用于測量內(nèi)毒素的試劑的制作方法
【專利摘要】提供了一種用于快速地且高靈敏度地測量內(nèi)毒素的方法。使用包含下面的蛋白(1)至(3)的內(nèi)毒素測量劑測量內(nèi)毒素，所述蛋白質(zhì)中的每一種是通過使用昆蟲細胞作為宿主進行表達可得到的重組蛋白：(1)源自東方鱟的因子C，該因子C在C-端處不具有His-標(biāo)簽序列；(2)鱟的因子B；和(3)鱟的前凝固酶。
【專利說明】用于測量內(nèi)毒素的試劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及內(nèi)毒素測量劑、用于生產(chǎn)所述測量劑的方法、和用于測量樣品中的內(nèi)毒素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)毒素是存在于革蘭氏陰性細菌的細胞壁外膜上的脂多糖，且已知是強致熱原。此外，已知的是，即使少量的內(nèi)毒素也會造成歸因于細菌感染的不同疾病狀態(tài)，諸如由巨噬細胞活化引起的炎癥性細胞因子的釋放和內(nèi)毒素性休克的誘導(dǎo)以及發(fā)熱。因此，藥物(諸如注射用藥)、水、醫(yī)療設(shè)備等中的內(nèi)毒素的檢測是重要的。此外，內(nèi)毒素被認為是革蘭氏陰性細菌感染中的休克的主要原因，因此，通過測量血液中的內(nèi)毒素，可以判斷感染和/或藥物作用是否存在。
[0003]此外，已知的是,革蘭氏陰性細菌對美洲當(dāng)(Limulus polyphemus)的感染會造成血管內(nèi)凝固，并且該現(xiàn)象已經(jīng)被用于檢測內(nèi)毒素。
[0004]也就是說，已知使用鱟的血細胞提取物(鱟變形細胞裂解物；在下文中也被稱作“裂解物”)測量內(nèi)毒素的方法(例如，非專利文獻I)。該方法被稱作“鱟試驗”，且使用存在于所述裂解物中的不同蛋白質(zhì)的級聯(lián)反應(yīng)，該反應(yīng)通過使內(nèi)毒素與所述裂解物接觸而發(fā)生。所述級聯(lián)反應(yīng)的示意圖顯示在圖1中。
[0005]在使內(nèi)毒素與裂解物接觸后，存在于裂解物中的因子C被活化，以產(chǎn)生活化型因子C。該活化型因子C會活化存在于裂解物中的因子B，以產(chǎn)生活化型因子B。該活化型因子B然后活化存在于裂解物中的前凝固酶，以產(chǎn)生凝固酶。
[0006]該凝固酶會水解存在于裂解物中的凝固蛋白原分子的特定部分。由此產(chǎn)生凝固蛋白凝膠，以造成裂解物的凝固。因而，通過測量裂解物的凝固反應(yīng)，可以測量內(nèi)毒素。
[0007]此外，通過使凝固酶與合成底物反應(yīng)以造成顯色反應(yīng)，也可以測量內(nèi)毒素。例如，凝固酶會與合成底物叔丁氧羰基-亮氨?；?甘氨酰基-精氨?；?PNA(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA)反應(yīng)以水解它的酰胺鍵，并由此釋放pNA。因而，通過最初在反應(yīng)系統(tǒng)中包括合成底物，可以通過測量著色物質(zhì)(PNA)的吸光度(405 nm)來定量內(nèi)毒素。
[0008]此外，已知的是，使用從日本鱟裂解物純化出的因子C、因子B和前凝固酶，可以重構(gòu)級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)(非專利文獻2)。
[0009]此夕卜，已知這樣的情況，其中使用源自東南亞當(dāng)圓尾當(dāng)(Carcinoscorpiusrotundicauda)的重組因子C、以及源自日本當(dāng)東方當(dāng)trident a tus)的重組因子B和重組前凝固酶來重構(gòu)級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)(專利文獻I)。
[0010]此外，已知用于檢測內(nèi)毒素的系統(tǒng)，其使用源自東南亞鱟圓尾鱟的重組因子C和可與活化型因子C反應(yīng)以釋放熒光物質(zhì)的底物(專利文獻2)。該系統(tǒng)可作為內(nèi)毒素檢測系統(tǒng)商購得到(商品名:PyroGene (注冊商標(biāo))；Lonza)。
[0011]但是，為了使用裂解物或從其制備的天然存在的因子C、因子B和前凝固酶，必須捕獲鱟并從其收集血液。因此，考慮到生物資源的保護等，難以無限地供給這些組分。因此，已經(jīng)需要容易地且快速地以低成本生產(chǎn)用于檢測內(nèi)毒素的試劑的技術(shù)。
[0012]此外，在使用重組因子C、重組因子B和重組前凝固酶的情況下，任意上述情況需要I小時或更久來進行測量，并且尚未實現(xiàn)在0.001 EU/mL量級的檢測靈敏度。因此，已經(jīng)需要快速地且高靈敏度地測量內(nèi)毒素的技術(shù)。[0013]現(xiàn)有技術(shù)文件 專利文獻
[專利文獻 I] WO 2008/004674 [專利文獻 2] US 6，849，426 B 非專利文獻。
[0014]【'非專利文獻 I] Iwanaga S.，Curr Opin Immunol.1993 Feb; 5(1): 74-82。
[非專利文獻 2] Nakamura T.等人，J Biochem.1986 Mar; 99(3): 847-57。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明目的在于，提供用于快速地且高靈敏度地測量內(nèi)毒素的方法。本發(fā)明目的還在于，提供要在所述方法中使用的內(nèi)毒素測量劑和用于生產(chǎn)所述試劑的方法。
[0016]本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使用源自日本鱟東方鱟并使用昆蟲細胞作為宿主進行表達的重組因子C (不含HiS-標(biāo)簽)、重組因子B和重組前凝固酶，可以快速地且高靈敏度地測量內(nèi)毒素，由此完成了本發(fā)明。
[0017]也就是說，本發(fā)明如下。
[I]
一種內(nèi)毒素測量劑，其包含下面的蛋白(I)至(3)，所述蛋白中的每一種是通過使用昆蟲細胞作為宿主進行表達可得到的重組蛋白:
(1)源自東方鱟的因子C，該因子C在C-端處不具有His-標(biāo)簽序列；
(2)鱟的因子B;和
(3)鱟的前凝固酶。
[2]
根據(jù)[I]所述的測量劑，其中所述因子B和所述前凝固酶源自東方鱟。
[3]
根據(jù)[I]或[2]所述的測量劑，其中所述因子C是下面的蛋白㈧或⑶；所述因子B是下面的蛋白(C)或⑶；且所述前凝固酶是下面的蛋白(E)或(F):
(A)蛋白，其包含在SEQID NO:2中所示的氨基酸序列；
(B)蛋白，其包含在SEQID NO: 2中所示的氨基酸序列，但是其包括一個或幾個氨基酸殘基的置換、缺失、插入或添加，所述蛋白具有因子C活性；
(C)蛋白，其包含在SEQID NO:4中所示的氨基酸序列；
(D)蛋白，其包含在SEQID NO:4中所示的氨基酸序列，但是其包括一個或幾個氨基酸殘基的置換、缺失、插入或添加，所述蛋白具有因子B活性；
(E)蛋白，其包含在SEQID NO:6中所示的氨基酸序列；
(F)蛋白，其包含在SEQID NO:6中所示的氨基酸序列，但是其包括一個或幾個氨基酸殘基的置換、缺失、插入或添加，所述蛋白具有前凝固酶活性。
[4]
一種用于生產(chǎn)根據(jù)[I]至[3]中的任一項所述的測量劑的方法，所述方法包括下面的步驟(A)至(C):
(A)將下面DNA(I)至(3)中的每一種摻入病毒DNA中的步驟:
(1)DNA,其編碼源自東方鱟的因子C，該因子C在C-端處不具有His-標(biāo)簽序列；
(2)DNA，其編碼鱟的因子B;和
(3)DNA，其編碼鱟的前凝固酶；
(B)用其中摻入了所述每種DNA的病毒感染昆蟲細胞的步驟；和
(C)使被所述每種病毒感染的昆蟲細胞表達由所述每種DNA編碼的蛋白的步驟。
[5]
一種用于生產(chǎn)根據(jù)[I]至[3]中的任一項所述的測量劑的方法，所述方法包括下面的步驟(A)至(C):
(A)將下面DNA(I)至(3)中的每一種摻入載體中的步驟:
(1)DNA,其編碼源自東方鱟的因子C，該因子C在C-端處不具有His-標(biāo)簽序列；
(2)DNA，其編碼鱟的因子B;和
(3)DNA，其編碼鱟的前凝固酶；
(B)將其中摻入了所述每種DNA的載體引入昆蟲細胞中以使所述每種DNA摻入昆蟲細胞的染色體中的步驟；和
(C)使其中摻入了所述每種DNA的昆蟲細胞表達由所述每種DNA編碼的蛋白的步驟。
[6]
根據(jù)[4]或[5]所述的方法，其中所述編碼因子C的DNA是下面的DNA (A)或⑶；所述編碼因子B的DNA是下面的DNA (C)或⑶；且所述編碼前凝固酶的DNA是下面的DNA
(E)或(F):
(A)DNA，其包含在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；
(B)DNA，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的全長或一部分的互補序列雜交，且編碼具有因子C活性的蛋白。
(C ) DNA,其包含在SEQ ID NO: 3或8中所示的核苷酸序列；
(D)DNA，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO: 3或8所示核苷酸序列的全長或一部分的互補序列雜交，且編碼具有因子B活性的蛋白。
(E ) DNA,其包含在SEQ ID NO: 5或9中所示的核苷酸序列；
(F)DNA，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO: 5或9所示核苷酸序列的全長或一部分的互補序列雜交，且編碼具有前凝固酶活性的蛋白。
[7]
一種用于測量試驗樣品中的內(nèi)毒素的方法，所述方法包括:使根據(jù)[I]至[3]中的任一項所述的測量劑與試驗樣品混合的步驟，和測量級聯(lián)反應(yīng)的進展的步驟。
[8]
根據(jù)[7]所述的方法，所述方法包括:將用于檢測級聯(lián)反應(yīng)的進展的底物加入反應(yīng)系統(tǒng)中的步驟。[9]
根據(jù)[8]所述的方法，所述方法另外包括:基于所述底物的反應(yīng)計算試驗樣品中的內(nèi)毒素水平的步驟。
[0018]通過本發(fā)明，可以快速地且高靈敏度地測量內(nèi)毒素。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，僅測量30分鐘便可以實現(xiàn)0.0005 EU/mL量級的檢測靈敏度。此外，在本發(fā)明中，表達的重組因子C、重組因子B和重組前凝固酶可以不經(jīng)過純化就使用，并且因此，可以簡單地且快速地以低成本生產(chǎn)包含這些重組蛋白的內(nèi)毒素測量劑。
[0019]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1的簡圖顯示了鱟試驗中的級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)。
圖2的簡圖顯示了載體Piz/V5-His的結(jié)構(gòu)和每個基因的插入位置。在上部的箭頭指示了基因的插入位置。
圖3的照片顯示了各個因子C的表達水平。
圖4的簡圖顯示了各個因子C的活性。
圖5的照片顯示了通過病毒方法表達的因子C的穩(wěn)定性。
圖6的照片顯示了通過穩(wěn)定表達細胞方法表達的因子C的穩(wěn)定性。
圖7的簡圖顯示了中空纖維膜過濾處理對通過病毒方法表達的因子的反應(yīng)性的影響。 圖8的簡圖顯示了含有通過病毒方法表達的因子的內(nèi)毒素測量劑的反應(yīng)性。
圖9的簡圖顯示了含有通過穩(wěn)定表達細胞系方法表達的因子的內(nèi)毒素測量劑的反應(yīng)性。(a)在0-0.1 EU/mL的內(nèi)毒素濃度時的反應(yīng)性。(b)在0-0.01 EU/mL的內(nèi)毒素濃度時的反應(yīng)性。
圖10的照片顯示了純化的重組因子C和純化的天然存在的因子C的純度和濃度。
圖11的校正曲線顯示了帶強度和BSA的量之間的關(guān)聯(lián)。
圖12的簡圖顯示了純化的重組因子C和純化的天然存在的因子C的活性。
【具體實施方式】
[0020]在本發(fā)明中，下述的一系列反應(yīng)可以被稱作“級聯(lián)反應(yīng)”:其中內(nèi)毒素活化因子C以產(chǎn)生活化型因子C ;所述活化型因子C活化因子B以產(chǎn)生活化型因子B ;和所述活化型因子B活化前凝固酶以產(chǎn)生凝固酶。
[0021][ I ]本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑
本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑包含因子C、因子B和前凝固酶。在本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑中包含的因子C、因子B和前凝固酶在下文中可以分別被稱作“本發(fā)明的因子C”、“本發(fā)明的因子B”和“本發(fā)明的前凝固酶”。此外，因子C、因子B和前凝固酶可以共同地稱作“因子”。
[0022]本發(fā)明的因子C、本發(fā)明的因子B和本發(fā)明的前凝固酶全部是通過使用昆蟲細胞作為宿主進行表達可得到的重組蛋白。
[0023]本發(fā)明的因子C是源自日本鱟東方鱟的因子C。本發(fā)明的因子C的特征在于，它不具有在C-端處連接的His-標(biāo)簽。此外，本發(fā)明的因子C優(yōu)選地在C-端處不具有V5-標(biāo)簽。此外，本發(fā)明的因子C更優(yōu)選地不具有在C-端處連接的任何肽。此外，本發(fā)明的因子C特別優(yōu)選地不具有在任一端處連接的任何肽。東方鱟的因子C的氨基酸序列顯示在SEQID N0:2中。編碼東方鱟的因子C的基因的核苷酸序列顯示在SEQ ID NO:1中。[0024]本發(fā)明的因子C可以是具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白的變體，只要所述變體具有因子C活性。
[0025]“因子C活性”是指，因子C在有內(nèi)毒素存在下變成活化型因子C以活化因子B的活性。例如，可以如下證實本發(fā)明的因子C “具有因子C活性”的事實:使用與合適的因子B和合適的前凝固酶相組合的本發(fā)明的因子C，并在有內(nèi)毒素存在下檢測級聯(lián)反應(yīng)的進展。更具體地，SEQ ID N0:4的蛋白可以用作合適的因子B，SEQ ID NO:6的蛋白可以用作合適的前凝固酶。使用下面提及的底物進行檢測，可以測量級聯(lián)反應(yīng)的進展。
[0026]本發(fā)明的因子C可以是這樣的蛋白:其包含在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，但是其包括一個或幾個氨基酸殘基的置換、缺失、插入或添加，只要所述因子C具有因子C活性。術(shù)語“一個或幾個”的含義隨所述氨基酸殘基在蛋白的三維結(jié)構(gòu)中的位置和所述氨基酸殘基的類型而變化，并且，更具體地，該術(shù)語優(yōu)選是指1-20、更優(yōu)選1-10、更優(yōu)選1-5、特別優(yōu)選1-3。上述的一個或幾個氨基酸的置換、缺失、插入或添加是維持蛋白的正常功能的保守突變。保守突變的代表性例子是保守置換。所述保守置換是例如這樣的突變:其中，如果置換位點是芳族氨基酸，那么置換在Phe、Trp和Tyr之間相互發(fā)生；如果置換位點是疏水氨基酸，那么置換在Leu、Ile和Val之間相互發(fā)生；如果置換位點是極性氨基酸，那么置換在Gln和Asn之間相互發(fā)生；如果置換位點是堿性氨基酸，那么置換在Lys、Arg和His之間相互發(fā)生；如果置換位點是酸性氨基酸，那么置換在Asp和Glu之間相互發(fā)生；如果置換位點是具有羥基的氨基酸，那么置換在Ser和Thr之間相互發(fā)生。被視作保守置換的置換的例子具體地包括=Ser或Thr對Ala的置換，Gin、His或Lys對Arg的置換，Glu, Gin、Lys> His或Asp對Asn的置換，Asn、Glu或Gln對Asp的置換，Ser或Ala對Cys的置換，Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 對 Gln 的置換，Gly、Asn、Gln、Lys 或 Asp 對 Glu 的置換，Pro對 Gly 的置換，Asn、Lys> Gin、Arg 或 Tyr 對 His 的置換，Leu、Met、Val 或 Phe 對 Ile 的置換，lie、Met、Val 或 Phe 對 Leu 的置換，Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 對 Lys 的置換，lie、Leu、Val或Phe對Met的置換，Trp, Tyr, Met, Ile或Leu對Phe的置換，Thr或Ala對Ser的置換，Ser或Ala對Thr的置換，Phe或Tyr對Trp的置換，His、Phe或Trp對Tyr,和Met、Ile或Leu對Val的置換。此外，上述的置換、缺失、插入、添加、倒位等還可以包括天然存在的突變，所述突變歸因于衍生出所述基因的鱟的個體、品種或物種的差異。
[0027]此外，本發(fā)明的因子C可以是這樣的蛋白:其與如上所述的因子C的全長氨基酸序列(例如，SEQ ID NO: 2所示的全長氨基酸序列)具有不小于80%、優(yōu)選不小于90%、更優(yōu)選不小于95%、更優(yōu)選不小于97%、特別優(yōu)選不小于99%的同源性或同一性，并且具有因子C活性。
[0028]編碼本發(fā)明的因子C的基因沒有特別限制，只要所述基因編碼如上所述的本發(fā)明的因子C。編碼本發(fā)明的因子C的基因可以是基于已知基因序列制備的探針，例如，這樣的DNA:其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的全長或一部分的互補序列雜交，且編碼具有因子C活性的蛋白。術(shù)語“嚴(yán)謹(jǐn)條件”在本文中是指這樣的條件:在該條件下，形成所謂的特異性的雜交物，但是不形成非特異性的雜交物。所述條件的例子包括這樣的條件:在該條件下，高度同源的DNA彼此雜交，例如，具有不小于80%同源性、優(yōu)選不小于90%同源性、更優(yōu)選不小于95%同源性、更優(yōu)選不小于97%同源性、特別優(yōu)選不小于99%同源性的DNA彼此雜交，而其同源性低于上述值的DNA不會彼此雜交；以及這樣的條件:在該條件下，在與 60°C、1XSSC 和 0.1% SDS (優(yōu)選 60°C、0.I XSSC 和 0.1% SDS，更優(yōu)選 68°C、
0.1 X SSC和0.1% SDS，它們是在DNA雜交中的標(biāo)準(zhǔn)洗滌條件)相對應(yīng)的鹽濃度和溫度，進行洗滌I次，更優(yōu)選2次或3次。
[0029]此外，可以改變編碼本發(fā)明的因子C的基因中的密碼子組合，從而為在昆蟲細胞中的表達而優(yōu)化所述基因。所述優(yōu)化可以如下進行，例如，使用通?？傻玫降膮f(xié)議服務(wù)。編碼本發(fā)明的因子C的基因可以是DNA變體，其密碼子組合為在昆蟲細胞中的表達進行了優(yōu)化。
[0030]上面關(guān)于基因和蛋白的變體的描述類似地適用于本發(fā)明的因子B和前凝固酶，并適用于編碼它們的基因。
[0031]本發(fā)明的因子B是源自鱟的因子B。此外，本發(fā)明的前凝固酶是源自鱟的前凝固酶。鱟的例子包括日本鱟東方鱟、美洲當(dāng)黃///:#、東南亞鱟圓尾鱟和東南亞鱟馬來鱟(Tachypleus gigas )。在這些當(dāng)中，上述因子優(yōu)選地源自日本當(dāng)東方當(dāng)。
[0032]東方鱟的因子B和前凝固酶的氨基酸序列分別顯示在SEQ ID N0:4和6中。編碼東方鱟的因子B和前凝固酶的基因的核苷酸序列分別顯示在SEQ ID N0:3和5中。
[0033]本發(fā)明的因子B可以是上述任一種鱟的因子B的變體，例如，具有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的蛋白的變體，只要本發(fā)明的因子B具有因子B活性。此外，編碼本發(fā)明的因子B的基因沒有特別限制，只要所述基因編碼如上所述的本發(fā)明的因子B。上面關(guān)于因子C的描述在細節(jié)上做必要的修正后也適用于基因和蛋白的變體。
[0034]“因子B活性”是指，因子B在活化型因子C存在下變成活化型因子B以將前凝固酶變成它的活性形式凝固酶的活性。例如，可以如下證實本發(fā)明的因子B “具有因子B活性”的事實:使用與合適的因子C和合適的前凝固酶相組合的本發(fā)明的因子B，并在內(nèi)毒素存在下檢測級聯(lián)反應(yīng)的進展。更具體地，SEQ ID N0:2的蛋白可以用作合適的因子C，SEQID N0:6的蛋白可以用作合適的前凝固酶。使用下面提及的底物進行檢測，可以測量級聯(lián)反應(yīng)的進展。
[0035]本發(fā)明的前凝固酶可以是上述任一種鱟的前凝固酶的變體，例如，具有SEQ IDN0:6所示氨基酸序列的蛋白的變體，只要本發(fā)明的前凝固酶具有前凝固酶活性。此外，編碼本發(fā)明的前凝固酶的基因沒有特別限制，只要所述基因編碼如上所述的本發(fā)明的前凝固酶。上面關(guān)于因子C的描述在細節(jié)上做必要的修正后也適用于基因和蛋白的變體。
[0036]“前凝固酶活性”是指，前凝固酶在活化型因子B存在下變成凝固酶以與下面提及的用于檢測的底物反應(yīng)的活性?！芭c用于檢測的底物反應(yīng)的活性”是指，例如，與凝固蛋白原反應(yīng)以造成凝固的活性，和與Boc-Leu-Gly-Arg-pNA反應(yīng)以釋放pNA的活性。例如,可以如下證實本發(fā)明的前凝固酶“具有前凝固酶活性”的事實:使用與合適的因子C和合適的因子B相組合的本發(fā)明的凝固酶，并在內(nèi)毒素存在下檢測級聯(lián)反應(yīng)的進展。更具體地，SEQ IDN0:2的蛋白可以用作合適的因子C，SEQ ID N0:4的蛋白可以用作合適的因子B。使用下面提及的底物進行檢測，可以測量級聯(lián)反應(yīng)的進展。
[0037]可以向本發(fā)明的因子B和/或本發(fā)明的前凝固酶添加任意肽等，只要所述因子分別具有因子B活性和前凝固酶活性。這樣的肽的例子包括標(biāo)簽序列諸如His-標(biāo)簽和V5-標(biāo)簽。與本發(fā)明的因子C類似地，要使用的本發(fā)明的因子B和/或本發(fā)明的前凝固酶可以屬于下述的任一種:其中在C-端沒有添加His-標(biāo)簽的那些，其中在C-端沒有添加V5-標(biāo)簽的那些，其中在C-端根本沒有添加肽的那些，和其中在任一端根本沒有添加肽的那些。
[0038]此外，可以改變編碼本發(fā)明的因子B的基因和/或編碼本發(fā)明的前凝固酶的基因中的密碼子組合，從而為在昆蟲細胞中的表達而優(yōu)化所述基因。編碼SEQ ID N0:4的因子B且具有為在昆蟲細胞中的表達而優(yōu)化的密碼子組合的DNA的例子包括SEQ ID N0:8的DNA。編碼SEQ ID N0:6的前凝固酶且具有為在昆蟲細胞中的表達而優(yōu)化的密碼子組合的DNA的例子包括SEQ ID NO:9的DNA。每一個編碼本發(fā)明的因子B的基因和/或編碼本發(fā)明的前凝固酶的基因可以是DNA變體，其密碼子組合為在昆蟲細胞中的表達進行了優(yōu)化。
[0039]本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑可以由本發(fā)明的因子C、本發(fā)明的本發(fā)明的因子B和本發(fā)明的前凝固酶組成。
[0040]本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑可以包含用于檢測級聯(lián)反應(yīng)的進展的底物。在本發(fā)明中，這樣的底物可以被稱作“用于檢測的底物”。
[0041]用于檢測的底物的例子包括凝固蛋白原。由于凝固蛋白原與凝固酶的接觸，發(fā)生凝固從而產(chǎn)生凝固蛋白。通過測量反應(yīng)溶液的濁度，可以測定凝固反應(yīng)的進程?？梢詮镊c血細胞提取物(裂解物)回收凝固蛋白原。并且，因為已經(jīng)公開了編碼凝固蛋白原的基因的核苷酸序列(Miyata,等人，PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME,增刊，第 29 期，第30-43頁(1986))，可以根據(jù)常規(guī)方法通過基因工程生產(chǎn)凝固蛋白原。
[0042]還可以使用合成底物作為用于檢測的底物。所述合成底物沒有特別限制，只要所述底物具有適合用于檢測的性質(zhì)，諸如使凝固酶的催化反應(yīng)造成顯色或發(fā)熒光的性質(zhì)。合成底物的例子包括由通式X-Y-Z (其中X代表保護基，Y代表肽，且Z代表經(jīng)由酰胺鍵與Y結(jié)合的染料)代表的底物。在內(nèi)毒素存在于反應(yīng)系統(tǒng)中的情況下，凝固酶(其作為級聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果而產(chǎn)生)的催化反應(yīng)會切割Y和Z之間的酰胺鍵，以釋放染料Z，從而導(dǎo)致顯色或發(fā)熒光。保護基X沒有特別限制，可以適當(dāng)?shù)厥褂秒牡囊阎Ｗo基。這樣的保護基的例子包括叔丁氧羰基和苯甲酰基。染料Z沒有特別限制，且可以是在可見光下可檢測的染料或熒光染料。染料Z的例子包括PNA (對-硝基苯胺)、MCA (7-甲氧基香豆素-4-乙酸)、DNP (2，4- 二硝基苯胺)和丹磺?；玖?。肽Y的例子包括Leu-Gly-Arg (LGR)、Ile-Glu-Gly-Arg (IEGR) (SEQ ID NO: 12)和 Val—Pro—Arg (VPR)。通過根據(jù)染料的性質(zhì)選擇的方法，可以測量釋放的染料Z。
[0043]此外，本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑還可以包含除了因子和用于檢測的底物以外的組分，只要所述試劑可以用于測量內(nèi)毒素。這樣的組分沒有特別限制，且可以考慮因子和用于檢測的底物的儲存性、操作容易度以及穩(wěn)定性來選擇。本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑可以包含，例如，PH-緩沖劑和/或鹽。pH-緩沖劑的例子包括HEPES緩沖劑、MES緩沖劑、Tris緩沖劑和GTA寬范圍緩沖劑。在本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑中還可以包含諸如醇、酯、酮和酰胺等有機溶劑。
[0044]本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑可以配制成任意形式，包括例如，固體形式、液體形式和凝膠形式。就制劑而言，可以使用通常用作制劑載體諸如媒介物、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑、矯味劑、稀釋劑、表面活性劑和溶劑的添加劑。本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑可以原樣用于測量內(nèi)毒素，或者在水、生理鹽水、緩沖液等中進行稀釋、分散或溶解。不言而喻，通過這樣的稀釋、分散或溶解得到的生成制劑也在本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑的范圍內(nèi)。
[0045]在本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑中，所述因子和所述其它組分可以作為混合物存在，或者可以分開存在。例如，所述因子可以以要配制的任意比例混合，或者可以分開配制。
[0046]在本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑中的所述因子和所述其它組分的濃度沒有特別限制，且優(yōu)選地經(jīng)過調(diào)節(jié)，使得當(dāng)測量內(nèi)毒素時，所述濃度是在下面提及的優(yōu)選范圍內(nèi)。在本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑(以在與試驗樣品接觸之前制備的溶液的方式)中的每種因子的濃度是，例如，優(yōu)選20-100 μ g/mL、更優(yōu)選40-80 μ g/mL、特別優(yōu)選約60 μ g/mL。
[0047]本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑可以作為內(nèi)毒素測量試劑盒來提供。內(nèi)毒素測量試劑盒沒有特別限制，只要所述試劑盒含有本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑。
[0048]( 2 )用于生產(chǎn)本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑的方法
通過使用昆蟲細胞作為宿主進行表達，可以生產(chǎn)在本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑中包含的因子。
[0049]所述昆蟲細胞沒有特別限制，只要所述細胞可以表達所述因子，并且可以適當(dāng)?shù)厥褂猛ǔＳ糜诒磉_異源蛋白的細胞。這樣的昆蟲細胞的例子包括Sf9、Sf2K SF+和High-Five0所述昆蟲細胞優(yōu)選地是Sf9。
[0050]用于培養(yǎng)昆蟲細胞的培養(yǎng)條件沒有特別限制，只要在所述條件下可以培養(yǎng)昆蟲細胞，并且如果必要的話，可以在適當(dāng)?shù)匦薷暮笫褂猛ǔＳ糜谂囵B(yǎng)昆蟲細胞的培養(yǎng)條件。例如，可以使用通常用于培養(yǎng)昆蟲細胞的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基。這樣的培養(yǎng)基的例子包括商購可得的用于昆蟲細胞的無血清培養(yǎng)基。更具體地，可以適當(dāng)?shù)厥褂肧f900 II培養(yǎng)基(Invitrogen)等。例如,可以在27°C至28°C在搖動下進行培養(yǎng)。
[0051]使用昆蟲細胞作為宿主來表達因子的方法沒有特別限制，只要通過該方法可以表達所述因子，并且可以適當(dāng)?shù)厥褂猛ǔＳ糜诒磉_異源蛋白的方法。例如，通過用其中摻入了編碼所述因子的基因的病毒感染昆蟲細胞，可以表達每種因子(病毒方法)。可替換地，通過將其中摻入了編碼所述因子的基因的載體引入昆蟲細胞中，由此將所述基因摻入宿主染色體中，可以表達每種因子(穩(wěn)定表達細胞系方法)。
[0052]<病毒方法>
要在病毒方法中使用的病毒沒有特別限制，只要該病毒可以感染昆蟲細胞，并且由此可以表達所述因子，并且可以適當(dāng)?shù)厥褂猛ǔＳ糜谠诶ハx細胞中表達蛋白的病毒。這樣的病毒的例子包括桿狀病毒。所述桿狀病毒優(yōu)選地是核多角體病毒屬(NPV)。NPV的例子包括AcNPV (苜蓿銀紋夜蛾NPV)和BmNPV (家蠶NPV)。NPV優(yōu)選地是AcNPV。
[0053]通過常規(guī)方法，例如，通過使用轉(zhuǎn)移載體的同源重組，可以將核酸引入病毒中。轉(zhuǎn)移載體的例子包括 pPSC8 (Protein Sciences)、pFastBac (Invitrogen)和 pVL1393(Pharmingen)。轉(zhuǎn)移載體優(yōu)選地是pPSC8。
[0054]通過常規(guī)方法用其中摻入了編碼每種因子的基因的病毒感染昆蟲細胞，可以得到攜帶所述病毒并表達所述因子的昆蟲細胞。
[0055]<穩(wěn)定表達細胞系方法>
通過將編碼每種因子的基因摻入昆蟲細胞的染色體中，可以得到穩(wěn)定表達細胞系，其穩(wěn)定地表達所述因子。穩(wěn)定表達細胞系的構(gòu)建方法沒有特別限制，并且可以通過常規(guī)方法進行構(gòu)建。例如，根據(jù)手冊使用pIZ/V5-His載體(Invitrogen),可以構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞系。
[0056]在任何情況下，構(gòu)建表達細胞，使得表達的因子C具有沒有連接His標(biāo)簽的C-端。此外，在沒有添加任何肽(其不限于在因子C的C-端處的HiS-標(biāo)簽)而表達每種因子的情況下，可以構(gòu)建表達細胞，使得不添加肽。
[0057]在任何情況下，所述因子可以由單一類型的表達細胞一起表達，或者可以為每種因子構(gòu)建表達細胞以分別表達各種因子。
[0058]通過測量因子的活性，可以證實每種因子是否被表達。通過測量從編碼因子的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量，或者通過使用抗體通過蛋白質(zhì)印跡法而檢測因子，也可以證實每種因子是否被表達。
[0059]每種表達的因子可以作為含有因子的溶液回收，以用作本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑的組分。含有因子的溶液可以是，例如，培養(yǎng)液、培養(yǎng)物上清液、或細胞提取物、或其混合物。每種因子可以在純化后或不經(jīng)過純化地使用。在本發(fā)明中，即使不經(jīng)過因子純化而原樣使用含有每種表達的因子的細胞培養(yǎng)物上清液，也可以提供具有足夠高性能的內(nèi)毒素測量劑。在要純化每種因子的情況下，可以通過例如用于蛋白純化的已知方法進行純化。這樣的方法的例子包括硫酸銨沉淀、凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法、疏水相互作用色譜法和羥磷灰石色譜法。在將諸如His-標(biāo)簽等標(biāo)簽與每種因子連接的情況下，使用針對所述標(biāo)簽的親和力，通過親和色譜法也可以純化所述因子。
[0060]在通過病毒方法生產(chǎn)每種因子的情況下，優(yōu)選地消除病毒。消除病毒的方法沒有特別限制，并且可以通過常規(guī)方法進行消除。例如，通過具有500 kDa孔徑的中空纖維過濾膜，可以消除病毒。
[0061]( 3 )本發(fā)明的測量內(nèi)毒素的方法
通過將本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑與試驗樣品混合，在試驗樣品含有內(nèi)毒素的情況下，發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)。通過測量級聯(lián)反應(yīng)的進展，可以測量試驗樣品中的內(nèi)毒素。也就是說，本發(fā)明提供了一種用于測量試驗樣品中的內(nèi)毒素的方法，所述方法包括:將本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑與試驗樣品混合的步驟，和測量級聯(lián)反應(yīng)的進展的步驟(在下文中被稱作“第一實施方案”)。
[0062]在所述第一實施方案中，從將本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑與試驗樣品混合的步驟開始，在本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑中含有的每種因子可以已經(jīng)被包含在反應(yīng)系統(tǒng)中，或者可以順序地加入反應(yīng)系統(tǒng)中。
[0063]例如，將本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑與試驗樣品混合的步驟可以包括下述步驟(A)至
(C):
(A)將本發(fā)明的因子C加入反應(yīng)系統(tǒng)中的步驟；
(B)將本發(fā)明的因子B加入反應(yīng)系統(tǒng)中的步驟；和
(C)將本發(fā)明的前凝固酶加入反應(yīng)系統(tǒng)中的步驟。
[0064]步驟(A)至(C)可以分開地、部分同時地或完全同時地進行。步驟㈧至(C)可以以任意次序進行。例如，步驟(A)之后進行步驟(B)，然后進行步驟(C)。
[0065]在所述第一實施方案中，通過將用于檢測的底物加入反應(yīng)系統(tǒng)中，然后測量底物的反應(yīng)(著色、凝固等)，可以測量級聯(lián)反應(yīng)的進展。從將本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑與試驗樣品混合的步驟開始，用于檢測的底物可以已經(jīng)被包含在反應(yīng)系統(tǒng)中，或者可以在進展過程中或在該步驟結(jié)束以后加入反應(yīng)系統(tǒng)中。當(dāng)然，所述第一實施方案包括這樣的情況:其中采用預(yù)先含有用于檢測的底物的本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑。
[0066]只要在試驗物含有內(nèi)毒素的情況下發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，本發(fā)明的因子B和前凝固酶本身可以不必與試驗樣品接觸。也就是說，本發(fā)明的用于測量內(nèi)毒素的方法的另一個實施方案(在下文中被稱作“第二實施方案”)是，用于測量試驗物中的內(nèi)毒素的方法，該方法包括下面的步驟㈧至⑶。
(A)將本發(fā)明的因子C與試驗樣品混合的步驟；
(B)在步驟A中混合因子C以后，將本發(fā)明的因子B與因子C混合的步驟；
(C)在步驟B中混合因子B以后，將本發(fā)明的前凝固酶與因子B混合的步驟；和
(D)測量級聯(lián)反應(yīng)的進展的步驟。
[0067]在所述第二實施方案中，步驟(A)至(D)可以分開地、部分同時地或完全同時地進行。例如，在開始步驟A之后，可以在進展過程中或在該步驟結(jié)束以后將因子B和/或前凝固酶加入反應(yīng)系統(tǒng)中。可替換地，在開始步驟B之后，可以在進展過程中或在該步驟結(jié)束以后將前凝固酶加入反應(yīng)系統(tǒng)中?？商鎿Q地，從步驟A開始時，所有3種因子可以都被包含在反應(yīng)系統(tǒng)中?？商鎿Q地，例如，可以回收在步驟A中的接觸以后的因子C用于步驟B，且可以回收在步驟B中的接觸以后的因子B用于步驟C。
[0068]在所述第二實施方案中，通過將用于檢測的底物加入反應(yīng)系統(tǒng)中，然后測量底物的反應(yīng)(著色、凝固等)，可以測量級聯(lián)反應(yīng)的進展。從步驟A開始，用于檢測的底物可以被包含在反應(yīng)系統(tǒng)中，或者可以在進展過程中或在每個步驟結(jié)束以后加入反應(yīng)系統(tǒng)中。
[0069]本發(fā)明的測量內(nèi)毒素的方法可以包含其它任意步驟，只要在試驗樣品含有內(nèi)毒素的情況下會發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)即可。例如，本發(fā)明的測量內(nèi)毒素的方法可以包括:將用于檢測的底物加入反應(yīng)系統(tǒng)中的步驟，或?qū)⒂杉壜?lián)反應(yīng)產(chǎn)生的凝固酶與用于檢測的底物混合的步驟。此外，例如，本發(fā)明的測量內(nèi)毒素的方法可以包括:基于用于檢測的底物的反應(yīng)，計算試驗樣品中的內(nèi)毒素水平的步驟。
[0070]在本發(fā)明的測量內(nèi)毒素的方法中，所述反應(yīng)優(yōu)選地在水性溶劑諸如水或緩沖液中進行。
[0071 ] 在本發(fā)明的測量內(nèi)毒素的方法中，反應(yīng)溶液中的每種因子的濃度沒有特別限制，只要在試驗樣品中含有內(nèi)毒素的情況下會發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)即可，并且可以根據(jù)因子的性質(zhì)和/或類似因素適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。例如，以終濃度的方式，每種因子的濃度通常是10-50 μ g/mL、優(yōu)選 20-40 μ g/mL、更優(yōu)選約 30 μ g/mL。
[0072]在本發(fā)明的測量內(nèi)毒素的方法中，反應(yīng)溶液中的用于檢測的底物的濃度沒有特別限制，只要在試驗樣品中含有內(nèi)毒素的情況下會發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)即可，并且可以根據(jù)用于檢測的底物的性質(zhì)和/或類似因素適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。例如，在用于檢測的底物是合成底物的情況下，以終濃度的方式，用于檢測的底物的濃度通常是0.001 mM-100禮、優(yōu)選0.01 mM-10
mMo
[0073]在任何實施方案中，反應(yīng)系統(tǒng)可以含有除了內(nèi)毒素測量劑(在第一實施方案中)或因子(在第二實施方案中)、用于檢測的底物和試驗樣品以外的一種或多種任意組分，只要在試驗樣品中含有內(nèi)毒素的情況下會發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)即可。例如，反應(yīng)系統(tǒng)可以含有pH-緩沖劑和/或鹽。PH-緩沖劑的例子包括HEPES緩沖劑、MES緩沖劑、Tris緩沖劑和GTA寬范圍緩沖劑。在反應(yīng)系統(tǒng)中還可以包含諸如醇、酯、酮和酰胺等有機溶劑。
[0074]反應(yīng)溶液的pH沒有特別限制，只要在試驗樣品中含有內(nèi)毒素的情況下會發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)即可，且可以根據(jù)每種因子的性質(zhì)適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。例如，反應(yīng)溶液的pH通常是5-10、優(yōu)選 7-8.5。
[0075]反應(yīng)溫度沒有特別限制，只要在試驗樣品中含有內(nèi)毒素的情況下會發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)即可，且可以根據(jù)每種因子的性質(zhì)適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。反應(yīng)溫度通常是，例如，10°C至80°C、優(yōu)選20°C至50°C。例如，反應(yīng)溫度可以是室溫。
[0076]反應(yīng)時間沒有特別限制，且可以根據(jù)諸如每種因子的性質(zhì)和反應(yīng)溫度等條件適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。反應(yīng)時間通常是，例如，5分鐘至I小時、優(yōu)選15分鐘至45分鐘。例如，反應(yīng)時間可以是30分鐘。
[0077]在任何實施方案中，在反應(yīng)過程中，可以向反應(yīng)系統(tǒng)中額外地單獨地或以任意組合加入試驗樣品、因子和其它組分。這些組分可以一次性加入，或者分多次加入，或者可以連續(xù)加入。從反應(yīng)開始至反應(yīng)結(jié)束可以采用恒定條件，或者可以在反應(yīng)過程中改變條件。
[0078]通過測量用于檢測的底物的反應(yīng)(著色、凝固等)，可以測量由內(nèi)毒素的存在引起的級聯(lián)反應(yīng)的進展，并因此可以測量試驗物中的內(nèi)毒素。通過依賴于采用的用于檢測的底物的方法，可以測量用于檢測的底物的反應(yīng)(著色、凝固等)。
[0079]在定量測量內(nèi)毒素的情況下，可以使用已知其濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品來得到內(nèi)毒素水平和用于檢測的底物的反應(yīng)程度(著色、凝固等的程度)之間的關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)，并且，基于關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)，可以定量在試驗樣品中存在的內(nèi)毒素。關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)可以是，例如，校正曲線。定量可以通過動力學(xué)方法或通過終點法來進行。
[0080]要進行內(nèi)毒素測量的試驗樣品沒有特別限制，其例子包括醫(yī)用水、藥物、輸注溶液、血液制品、醫(yī)療設(shè)備、醫(yī)療儀器、化妝品、食品和飲料、環(huán)境樣品(例如，空氣、河水和土壤)、生物組分(例如，血液、體液和組織)、天然存在的蛋白、重組蛋白、核酸和碳水化合物。通過在反應(yīng)系統(tǒng)中混合、分散或溶解試驗樣品原樣或試驗樣品的提取物或洗滌溶液，可以對試驗樣品進行內(nèi)毒素測量。
實施例
[0081]現(xiàn)在將通過實施例更具體地描述本發(fā)明。但是，這些僅僅是本發(fā)明的實施例，并且本發(fā)明的范圍不限于這些。
[0082]實施例1:本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑的生產(chǎn)
(1-1)使用病毒的方法(在下文中被稱作“病毒方法”)
在本實施例中，使用其中摻入了編碼每種因子C、因子B和前凝固酶的基因的重組桿狀病毒在昆蟲細胞中表達所述因子，并由此生產(chǎn)內(nèi)毒素測量劑。
[0083]( 1-1 -1 )重組桿狀病毒的制備
使用通常可得到的協(xié)議服務(wù)(TAKARA BIO INC.)，完全合成了 SEQ ID勵:7的0嫩，作為編碼HiS-標(biāo)簽連接的因子C的DNA (HiS-標(biāo)簽連接的因子C基因)。His-標(biāo)簽連接的因子C是在SEQ ID N0:2中顯示的日本鱟的因子C，其中6XHis-標(biāo)簽連接至C-端。將所述DNA插入在轉(zhuǎn)移載體pPSC8 (Protein Sciences)的限制性酶Μ?Ι和的識別位點之間，以得到用于重組的載體。使用用于重組的載體，將His-標(biāo)簽連接的因子C基因摻入桿狀病毒AcNPV中，以制備重組桿狀病毒。
[0084]此外，使用引物FC-N-Pst (SEQ ID NO: 10)和引物 FC-notag-R-Bam (SEQ IDNO: 11)并使用上述的編碼His-標(biāo)簽連接的因子C的DNA作為模板，進行PCR以制備編碼因子C的DNA，其中編碼在3’ -末端處的HiS-標(biāo)簽序列的核苷酸序列被除去(不含HiS-標(biāo)簽的因子C基因)。該DNA編碼在SEQ ID NO: 2中顯示的日本鱟因子C，其中在C-端處沒有連接His標(biāo)簽。對于不含His-標(biāo)簽的因子C基因，也通過如上所述的相同方法制備重組桿狀病毒。
[0085]使用通?？傻玫降膮f(xié)議服務(wù)(TAKARA BIO INC.)，完全合成了 SEQ ID NO: 8的DNA，作為編碼因子B的DNA(因子B基因)。該DNA編碼在SEQ ID N0:4中顯示的日本鱟因子B (不含His-標(biāo)簽)，并且它的密碼子組合為在昆蟲細胞中的表達進行了優(yōu)化。對于因子B基因，也通過如上所述的相同方法制備重組桿狀病毒。但是，在PPSC8載體中的插入位置是在限制性酶AiI和治的識別位點之間。
[0086]使用通?？傻玫降膮f(xié)議服務(wù)(TAKARA BIO INC.)，完全合成了 SEQ ID N0:9的DNA，作為編碼前凝固酶的DNA(前凝固酶基因)。該DNA編碼在SEQ ID NO:6中顯示的日本鱟前凝固酶(不含His-標(biāo)簽)，并且它的密碼子組合為在昆蟲細胞中的表達進行了優(yōu)化。對于前凝固酶基因，也通過如上所述的相同方法制備重組桿狀病毒。但是，在PPSC8載體中的插入位置是在限制性酶XbaI和BglII的識別位點之間。
[0087](1-1-2)用重組桿狀病毒感染昆蟲細胞(Sf9細胞)
以1.5 X IO6細胞/mL，將Sf9細胞(Novagen)接種在培養(yǎng)基中，并將在其中弓丨入了編碼Hi S-標(biāo)簽連接的因子C的DNA的重組桿狀病毒加入培養(yǎng)基中，以用所述病毒感染所述細胞。使用補充了抗生素(抗生素-抗真菌劑(X 100) ;Invitrogen)(終濃度，XI)的Sf900II培養(yǎng)基(InvitiOgen) (I L)，作為Sf9細胞的培養(yǎng)基。將病毒的感染復(fù)數(shù)(MOI)設(shè)定為
1.0。此后，將得到的細胞在搖動下在28°C培養(yǎng)48小時。
[0088]類似地，用在其中引入了編碼不含His-標(biāo)簽的因子C的DNA的病毒感染Sf9細胞。
[0089]此外，還用下述每種病毒感染Sf9細胞:向其中引入了編碼因子B的DNA的病毒，和向其中引入了編碼前凝固酶的DNA的病毒。在這些情況下，將MOI設(shè)定為0.5，培養(yǎng)時間為72小時。
[0090]( 1-1 - 3 )表達的重組蛋白的溶液的回收
將上述培養(yǎng)以后得到的每種培養(yǎng)液在4°C在3000Xg離心30分鐘以得到上清液，然后將上清液在-80°C保存。
[0091]( 1-1 - 4 )從重組蛋白溶液除去雜質(zhì)和病毒
將已經(jīng)如上所述冷凍保存的每種上清液融化，并應(yīng)用于具有0.1 μ m孔徑的濾器(CupFilter (Millipore))。在抽吸下進行過濾,并回收已經(jīng)穿濾器的溶液。將每種回收的上清液應(yīng)用于具有500 kDa孔徑的中空纖維過濾膜(聚醚砜中空纖維膜；Spectrum Labs),并使用Kros Flow TFF泵過濾系統(tǒng)(Spectrum Labs)過濾?；厥找呀?jīng)穿過膜的每種溶液。
[0092]( I — I — 5 )試劑的制備
在4°C，將560 mL在上面(1-1-4)得到的每種溶液(其中含有因子C、因子B或前凝固酶)、134 mL蒸懼水、126 mL 6.66 mM的合成底物(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA)的水溶液(終濃度，0.3 mM)和560 mL 15%的葡聚糖水溶液(終濃度，3%)混合到一起。將該混合物以
5mL體積等分分進管形瓶中并冷凍干燥，以得到內(nèi)毒素測量劑I。
[0093](1-2)使用質(zhì)粒的方法(在下文中也被稱作“穩(wěn)定表達細胞系方法”)
在本實施例中，將編碼每種因子C、因子B和前凝固酶的基因摻入昆蟲細胞的染色體中以構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞系，然后表達每種因子，由此生產(chǎn)內(nèi)毒素測量劑。
[0094]( I — 2 — I )穩(wěn)定表達細胞系的制備和培養(yǎng)
使用pIZ載體試劑盒(Invitrogen),將在上述的病毒方法中使用的每種不含His-標(biāo)簽的因子C基因，因子B基因(SEQ ID NO:8)和前凝固酶基因(SEQ ID NO:9)引入Sf9細胞(Invitrogen)中。
[0095]更具體地，首先將每種DNA摻入在試劑盒所含的載體pIZ/V5_His的及^1^和#々/1識別位點之間，并將得到的每種載體與試劑盒所含的Cellfectin混合，隨后將所述載體引入Sf9細胞中。DNA在pIZ/V5-His中的摻入位置等顯示在圖2中。在圖2的頂部所示的厚箭頭指示的區(qū)域中，摻入了每種DNA。使用補充了抗生素(抗生素-抗真菌劑(XlOO)；Invitrogen)(終濃度，X I)和 Zeocin 抗生素(Invitrogen)(終濃度，50 μ g/mL)的Sf900 III培養(yǎng)基(Invitrogen)作為Sf9細胞的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中將如此得到的細胞系(其中引入了每種DNA)的密度調(diào)至6X IO5細胞/mL (IL)，并將所述細胞在搖動下在28°C培養(yǎng)96小時。
[0096]應(yīng)當(dāng)指出，盡管在pIZ/V5_His中含有His標(biāo)簽序列，所有上述的DNA具有終止密碼子，從而在沒有添加His-標(biāo)簽的情況下表達所有因子C、因子B和前凝固酶。
[0097](1-2-2)重組蛋白溶液的回收、雜質(zhì)的除去和試劑的制備
以與關(guān)于病毒方法的“(1-1-3)表達的重組蛋白的溶液的回收”、“(1-1-4)從重組蛋白溶液除去雜質(zhì)和病毒”和“(1-1-5)試劑的制備”中所述的相同方式，處理在上述培養(yǎng)以后得到的每種培養(yǎng)液。但是，沒有進行“(1-1-4)從重組蛋白溶液除去雜質(zhì)和病毒”中的使用中空纖維過濾膜的過濾過程。將如此得到的測量劑作為內(nèi)毒素測量劑2提供。
[0098]實施例2:表達的蛋白質(zhì)的性能等 (2-1)因子C的表達水平的對比
在通過病毒方法和穩(wěn)定表達細胞系方法得到的不含His-標(biāo)簽的因子C和通過病毒方法得到的Hi S-標(biāo)簽連接的因子C之間，對比了表達水平。
[0099]如下評價了表達水平:取0.5、1.5、5或15 μ L與在實施例1中過濾以后且在制備試劑之前的溶液相對應(yīng)的溶液，并對取樣的溶液進行在有SDS存在下的5-20%聚丙烯酰胺凝膠電泳(在非還原條件下)，然后使用抗-因子C抗體(2C12,得自Shun-1chiro Kawabata教授,Department of Biology, Graduate School of Sciences, Kyushu University)進行蛋白質(zhì)印跡法。
[0100]結(jié)果顯示在圖3中。結(jié)果指示，不含HiS-標(biāo)簽的因子C的表達水平低于HiS-標(biāo)簽連接的因子C的表達水平。此外，使用光密度計測量了圖3中的蛋白質(zhì)印跡上的帶的強度，并且，基于測得的強度的相對值，計算用于得到相等因子C濃度的每種溶液的體積比。通過病毒方法得到的不含His-標(biāo)簽因子C的體積比為50，通過穩(wěn)定表達細胞系方法得到的不含His-標(biāo)簽因子C的體積比為17，`通過病毒方法得到的His-標(biāo)簽連接的因子C的體積比為7。
[0101]( 2 — 2 )因子C的活性的對比
使用等量的因子C，研究了每種因子C溶液的前凝固酶活化能力。
[0102]更具體地，將每種通過病毒方法得到的His-標(biāo)簽連接的因子C溶液(0.7 μ L或5 μ L)、通過病毒方法得到的不含His-標(biāo)簽的因子C溶液(5 μ L)和通過穩(wěn)定表達細胞系方法得到的不含His-標(biāo)簽的因子C溶液(1.7 UL)放入96-孔板的孔中。此后，向每個孔中加入含有因子B的溶液(5 μ L)和含有前凝固酶的溶液(5 μ L)(在實施例1的病毒方法中在(1-1-4)中穿過0.1 μπι濾器過濾以后得到)、以及Boc-Leu-Gly-Arg-pNA (終濃度，0.3 mM)、Tris-HCl (pH 8.0)(終濃度，100 mM)和 50 μ L 內(nèi)毒素(產(chǎn)品名“USP-參比標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素”(USP-Reference Standard Endotoxin, (USP-RSE);可商購得自 SeikagakuBiobusiness Corporation)(樣品濃度:0、0.05或0.5 EU/mL),使得孔中的總體積變?yōu)?00μ L，并混合到一起，隨后在37°C溫育3小時，在這期間，隨著時間測量在405 nm的吸光度。使用蒸餾水作為陰性對照。吸光度的增加速率(吸光度變化速率)反映了前凝固酶活化能力。術(shù)語“EU”是指“內(nèi)毒素單位”，它是代表內(nèi)毒素的量的單位(這也適用于下文中)。
[0103]結(jié)果顯示在圖4中。在圖4中，“DW”是指蒸餾水；“病毒+ His標(biāo)簽(xl) ”是指通過病毒方法得到的His-標(biāo)簽連接的因子C溶液(0.7 UL);“病毒+ His標(biāo)簽(x7)”是指相同的溶液(5 UL)病毒且無標(biāo)簽(xl) ”是指通過病毒方法得到的不含His-標(biāo)簽因子C溶液；和“穩(wěn)定的Sf9且無標(biāo)簽(xl) ”是指通過穩(wěn)定表達細胞系方法得到的不含His-標(biāo)簽因子C溶液。
[0104]結(jié)果，在含有等量的因子C的His-標(biāo)簽連接的因子C溶液(0.7 UL)中，并且甚至在含有約7倍量的因子C的溶液(5 μ L)中，沒有觀察到或幾乎沒有觀察到前凝固酶的活化。另一方面，不含His-標(biāo)簽的因子C表現(xiàn)出顯著的前凝固酶活化能力，不論它是通過病毒方法得到還是通過穩(wěn)定表達細胞系方法得到。
[0105]上述結(jié)果表明，與在添加His-標(biāo)簽序列的情況下表達的重組因子C分子相比，在沒有添加His-標(biāo)簽序列的情況下表達的重組因子C分子具有強得多的前凝固酶活化能力。此外，表明了每種表達的蛋白質(zhì)可以以在培養(yǎng)物上清液中含有的蛋白質(zhì)的狀態(tài)不經(jīng)純化地使用。
[0106]( 2 - 3 )表達的因子C的穩(wěn)定性的對比 (2-3-1)通過病毒方法表達的因子C的穩(wěn)定性
在實施例1的病毒方法中在(1-1-2)中在搖動下在28°C培養(yǎng)病毒感染的細胞的步驟中，在培養(yǎng)48小時、72小時和96小時以后回收上清液，并對每種回收的上清液進行在有SDS存在下的5-20%聚丙烯酰胺凝膠電泳(在非還原條件下)，然后使用抗-因子C抗體(2C12，其與上面使用的相同)通過蛋白質(zhì)印跡法評價因子C的剩余量。此外，以相同的方式對通過在病毒感染24小時后向培養(yǎng)液中加入蛋白酶抑制劑(終濃度為0.5 μ g/mL的亮抑酶肽+終濃度為0.7 μ g/mL的抑胃酶肽A)得到的上清液分別進行取樣和分析。
[0107]結(jié)果顯示在圖5中。結(jié)果表明，通過病毒方法表達的因子C在培養(yǎng)期間隨著時間而分解。此外，表明了在加入蛋白酶抑制劑的情況下，也發(fā)生某種程度的因子C的分解。
[0108](2-3-2)通過穩(wěn)定表達細胞系方法表達的因子C的穩(wěn)定性
類似地，在實施例1的穩(wěn)定表達細胞系方法中在(1-2-1)中在搖動下在28°C培養(yǎng)穩(wěn)定表達細胞系的步驟中，在培養(yǎng)72小時、96小時、120小時、144小時和168小時以后回收上清液，并對每種回收的上清液進行在有SDS存在下的5-20%聚丙烯酰胺凝膠電泳(在非還原條件下)，然后使用抗-因子C抗體(2C12，其與上面使用的相同)通過蛋白質(zhì)印跡法評價因子C的剩余量。此外，還將通過病毒方法培養(yǎng)48小時以后得到的上清液上樣。
[0109]結(jié)果顯示在圖6中。結(jié)果，在沒有蛋白酶抑制劑存在下，即使在培養(yǎng)168小時以后，通過穩(wěn)定表達細胞系方法表達的因子C也沒有分解。由此表明，穩(wěn)定表達細胞系方法的應(yīng)用可以防止因子C的分解。 [0110](2-4)關(guān)于中空纖維膜過濾處理是否必要的研究
研究了在病毒方法中在(1-1-4)中的中空纖維過濾膜處理是否是必要的。使用在(1-1-4)中穿過中空纖維膜過濾之前取樣的每種溶液和在(1-1-4)中穿過中空纖維膜過濾之后取樣的每種溶液(3批)，通過加入內(nèi)毒素(USP-RSE)至O或0.05 EU/mL的終濃度，以與上面(2-2)相同的方式測量了吸光度的增加速率(吸光度變化速率)。
[0111]結(jié)果顯示在圖7中。在圖7中，“未過濾的溶液”是指沒有過濾的保留在中空纖維膜筒中的溶液。在使用穿過中空纖維膜過濾后取樣的每種溶液的情況下，當(dāng)內(nèi)毒素的濃度為O EU/mL時，前凝固酶的活化度較低(換而言之，在內(nèi)毒素測量后的空白值較低)，也就是說，得到了優(yōu)良結(jié)果。相反，表明了在使用穿過中空纖維膜過濾之前取樣的每種溶液(“過濾前”或“未過濾的溶液”)的情況下，即使在O EU/mL內(nèi)毒素的情況下，前凝固酶的活化程度也較高，這會導(dǎo)致在內(nèi)毒素測量后的高空白值。
[0112]相反，通過穩(wěn)定表達細胞系方法，即使沒有這樣的穿過中空纖維過濾膜的過濾過程，在O EU/mL內(nèi)毒素的情況下前凝固酶的活化程度(在內(nèi)毒素測量后的空白值)保持較低(圖4)。
[0113]這些結(jié)果表明，盡管在使用病毒方法的情況下，穿過中空纖維過濾膜的過濾是必不可少的，但是在使用穩(wěn)定表達細胞系方法的情況下，這樣的過濾不是必需的。
[0114]實施例3:使用本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑測量內(nèi)毒素 (3-1)使用內(nèi)毒素測量劑I的測量
向內(nèi)毒素測量劑I (冷凍干燥產(chǎn)品)中，加入3.3 mL 100 mM Tris緩沖液(pH 8.0)，以溶解該試劑。在該溶液中，含有因子C、因子B和前凝固酶的每種培養(yǎng)物上清液的蛋白濃度為約60 μ g/mL。
在96-孔微孔滴定板的每個孔中，加入50 4 1^農(nóng)度為0、0.001、0.01或0.1 EU/mL的內(nèi)毒素溶液的等分試樣，并將50 μ L通過溶解所述試劑制備的內(nèi)毒素測量劑溶液加入每個孔中，隨后混合得到的混合物。然后將混合物在37°C溫育30分鐘，并根據(jù)反應(yīng)速率方法測量內(nèi)毒素濃度，其中在溫育過程中隨時間測量在405 nm的吸光度。在該反應(yīng)溶液中,含有因子C、因子B和前凝固酶的每種培養(yǎng)物上清液的蛋白濃度為約30 μ g/mL。
[0115]結(jié)果顯示在圖8中。結(jié)果表明，在使用通過病毒方法表達的因子的情況下，吸光度變化速率隨著內(nèi)毒素濃度增加而在0.001-0.10 EU/mL范圍內(nèi)線性地增加。
[0116](3-2)使用內(nèi)毒素測量劑2的測量
向內(nèi)毒素測量劑2 (冷凍干燥產(chǎn)品)中，加入3.3 mL 100 mM Ifepes緩沖液(pH 7.6)，以溶解該試劑。在該溶液中，含有因子C、因子B和前凝固酶的每種培養(yǎng)物上清液的蛋白濃度為約60 μ g/mL。
在96-孔微孔滴定板的每個孔中，加入50 μ L濃度為0、0.0005,0.001,0.005,0.01或
0.1 EU/mL的內(nèi)毒素溶液的等分試樣，并將50 μ L通過溶解所述試劑制備的內(nèi)毒素測量劑溶液加入每個孔中，隨后混合得到的混合物。然后將混合物在37°C溫育30分鐘，并根據(jù)反應(yīng)速率方法測量內(nèi)毒素濃度，其中在溫育過程中隨時間測量在405 nm的吸光度。在該反應(yīng)溶液中，含有因子C、因子B和前凝固酶的每種培養(yǎng)物上清液的蛋白濃度為約30 μ g/mL。[0117]結(jié)果顯示在圖9中。結(jié)果表明，在使用通過穩(wěn)定表達細胞方法表達的因子的情況下，吸光度變化速率隨著內(nèi)毒素濃度增加而在0.0005-0.1 EU/mL范圍內(nèi)線性地增加。
[0118]基于上述結(jié)果，利用任一種內(nèi)毒素測量劑，在30分鐘內(nèi)可實現(xiàn)0.001 EU/mL濃度的內(nèi)毒素的定量。此外，利用內(nèi)毒素測量劑2，能夠在30分鐘內(nèi)測量0.0005 EU/mL濃度的內(nèi)毒素。因而，表明了與常規(guī)方法(其測量需要不小于I小時，且尚未實現(xiàn)0.001 EU/mL的檢測靈敏度)相比，本發(fā)明的內(nèi)毒素測量劑能夠更快速地且靈敏地定量內(nèi)毒素。此外，表明了在任一種情況下，表達的因子可以不經(jīng)過純化而原樣用于測量劑中。
[0119]實施例4:重組因子C蛋白和天然存在的因子C蛋白之間的活性差異 (4-1)重組因子C蛋白和天然存在的因子C蛋白的純化
通過使2 mg抗-因子C抗體(2C12，其與上面使用的相同)與Iml瓊脂糖柱(GEHealthcare)共價連接，制備了 2個因子-C抗體柱。根據(jù)在所附的說明書中描述的方法，進行所述制備。向76 mL含有通過穩(wěn)定表達細胞方法制備的重組因子C蛋白(其通過與上面“(1-2-2)重組蛋白的回收”中所述相同的方法制備)的培養(yǎng)物上清液中，加入等量的20mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)(其含有2 M氯化鈉和2 mM EDTA)以稀釋所述培養(yǎng)物上清液，隨后將得到的稀釋液應(yīng)用于因子-C抗體柱之一。類似地，向76 mL鱟血細胞提取物中，加入等量的20 mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)(其含有2 M氯化鈉和2 mM EDTA)以稀釋所述提取物，隨后將得到的稀釋液應(yīng)用于因子-C抗體柱中的另一個。順序地用20 mL各自含有200 mM或450 mM氯化鈉的20 mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)洗滌2個柱，然后用50mM甘氨酸緩沖液(pH 2.5)進行洗脫。在預(yù)先放入了 0.025 mL IM氨丁三醇堿(Sigma)的
1.5 mL試管中，收集I mL每個洗脫的級分，以使洗脫的溶液的pH恢復(fù)至中性。
[0120]( 4 - 2 )純化的重組的和天然存在的因子C蛋白之間的濃度對比
對純化的重組的和天然存在的因子C蛋白的洗脫級分進行在有SDS存在下的5-20%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(在非還原條件下)。在該過程中，已知濃度的純化的牛血清白蛋白(=BSA)作為濃度參照物樣品也在相同的凝膠上進行分離(圖10)。用光密度計定量在考馬斯亮藍染色的凝膠上的BSA帶的強度，并相對于BSA蛋白的濃度繪圖，以制備校正曲線(圖11)?；诩兓囊蜃覥蛋白的帶強度和校正曲線，估測出純化的因子C蛋白的濃度。結(jié)果表明，關(guān)于純化的樣品，天然存在的因子C蛋白的濃度是重組因子C蛋白的濃度的約4倍。
[0121](4-3)純化的重組的和天然存在的因子C蛋白之間的活性對比
使用純化的重組的和天然存在的因子C蛋白，進行了活性對比。在該對比中，基于(4-2)的結(jié)果，在純化的因子C之間平衡蛋白濃度。在96-孔微孔滴定板的每個孔中，加入50 μ L濃度為0、0.05,0.1或0.5 EU/mL的內(nèi)毒素溶液的等分試樣。將試劑和培養(yǎng)物上清液加入每個孔中，使得反應(yīng)溶液中含有50 mM Tris緩沖液(pH 8.0)、0.2 μ g/mL的純化的因子C蛋白、30 μ g/mL的含有重組因子B和重組前凝固酶的每種培養(yǎng)物上清液的蛋白、和0.3 mM的合成底物Boc-Leu-Gly-Arg-pNA，通過加入注射用水將所述反應(yīng)溶液的總體積調(diào)至100 μ L0將反應(yīng)溶液在37°C溫育30分鐘，并根據(jù)反應(yīng)速率方法進行分析，其中在溫育過程中隨時間測量在405 nm的吸光度。
[0122]結(jié)果表明，純化的重組因子C蛋白的活性是純化的天然存在的因子C蛋白的活性的約2倍(圖12)。上述結(jié)果提示，重組因子C具有比天然存在的因子C更高的比活性。
[0123]工業(yè)適用性 通過本發(fā)明，可以快速地且高靈敏度地測量內(nèi)毒素。此外，通過本發(fā)明，可以簡單地且快速地以低成本生產(chǎn)內(nèi)毒素測量劑。因此，本發(fā)明可以非常有效地用于內(nèi)毒素的檢測。[0124] 序列表的描述
SEQ ID NO:1 日本鱟的因子C基因的DNA序列 SEQ ID NO:2 日本鱟的因子C的氨基酸序列 SEQ ID NO: 3 日本鱟的因子B基因的DNA序列 SEQ ID NO:4 日本鱟的因子B的氨基酸序列 SEQ ID NO: 5 日本鱟的前凝固酶基因的DNA序列 SEQ ID NO:6 日本鱟的前凝固酶的氨基酸序列 SEQ ID NO: 7 His-標(biāo)簽連接的因子C基因的DNA序列
SEQ ID N0:8 其密碼子為在昆蟲細胞中的表達進行了優(yōu)化的因子B基因的DNA序列 SEQ ID NO: 9 其密碼子為在昆蟲細胞中的表達進行了優(yōu)化的前凝固酶基因的DNA序列 SEQ ID NO: 10用于制備不含His-標(biāo)簽的因子C基因的引物 SEQ ID NO: 11用于制備不含His-標(biāo)簽的因子C基因的引物 SEQ ID NO: 12 肽序列
【權(quán)利要求】
1.一種內(nèi)毒素測量劑，其包含下面的蛋白(I)至(3)，該蛋白中的每一種是通過使用昆蟲細胞作為宿主進行表達可得到的重組蛋白: (1)源^包東卞墻XTachypleusiriofefliaiWs)的因子C,該因子C在C-端處不具有His-標(biāo)簽序列； (2)鱟的因子B;和 (3)鱟的前凝固酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測量劑，其中所述因子B和所述前凝固酶源自東方鱟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測量劑，其中所述因子C是下面的蛋白㈧或⑶；所述因子B是下面的蛋白(C)或⑶；且所述前凝固酶是下面的蛋白(E)或(F): (A)蛋白，其包含在SEQID NO:2中所示的氨基酸序列； (B)蛋白，其包含在SEQID NO: 2中所示的氨基酸序列，但是其包括一個或幾個氨基酸殘基的置換、缺失、插入或添加，該蛋白具有因子C活性； (C)蛋白，其包含在SEQID NO:4中所示的氨基酸序列； (D)蛋白，其包含在SEQID NO:4中所示的氨基酸序列，但是其包括一個或幾個氨基酸殘基的置換、缺失、插入或添加，該蛋白具有因子B活性； (E)蛋白，其包含在SEQID N0:6中所示的氨基酸序列； (F)蛋白，其包含在SEQID NO:6中所示的氨基酸序列，但是其包括一個或幾個氨基酸殘基的置換、缺失、插入或添加，該蛋白具有前凝固酶活性。
4.一種用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任一項所述的測量劑的方法，該方法包括下面的步驟㈧至(C): (A)將下面DNA(I)至(3)中的每一種摻入病毒DNA中的步驟:(1)DNA，其編碼源自東方鱟的因子C，該因子C在C-端處不具有His-標(biāo)簽序列； (2)DNA，其編碼鱟的因子B;和 (3)DNA，其編碼鱟的前凝固酶； (B)用其中摻入了所述每種DNA的病毒感染昆蟲細胞的步驟；和 (C)使被所述每種病毒感染的昆蟲細胞表達由所述每種DNA編碼的蛋白的步驟。
5.一種用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任一項所述的測量劑的方法，該方法包括下面的步驟㈧至(C): (A)將下面DNA(I)至(3)中的每一種摻入載體中的步驟:(1)DNA，其編碼源自東方鱟的因子C，該因子C在C-端處不具有His-標(biāo)簽序列； (2)DNA，其編碼鱟的因子B;和 (3)DNA，其編碼鱟的前凝固酶； (B)將其中摻入了所述每種DNA的載體引入昆蟲細胞中以使所述每種DNA摻入昆蟲細胞的染色體中的步驟；和 (C)使其中摻入了所述每種DNA的昆蟲細胞表達由所述每種DNA編碼的蛋白的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述編碼因子C的DNA是下面的DNA(A)或(B);所述編碼因子B的DNA是下面的DNA (C)或⑶；且所述編碼前凝固酶的DNA是下面的 DNA (E)或(F): (A)DNA，其包含在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；(B)DNA，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的全長或部分的互補序列雜交，且編碼具有因子C活性的蛋白； (C)DNA，其包含在SEQ ID N0:3或8中所示的核苷酸序列； (D)DNA，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO: 3或8所示核苷酸序列的全長或部分的互補序列雜交，且編碼具有因子B活性的蛋白； (E)DNA，其包含在SEQ ID N0:5或9中所示的核苷酸序列； (F)DNA，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO: 5或9所示核苷酸序列的全長或部分的互補序列雜交，且編碼具有前凝固酶活性的蛋白。
7.一種在試驗樣品中測量內(nèi)毒素的方法，該方法包括:使根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任一項所述的測量劑與試驗樣品混合的步驟，和測量級聯(lián)反應(yīng)的進展的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，該方法包括:將用于檢測級聯(lián)反應(yīng)的進展的底物加入反應(yīng)系統(tǒng)中的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，該方法另外包括:基于所述底物的反應(yīng)計算試驗樣品中的內(nèi)毒素水平的步驟。`
【文檔編號】G01N33/579GK103562724SQ201280010708
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月28日
【發(fā)明者】水村光, 相澤真紀(jì), 小田俊男 申請人:生化學(xué)工業(yè)株式會社