(jīng)實驗后發(fā)覺此法只能將內(nèi)毒素降至10萬EU/mg(質(zhì)粒)左右。一些公司開發(fā)的質(zhì)粒純化試劑盒采用了有機(jī)溶劑離心分相法代替上述霧點溫度轉(zhuǎn)換分相離心法，即利用Triton X-114的兩性性能，采用能溶解TritonX-114(及其與內(nèi)毒素形成的復(fù)合物)但與水混合時不能互溶的有機(jī)溶劑，經(jīng)離心分相去除Triton X-114與內(nèi)毒素形成的復(fù)合物的方法。其內(nèi)毒素去除率略高，能使質(zhì)粒中內(nèi)毒素殘余量降低至1000EU/mg左右，但所得質(zhì)粒的濃度下降一倍以上，需要濃縮，而且所得超螺旋質(zhì)粒的含量明顯減少，變成二聚體、三聚體，這是人用生物制品所不允許的。本發(fā)明者應(yīng)用Qiagen提供的質(zhì)粒超純試劑盒進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素也只能去除到1000EU/mg左右。因此這類試劑盒采用的方法仍難達(dá)到臨床用核酸疫苗內(nèi)毒素含量小于100EU/mg的標(biāo)準(zhǔn)。
層析法可分為非特異性層析法和親和層析法。非特異性層析法雖然能去除質(zhì)粒中的內(nèi)毒素達(dá)到臨床級要求，但步驟較多，需要購買專用的填料和設(shè)備，生產(chǎn)成本高，同時因步驟過多導(dǎo)致質(zhì)粒回收得率降低，這類方法不是專門去除內(nèi)毒素的方法。
親和層析法是采用對內(nèi)毒素有選擇性結(jié)合能力的多粘菌素B(Polymyxin B，PMXB)親和凝膠填料使內(nèi)毒素結(jié)合在凝膠上，此法可去除蛋白制品中的內(nèi)毒素，且PMXB凝膠用后可用1％脫氧膽酸鈉再生而重復(fù)使用。然而，此PMXB凝膠填料用于去除質(zhì)粒中內(nèi)毒素的效果不是令人非常滿意而應(yīng)用不多。
多粘菌素B硫酸鹽，是一種從桿狀多粘細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出來的陽離子環(huán)狀多肽抗生素，其分子式為C55H96N16O13，其結(jié)構(gòu)式見附圖2，可見也具有兩性(親水性和親脂性)基團(tuán)。多粘菌素B是B1和B2突變體的混合物(其中占主導(dǎo)地位的是B1)，低于50mg/ml的多粘菌素B硫酸鹽水溶液澄清、色微黃。多粘菌素B硫酸鹽在有機(jī)溶液里是微溶的，在2-8℃可保存活性至少2個月，在室溫下可保存活性至少三星期，但在強(qiáng)酸溶液中迅速失活。多粘菌素B作用于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁脂多糖的脂質(zhì)A部分，多粘菌素B的氨基端能與脂質(zhì)A-kdo區(qū)的羧基端之間發(fā)生離子相互作用力、雙方巰基之間可產(chǎn)生疏水作用力，因而能選擇性結(jié)合內(nèi)毒素(脂多糖)，二者是一對一結(jié)合。根據(jù)ISP國際計量單位(1969年)，每毫克多粘菌素B硫酸鹽含8403個單位。
將多粘菌素B通過化學(xué)偶聯(lián)固定在凝膠上后可用于去除蛋白制品溶液中的內(nèi)毒素。Sigman和BioRad公司有相應(yīng)的多粘菌素B親和凝膠產(chǎn)品出售。Cotten M等人也試用了BioRad的多粘菌素B凝膠來去除質(zhì)粒污染的內(nèi)毒素，他們用TritonX-114霧點分相離心法或PMXB凝膠法去除內(nèi)毒素后的質(zhì)粒DNA成功轉(zhuǎn)染了細(xì)胞而沒有毒性，但他們沒有具體測定去除內(nèi)毒素到什么程度(Cotten M，Baker A，SallikM，et alGene Therapy，1239-46，1994)。據(jù)我們的常規(guī)質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗，只要去除內(nèi)毒素到1萬EU左右/mg(質(zhì)粒)對細(xì)胞就沒有毒性了。由于質(zhì)粒污染的內(nèi)毒素量很高，Sigman和BioRad公司并不推薦他們的多粘菌素B親和凝膠用于去除質(zhì)粒中污染的內(nèi)毒素。本發(fā)明者購買了Sigma的多粘菌素凝膠進(jìn)行柱層析，發(fā)覺最多可將質(zhì)粒中內(nèi)毒素含量降至1000EU/mg左右，而不能降到100EU/mg以下。而且這種凝膠層析法或混合法不可避免地會稀釋質(zhì)粒液，即使去除內(nèi)毒素達(dá)到要求，但至少要增加一濃縮步驟，這也會影響得率。目前北京卓冠科技公司生產(chǎn)了去內(nèi)毒素用瓊脂糖凝膠FF(共價偶聯(lián)了多粘菌素的瓊脂糖凝膠)，但是由于其吸附內(nèi)毒素量低于1萬/ml，而粗提質(zhì)粒中內(nèi)毒素的含量很高，故去除質(zhì)粒內(nèi)毒素效果不佳，達(dá)不到100EU/mg以下的要求。
在關(guān)于采用PMXB去除內(nèi)毒素的文獻(xiàn)中均提到PMXB凝膠層析法，未見采用PMXB進(jìn)行有機(jī)溶劑離心分相來去除內(nèi)毒素的報導(dǎo)或試劑盒。而且，至今尚未有PMXB與內(nèi)毒素結(jié)合形成的復(fù)合物更易溶于有機(jī)溶劑的報導(dǎo)。
為了解決上述技術(shù)問題，達(dá)到臨床級質(zhì)粒純化去除內(nèi)毒素到100EU/mg以下標(biāo)準(zhǔn)，急需獲得一種有效去除內(nèi)毒素且質(zhì)?；厥盏寐矢叩姆椒ā１景l(fā)明者根據(jù)已建立的Triton X-114有機(jī)溶劑離心分相法原理，利用本發(fā)明者對于PMXB與內(nèi)毒素結(jié)合形成的復(fù)合物更易溶于有機(jī)溶劑的發(fā)現(xiàn)創(chuàng)立了PMXB有機(jī)溶劑分相法，或先用分相離心去除質(zhì)粒液中的大部分內(nèi)毒素，再結(jié)合PMXB親和層析法去除殘余內(nèi)毒素；并利用本發(fā)明者對于PMXB和Triton X-114聯(lián)用能更有效去除內(nèi)毒素的發(fā)現(xiàn)，采用更簡單的Triton X-114聯(lián)合PMXB的有機(jī)溶劑分相法徹底去除內(nèi)毒素。同時，對于可與水分相的有機(jī)溶劑的選擇，本發(fā)明者也進(jìn)行了研究，分別嘗試了氯仿和無毒無害的肉豆蔻酸異丙酯、乙酸乙酯、二乙二醇單甲醚及苯甲酸芐酯等等，從中篩選到乙酸乙酯和苯甲酸芐酯，進(jìn)一步完善了本發(fā)明，使本發(fā)明方法可有效地應(yīng)用于核酸疫苗和基因治療用質(zhì)粒產(chǎn)品的生產(chǎn)制備和蛋白質(zhì)中內(nèi)毒素的去除，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明第一個目的是提供兩種去除初純質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)中內(nèi)毒素的方法。
本發(fā)明第二個目的是提供一種去除初純質(zhì)粒或蛋白質(zhì)中內(nèi)毒素的試劑盒。
發(fā)明概述本發(fā)明第一方面提供一種用PMXB去除初純質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)中內(nèi)毒素的方法，包括將質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)與PMXB，按質(zhì)粒與PMXB的重量比為1000∶100-800或蛋白質(zhì)與PMXB的重量比為1000∶2.5-30，于室溫下混合均勻形成混合液；加入有機(jī)溶劑混勻后分層，收集含有質(zhì)粒或蛋白質(zhì)的水相。
本發(fā)明第二方面提供一種PMXB和TritonX-114聯(lián)用去除初純質(zhì)粒或蛋白質(zhì)中內(nèi)毒素的方法，包括將質(zhì)粒與PMXB和TritonX-114液，按質(zhì)粒與PMXB的重量比為1000∶50-600、質(zhì)粒與Triton X-114液的重量體積比為1000μg∶20-400μl，或?qū)⒌鞍踪|(zhì)與PMXB和Triton X-114液，按蛋白質(zhì)與PMXB的重量比為1000∶1.5-20、蛋白質(zhì)與Triton X-114液的重量體積比為1000μg∶0.5-15μl，4-20℃下混合均勻形成混合液；加入有機(jī)溶劑混勻后分層，收集含有質(zhì)粒或蛋白質(zhì)的水相。
本發(fā)明提供的去除內(nèi)毒素的方法還包括用PMXB凝膠去除剩余內(nèi)毒素的PMXB凝膠法步驟，包括PMXB凝膠混合法和/或凝膠層析法。
本發(fā)明提供的有機(jī)溶劑選自氯仿、苯甲酸芐酯和乙酸乙酯。
本發(fā)明提供的混合液還含有最終濃度為0.1-1.0M的NaCl。
本發(fā)明第三方面提供的一種去除初純質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)中內(nèi)毒素的試劑盒，包括PMXB、TritonX-114及使用說明書。其中PMXB及TritonX-114為分置于多個獨立包裝的無內(nèi)毒素小管中的溶液，可為單獨用于去內(nèi)毒素的試劑盒，或為質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)純化全套試劑盒中的組成部分。
發(fā)明詳述本發(fā)明第一方面提供一種去除初純質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)中內(nèi)毒素的方法，包括以下步驟；將質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)液與PMXB溶液，按質(zhì)粒與PMXB的重量比為1000∶100-800，優(yōu)選1000∶350-450；或蛋白質(zhì)與PMXB的重量比為1000∶2.5-30，優(yōu)選1000∶5-15，混合均勻形成混合液，然后在混合液中加入有機(jī)溶劑，離心或靜置分層后獲得含有質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)的水相，和含有內(nèi)毒素的有機(jī)相。
本發(fā)明第二方面提供一種PMXB和TritonX-114聯(lián)用去除初純質(zhì)粒或蛋白質(zhì)中內(nèi)毒素的方法，包括將質(zhì)粒液與PMXB液和TritonX-114液，按質(zhì)粒與PMXB的重量比為1000∶50-600，優(yōu)選1000∶350-450，質(zhì)粒與Triton X-114液的重量體積比為1000μg∶20-400μl，優(yōu)選1000μg∶70-90μl混合均勻形成混合液；或?qū)⒌鞍踪|(zhì)液與PMXB液和Triton X-114液，按蛋白質(zhì)與PMXB的重量比為1000∶1.5-20，優(yōu)選1000∶4-10，蛋白質(zhì)與Triton X-114液的重量體積比為1000μg∶0.5-15μl，優(yōu)選1000μg∶4-10μl，混合均勻形成混合液；然后在混合液中加入有機(jī)溶劑，離心或靜置分層后獲得含有質(zhì)粒或蛋白質(zhì)的水相，和含有內(nèi)毒素的有機(jī)相。
術(shù)語“混合液”指質(zhì)粒或蛋白質(zhì)與具有去除內(nèi)毒素作用的試劑混合后形成的溶液，除含有質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)外，還含有PMXB或PMXB和TrintonX-114。
當(dāng)混合液中含有TrintonX-114時，與TritonX-114的混合在4-20℃，優(yōu)選4-10℃下進(jìn)行，Triton X-114可以和PMXB同時或先后與質(zhì)粒混合。優(yōu)選先將PMXB與質(zhì)粒混合，混合時間優(yōu)選20分鐘，再加入Triton X-114液，混合時間優(yōu)選15分鐘。
本發(fā)明還包括采用上述第一方面或第二方面的方法去除大部分內(nèi)毒素后，再聯(lián)合使用PMXB凝膠法進(jìn)一步去除內(nèi)毒素的方法，包括使用PMXB凝膠混合法和/或?qū)游龇ㄈコＳ鄡?nèi)毒素的步驟。其中，PMXB凝膠與質(zhì)粒的體積比可以為1-3∶1。所述PMXB凝膠可用1％膽酸鈉溶液再生、平衡后重復(fù)使用。
術(shù)語“初純質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)”是指從基因工程大腸桿菌提取的基本上已純化或部分純化但沒有去除內(nèi)毒素的質(zhì)粒或蛋白質(zhì)?？刹捎煤?.1-1.0M NaCl的純水、生理鹽水、濃度為0.01-0.15M、pH6.5-8.5的各種緩沖液如磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、Tris/HCl等進(jìn)行配制，其中NaCl濃度優(yōu)選0.3M。可將質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)配制成各種濃度，優(yōu)選1mg/ml以上濃度。
本發(fā)明中選用的PMXB，優(yōu)選其硫酸鹽溶液?？捎门c質(zhì)粒液相同或不同的含0.1-1.0M NaCl的純水、生理鹽水、濃度0.01-0.15M、pH6.5-8.5的各種緩沖液如磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、Tris/HCl等緩沖液進(jìn)行配制，可將PMXB配制成各種濃度，優(yōu)選5mg/ml濃度，緩沖液優(yōu)選含50-80％甘油，便于保存在零下20-25℃。
術(shù)語“有機(jī)溶劑”是任何與水混合但不能互溶，離心或靜置后可分離形成有機(jī)相和水相兩相的有機(jī)溶劑。本發(fā)明中有機(jī)溶劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，優(yōu)選氯仿、苯甲酸芐酯或乙酸乙酯，更優(yōu)選無毒性且不被懷疑有致癌作用的苯甲酸芐酯或乙酸乙酯。有機(jī)溶劑洗滌次數(shù)為1-5次，優(yōu)選3-4次，每次用量優(yōu)選約等于混合液體積。
本發(fā)明提供的去除初純質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)中內(nèi)毒素的方法可用于小量或規(guī)模化去除初純質(zhì)粒液或初純蛋白質(zhì)液中的內(nèi)毒素，或成為質(zhì)粒提取純化整個工藝中的一個組成部分。
本發(fā)明第三方面提供一種去除初純質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)中內(nèi)毒素的試劑盒，包括PMXB、TritonX-114及使用說明書，其中PMXB及TritonX-114為分置于一個或多個獨立包裝的無內(nèi)毒素小管中的溶液。該試劑盒可以是獨立的去內(nèi)毒素試劑盒，用于實驗室小量去除初純質(zhì)粒或蛋白質(zhì)中的內(nèi)毒素，或用于規(guī)?；コ跫冑|(zhì)粒中的內(nèi)毒素，也可成為質(zhì)粒或蛋白質(zhì)大規(guī)模純化全套試劑盒中的組成部分。
本發(fā)明提供的試劑盒中PMXB優(yōu)選其硫酸鹽，可用含0.1-1.0M NaCl的純水、生理鹽水、濃度0.01-0.15M、pH6.5-8.5的各種緩沖液如磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、Tris/HCl等緩沖液進(jìn)行配制，可配制成各種濃度，優(yōu)選5mg/ml濃度，其中NaCl濃度優(yōu)選0.3M。其中Triton X-114液優(yōu)選不稀釋的原液。其中有機(jī)溶劑為與水混合時不能互溶，離心或靜置后可分離形成有機(jī)相和水相二相的任何有機(jī)溶劑，優(yōu)選氯仿、苯甲酸芐酯或乙酸乙酯，更優(yōu)選氯仿或苯甲酸芐酯原液。
本發(fā)明的優(yōu)點是操作簡便快速、成本低，可將質(zhì)粒液或蛋白液中的內(nèi)毒素降低至10EU/mg以下，符合臨床用藥要求，而且不影響去除內(nèi)毒素后質(zhì)?；虻鞍滓旱臐舛取?br> 附圖的簡單說明圖1是內(nèi)毒素(脂多糖LPS)的分子結(jié)構(gòu)圖。
圖2是多粘菌素B的分子結(jié)構(gòu)圖。
圖3是有機(jī)溶劑離心分相法去內(nèi)毒素后質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖與具體實施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容，并對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但這些實施例絕非對本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實施中所作的任何變動都將屬于本發(fā)明權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
實驗材料和儀器初純質(zhì)粒HG43、PSW、PSA43和Ag85A重組蛋白質(zhì)液得自上海海規(guī)生物科技有限公司。
有機(jī)溶劑肉豆蔻酸異丙酯(isopropyl myristate)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、二乙二醇單甲醚(dietylene glycol monomethyl ether)、苯甲酸芐酯(benzyl benzoate)、氯仿(chloroform)，分析純，均購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。硫酸多粘菌素B(PMXB)和Triton-X-114購自Sigma(P1004和93428)，PMXB親和凝膠購自Sigma(P-1411)和北京卓冠生物技術(shù)公司。脫氧膽酸鈉購自Aldrich。
以下實施例中肉豆蔻酸異丙酯、乙酸乙酯、二乙二醇單甲醚、苯甲酸芐酯、氯仿和Triton X-114均以不稀釋的原液使用。硫酸多粘菌素B(PMXB)先用0.1M PBS緩沖液溶解，再加入甘油配制成濃度為5mg/ml、含80％甘油的溶液，保存于-20℃至-25℃冰箱中。
潔凈的(即無內(nèi)毒素的)1.5ml或2.0ml離心管(microtubes Clear)，200μl和1000μl吸嘴購自AXYGEN公司；一次性滅菌注射器和超純水或注射用生理鹽水購自上海醫(yī)藥公司。分液漏斗、旋轉(zhuǎn)瓶等玻璃器皿先用0.5M NaOH溶液浸泡24-48小時，大量蒸餾水洗滌后于250℃烘烤2小時除去內(nèi)毒素。
HS-3垂直混合儀和旋渦振蕩器購自寧波新芝公司，LXS-11B低速大容量離心機(jī)及TGL-16B小型臺式離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠，RE-52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海博通公司。鱟試劑及潔凈的玻璃小試管購自湛江安度斯生物有限公司，靈敏度為0.25EU/ml，按說明書操作采用膠凝法半定量測定質(zhì)粒液的內(nèi)毒素含量。
實施例1應(yīng)用鱟試劑膠凝半定量法測定質(zhì)粒液中的內(nèi)毒素含量1.鱟試劑靈敏度復(fù)核采用湛江安度斯公司生產(chǎn)的鱟試劑盒(靈敏度為0.25EU/ml)和內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(10EU/ml)，按廠家說明書進(jìn)行操作，復(fù)核結(jié)果見表1。
表1鱟試劑靈敏度復(fù)核

上述實驗結(jié)果說明所用鱟試劑的靈敏度與標(biāo)示值相符合，按標(biāo)示值使用。
2.質(zhì)粒樣品的系列稀釋和鱟試劑檢測所用器材均應(yīng)潔凈，如醫(yī)用注射用水、塑料吸頭、玻璃小管等另準(zhǔn)備好試管架和37℃水浴箱。
1)取20μl質(zhì)粒液加入到裝有780μl注射用水的第1號玻璃小管中(1∶40稀釋)，旋渦振蕩20分鐘，以使聚集成團(tuán)的內(nèi)毒素均勻分散；2)從第1號小管中取20μl液體加入到裝有980μl注射用水的第2號玻璃小管中(1∶2000稀釋)，旋渦振蕩1分鐘；3)從第2號小管中取20μl液體加入到裝有980μl注射用水的第3號玻璃小管中(1∶10萬稀釋)，旋渦振蕩1分鐘；4)從第3號小管中取20μl液體加入到裝有980μl注射用水的第4號玻璃小管中(1∶500萬稀釋)，旋渦振蕩1分鐘；或從第1號小管中取20μl液體至裝有180μl注射用水的第3號玻璃小管中稀釋10倍(1∶400稀釋)，旋渦振蕩1分鐘。如此可制備1∶4,000，1∶40,000等不同稀釋度的質(zhì)粒液；5)各小管保留100μl質(zhì)粒液，棄去其余液體，旋渦振蕩1分鐘。另設(shè)置陽性對照管和陰性對照(100μl潔凈水)管。各管加入100μl鱟試劑，混合5-10秒，37℃水浴靜置1小時。小心取出各官，將其倒置并觀察膠凝結(jié)果。
第一次倒置時管底有膠凝物不流下為陽性，若流下為陰性。陰性和陽性對照管均成立才記錄其它各管結(jié)果。本實驗中所用鱟試劑的靈敏度為0.25EU/ml，故最高稀釋度為陽性的稀釋液，將其稀釋度除以4即為該質(zhì)粒液殘留的內(nèi)毒素濃度(EU/ml)，再除以質(zhì)粒原液的濃度即為每mg質(zhì)粒中殘留的內(nèi)毒素含量(EU/mg(質(zhì)粒))。此試驗為半定量法，所得結(jié)果用每mg質(zhì)粒所含內(nèi)毒素大于、小于多少個EU表示，為近似值。
實施例2 Triton霧點離心分相法去除質(zhì)粒液中的內(nèi)毒素此實施例是重復(fù)文獻(xiàn)所述步驟操作(Cotten，Baker A，Sallik M等GeneTherapy，1239-46，1994)，目的是驗證該法去除內(nèi)毒素的效果。
取1ml濃度為1.2mg/ml的初純HG43質(zhì)粒液(用0.1M PBS緩沖液液配制)加至潔凈的離心小管中，在4-10℃下按1ml質(zhì)粒液∶20μl TritonX-114液的比例加入TritonX-114(不稀釋)。4-10℃混合15分鐘，然后移至35-37℃靜置5分鐘后混合液出現(xiàn)云霧樣混濁，在同一溫度的臺式離心機(jī)中13,000rpm離心5分鐘，小管底部有油狀液沉積(為TritonX-114與內(nèi)毒素形成的復(fù)合物)。小心吸取含質(zhì)粒的上層水相(不可觸及油狀液)，移至另一潔凈小管中，加入20μl TritonX-114，于4-10℃混合30分鐘，然后移至35-37℃靜置5分鐘后混合液出現(xiàn)云霧樣混濁，在同一溫度的臺式離心機(jī)中13,000rpm離心5分鐘。小心吸取上層水相移至另一潔凈小管中。如此重復(fù)3次，隨后用鱟試劑測定質(zhì)粒液中殘留內(nèi)毒素量，測定結(jié)果見表2。
表2 Triton霧點離心分相法去除內(nèi)毒素

質(zhì)粒液濃度去內(nèi)毒素前為1.2mg/ml，去內(nèi)毒素后為1.15mg/ml。質(zhì)粒液殘留內(nèi)毒素含量約為10-20萬EU/mg。按1ml質(zhì)粒液∶40或60μl TritonX-114液的二種比例重復(fù)此實驗，殘留內(nèi)毒素含量仍在10-20萬EU/mg，表明用量加大效果仍如此。此實施例表明應(yīng)用Triton X-114霧點法可去除質(zhì)粒污染內(nèi)毒素至10萬EU/mg左右。
實施例3有機(jī)溶劑離心分相法去除質(zhì)粒液中內(nèi)毒素的基本步驟1.試劑的選用1)初純質(zhì)粒液可用純水、生理鹽水、濃度0.01-0.15M、pH6.5-8.5的各種緩沖液如磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、Tris-HCl等緩沖液配制。
2)PMXB可用與質(zhì)粒液相同或不相同的溶液配成5mg/ml或1-50mg/ml濃度，一般加入50-80％的甘油，以便在負(fù)20-25℃長期保存活性且使用方便。由于高濃度時用量少不易精確，低濃度時會帶入水份導(dǎo)致稀釋質(zhì)粒液，故常用5mg/ml濃度。
3)TritonX-114的原液較粘稠，可用與質(zhì)粒液相同或不相同的溶液作1∶1、1∶2或1∶3稀釋。但其稀釋液用量應(yīng)相應(yīng)增加，雖稀釋液不粘稠，使用較方便，然而會稀釋質(zhì)粒液，故仍常用其原液。由于TritonX-114在4-20℃時水溶性好，利于結(jié)合內(nèi)毒素，因此使用時需在4-20℃環(huán)境下。
4)各有機(jī)溶劑采用不稀釋的原液。
2.步驟1)取濃度為1mg/ml以上的初純質(zhì)粒液加至2ml潔凈的離心小管中；加入PMXB和/或TritonX-114液；
2)在4-20℃或室溫下，于垂直混合器中緩慢混合20-35分鐘，或混合20分鐘后再置4-20℃混合15分鐘；隨后加入大約等體積的有機(jī)溶劑混合2分鐘，于臺式離心機(jī)中10,000--13,000rpm離心3-4分鐘。離心后兩相之間形成的一層薄膜，此膜為PMXB和/或TritonX-114與內(nèi)毒素形成的復(fù)合物；3)小心吸取含質(zhì)粒的水相(不可觸及薄膜)并移至另一潔凈小管中，再加入等體積有機(jī)溶液，按步驟2)所述混合后離心(此步簡稱為用有機(jī)溶劑洗去內(nèi)毒素)；4)如此重復(fù)洗滌3-4次，隨后取質(zhì)粒液樣品測定體積，按常規(guī)用紫外分光光度計測OD260值計算質(zhì)粒液濃度，由凝膠電泳觀察純度和用鱟試劑測定殘留內(nèi)毒素量。
實施例4 TritonX-114有機(jī)溶液離心分相法去除質(zhì)粒液中的內(nèi)毒素此法已為許多商品化質(zhì)粒純化試劑盒所采用。這里主要是驗證其去除內(nèi)毒素能到何種水平，并作為本發(fā)明的對照。
各取1ml濃度1.2mg/ml的PSW初純質(zhì)粒液(內(nèi)毒素含量大于500萬EU/mg)，加至3個潔凈的離心小管中，按1mg質(zhì)?！?0μl、120μl或200μl TritonX-114的比例分別加入TritonX-114；有機(jī)溶劑采用氯仿，洗滌3次；按實施例3所述步驟操作。結(jié)果見表3。
表3 TritonX-114有機(jī)溶液離心分相法去除內(nèi)毒素

本實施例中Triton X-114僅使用1次，實施例2中使用3次。結(jié)果表明，TritonX-114的用量為80μl時，去除內(nèi)毒素效果較差；為120μl時，內(nèi)毒素含量降至2.5-5萬EU/ml；為200μl時，內(nèi)毒素含量降至1-2.5萬EU/ml；為350μl時，效果與200μl時的相似。本發(fā)明者重復(fù)此實驗幾十次，證實該法可將內(nèi)毒素降至10,000EU/mg左右，此類質(zhì)粒已可用于要求不太高的動物實驗、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等。
實施例5 PMXB有機(jī)溶液離心分相法去除質(zhì)粒液中的內(nèi)毒素各取1ml濃度為1.32mg/ml的PSA43質(zhì)粒液(內(nèi)毒素含量大于500萬EU/mg)，加至3個潔凈的2ml小管中，按質(zhì)粒量∶PMXB(5mg/ml)體積比為1000∶80或60或40的比例；有機(jī)溶劑采用氯仿，洗滌3次；如實施例3所述步驟操作。結(jié)果見表4。
表4 PMXB有機(jī)溶液離心分相法去除內(nèi)毒素

結(jié)果顯示，PMXB用量高，去內(nèi)毒素后質(zhì)粒濃度降低較多、回收率損失較大，但去除內(nèi)毒素的效果較好。當(dāng)此比例為1000∶80時，內(nèi)毒素降低至500-1,000 Eu/mg。當(dāng)PMXB用量降低時，去除內(nèi)毒素的效果降低。本發(fā)明者在上百次試驗中觀察到，即使加大PMXB用量至質(zhì)粒對PMXB的比例1000∶120時，內(nèi)毒素仍只能降低至500-1,000Eu/mg。
實施例6 加鹽對降低PMXB去除內(nèi)毒素時質(zhì)粒損失的影響取0.95mg/ml PSA43質(zhì)粒液(內(nèi)毒素含量大于500萬EU/ml)，在該質(zhì)粒液中加入NaCl至如下表5所示濃度，采用每mg質(zhì)?！?0μl PMXB的比例；用氯仿洗滌3次去除內(nèi)毒素；按實施例3所述步驟操作。結(jié)果見表5。
表5 加鹽對降低PMXB去除內(nèi)毒素時質(zhì)粒損失的影響

結(jié)果顯示，PMXB可能會結(jié)合一些質(zhì)粒將其去除，NaCl的加入對去除內(nèi)毒素效果沒有影響，且一定濃度的NaCl可以有效避免質(zhì)粒的損失，但并不是鹽濃度越高效果越好。根據(jù)上述結(jié)果，當(dāng)NaCl濃度為0.5M時，質(zhì)?；厥章侍岣咧?2％左右；當(dāng)NaCl濃度為1.0M時，回收率不再提高。經(jīng)多次試驗后，本發(fā)明者摸索到，采用2％(約0.3M)的NaCl較適當(dāng)，回收率可保持在90％以上，故以下實施例中的質(zhì)粒液均用含2％NaCl、pH 8.0的PBS緩沖液配制。此法去除內(nèi)毒素效果達(dá)到99％以上，內(nèi)毒素可降至500-1000EU/mg，但離人用疫苗100EU/mg以下的標(biāo)準(zhǔn)尚有距離。
實施例7 PMXB和TritonX-114聯(lián)用離心分相法去除質(zhì)粒液中的內(nèi)毒素上述實施例結(jié)果表明，單獨使用PMXB或TritonX-114進(jìn)行有機(jī)溶劑離心分相，內(nèi)毒素含量無法降至100EU/mg以下。因此本發(fā)明者將二者聯(lián)用，檢測其效果。
各取1ml濃度為1.28mg/ml的初純HG43質(zhì)粒液(含0.3M NaCl)，加至6個潔凈的2ml離心管中；先加不同量(如下表6所示)的PMXB(5mg/ml)垂直混合20分鐘后，再加不同量(如下表6所示)的TritonX-114混合15分鐘，于4-10℃靜置15分鐘，然后用氯仿洗滌3次；按實施例3所述步驟操作。結(jié)果見表6。
表6 PMXB和TritonX-114聯(lián)用離心分相法去除內(nèi)毒素

結(jié)果顯示，PMXB和TritonX-114聯(lián)用，在適當(dāng)?shù)挠昧亢捅壤?，?nèi)毒素可降至100EU/mg以下，甚至10EU/mg以下。本發(fā)明者重復(fù)此試驗幾十次，只要PMXB和Triton X-114的用量足夠、比例適當(dāng)，都可以達(dá)到此結(jié)果，可見此方法重復(fù)性非常好。經(jīng)幾十次試驗確定，質(zhì)粒量與加入的PMXB(5mg/ml)或TritonX-114(原液)體積比例是質(zhì)粒1000μg∶PMXB或TritonX-114各70-100μl為佳(質(zhì)粒與PMXB的質(zhì)量比＝1000μg質(zhì)粒∶350-450μgPMXB)，內(nèi)毒素可降至100EU/mg以下，甚至10EU/mg以下。如果某些初純質(zhì)粒污染的內(nèi)毒素極高(如7000萬EU/mg以上)時，若此用量還不能去除干凈，可再用此劑量的1/5-1/4量重復(fù)上述去內(nèi)毒素操作一次，仍可使內(nèi)毒素降低至10EU/mg以下。
實施例8 PMXB和TritonX-114聯(lián)用的順序?qū)Ψ窒嚯x心法去除內(nèi)毒素的影響各取1ml濃度為1.5mg/ml的初純HG43質(zhì)粒液(含0.3M NaCl)，加至3個潔凈的2ml離心管中，第1管先加105μl PMXB、第2管先加105μl Triton X-114，垂直混合20分鐘后，第1管再加入105μl Triton X-114、第二管再加入105μl PMXB，再次混合20分鐘，共1小時。第3管同時各加105μl PMXB和Triton X-114，混合40分鐘。然后用氯仿洗滌3次。按實施例3所述步驟操作。結(jié)果見表7。
表7 PMXB和TritonX-114聯(lián)用的順序?qū)Ψ窒嚯x心法去除內(nèi)毒素的影響

結(jié)果表明，PMXB和TritonX-114同時加入時效果略差，而二者分別先后加入效果相似，因此以下實施例均按實施例7所述步驟操作。
實施例7、8的結(jié)果分析不想受現(xiàn)有理論的束縛，本發(fā)明者推測PMXB和Triton X-114聯(lián)用取得如此優(yōu)良的效果可能是如下原因。
1.內(nèi)毒素(LPS)本身不是一種非常均一的分子，而且在細(xì)胞裂解時有些LPS分子可能碎裂成較小片段。而PMXB和Triton X-114各自與LPS選擇性結(jié)合的基團(tuán)有所不同。細(xì)胞裂解產(chǎn)生的大部分LPS可與PMXB和Triton X-114二者同時結(jié)合，但可能一小部分LPS片段(根據(jù)實施例5-6約占內(nèi)毒素的萬分之一)不能結(jié)合PMXB，而另一小部分LPS片段(根據(jù)實施例4約占內(nèi)毒素的千分之一)不能結(jié)合Triton X-114。故單用PMXB或Triton X-114都有不能完全去除干凈質(zhì)粒中的內(nèi)毒素，只有二者聯(lián)用才能達(dá)到此目的。
2.內(nèi)毒素分子中雖也有疏水基團(tuán)，但通常內(nèi)毒素分子聚集成團(tuán)，其疏水基團(tuán)包在內(nèi)部，表面為親水基團(tuán)，故內(nèi)毒素分子溶于水而不溶于有機(jī)溶劑。PMXB或/和Triton X-114與LPS緊密結(jié)合后可能使成團(tuán)的LPS內(nèi)部疏水部分暴露，產(chǎn)生的二重或三重復(fù)合物疏水性大大增強(qiáng)而易溶于有機(jī)溶劑中，因而可用不與水混溶的有機(jī)溶劑將此種復(fù)合物分相除去。
3.PMXB或Triton X-114先后加入質(zhì)粒液中時，先加的先與內(nèi)毒素結(jié)合，后加的可能與形成的復(fù)合物再結(jié)合，最后形成三重復(fù)合物。而二者同時加入質(zhì)粒液中時，可能有一部分PMXB和Triton X-114先互相發(fā)生結(jié)合而不能再與內(nèi)毒素結(jié)合。因此同時加入PMXB和Triton X-114去除內(nèi)毒素效果較差。
實施例9 無毒無害有機(jī)溶劑的選擇上述實施例中洗滌用有機(jī)溶劑均采用氯仿，且取得了很好效果，但氯仿被懷疑有致癌作用，因此生物制品制備工藝中應(yīng)盡量避免使用。為此本發(fā)明者選擇了幾種文獻(xiàn)顯示不會與水混溶且安全無毒性無害的有機(jī)溶劑肉豆蔻酸異丙酯、乙酸乙酯、二乙二醇單甲醚、苯甲酸芐酯，并從中進(jìn)行篩選。篩選的原理是利用TritonX-114的水溶液中OD260與OD280測定值都很高，若有機(jī)溶劑能洗滌去除TritonX-114則水相OD260與OD280測定值將降低，若不能去除則測定值保持高水平。
先配制含有10％TritonX-114的PBS緩沖液，每只離心小管中各裝1ml，分別加入等體積的上述4種有機(jī)溶劑，以氯仿作對照?；旌?分鐘，13,000rpm離心3-4分鐘，分別取水相和有機(jī)相測D260與OD280值。結(jié)果見表8。
表8無毒無害有機(jī)溶劑的選擇結(jié)果

結(jié)果表明，苯甲酸芐酯和乙酸乙酯類似氯仿，可洗滌去除Triton X-114，但效果較氯仿略差。而肉豆蔻酸異丙酯和二乙二醇單甲醚達(dá)不到氯仿的效果。因此選擇苯甲酸芐酯和乙酸乙酯進(jìn)行以下實施例。
實施例10 苯甲酸芐酯和乙酸乙酯分相法去除質(zhì)粒中的內(nèi)毒素1.單獨使用PMXB或TritonX-114分別單獨使用PMXB或TritonX-114去除質(zhì)粒液中的內(nèi)毒素，有機(jī)溶劑采用苯甲酸芐酯或乙酸乙酯洗滌4次，以氯仿洗滌三次作對照，按實施例3所述步驟操作。結(jié)果見表9。
表9單獨使用PMXB或TritonX-11結(jié)合苯甲酸芐酯和乙酸乙酯分相法去除內(nèi)毒素

結(jié)果表明，單獨使用PMXB或TritonX-114結(jié)合苯甲酸芐酯或乙酸乙酯洗滌都能去除質(zhì)粒中的90％以上的內(nèi)毒素，使其殘留量降至1-2.5萬，但無法降至100EU/mg以下，而PMXB加氯仿可降低至1000EU/mg左右。苯甲酸芐酯或乙酸乙酯的溶劑強(qiáng)度比氯仿略差，需洗滌4次(氯仿洗滌三次)。根據(jù)實施例7所得結(jié)果，PMXB和Triton X-114聯(lián)用效果好，因此本發(fā)明者再次將二者聯(lián)用試驗。
2.PMXB和TritonX-114聯(lián)用各取1ml濃度為1.5mg/ml的初純HG43質(zhì)粒液，加至2個潔凈2ml離心管和一支醫(yī)用一次性注射器(5ml，下端出口用封端堵住，用于下步乙酸乙酯洗滌)中，各管先加105μl PMXB，垂直混合20分鐘后再加入105μl TritonX-114，4-10℃再混合15分鐘，以三種有機(jī)溶劑洗滌，按實施例3操作，用乙酸乙酯洗滌時注射器不離心而是垂直靜置分相分層，每次洗滌將含質(zhì)粒的下層水相從下部出口放到另一干凈注射器中。結(jié)果見表10。
表10 PMXB和TritonX-114聯(lián)用結(jié)合苯甲酸芐酯和乙酸乙酯分相法去除質(zhì)粒污染的內(nèi)毒素

結(jié)果表明，當(dāng)PMXB和Triton X-114聯(lián)用時，苯甲酸芐酯或乙酸乙酯與氯仿一樣可有效去除質(zhì)粒污染的內(nèi)毒素，只是洗滌增加一次而已。
實驗過程中苯甲酸芐酯和氯仿比水重，離心分相后有機(jī)相位于下部，第1、2次洗滌時兩相界面形成復(fù)合物薄膜，第3、4次洗滌時此薄膜逐漸消失，表明已逐漸去除。第1次洗滌，苯甲酸芐酯形成的水相較混濁，而氯仿形成的水相澄清。洗滌第2次時苯甲酸芐酯形成的水相已澄清。乙酸乙酯比水輕，不用離心而是靜置幾分鐘自行分相，形成的水相位于下部，兩相界面無薄膜，下部水相含質(zhì)粒。去除內(nèi)毒素的質(zhì)粒液濃度不降低反而略升高但體積也相應(yīng)略減少，可能因這二種有機(jī)溶劑能吸附少量水而致。
有機(jī)溶劑離心分相法去內(nèi)毒素后質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3。其中，泳道1是去內(nèi)毒素前的質(zhì)粒；泳道2是去內(nèi)毒素后的質(zhì)粒，其中有機(jī)溶劑為氯仿；泳道3是去內(nèi)毒素后的質(zhì)粒，其中有機(jī)溶劑為苯甲酸芐酯；泳道4是去內(nèi)毒素后的質(zhì)粒，其中有機(jī)溶劑為乙酸乙酯；采用氯仿、苯甲酸芐酯和乙酸乙酯所獲得的去除內(nèi)毒素的質(zhì)粒與去內(nèi)毒素前相比，電泳圖相似，超螺旋質(zhì)粒條帶無顯著變化，也無二聚體或多聚體條帶形成。
上述結(jié)果表明，聯(lián)用PMXB和TritonX-114及無毒的苯甲酸芐酯或乙酸乙酯可去除質(zhì)粒污染的內(nèi)毒素至10EU/mg以下，達(dá)到了臨床人用標(biāo)準(zhǔn)。此實施例是小量去除內(nèi)毒素，可配備相應(yīng)的潔凈離心小管(乙酸乙酯比水輕應(yīng)配備無菌注射器那樣有下部出口加封帽的小管，不用離心)，用于實驗室小規(guī)模純化質(zhì)粒的內(nèi)毒素去除，相對而言，采用比水重的苯甲酸芐酯作為有機(jī)溶劑更適合此用途。
實施例11 規(guī)?；郊姿崞S酯或乙酸乙酯分相法去除質(zhì)粒污染的內(nèi)毒素1.苯甲酸芐酯分相取200ml濃度為1.64mg/ml的初純HG43質(zhì)粒液(共含質(zhì)粒328mg)平均分裝至8個潔凈50ml離心管中，每管25ml。各管先加入2900μl PMXB(5mg/ml)(88μlPMXB/mg質(zhì)粒)，室溫(8-10℃)、10rpm轉(zhuǎn)速垂直緩慢混合20分鐘，再各加入2900μlTritonX-114，混合15分鐘。隨后用LXS-11B低速大容量離心機(jī)室溫3,000rpm離心5分鐘。分別吸取上部含質(zhì)粒的水相，轉(zhuǎn)移到新的潔凈離心管中，加入25ml苯甲酸芐酯混合5分鐘。室溫3,000rpm離心5分鐘，吸取上部水相轉(zhuǎn)移到新的潔凈離心管中。按此步驟，用苯甲酸芐酯洗滌4次。
合并各管上部水相得175ml質(zhì)粒液，經(jīng)測定其濃度為1.70mg/ml(總量297.5mg，回收率91％)、內(nèi)毒素含量＜10EU/mg。其中回收率達(dá)不到100％的原因主要是在每次吸取水相質(zhì)粒液時，為避免觸及二相之間的內(nèi)毒素復(fù)合物而舍棄部分質(zhì)粒液。
2.乙酸乙酯分相乙酸乙酯比水輕，故采用經(jīng)250℃烘烤2小時去除內(nèi)毒素的玻璃圓形分液漏斗8個(500ml)和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的圓形旋轉(zhuǎn)瓶(1000ml)。將300ml濃度為1.47mg/ml的初純HG43質(zhì)粒液(共含質(zhì)粒441mg)加入旋轉(zhuǎn)瓶中，再加入3528μl PMXB(5mg/ml)(80μl PMXB/mg質(zhì)粒)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀25-28℃水浴中以10rpm轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)混合20分鐘，再加入3258μl TritonX-114，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水浴中加入冰塊，使水溫降至8-10℃，同速旋轉(zhuǎn)混合15分鐘。加入300ml乙酸乙酯混合5分鐘。將混合液倒入二個分液漏斗中，靜置5分鐘即分層。將二個分液漏斗中含質(zhì)粒的下層水相從下部出口放到另二個干凈的分液漏斗中，再各加入乙酸乙酯150ml混合5分鐘，靜置5分鐘，隨后將下層水相放入另一干凈漏斗中。如此用乙酸乙酯重復(fù)洗滌4次后，合并水相，測其體積、濃度和內(nèi)毒素。
結(jié)果顯示，體積為250ml，濃度為1.65mg/ml(總量412mg，回收率93.5％)，內(nèi)毒素含量＜10EU/mg。乙酸乙酯價格是苯甲酸芐酯的1/4，此例表明乙酸乙酯特別適合規(guī)?；コ齼?nèi)毒素。
以上實施例結(jié)果表明，本發(fā)明者已成功建立去除質(zhì)粒污染內(nèi)毒素達(dá)到臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的有效方法，即聯(lián)用PMXB和TritonX-114二種內(nèi)毒素結(jié)合試劑，并采用安全無毒性無害的有機(jī)溶劑苯甲酸芐酯或乙酸乙酯進(jìn)行分相法。此法簡便快速，耗時1小時左右，所用材料價格低，適合規(guī)?；a(chǎn)。
實施例12 分相法與PMXB凝膠法聯(lián)用去除質(zhì)粒污染的內(nèi)毒素去內(nèi)毒素FF凝膠(北京卓冠生物公司，1.5cm×68cm)的再生用100ml 1％脫氧膽酸鈉液再生此凝膠，再用潔凈的pH7.5、0.1M PBS緩沖液100ml充分洗滌使之平衡。
1.凝膠質(zhì)粒液混合法去除內(nèi)毒素取20ml再生的去內(nèi)毒素FF凝膠置于潔凈玻璃三角瓶中，沉降后吸棄上層液體。加入20ml濃度為1.35mg/ml的HG43質(zhì)粒液，室溫?fù)u動48小時(卓冠公司推薦方法)。沉降后吸取上層質(zhì)粒液，下部凝膠移入潔凈大離心管，3,000rpm離心10分鐘，吸取壓積后擠出的液體與以上質(zhì)粒液合并，共25ml。
結(jié)果顯示，質(zhì)粒濃度為0.75mg/ml，內(nèi)毒素含量為5000-10000EU/mg。表明利用此法去除內(nèi)毒素效果不佳。
2.凝膠層析法去除質(zhì)粒內(nèi)毒素準(zhǔn)備玻璃層析柱和蠕動泵管道系統(tǒng)，用300ml 0.5M NaOH液循環(huán)洗滌過夜，再用2000ml超純水洗滌整個系統(tǒng)去除NaOH。填裝20ml再生后的FF膠，加入20ml1.35mg/ml的HG43質(zhì)粒液，室溫循環(huán)吸附8小時(卓冠公司推薦方法)，收集流出的質(zhì)粒液，其中當(dāng)柱頂液體幾乎流干時再加入10ml PBS使柱內(nèi)質(zhì)粒液盡量流出。共收集得28.5ml質(zhì)粒液。
結(jié)果顯示，質(zhì)粒濃度為0.62mg/ml，內(nèi)毒素含量為5000-1000EU/mg。本發(fā)明者另用Sigma的PMXB凝膠產(chǎn)品重復(fù)此實施方式，內(nèi)毒素最低降至1000-2000EU/mg。表明此法不能有效去除質(zhì)粒污染的內(nèi)毒素。
3.分相法與PMXB凝膠混合法聯(lián)用去除內(nèi)毒素取HG43質(zhì)粒液先用PMXB和/或Triton X-114加氯仿離心分相法去除大部分內(nèi)毒素后(是本發(fā)明者早期摸索PMXB和Triton X-114聯(lián)用時由于用量不足而使內(nèi)毒素去除不夠的質(zhì)粒液)，再將此質(zhì)粒液與FF膠按1∶1、1∶2或1∶3的體積比混合搖動4小時，取質(zhì)粒液樣品測濃度和內(nèi)毒素含量。結(jié)果見表11。
表11分相法與PMXB凝膠混合法聯(lián)用去除內(nèi)毒素

其中，*先用Triton X-114加氯仿離心分相法去除大部分內(nèi)毒素；**先用PMXB加氯仿離心分相法去除大部分內(nèi)毒素；***先用PMXB和Triton X-114加氯仿離心分相法去除大部分內(nèi)毒素。
4.分相法與PMXB凝膠層析法聯(lián)用去除內(nèi)毒素取HG43質(zhì)粒液，先用PMXB和/或Triton X-114加氯仿離心分相法去除大部分內(nèi)毒素后，得到60ml濃度為1.39mg/ml的質(zhì)粒液(內(nèi)毒素含量為1-2萬EU/mg)。同時取120ml再生后去內(nèi)毒素FF凝膠裝柱，經(jīng)pH7.5含2％NaCl的0.05M PB緩沖液平衡后，加入上述質(zhì)粒液，蠕動泵流速1ml/分。待質(zhì)粒液基本全進(jìn)入柱內(nèi)后，關(guān)閉層析柱下出口30分鐘，讓內(nèi)毒素與柱上的PMXB充分結(jié)合。然后從下出口原流速分管收集流出的質(zhì)粒液，測定各管質(zhì)粒濃度和內(nèi)毒素含量。結(jié)果見表12。
表12分相法與PMXB凝膠層析法聯(lián)用去除內(nèi)毒素

結(jié)果表明，去內(nèi)毒素后質(zhì)粒液濃度0.622mg/ml(共74.72mg)，內(nèi)毒素含量10-100EU/mg；回收率89.6％。PMXB凝膠的內(nèi)毒素吸附量不高(卓冠公司說明其內(nèi)毒素負(fù)載量為5,000-7,000EU/ml)，單用此凝膠難以去除質(zhì)粒液中高污染的內(nèi)毒素，需要先用離心分相法去除內(nèi)毒素降至1萬EU/mg左右，再用PMXB凝膠，可有效去除質(zhì)粒污染的內(nèi)毒素；雖然先單用PMXB分相可將內(nèi)毒素含量降至1000EU/mg左右，但再采用PMXB凝膠卻達(dá)不到所需效果(見表11的**)；而采用分相法，即聯(lián)用PMXB和Triton X-114分相法之后再用親和凝膠(見表11的***)，內(nèi)毒素可降至100EU/mg以下。這與實施例7-8的結(jié)果分析相一致，即有很少的一小部分內(nèi)毒素碎片不能與PMXB結(jié)合因而二步都采用PMXB時不能將其去除。
單用PMXB凝膠混合或?qū)游龇?，或與上述分相法聯(lián)合應(yīng)用PMXB凝膠混合或?qū)游龇ㄈコ齼?nèi)毒素的另一缺點是由于在使用過程中凝膠約含一半水份導(dǎo)致質(zhì)粒液濃度被稀釋，當(dāng)需要較高濃度質(zhì)粒產(chǎn)品時需要增加濃縮步驟，因此會減少回收率。但規(guī)?；苽渑R床用質(zhì)粒時，考慮將PMXB凝膠層析步驟放在后面也可能有其好處，因先用的分相法所得質(zhì)粒液中可能殘留有PMXB和/或Triton X-114，因此通常需要再使用分子篩凝膠(一般采用Sepharose CL-4BB或6B)將其除去。而PMXB凝膠大都用Sepharose CL-4B制成，其對內(nèi)毒素而言是親和吸附，對不能吸附的質(zhì)粒而言則起著分子篩作用可去除分子量比質(zhì)粒小得多的有機(jī)分子、蛋白等殘留雜質(zhì)。當(dāng)然PMXB凝膠的成本比普通分子篩凝膠高，這需要綜合考慮。
實施例13 離心分相法去除蛋白質(zhì)污染的內(nèi)毒素大規(guī)模制備蛋白產(chǎn)品時一般無專門設(shè)置去除內(nèi)毒素的步驟，但實驗室小量制備時一般需要去除其中的內(nèi)毒素，以利于細(xì)胞培養(yǎng)、動物實驗等用途。考慮本發(fā)明的PMXB或PMXB聯(lián)用Triton X-114離心分相法簡便快速，適合于這種實驗室小量制備蛋白質(zhì)，為此進(jìn)行了此實施例。
取實驗室制備的大腸桿菌表達(dá)的初純結(jié)核桿菌保護(hù)性抗原Ag85A蛋白液(2.06mg/ml，內(nèi)毒素含量5,000-10,000EU/ml)各1ml，置于潔凈離心小管中。根據(jù)蛋白質(zhì)量分別加入不同量的PMXB(5mg/ml)或PMXB(5mg/ml)和Triton X-114，其中有機(jī)溶劑采用苯甲酸芐酯，按實施例3所述步驟操作，獲得去除內(nèi)毒素的Ag85A蛋白液。用BioRad蛋白定量試劑盒按說明書步驟測定所得蛋白濃度，用鱟試劑測其內(nèi)毒素殘留量。結(jié)果見表13。
表13離心分相法去除蛋白質(zhì)污染的內(nèi)毒素

結(jié)果表明，本發(fā)明單用PMXB或PMXB與TritonX-114聯(lián)用，經(jīng)離心分相能有效去除蛋白質(zhì)中污染的內(nèi)毒素。我們重復(fù)此實施例多次得出以下用量單用PMXB時，蛋白質(zhì)與PMXB的重量比為1000∶2.5-30，優(yōu)選1000∶5-15。PMXB與Triton X-114聯(lián)用時，蛋白質(zhì)與PMXB的重量比為1000∶1.5-20，優(yōu)選1000∶4-10μl，蛋白質(zhì)與Triton X-114液的重量體積比為1000μg∶0.5-15μl，優(yōu)選1000μg∶4-10μl。如背景資料所述蛋白質(zhì)中內(nèi)毒素含量不高，一般為1萬EU/mg左右，因此單用PMXB已足夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)中的內(nèi)毒素去除到所需水平。按實施例7-8結(jié)果分析所述，無法與PMXB結(jié)合的內(nèi)毒素片段一般只占萬分之一左右，即使不能去除也僅僅殘留1EU/mg左右。故該PMXB離心分相法適合于實驗室小量蛋白質(zhì)去除污染的內(nèi)毒素。
權(quán)利要求
1.一種用PMXB去除初純質(zhì)粒或蛋白質(zhì)中內(nèi)毒素的方法，包括以下步驟將質(zhì)粒或蛋白質(zhì)與PMXB，按質(zhì)粒與PMXB的重量比為1000∶100-800或蛋白質(zhì)與PMXB的重量比為1000∶2.5-30，于室溫下混合均勻形成混合液；加入有機(jī)溶劑混勻后分層，收集含質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)的水相。
2.一種PMXB和Triton X-114聯(lián)用去除初純質(zhì)粒或蛋白質(zhì)中內(nèi)毒素的方法，包括以下步驟將質(zhì)粒與PMXB和TritonX-114液，按質(zhì)粒與PMXB的重量比為1000∶50-600、質(zhì)粒與Triton X-114液的重量體積比為1000μg∶20-400μl，于4-20℃下混合均勻形成混合液；或?qū)⒌鞍踪|(zhì)與PMXB和TritonX-114液，按蛋白質(zhì)與PMXB的重量比為1000∶1.5-20、蛋白質(zhì)與Triton X-114液的重量體積比為1000μg∶0.5-15μl，于4-20℃下混合均勻形成混合液；加入有機(jī)溶劑混勻后分層，收集含質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)的水相。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，還包括用PMXB凝膠去除剩余內(nèi)毒素的PMXB凝膠法步驟。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述PMXB凝膠法包括凝膠混合法和/或凝膠層析法。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑選自氯仿、苯甲酸芐酯和乙酸乙酯。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述PMXB選用5mg/ml濃度，所述TrintonX-114液采用不稀釋的原液。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述混合液還包括終濃度為0.1-1.0M的NaCl。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述NaCl終濃度為0.3M。
9.一種去除初純質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)中內(nèi)毒素的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括PMXB及使用說明書。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中還包括TritonX-114。
11.如權(quán)利要求9或10所述的試劑盒，其中所述PMXB及TritonX-114為分置于多個獨立包裝的無內(nèi)毒素小管中的溶液；所述試劑盒為獨立的去內(nèi)毒素試劑盒，或為質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)純化全套試劑盒中的組成部分。
全文摘要
本發(fā)明者建立了一種去除初純質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)中內(nèi)毒素的方法包括單獨應(yīng)用PMXB，或聯(lián)用PMXB和TritonX－114，加有機(jī)溶劑混合后進(jìn)行分相；或先應(yīng)用PMXB和TritonX－114加有機(jī)溶劑進(jìn)行分相，再與PMXB凝膠混合法和/或PMXB凝膠層析法相結(jié)合的方法去除質(zhì)?；虻鞍踪|(zhì)中的內(nèi)毒素。本發(fā)明操作簡便快速、成本低，可將質(zhì)粒液或蛋白液中的內(nèi)毒素量降低至10EU/mg以下，符合臨床用藥標(biāo)準(zhǔn)，而且不影響去除內(nèi)毒素后質(zhì)?；虻鞍滓旱臐舛?。
文檔編號C07K1/00GK101091797SQ200610028088
公開日2007年12月26日 申請日期2006年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月23日
發(fā)明者劉慶良 申請人:上海海規(guī)生物科技有限公司, 劉慶良