一種生物制品的內(nèi)毒素去除方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種生物制品的內(nèi)毒素去除方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)毒素是脂多糖（LPS)，來自革蘭陰性菌的外膜，其結(jié)構(gòu)包含3個區(qū)域，即類脂A 區(qū)、核心多糖區(qū)和特異性多糖區(qū)，是熱原的一種。極微量的內(nèi)毒素進入動物或人體內(nèi)都會引 發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致輕微如發(fā)熱，重則死亡的嚴(yán)重后果。
[0003] 而生物制品中，內(nèi)毒素的污染廣泛存在，比如，單克隆抗體作為生物大分子藥物， 生產(chǎn)和純化工藝復(fù)雜，有諸多環(huán)節(jié)可能將內(nèi)毒素帶入，因此需要去除內(nèi)毒素，保證生物制品 的安全性。各國藥監(jiān)部門對生物產(chǎn)品中的內(nèi)毒素含量也均有嚴(yán)格規(guī)定。歐洲藥典規(guī)定注射 劑內(nèi)毒素限度不得高于5EUAkg?h)，EU為內(nèi)毒素單位，每EU內(nèi)毒素約相當(dāng)于100pg。隨 著生物制品的大量使用，對生物制品中內(nèi)毒素殘留限的要求越高，但是因為內(nèi)毒素分子結(jié) 構(gòu)復(fù)雜且不均一，導(dǎo)致內(nèi)毒素可以多種方式與溶液中的蛋白質(zhì)相互作用，形成復(fù)合物，大大 增加了去除的難度。并且，在去除內(nèi)毒素同時，還要盡可能減小活性成分的損失。
[0004] 目前，常用的去除內(nèi)毒素的方法有活性炭吸附、萃取、超濾、離子交換色譜等，但是 去除效果均不佳。如，李彥英等。單克隆抗體純化過程中內(nèi)毒素去除方法分析，生物技術(shù)通 訊，2013年1月24(1)中，采用離子交換色譜的方式處理單克隆抗體溶液，內(nèi)毒素含量降低 至5EU/ml后，便很難進一步降低；采用對內(nèi)毒素有親和作用的氨基酸作為層析介質(zhì)時，最 低也僅能降低至0. 2~0. 3EU/mg;公開號為103923211的專利申請中，制備人血漿來源人 血清白蛋白單克隆抗體（PHSA)時，先采用rHSA填料親和層析特異性吸附pHSA后，再采用 離子交換的方式去除內(nèi)毒素，得到的pHSA制品中內(nèi)毒素含量仍然高達(dá)0.lEU/mg。
[0005] 因此，采用吸附方法去除內(nèi)毒素，不僅去除效果不佳，成本也很高，亟需改進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的內(nèi)毒素去除方法以及該方法制備得到 的生物制品。
[0007] 本發(fā)明生物制品的內(nèi)毒素去除方法，包括如下步驟：
[0008] (1)取待處理生物制品，陰離子交換層析；
[0009] (2)羥基磷灰石層析，即可。
[0010] 步驟⑴中，所述陰離子交換層析的步驟如下：
[0011] a、用平衡液平衡陰離子交換層析柱；
[0012]b、取待處理樣品，調(diào)節(jié)pH以及電導(dǎo)率與平衡液一致；
[0013] c、上樣，收集280nm紫外吸收峰處的流出液；
[0014] d、用平衡液沖洗，收集280nm紫外吸收峰處的流出液；
[0015] e、合并步驟c和步驟d的流出液，即可。
[0016] 步驟a中，所述陰離子交換層析柱的填料為Q Sepharose High Performance填料、 QSepharoseFastFlow填料、DEAESepharoseFastFlow填料或者NuviaQ填料。
[0017] 步驟a和步驟d中，所述平衡液是含有NaCl的磷酸緩沖液，其pH為6. 1~7. 9,電 導(dǎo)率為 8. 3 ~24.lS/cmmS/cm，NaCl濃度為 50 ~150mmol/L，憐酸鹽濃度 5 ~50mmol/L。
[0018] 步驟（2)中，所述羥基磷灰石層析的步驟如下：
[0019] ①用平衡液平衡羥基磷灰石層析柱；
[0020] ②取待處理樣品，調(diào)節(jié)pH以及電導(dǎo)率與平衡液一致；
[0021] ③上樣，用平衡液沖洗至流出液280nm紫外吸收回到基線；
[0022] ④用洗脫液洗脫，收集280nm紫外吸收峰處的流出液，即可。
[0023] 步驟①中，所述羥基磷灰石層析柱使用的填料是CHTCeramicHydroxyapatite TypeI填料或者CHTCeramichydroxyapatitetypeII填料。
[0024] 步驟①和③中，所述平衡液是含有NaCl的磷酸緩沖液，其pH為6. 5~8. 0,電導(dǎo)率 為 8. 4 ~17. 8mS/cm，NaCl濃度為 50 ~120mmol/L，憐酸鹽濃度為 10 ~40mmol/L。
[0025] 步驟④中，所述洗脫液是含有NaCl的磷酸緩沖液，其pH6. 5~7. 9,NaCl濃度為 200~500mmol/L，憐酸鹽濃度為5~40mmol/L。
[0026] 本發(fā)明還提供了前述任意一項方法制備得到的生物制品。優(yōu)選地，所述生物制品 的內(nèi)毒素含量低于〇. 〇5EU/mg。優(yōu)選地，所述生物制品是單克隆抗體。
[0027] 本發(fā)明方法可以有效去除內(nèi)毒素，蛋白回收率高，不需要采用特定抗體吸附目 標(biāo)蛋白，處理方法簡單，成本低廉，采用本發(fā)明方法處理后的生物制品的內(nèi)毒素含量小于 0. 05EU/mg蛋白，安全性好，臨床應(yīng)用前景良好。
[0028] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0029] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【具體實施方式】
[0030] 實施例1本發(fā)明內(nèi)毒素去除方法
[0031] 1、試驗材料
[0032] 抗體蛋白樣品的獲得：
[0033] 步驟1、一種可表達(dá)抗⑶20單克隆抗體的CH0細(xì)胞的制備：
[0034] 制備表達(dá)抗⑶20單克隆抗體的CH0細(xì)胞：采用PCR技術(shù)和DNA重組技術(shù)將 pSV2-dhfr載體（ATCC產(chǎn)品）中的dhfr(二氫葉酸還原酶）表達(dá)單元克隆到pCDNA3. 1 (+) 載體（Invitrogen公司產(chǎn)品）中，構(gòu)建可表達(dá)DHFR的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體pBR)l。
[0035] 根據(jù)文獻(xiàn)報道（USPatent,US6399061)，采用化學(xué)合成技術(shù)合成重組抗CD20單克 隆抗體的輕鏈和重鏈基因片段；采用DNA重組技術(shù)將合成的基因片段分別克隆到pBFOl載 體中，分別構(gòu)建可表達(dá)抗⑶20單克隆抗體的輕鏈和重鏈多肽的重組表達(dá)載體pBR)l-⑶20L 和PBF01-CD20H。
[0036] 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將構(gòu)建的重組表達(dá)載體pBR)l-CD20L和pBR)l-CD20H共轉(zhuǎn)染 Invitrogen公司的CH0-DG44細(xì)胞，然后經(jīng)G418抗性篩選陽性克隆，然后再通過ELISA法篩 選高表達(dá)抗體的克隆，然后再用MTX(甲氨蝶呤）逐步加壓、篩選、克隆，最終獲得一株高表 達(dá)抗CD20單克隆抗體的CHO細(xì)胞株CH0-CD20。
[0037] 步驟2、細(xì)胞培養(yǎng)
[0038] 采用批次流加培養(yǎng)，得到細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0039] 步驟3、細(xì)胞培養(yǎng)上清的分離
[0040] 采用深層過濾的方法獲得細(xì)胞培養(yǎng)上清：采用Millipore公司的D0HC和B1HC深 層濾器按順序過濾步驟2中的細(xì)胞培養(yǎng)液，收集濾過液。
[0041] 步驟4、ProteinA親和層析
[0042] 層析填料：采用GE公司的MabselectSuRe層析填料（一種耐堿的ProteinA填 料）。
[0043]層析流速：5〇~3〇Ocm/h。
[0044] 填料清洗：用