專利名稱：一種純化抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種純化抗體的方法。例如，可以基于粗原料使用所述方法，或者作為親和色譜處理之后的步驟來(lái)除去殘存雜質(zhì)和從所述親和樹脂中泄漏的物質(zhì)。本發(fā)明還包括一種用于純化抗體的成套組件。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)由許多相互依賴的細(xì)胞類型組成，這些細(xì)胞類型共同防止身體免于細(xì)菌、寄生蟲、真菌及病毒感染以及防止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。免疫系統(tǒng)的守衛(wèi)者為巨噬細(xì)胞，它們連續(xù)地隨其宿主的血流漫游。當(dāng)被感染或免疫機(jī)制激發(fā)時(shí)，巨噬細(xì)胞通過吞噬標(biāo)記有被稱為抗原的外來(lái)分子的侵入病菌來(lái)予以響應(yīng)。由輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的該事件引起復(fù)雜的響應(yīng)鏈條從而導(dǎo)致B細(xì)胞激化。接著，這些B細(xì)胞產(chǎn)生被稱為抗體的蛋白質(zhì)，其與所述外來(lái)入侵者結(jié)合。所述抗體與抗原之間的結(jié)合事件標(biāo)記用于經(jīng)由噬菌作用或補(bǔ)體系統(tǒng)的活化的破壞的所述外來(lái)入侵者。存在著許多不同種類的抗體，亦稱為免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。它們的差異不僅在于它們的生理學(xué)作用而且在于它們的結(jié)構(gòu)?；诮Y(jié)構(gòu)視角，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)廣泛研究了IgG抗體，這或許是因?yàn)樗鼈冊(cè)诔赡耆说拿庖唔憫?yīng)中扮演著主導(dǎo)性角色。多克隆抗體是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法通過用適當(dāng)?shù)目乖饎?dòng)物免疫來(lái)制備的。在響應(yīng)過程中，所述動(dòng)物將產(chǎn)生多克隆的抗體。但是，出于諸多目的，人們希望擁有被稱為單克隆抗體的某一抗體的單個(gè)克隆。單克隆抗體(Mabs)通過由僅產(chǎn)生單一抗體的正常B細(xì)胞與異常骨髓瘤腫瘤細(xì)胞間的融合組成的雜交或融合細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。近來(lái)，將所得到的被稱為雜交瘤的雜交細(xì)胞用在標(biāo)準(zhǔn)方法中用于制備抗體。
現(xiàn)今，免疫球蛋白所具有的生物活性在人類及獸醫(yī)診斷、保健及治療部門中得到大范圍的不同應(yīng)用。事實(shí)上，近幾年來(lái)，單克隆抗體及重組抗體的構(gòu)建已經(jīng)成為目前臨床試驗(yàn)中所研究的并獲得FDA批準(zhǔn)作為治療法及診斷法的最龐大的蛋白質(zhì)種類。與表達(dá)系統(tǒng)及制備策略互補(bǔ)，需要高效純化流程來(lái)以簡(jiǎn)單并且低成本的方式獲得高純度的抗體。
用于分離免疫球蛋白的傳統(tǒng)方法是基于包含所述免疫球蛋白的蛋白質(zhì)部分的選擇性可逆沉淀而將其他類的蛋白質(zhì)留在溶液中。典型的沉淀劑為乙醇、聚乙二醇、易溶鹽例如硫酸銨及磷酸鉀、以及辛酸。一般地，這些沉淀法得到非常不純的產(chǎn)物而且同時(shí)耗時(shí)費(fèi)工。此外，所述沉淀劑向原材料中的添加使得難以將上清液用于其他目的而產(chǎn)生排放問題，當(dāng)論及免疫球蛋白的大規(guī)模純化時(shí)，這一問題尤其需要加以關(guān)注。
一種用于免疫球蛋白分離的可選方法為色譜法，其包括一系列相近關(guān)聯(lián)的分離方法。色譜法區(qū)別于大多數(shù)其他物理及化學(xué)分離方法的特征在于將兩種相互不混溶的相相接觸，其中一相為固定的而另一相為流動(dòng)的。當(dāng)引入流動(dòng)相中的樣品混合物被流動(dòng)相載運(yùn)通過系統(tǒng)時(shí)，與固定相及流動(dòng)相進(jìn)行一系列相互作用。相互作用利用所述樣品中組分的物理或化學(xué)性質(zhì)的差異。這些差異決定單個(gè)組分在流過包含固定相的色譜柱的流動(dòng)相的影響下的遷移速度。所分離的組分按照與所述固定相的相互作用漸增的次序出來(lái)。最少阻滯的組分首先被洗脫，而最強(qiáng)保留的材料最后被洗脫。當(dāng)一種組分被足夠阻滯從而防止與作為從所述柱洗脫的樣品組分的相鄰溶質(zhì)區(qū)帶重疊時(shí)，則實(shí)現(xiàn)分離。現(xiàn)在不斷地進(jìn)行著努力來(lái)設(shè)計(jì)用于每個(gè)特定分離目的的最佳固定相。這種固定相通常由已經(jīng)連接有包含官能團(tuán)即結(jié)合基團(tuán)的配體的載體或基礎(chǔ)基質(zhì)(base matrix)組成。通?；谄淅玫南嗷プ饔玫脑瓌t引用每種色譜法，例如離子交換色譜法、疏水性相互作用色譜法及親和色譜法。
離子交換色譜法經(jīng)常在用于分離免疫球蛋白的流程中被使用。在陰離子交換色譜法中，免疫球蛋白的帶負(fù)電荷的氨基酸側(cè)鏈將與色譜基質(zhì)的帶正電荷的配體相互作用。在另一方面，在陽(yáng)離子交換色譜法中，免疫球蛋白的帶正電荷的氨基酸側(cè)鏈將與色譜基質(zhì)的帶負(fù)電荷的配體相互作用。
疏水性相互作用色譜法(HIC)是所描述的并在用于分離免疫球蛋白的流程中使用的另一種方法。如果目的是獲得高純度的免疫球蛋白產(chǎn)物，通常推薦將HIC與一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步的步驟相結(jié)合。在HIC中，為了使所述免疫球蛋白有效地結(jié)合到HIC基質(zhì)，需要將易溶鹽添加到所述流動(dòng)相中。隨后通過降低易溶鹽的濃度來(lái)將所結(jié)合的免疫球蛋白從所述基質(zhì)釋放。因此，該過程的缺點(diǎn)是需要將易溶鹽添加到原材料中，由此可能帶來(lái)問題并因之提高大規(guī)模使用者的成本。例如，對(duì)于原材料例如乳清、血漿及蛋黃，向所述原材料中加入易溶鹽在許多情況下將在大規(guī)模應(yīng)用中被禁止，因?yàn)樗鳆}可能妨礙所述免疫球蛋白已被耗盡的原材料的任何經(jīng)濟(jì)上可行的使用。以大規(guī)模方式應(yīng)用的其他問題將是數(shù)千升廢料的排放。
親和色譜法基于目標(biāo)生物分子與生物特異性配體之間以鎖-匙識(shí)別原則的特定相互作用。因此，所述目標(biāo)與配體將形成親和對(duì)，例如抗原/抗體、酶/受體，等等。基于蛋白質(zhì)的親和配體為大家所熟知，例如蛋白A及蛋白G親和色譜法，二者都是廣泛使用的抗體分離及純化方法。眾所周知的是蛋白A色譜法提供顯著的特異性，特別是對(duì)于單克隆抗體，并且因之可獲得高純度。將其與離子交換作用、疏水性相互作用、羥磷灰石和/或凝膠過濾步驟結(jié)合使用，基于蛋白A的方法已經(jīng)成為許多生物制藥公司選擇的抗體純化方法，參見，例如WO8400773及US 5,151,350。但是，由于所述蛋白質(zhì)的肽鍵，蛋白A基質(zhì)顯示出一定程度的堿敏感性。另外，當(dāng)將蛋白A基質(zhì)用于從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化抗體時(shí)，來(lái)源于所述細(xì)胞的蛋白酶可引起蛋白A或其肽片段的泄漏。
在WO 03/041859(Boehringer Ingelheim Pharma KG)中已經(jīng)介紹了減少來(lái)自親和色譜法基質(zhì)的配體泄漏的嘗試，其中建議用至少一種表面活性劑預(yù)處理例如蛋白A基質(zhì)從而減少配體泄漏。所述親和基質(zhì)可以被處理，例如用5-15倍柱床體積的表面活性劑。所述接觸時(shí)間對(duì)于所述方法的效果是決定性的。例如，在室溫下，需要至少16小時(shí)的接觸時(shí)間用于減少泄漏。
US 4,983,722(Miles Inc.)中提供了一種解決來(lái)自親和色譜法基質(zhì)的配體泄漏問題的可選方法，其中蛋白A通過將其暴露于陰離子交換材料而從包含抗體及蛋白A的液體中被選擇性分離。兩種組分被吸附到所述陰離子交換材料上，然后在提高離子強(qiáng)度的條件下順序洗脫所述抗體及蛋白A。示例性的陰離子交換劑為二乙基氨基乙基(DEAE)Trisacryl M或DEAE瓊脂糖TM。
WO 2004/076485(Lonza Biologies Plc.)涉及通過蛋白A及離子交換色譜法進(jìn)行抗體純化。所述離子交換作用步驟包括在允許蛋白A結(jié)合的條件下將所純化的抗體加載在離子交換材料上的蛋白A上以及在流通液(flow-through)中收集所述抗體。所述陰離子交換劑為基于季銨的陰離子交換劑，最優(yōu)選瓊脂糖TMQ(Amersham Biosciences，現(xiàn)在是GE Healthcare)。
US 5,429,746(SmithKline Beecham Corp.)涉及一種方法，其中所述抗體首先被吸附到蛋白A色譜載體上并洗脫；然后被吸附到陽(yáng)離子交換色譜載體上并選擇性地從該處洗脫；以及最后被吸附到HIC載體上并洗脫。施加于所述HIC柱且接著進(jìn)行親和和/或陽(yáng)離子交換色譜處理的混合物可以包含免疫球蛋白聚集體、錯(cuò)誤折疊的物種、宿主細(xì)胞蛋白及來(lái)自所述親和色譜法步驟的殘余材料。
US 6,498,236(Upfront Chromatography)涉及由基于蛋白質(zhì)的親和配體與目標(biāo)免疫球蛋白之間分子量的小差異引起的具體問題。因此，公開了一種用于從溶液中分離或純化免疫球蛋白的方法，所述溶液例如是雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、動(dòng)物血漿或血清(ser)，該方法被建議作為使用蛋白A、蛋白G、合成肽及其他相對(duì)高分子量的配體的一種代替。在所公開的方法中使用的固相基質(zhì)由式M-SP1-X-A-SP2-ACID定義，其中M表示基質(zhì)骨架，SP1表示間隔區(qū)(spacer)，X表示O、S或NH，A表示單或二環(huán)的任選地被取代的芳香族或雜芳香族部分，SP2表示任選的間隔區(qū)以及ACID表示酸性基團(tuán)。所述具體的取代基被認(rèn)為對(duì)于所述基質(zhì)是否將有效地結(jié)合免疫球蛋白是決定性的。
US 5,945,520(Burton等)公開了混合模式的色譜樹脂，其在結(jié)合的pH值下顯示出疏水性特征并在解吸附的pH值下顯示出親水和/或靜電特征。所述樹脂被具體地設(shè)計(jì)來(lái)在低及高兩種離子強(qiáng)度下都從水溶液中結(jié)合所述目標(biāo)化合物。因此，所述吸附步驟使用HIC，而解吸附基于電荷排斥。
US 6,702,943(Johansson等)公開了一種通過將其吸附到帶有多個(gè)包含陰離子交換基團(tuán)及疏水性結(jié)構(gòu)的配體的基質(zhì)而從液體中移去目標(biāo)物質(zhì)的方法。更具體地說，所述配體在帶正電荷的陰離子交換基團(tuán)附近包含芳香環(huán)。一般認(rèn)為包括其他能夠提供電子給體-電子受體相互作用的基團(tuán)可以提高所述物質(zhì)與所述吸附劑之間的相互作用的強(qiáng)度。認(rèn)為所希望的物質(zhì)是細(xì)胞、細(xì)胞的部分及包含肽結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。對(duì)于對(duì)照蛋白例如牛血清清蛋白及IgG’定義了所述基質(zhì)的突破容量(break-through capacity)。所公開的配體由于它們?cè)诟邼舛鹊柠}例如0.25MNaCl下吸附目標(biāo)物質(zhì)的能力而被稱為“高鹽配體”。
進(jìn)一步地，WO 01/38228(Belew等)公開了另一種通過將其結(jié)合到包含混合模式的陰離子交換配體的基質(zhì)而從液體移去帶負(fù)電荷的物質(zhì)的方法。每個(gè)配體包含帶正電荷的氮以及在距離所述帶電荷的氮1-7個(gè)原子的位點(diǎn)處的硫醚鍵。類似于上述情形，所希望的物質(zhì)，例如細(xì)胞、細(xì)胞的部分及包含肽結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在0.25M NaCl左右的鹽濃度下被吸附。
已經(jīng)建議將陶瓷羥磷灰石用于免疫球蛋白的精加工。更具體地說，已經(jīng)報(bào)道可以在CHT陶瓷羥磷灰石(Bio-Rad)上將IgG1從非分級(jí)介質(zhì)中的IgG1-蛋白A復(fù)合物中分離出來(lái)(Chromatography，technote 2849；S.G.Franklin，Bio-Rad Laboratories，Inc.，2000 AlfredNobel Drive，Hercules，CA 94547 USA)。更具體地說，羥磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)為一種形式的磷酸鈣，已經(jīng)表明其具有獨(dú)特的分離特性。但是，基于羥磷灰石的基質(zhì)還已知包括某些缺點(diǎn)。例如，由于Ca-泄漏，它們?cè)谒嵝詐H值下是不穩(wěn)定的，而且它們對(duì)螯合劑例如EDTA敏感。另外，已經(jīng)表明使用基于羥磷灰石的基質(zhì)難以發(fā)展且難以擴(kuò)大規(guī)模為強(qiáng)有力且可重復(fù)的純化方法，例如，因?yàn)殡y于裝填羥磷灰石，以及難于在大型柱中保持其性能。最后，還存在由金屬離子污染及鈣離子交換所引起的樹脂性質(zhì)改變的風(fēng)險(xiǎn)，該改變與可控制的工作范圍(regulatory authorities)密切相關(guān)。
Johansson等人(Journal of Chromatography A，1016(2003)21-33“Preparation and characterization of prototypes for multi-modal separation media aimed for capture of negatively chargedbiomolecules at high salt conditions”)描述了用于從高電導(dǎo)性流動(dòng)相收集帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)的多模式配體原型的篩選。他們發(fā)現(xiàn)基于弱離子交換配體(伯及仲胺)的非芳香族多模式陰離子交換配體用于通過高鹽條件下的吸附來(lái)收集蛋白質(zhì)是最佳的。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種將抗體與液體的其他組分分離的方法，其較現(xiàn)有技術(shù)方法需要更少的時(shí)間及工藝步驟。這可以通過其中將所述包含抗體的液體與多模式分離基質(zhì)接觸以及以非結(jié)合模式回收基本上純的抗體的方法來(lái)獲得。例如，如果將所述液體施加于包含所述基質(zhì)的色譜柱，從所述流通液輕易地回收所述抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種將抗體與液體的其他組分分離的方法，其較現(xiàn)有技術(shù)方法取得了新的特性。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面是提供一種將抗體與液體的其他組分分離的方法，其中存在于粗原料例如宿主細(xì)胞蛋白中的雜質(zhì)的清除得以改善。
以下詳細(xì)說明將顯示本發(fā)明進(jìn)一步的方面和優(yōu)點(diǎn)。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1a)-d)顯示可用在本發(fā)明方法中的多模式陰離子交換配體的例證性選擇N-芐基-N-甲基乙醇胺、N，N-二甲基芐胺、2-氨基苯并咪唑及2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇(thiomicamine)。圖2顯示在多模式分離基質(zhì)上分離單克隆抗體的色譜圖，所述多模式分離基質(zhì)包括固定在瓊脂糖TM6 FF上的N-芐基-N-甲基乙醇胺；固定在瓊脂糖TM6 FF上的N，N-二甲基芐胺；以及用于對(duì)照的強(qiáng)陰離子交換劑Q瓊脂糖TMFF，如下實(shí)施例1中所描述。
圖3a)及b)顯示加載到分離基質(zhì)上的單克隆抗體的色譜圖，所述分離基質(zhì)包括以不同密度固定在瓊脂糖TM6 FF上的2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇及2-氨基苯并咪唑，如以下實(shí)施例3所描述的。
圖4a)-g)顯示采用mAb1-r蛋白A的混合物在原型上進(jìn)行色譜處理的結(jié)果。
圖5a)-h)顯示針對(duì)含有MAb 1、1％rPrA的樣品和匯集的來(lái)自圖4中的色譜操作的流通液及洗脫液餾分的分析型尺寸排阻色譜(SEC)的結(jié)果。
圖6顯示使用所述多模式基質(zhì)Q苯基瓊脂糖TMFast Flow的單克隆抗體分子的分離，如實(shí)施例5中所描述的。
定義在本說明書中，術(shù)語(yǔ)“抗體”及“免疫球蛋白”可互換使用。
術(shù)語(yǔ)“分離基質(zhì)”在本文中使用來(lái)表示由已經(jīng)偶聯(lián)有一種或多種包含官能團(tuán)的配體的載體組成的材料。
術(shù)語(yǔ)“多模式”分離基質(zhì)是指能夠提供至少兩個(gè)不同的但共同起作用的與將要被結(jié)合的所述化合物相互作用的位點(diǎn)的基質(zhì)。例如，這些位點(diǎn)之一可以在所述配體與所關(guān)心的物質(zhì)之間產(chǎn)生電荷-電荷相互作用的吸引類型。另一個(gè)位點(diǎn)可以產(chǎn)生電子受體-給體相互作用和/或疏水和/或親水作用。電子給體-受體相互作用包括例如氫鍵鍵合、π-π、陽(yáng)離子-π、電荷轉(zhuǎn)移、偶極-偶極、誘導(dǎo)偶極等等的相互作用。“多模式”分離基質(zhì)亦稱“混合模式”分離基質(zhì)。
在本文中術(shù)語(yǔ)“表面”是指所有外表面，并在多孔載體的情形下包括外表面以及孔隙表面。
短語(yǔ)“電子給體-受體相互作用”是指具有一對(duì)自由電子的作為給體并結(jié)合到缺電子原子的電負(fù)性的原子，該缺電子的原子作為所述給體的電子對(duì)的受體。(參見，例如，Karger等，An Introduction intoSeparation Science，John Wiley & Sons(1973)page 42。)在本文中術(shù)語(yǔ)“陰離子交換基團(tuán)”是指帶正電荷或可帶正電荷的基團(tuán)。
術(shù)語(yǔ)“洗脫劑”按本領(lǐng)域中它的常規(guī)含義加以使用，即，用于從分離基質(zhì)中釋放一種或多種化合物的具有適宜pH值和/或離子強(qiáng)度的緩沖液。
在液相色譜的范圍中術(shù)語(yǔ)“收集步驟”是指分離過程的起始步驟。最通常地，收集步驟包括澄清、濃縮、穩(wěn)定及從可溶雜質(zhì)中顯著純化。在收集步驟之后，可以接著進(jìn)行中間體的純化，這進(jìn)一步降低雜質(zhì)的殘余量，所述雜質(zhì)例如是宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、病毒、內(nèi)毒素、營(yíng)養(yǎng)素、細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)的組分，例如消泡劑及抗生素以及與產(chǎn)物有關(guān)的雜質(zhì)，例如聚集體、錯(cuò)誤折疊物種及聚集體。
在液相色譜范圍中術(shù)語(yǔ)“精加工步驟”是指最后的純化步驟，其中痕量雜質(zhì)被除去從而留下活性的、安全的產(chǎn)物。在所述精加工步驟期間除去的雜質(zhì)常常是所述目標(biāo)分子的構(gòu)象異構(gòu)體或可能是泄漏產(chǎn)物(leakage products)。
術(shù)語(yǔ)“Fc-結(jié)合蛋白”是指能夠結(jié)合到抗體的可結(jié)晶部分(Fc)的蛋白并且包括例如蛋白A及蛋白G，或仍保持有所述結(jié)合性質(zhì)的它們的任何片段或融合蛋白。
發(fā)明詳述在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種將抗體與液體樣品的一種或多種其他化合物分離的方法，其中將包含所述液體樣品的流動(dòng)相與多模式分離基質(zhì)接觸，從而吸附一種或多種目標(biāo)化合物而所述抗體在所述流動(dòng)相中保持游離，其中所述多模式分離基質(zhì)包含能夠與所述目標(biāo)化合物的帶負(fù)電荷的位點(diǎn)相互作用的第一基團(tuán)以及能夠與所述目標(biāo)化合物進(jìn)行除電荷-電荷相互作用以外的至少一種相互作用的第二基團(tuán)。本發(fā)明還包括其中除了所述第一和第二基團(tuán)外還加入第三或更進(jìn)一步基團(tuán)的方法。
在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，本方法使用液相色譜的原理進(jìn)行，即，通過將流動(dòng)相流過包含所述多模式分離基質(zhì)的色譜柱。所述載體可以是呈多孔或無(wú)孔顆粒，例如基本上球狀顆粒、整塊、濾料、膜、表面、毛細(xì)管的形式的，或者任何其他通常使用的形式。在一個(gè)可選實(shí)施方案中，本方法使用膨脹床色譜的原理進(jìn)行，即，通過將所述流動(dòng)相加入到分離基質(zhì)的膨脹床中，所述分離基質(zhì)呈顆粒，例如基本上球狀顆粒的形式，包含高密度填料。在另一個(gè)可選實(shí)施方案中，本方法使用分批方式工藝進(jìn)行，其中所述分離基質(zhì)被加入到包含所述液體樣品的容器中。
因此，在根據(jù)本發(fā)明的用于純化抗體的方法中，一種或多種不希望的化合物被吸附到所述分離基質(zhì)而所述希望的抗體保留在所述流動(dòng)相中而未被吸附。在本方法的范圍中，可理解的是，術(shù)語(yǔ)“目標(biāo)”化合物是指被吸附到所述分離基質(zhì)的化合物。顯然，所吸附的化合物的性質(zhì)及特性將取決于所述液體樣品的來(lái)源。目標(biāo)化合物的例子有細(xì)胞及細(xì)胞碎片；蛋白質(zhì)及肽；核酸，例如DNA及RNA；內(nèi)毒素，以及病毒。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在色譜柱中提供所述多模式分離基質(zhì)而所述流動(dòng)相靠重力和/或泵送而穿過所述柱，所述抗體在所述柱的流通液中被回收。本方法的優(yōu)點(diǎn)在于其不需要從所述柱洗脫所述抗體。從工藝角度看，避免具體的洗脫步驟是有益的，因?yàn)楦俨襟E將導(dǎo)致更為迅速的純化流程并因此降低所述工藝成本。另外，抗體對(duì)某些可能損害它們的折疊模式；或者通過破壞它們的肽鍵而使它們降解的條件是敏感的。盡管用于陰離子交換劑的洗脫條件通常不涉及任何極端的化學(xué)試劑，但是鹽及pH值的每一改變可能會(huì)影響到敏感的抗體，所述效果從種類到種類的改變?nèi)Q于pI、電荷分布等等。因此，本方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于其避免加入洗脫液并且避免對(duì)所述抗體施用洗脫條件。
如上所述，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，從其中希望分離出所述抗體的所述目標(biāo)化合物被吸附到所述多模式分離基質(zhì)。為了獲得最適于吸附目標(biāo)化合物的條件，將所述液體樣品與適當(dāng)?shù)木彌_液或其他液體混合從而提供流動(dòng)相。本方法在陰離子交換色譜法的慣用條件下方便地運(yùn)行，所述陰離子交換色譜法通常包括在相對(duì)低的鹽濃度下進(jìn)行吸附。因此，在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相的電導(dǎo)率在0-25，例如10-15mS/cm的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述流動(dòng)相的pH值為大約5-6。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地改變所述條件以獲得所述抗體的流通液，例如，通過調(diào)節(jié)pH值或電導(dǎo)率，這將取決于例如將要純化的抗體的電荷及電荷分布。如果需要，可以在任何這樣的過程(passage)之前或之間進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟。如果希望隨后釋放所吸附的化合物，例如用于所述基質(zhì)的再利用，可以在更高的鹽濃度下進(jìn)行洗脫，例如，通過利用漸增的鹽梯度。還可以或可選地改變所述pH值，例如，是一種漸減的pH值梯度，從而洗脫所吸附的化合物。
如上所述，所述多模式分離基質(zhì)包含能夠與所述目標(biāo)化合物的帶負(fù)電荷的位點(diǎn)相互作用的第一基團(tuán)以及能夠與所述目標(biāo)化合物進(jìn)行除電荷-電荷相互作用以外的至少一種相互作用的第二基團(tuán)。在這方面，可理解的是所述分離基質(zhì)的基團(tuán)的相互作用的不同模式涉及相同的目標(biāo)化合物，即，每個(gè)目標(biāo)化合物理論上通過兩種或更多種模式的相互作用被吸附。包含帶正電荷或可帶正電荷的陰離子-交換基團(tuán)的多模式配體在本領(lǐng)域中是已知的，參見，例如，US 6,702,943(Johansson等)、WO 01/38228(Belew等)及WO 02/053252(Belew等)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一基團(tuán)即所述多模式分離基質(zhì)的陰離子-交換基團(tuán)為強(qiáng)陰離子交換劑。在這方面，術(shù)語(yǔ)“強(qiáng)”陰離子交換劑被理解為在寬的pH值范圍內(nèi)保持帶電的基團(tuán)。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，所述強(qiáng)陰離子交換基團(tuán)為季胺，又名Q基團(tuán)。在一個(gè)可選實(shí)施方案中，所述多模式分離基質(zhì)的第一基團(tuán)為弱離子交換基團(tuán)。在這方面，術(shù)語(yǔ)“弱”陰離子交換劑被理解為是指在某些pH值下帶電荷但可通過改變pH值而失電荷的基團(tuán)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述第一基團(tuán)包含陰離子-交換基團(tuán)與其他官能團(tuán)的混合體，例如陰離子交換劑與氫鍵鍵合基團(tuán)的混合體。因此，在該實(shí)施方案中，所述第一基團(tuán)可以為TRIS(三(羥甲基)氨基甲烷)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多模式分離基質(zhì)的第二基團(tuán)包含芳香族基團(tuán)和/或氫鍵鍵合基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述芳香族基團(tuán)包含含有芳香族或雜芳香族結(jié)構(gòu)的環(huán)系。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，第二基團(tuán)包含苯基基團(tuán)?？蛇x地，第二基團(tuán)可以包含芳香族與非芳香族疏水基團(tuán)，例如烷基基團(tuán)的混合體。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述第一基團(tuán)包含烷基基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明所使用的分離基質(zhì)可以包含相同種類的兩個(gè)或更多個(gè)官能團(tuán)，例如兩個(gè)或更多個(gè)不同種類的疏水基團(tuán)；或包含兩個(gè)或更多個(gè)不同種類的多模式陰離子交換劑。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，在本方法中所使用的分離基質(zhì)的官能團(tuán)可以存在于相同的配體上，在這種情形下每一配體為多模式的，或在不同的配體上，在這種情形下所述分離基質(zhì)的整體性質(zhì)為多模式的。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離基質(zhì)包含偶聯(lián)到相同配體的第一和第二基團(tuán)。可以將任何一個(gè)以上所討論的第一和第二基團(tuán)用于本實(shí)施方案中，例如季胺基團(tuán)及苯基基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述配體已經(jīng)通過它們的第一基團(tuán)偶聯(lián)到所述載體，例如通過胺得到季胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二基團(tuán)彼此之間由包含1-6個(gè)，例如1-3個(gè)，優(yōu)選1-2個(gè)碳原子的烴鏈隔開。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述配體選自N-芐基-N-甲基乙醇胺、N，N-二甲基芐胺、2-氨基苯并咪唑、2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇及Q苯基。
在一個(gè)可選實(shí)施方案中，所述分離基質(zhì)包含偶聯(lián)到不同配體的第一和第二基團(tuán)?？梢詫⑷魏我粋€(gè)以上所討論的第一和第二基團(tuán)用于該實(shí)施方案中，例如季胺基團(tuán)及苯基基團(tuán)。在本實(shí)施方案中，在顆粒狀分離基質(zhì)的情形下，這種不同的配體可以以基本上相等或不等的量被固定到不同或相同的顆粒上?？蛇x地，或另外，顆粒狀分離基質(zhì)可以包含不同種類的被固定到不同顆粒上的第一基團(tuán)；或不同種類的第二基團(tuán)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地制備在本方法中所使用的多模式色譜基質(zhì)。簡(jiǎn)單地說，所述基質(zhì)由偶聯(lián)到載體的配體組成，所述載體在本領(lǐng)域中又被稱為基礎(chǔ)基質(zhì)(base matrix)，直接或間接地經(jīng)由常規(guī)的間隔區(qū)從而在載體表面與相互作用的基團(tuán)之間提供適當(dāng)?shù)拈g隔。為了獲得高吸附能力，所述載體優(yōu)選是多孔的，然后將配體偶聯(lián)到外表面以及孔隙表面。在本領(lǐng)域中將配體固定到多孔或無(wú)孔表面的方法為大家所熟知；參見，例如，Immobilized Affinity Ligand Techniques，Hermanson等，Greg T.Hermanson，A.Krishna Mallia及Paul K.Smith，Academic Press，INC，1992。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述載體表面上的配體密度在接近于通常用于常規(guī)離子交換基質(zhì)的范圍內(nèi)?？梢詫⑺雠潴w直接偶聯(lián)到所述載體，這簡(jiǎn)單地通過從所使用的化學(xué)作用引起的連接元素；或通過稱為伸出物、觸手或可彎曲臂的較長(zhǎng)元件，參見，例如，US 6,428,707，其在此收入本文作為參考。簡(jiǎn)單地說，所述伸出物可以是以聚合物例如均聚物或共聚物的形式。親水的聚合伸出物可以是合成來(lái)源的，即，具有合成骨架，或是生物來(lái)源的，即，具有天然存在的骨架的生物聚合物。典型的合成聚合物選自聚乙烯醇、聚丙烯酰胺及聚甲基丙烯酰胺以及聚乙烯基醚。典型的生物聚合物選自聚糖，例如淀粉、纖維素、右旋糖苷及瓊脂糖。
所述載體可以由有機(jī)或無(wú)機(jī)材料制成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體從天然聚合物制備，所述天然聚合物例如是交聯(lián)的碳水化合物材料，如瓊脂糖、瓊脂、纖維素、右旋糖苷、殼聚糖、魔芋膠(konjac)、卡拉膠、結(jié)冷膠(gellan)、藻酸鹽等等。所述天然聚合物載體可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法容易地制備及任選地將其交聯(lián)，例如，反向混懸液凝膠化(inverse suspension gelation)(S HjertenBiochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964)。在一個(gè)特別有利的實(shí)施方案中，所述載體是一種相對(duì)剛性的但多孔的瓊脂糖，其通過提高它的流動(dòng)性質(zhì)的方法制備，參見，例如，US 6,602,990(Berg)或SE 0402322-2(Berg等)。在一個(gè)可選實(shí)施方案中，所述載體從合成聚合物或共聚物制備，例如從交聯(lián)的合成聚合物，例如，苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等等制備。這種合成聚合物可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法容易地制備及任選地將其交聯(lián)，參見，例如，“Styrene based polymer supports developed by suspensionpolymerization”(R ArshadyChimica e L′Industria 70(9)，70-75(1988))。天然或合成聚合物載體還可以從商業(yè)來(lái)源獲得，例如GEHealthcare、Uppsala、Sweden，例如以多孔顆粒形式。在又一可選的實(shí)施方案中，所述載體從無(wú)機(jī)聚合物例如二氧化硅制備。無(wú)機(jī)多孔及無(wú)孔載體在本領(lǐng)域中為大家所熟知并且可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法容易地制備。
本分離基質(zhì)的適當(dāng)顆粒尺寸可以在5-500μm，例如10-100μm，如20-80μm的直徑范圍內(nèi)。在基本上球狀顆粒的情形下，所述平均顆粒尺寸可以在5-1000μm，例如10-500的范圍內(nèi)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述平均顆粒尺寸在10-200μm范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所使用的工藝容易地選擇適當(dāng)?shù)念w粒尺寸及孔隙率。例如，對(duì)于大規(guī)模過程，出于經(jīng)濟(jì)上的原因，可以優(yōu)選更多孔的但剛性的載體來(lái)允許大批量的加工生產(chǎn)，特別是對(duì)于所述收集步驟。在色譜法中，工藝參數(shù)例如尺寸及柱的形狀將會(huì)影響所述選擇。在膨脹床工藝中，所述基質(zhì)通常包含高密度填料，優(yōu)選不銹鋼填料。對(duì)于其他工藝，其他標(biāo)準(zhǔn)可影響所述基質(zhì)的性質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明所分離的抗體可以源自任何通常使用的來(lái)源，例如表面上所培養(yǎng)的細(xì)胞或者在發(fā)酵罐或容器中分批或連續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述液體為從細(xì)胞發(fā)酵過程得到的上清液。所吸附化合物的例子有蛋白質(zhì)、DNA、病毒、內(nèi)毒素、營(yíng)養(yǎng)素、細(xì)胞培養(yǎng)物介質(zhì)的組分，例如消泡劑及抗生素、以及與產(chǎn)物有關(guān)的雜質(zhì)，例如錯(cuò)誤折疊種類及聚集體。在所述流動(dòng)相與所述多模式分離基質(zhì)之間接觸的步驟，即，所述吸附步驟之前可以進(jìn)行機(jī)械過濾、離心分離和/或色譜處理步驟。例如，如果所述液體樣品為發(fā)酵液，在所述多模式色譜處理之前用機(jī)械方法除去細(xì)胞碎片、完整細(xì)胞及其他相對(duì)大的組分是有利的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法構(gòu)成純化流程的收集步驟。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述液體樣品為粗原料，將其在與所述多模式色譜基質(zhì)接觸之前將其過濾。因此，該實(shí)施方案將仍構(gòu)成收集步驟，盡管所述液體樣品已經(jīng)通過機(jī)械方法預(yù)純化。眾所周知，產(chǎn)生抗體的宿主細(xì)胞將還包含許多其他通常被稱為宿主細(xì)胞蛋白(HCP)的蛋白質(zhì)。這種HCP包括酶，例如蛋白酶，以及其他由所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，我們出乎意料地發(fā)現(xiàn)所述宿主細(xì)胞蛋白可以被吸附到所述多模式分離基質(zhì)上而與此同時(shí)所述抗體在所述流動(dòng)相中保持游離。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述液體樣品的基本上所有宿主細(xì)胞蛋白均被吸附到所述多模式分離基質(zhì)。
在可選的實(shí)施方案中，本方法用作提純流程中的第二、第三乃至第四步驟，例如中間體純化或精加工步驟。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，施加于所述多模式分離基質(zhì)的流動(dòng)相包含來(lái)自分離基質(zhì)的包含抗體的洗脫液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述液體樣品為來(lái)自在前的親和色譜基質(zhì)的洗脫液。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，從所述分離基質(zhì)獲得的洗脫液包含一種或多種結(jié)合Fc-的蛋白配體，例如蛋白A配體。在本文中，術(shù)語(yǔ)蛋白A配體包括天然及重組蛋白A或其官能片段。在這方面，術(shù)語(yǔ)“官能”片段是指仍保持所述蛋白的原始結(jié)合性質(zhì)的片段。這種親和性基質(zhì)是市場(chǎng)上可買到的，例如來(lái)自GE Healthcare的MabSelectTM。因此，在該實(shí)施方案中，所吸附的化合物可以是選自所釋放的蛋白A；蛋白A與抗體形成的復(fù)合物，例如蛋白A-MAb復(fù)合物，該復(fù)合物每蛋白A分子可以包含若干抗體，例如一個(gè)蛋白A分子復(fù)合有2-4個(gè)抗體；以及所釋放的蛋白A或抗體的聚集體的一種或多種復(fù)合物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，取決于在前步驟，例如親和色譜法中所使用的具體條件，所述洗脫液可需要通過適當(dāng)?shù)奶砑踊蛘{(diào)整來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此，將所述洗脫液與適當(dāng)?shù)木彌_液或液體混合從而得到流動(dòng)相。應(yīng)注意到的是，盡管出于應(yīng)用的原因這是優(yōu)選的，如果將純化來(lái)自蛋白A柱的洗脫液，本方法沒有必要緊接著所述親和色譜法進(jìn)行，甚至在相同的設(shè)備中進(jìn)行。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本方法是一種多步工藝，其包括在親和色譜基質(zhì)例如蛋白A色譜基質(zhì)上的收集步驟以及在如上所述的多模式分離基質(zhì)上的精加工步驟。施加于所述親和色譜基質(zhì)的所述液體樣品可以是細(xì)胞培養(yǎng)物液體或發(fā)酵液，其已任選地經(jīng)預(yù)處理，例如過濾和/或通過調(diào)節(jié)pH值和/或電導(dǎo)率進(jìn)行調(diào)節(jié)以提供流動(dòng)相。在該工藝中，所述收集步驟將除去一種或多種宿主細(xì)胞蛋白以及宿主細(xì)胞殘余物例如細(xì)胞碎片及蛋白質(zhì)、DNA、內(nèi)毒素等等。在隨后的精加工步驟中，以來(lái)自所述收集步驟的殘余物的形式的主要化合物，例如蛋白A-抗體聚集體，將被吸附。
本方法可用于回收任何單克隆抗體或多克隆抗體，例如源自哺乳動(dòng)物宿主，如小鼠、嚙齒類、靈長(zhǎng)類及人類的抗體，或源自雜交瘤的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所回收的抗體為人類或人源化抗體(humanised antibodies)。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，所述抗體為單體抗體。所述抗體可以為任何類別，即，選自IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述將被純化的抗體為能夠結(jié)合到蛋白A的抗體，或者含F(xiàn)c的抗體片段或融合蛋白。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所回收的抗體為免疫球蛋白G(IgG)，例如IgG1。在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法用于純化具有6-9個(gè)范圍內(nèi)，例如7-8個(gè)范圍內(nèi)的pI的抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所純化抗體的pI為大約9。在本文中，應(yīng)理解的是術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括抗體片段以及任何包含抗體或抗體片段的融合蛋白。因此，本發(fā)明還包括純化上述抗體以及包含這種抗體的融合蛋白的任何一種的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。
如以上描述所顯示的，在本方法中，不希望的化合物被吸附到所述多模式分離基質(zhì)，并回收未被吸附的抗體的基本上純的部分。在本文中，術(shù)語(yǔ)“基本上純的”被理解為是指基本上所有非抗體化合物已經(jīng)被除去。最為有利的地，雜質(zhì)總量的至少大約80％，例如至少大約95％，即，在95-100％之間，例如至少大約98％，即，在98-100％之間以及優(yōu)選至少大約99％，即，在99-100％之間在所述多模式分離基質(zhì)上被除去。但是，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)的，可能的純度將取決于施加于所述分離基質(zhì)的液體樣品中抗體的濃度以及所使用的其他條件。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本方法所分離的抗體是治療級(jí)的抗體。因此，根據(jù)本發(fā)明所純化的抗體可用于研究也可用于抗體藥物例如MAb藥物的制備。所純化抗體的一個(gè)可選用途為診斷用途。進(jìn)一步地，還可將所純化的抗體用于食品例如人類食品添加劑。例如，根據(jù)本發(fā)明所純化的牛抗體可用于食品。
在一個(gè)本方法的具體實(shí)施方案中，所述多模式分離基質(zhì)作為一次性的色譜柱或?yàn)V料提供。在用于純化治療性化合物例如抗體的方法中使用一次性產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)在于通過在使用之后丟棄所述分離基質(zhì)而消除了兩個(gè)不同工藝環(huán)節(jié)間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。在許多這種方法中，需要保持無(wú)菌條件。因此，在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多模式分離基質(zhì)已經(jīng)被滅菌，并且所述無(wú)菌多模式分離基質(zhì)作為無(wú)菌填充色譜柱或?yàn)V料被提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法按分批工藝進(jìn)行，其中一次性分離多模式基質(zhì)被加入到容納有從其中將回收所述抗體的液體的容器中。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，所述一次性分離基質(zhì)由干燥的顆粒組成，所述干燥的顆粒例如干燥的瓊脂糖顆粒，當(dāng)接觸含水液體時(shí)其容易溶脹。提供適當(dāng)?shù)臅r(shí)間用于將目標(biāo)化合物吸附到所述基質(zhì)，之后將包含所述抗體的液相從所述容器移開。然后可以將所使用的基質(zhì)丟棄，在未釋放所吸附化合物的情況下，出于安全的觀點(diǎn)，這也可是有益的，因?yàn)榛衔锢鐑?nèi)毒素、朊病毒和/或某些宿主細(xì)胞蛋白不必進(jìn)一步處理。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于從液體中的一種或多種其他組分純化抗體的成套組件，該成套組件在分離隔室中包括裝填有第一分離基質(zhì)的第一色譜柱、裝填有包含能夠與所述目標(biāo)化合物的帶負(fù)電荷的位點(diǎn)相互作用的第一基團(tuán)以及能夠與所述目標(biāo)化合物進(jìn)行除電荷-電荷相互作用以外的至少一種相互作用的第二基團(tuán)的多模式分離基質(zhì)的第二色譜柱、一種或多種緩沖液以及書面說明書。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，該說明書教導(dǎo)從多模式分離基質(zhì)的流通液中純化抗體。所述配體、載體及所述多模式分離基質(zhì)的其他細(xì)節(jié)可以是如上所述的。本說明書有益地描述了如上所定義的方法。在所述成套組件的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一分離基質(zhì)是親和色譜基質(zhì)并優(yōu)選包含蛋白配體，例如蛋白A或G配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和/或第二色譜柱是無(wú)菌的和/或一次性的柱。
最后，本發(fā)明還涉及一種用于純化抗體的一次性色譜柱，該柱包含多模式分離基質(zhì)，其含有能夠與帶負(fù)電荷的目標(biāo)位點(diǎn)相互作用的第一基團(tuán)以及能夠進(jìn)行除電荷-電荷相互作用以外的至少一種相互作用的第二基團(tuán)。所述配體、載體及所述多模式分離基質(zhì)的其他細(xì)節(jié)可以是如上所述的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離基質(zhì)能夠從其中電導(dǎo)率在0-50，例如0-25，如0-15mS/cm的范圍內(nèi)的流動(dòng)相吸附除抗體以外的蛋白質(zhì)。此方面的一個(gè)可選實(shí)施方案為一種用于純化抗體的一次性濾料，該濾料包含能夠與帶負(fù)電荷的目標(biāo)位點(diǎn)相互作用的第一基團(tuán)以及能夠進(jìn)行除電荷-電荷相互作用以外的至少一種相互作用的第二基團(tuán)，這些基團(tuán)被偶聯(lián)到所述濾料的表面。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的濾料能夠從其中電導(dǎo)率在0-50，例如0-25，如0-15mS/cm的范圍內(nèi)的流動(dòng)相中吸附除抗體以外的蛋白質(zhì)。
附圖的詳細(xì)說明在圖1中，a)顯示了所述原型多模式配體2-氨基苯并咪唑；b)顯示了所述原型多模式配體2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇；c)顯示了固定到珠粒形式的載體上的原型多模式配體N-芐基-N-甲基乙醇胺；以及d)顯示了所述原型多模式配體N，N-二甲基芐胺。在實(shí)驗(yàn)部分中，所述原型配體被偶聯(lián)到6％瓊脂糖基質(zhì)瓊脂糖TM6 FF。
圖2顯示了包含50mg Mab1的樣品施加于包含在25mM Bis-Tris、100mM NaCl(～12mS/cm)，pH值6.5中的固定在瓊脂糖TM6 FF上的N-芐基-N-甲基乙醇胺(901035A)、固定在瓊脂糖TM6 FF上的N，N-二甲基芐胺(901035B)以及Q瓊脂糖TMFF的配體的多模式分離基質(zhì)的色譜圖。使用pH值6.5的25mM Bis-Tris、0.5M NaCl進(jìn)行洗脫。
圖3a)及b)顯示了加載到原型及對(duì)照上的包含20mg MAb 2的樣品的色譜圖，如以下實(shí)施例3所述。用于平衡及加載的緩沖液是pH值為6.0的25mM Bis-Tris、100mM NaCl(～12mS/cm)。洗脫緩沖液是0.5M乙酸鈉，pH值為4.0。3a)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇(1282004，綠色)，65μmol/mL、2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇(1282002，藍(lán)色)，128μmol/mL及Q瓊脂糖TMFF(黑色)。b)2-氨基苯并咪唑(1282045，藍(lán)色)，65μmol/mL、2-氨基苯并咪唑(1282030，綠色)，146μmol/mL以及Q瓊脂糖TMFF(黑色)。
圖4a)-g)顯示用mAb1-r蛋白A在原型上進(jìn)行色譜處理的結(jié)果。A-緩沖液是pH值為6.0的25mM Bis-Tris、50mM NaCl。所述電導(dǎo)率為大約7mS/cm。將B-緩沖液0.5M乙酸鈉，pH值4.0，用于洗脫。流速為0.5mL/min(150cm/h)。樣品為濃度為4mg/mL mAb1及1％rProtein A(w/w)的10mg mAb1及0.10mg rPrA。4a)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇，65μmol/mL(1282004)；b)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇，128μmol/mL(1282002)；c)對(duì)照Q瓊脂糖TMFF；d)2-氨基苯并咪唑，65μmol/mL(1282045)；e)2-氨基苯并咪唑，146μmol/mL(1282032)；f)N-芐基-N-甲基乙醇胺，146μmol/mL(901035A)；以及g)N，N-二甲基芐胺，175μmol/mL(901035B)。
圖5a)-h)顯示了針對(duì)具有MAb 1、1％rPrA的樣品匯集的來(lái)自圖4中的色譜操作的流通液及洗脫液餾分的分析型空間排阻色譜(SEC)的結(jié)果。藍(lán)色曲線為流通液(FT)餾分而紅色為洗脫液。更具體地，圖5a)顯示了1％(w/w)的4mg/mL mAb1、0.04mg/mL rPrA的樣品；5b)顯示了來(lái)自圖4a)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇，65μmol/mL(1282004)的FT及洗脫液；5c)顯示了來(lái)自圖4b)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇，128μmol/mL(1282002)的FT及洗脫液；5d)顯示了來(lái)自圖4c)Q瓊脂糖TMFF的FT及洗脫液；5e)顯示了來(lái)自圖4d)2-氨基苯并咪唑，65μmol/mL(1282045)的FT及洗脫液；5f)顯示了來(lái)自圖4e)2-氨基苯并咪唑，146μmol/mL(1282032)的FT及洗脫液；5g)顯示了來(lái)自圖4f)N-芐基-N-甲基乙醇胺，146μmol/mL(901035A)的FT及洗脫液；以及5h)顯示了來(lái)自圖4g)N，N-二甲基芐胺，175μmol/mL(901035B)的FT及洗脫液。
圖6顯示了以下實(shí)施例5的結(jié)果。更具體地，顯示了施加于Q苯基瓊脂糖TM6 Fast Flow的包含50mg Mab的樣品所得到的色譜。用pH值為8.0的25mM Bis-Tris、0.5M NaCl進(jìn)行洗脫。圖6顯示了單克隆抗體分子怎樣沒有被吸附到Q苯基瓊脂糖TMFast Flow，因?yàn)樵谝蕴荻认疵撨M(jìn)行的色譜圖中僅觀察到非常小的峰。
實(shí)驗(yàn)部分本實(shí)施例僅以舉例說明的目的被提供，而不應(yīng)被以任何方式解釋為限制如所附權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的范圍。本說明書中，以下及其他處所提供的所有參考文獻(xiàn)在此引入本文作為參考。
分布在未結(jié)合的情況下，將包含大約50mg mAb1的樣品以大約5及12mS/cm下加載到原型901035 A(N-芐基-N-甲基乙醇胺)及901035 B(N，N-二甲基芐胺)上。在5、10及15倍柱體積(CV)時(shí)收集流通液餾分(FT)。合并來(lái)自所述洗脫峰的餾分。分析FT餾分的HCP及蛋白A含量。
對(duì)于多模式配體2-氨基苯并咪唑及2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇制備具有高及低配體密度的原型。在pH值6.5下，將包含20mgmAb1的樣品在大約5及12mS/cm下加載到所述柱。首先用分析型SEC評(píng)價(jià)所述原型的性能。分析所選擇的餾分的HCP及蛋白A含量。在用SEC篩選所述餾分之后，將所選擇的餾分送至HCP及蛋白A分析。
為了證實(shí)所述色譜性能對(duì)于某一特定mAb不是獨(dú)特的，使用包含mAb2的樣品在pH值6.0及大約12mS/cm的條件下重復(fù)所述色譜操作。首先用分析型SEC評(píng)價(jià)所述原型的性能。分析所選擇的餾分的HCP及蛋白A含量。在用SEC篩選所述餾分之后，將所選擇的餾分送至HCP及蛋白A分析。
為了更容易地區(qū)分哪個(gè)原型得到最好的r蛋白A清除率，用1％(w/w)重組蛋白A(rPrA)摻雜mAb1。將對(duì)應(yīng)于10mg mAb1、1％rProtein A的樣品量在pH值6.0及大約7mS/cm的電導(dǎo)率下注入每個(gè)原型。將流通液及洗脫液餾分分別合并并用SEC分析。
材料/研究裝置柱及凝膠得自GE Healthcare、Uppsala、SwedenHiPrepTM26/10 Desalting 目錄號(hào)17-5087-01 CV＝53.09mLTricornTM5/50目錄號(hào)18-1163-09 CV＝1mLHR5/5TM目錄號(hào)18-0338-01 CV＝1mLSuperdexTM20010/300GL ，目錄號(hào)17-5175-01 CV＝23.56mL儀器色譜系統(tǒng) KTAExplorerTM10分光光度計(jì) Spectra MAX plus化學(xué)試劑所使用的所有化學(xué)試劑為分析純。水為經(jīng)MilliQ過濾了的。
色譜介質(zhì)所述對(duì)照基質(zhì)為Q瓊脂糖TMFast Flow(FF)(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)。所述多模式分離基質(zhì)原型所攜帶的配體如下表1所述表1多模式陰離子交換配體

原型N-芐基-N-甲基乙醇胺瓊脂糖TMFast Flow的制備A.在所述基質(zhì)上引入烯丙基基團(tuán)按以下方法用烯丙基縮水甘油醚活化瓊脂糖TM6 Fast Flow(GEHealthcare，Uppsala Sweden)將100ml的瓊脂糖TM6 Fast Flow抽干，與0.3g NaBH4、12g Na2SO4及35ml 50％的NaOH水溶液混合。將所述混合物在50℃下攪拌1小時(shí)。在加入100ml烯丙基縮水甘油醚之后，將所述混懸液在50℃下強(qiáng)烈攪拌另外16小時(shí)。在將所述混合物過濾之后，將所述凝膠依次用500ml蒸餾水、500ml乙醇、200ml蒸餾水、200ml 0.2M乙酸及500ml蒸餾水洗滌。滴定給出0.22mmol烯丙基/ml凝膠的取代度。
B.通過溴化活化烯丙基瓊脂糖TM6 Fast Flow將溴加入到已攪拌過的50ml經(jīng)烯丙基活化的瓊脂糖TM6 FastFlow(0.22mmol烯丙基基團(tuán)/ml排空凝膠)、1g乙酸鈉及15ml蒸餾水的混懸液中，直到得到持久的黃色。然后加入甲酸鈉直到所述混懸液被完全脫色。將所述反應(yīng)混合物過濾而后用500ml蒸餾水洗滌所述凝膠。然后將經(jīng)活化的凝膠直接轉(zhuǎn)移至反應(yīng)容器中并進(jìn)一步與N-芐基-N-甲基乙醇胺反應(yīng)。
C.在所述經(jīng)活化的基質(zhì)上引入BMEA(N-芐基-N-甲基乙醇胺)基團(tuán)將所述胺基團(tuán)直接通過所述胺基團(tuán)的氮原子引入到所述基質(zhì)上。在一個(gè)典型的過程中，對(duì)所述基質(zhì)的偶聯(lián)通過所述烯丙基的溴化及在堿性條件下的親核取代來(lái)實(shí)現(xiàn)。將25ml經(jīng)溴活化的凝膠(0.22mmol烯丙基基團(tuán)/ml排出的凝膠)移入包含N-芐基-N-甲基乙醇胺(16.0ml)溶液的反應(yīng)小瓶中。加入5ml水，然后用氫氧化鈉溶液將所述反應(yīng)溶液的pH值調(diào)節(jié)到12.0。將所述反應(yīng)在50℃下攪拌16小時(shí)。在過濾所述反應(yīng)混合物之后，依次用3×10ml蒸餾水、3×10ml 0.5 HCl水溶液及最后用3×10ml蒸餾水洗滌所述凝膠。得到取代度為0.15mmol胺/ml凝膠的BMEA瓊脂糖TMFast Flow凝膠。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法加以制備(參見US 6,702,943(Johansson等)，WO 01/38228(Belew等)及WO 02/053252(Belew等))具有高及低配體密度的2-氨基苯并咪唑及2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇原型。
樣品使用兩種不同的人源化IgG抗體，亞類1，表示為MAb 1及MAb2，吸光系數(shù)分別為1.46及1.50。兩種抗體均是在CHO培養(yǎng)物中被表達(dá)的而后在本實(shí)驗(yàn)之前采用常規(guī)蛋白A親和色譜法加以純化。
通過以SuperloopTM(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)注入適當(dāng)體積(5-15mL)而在HiPrepTMDesalting柱(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上進(jìn)行緩沖液更換，將所述柱用所關(guān)心的緩沖液平衡。所述流速為5mL/min并收集5mL的餾分。將包含所述洗脫峰的餾分合并且一式兩份在280nm處測(cè)定吸光度，用于根據(jù)方程式1計(jì)算所述濃度A280＝ε·C·l(方程式1)
其中 A280為在280nm處的吸光度。
ε(mL*mg-1*cm-1)為特定蛋白質(zhì)的吸光系數(shù)。
C(mg/mL)為所述蛋白質(zhì)的濃度。
l(cm)為光程長(zhǎng)度。以0.5mL/min流速在uperdexTM200 10/300柱(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上進(jìn)行尺寸排阻色譜法(SEC)。所述緩沖液為PBS(磷酸緩沖鹽水)；10mM磷酸鹽、0.137M NaCl、2.7mM KCl，pH值為7.4且從片劑(Sigma，P-4417)配制。
方法平衡 2/0.1CV；2CV，第一次使用；0.1CV，在兩次操作之間樣品注射 50μl等度洗脫 1.5CV用mAb在原型上進(jìn)行色譜處理A-緩沖液為25mM Bis-Tris，pH值為6.0或6.5。取決于所希望的電導(dǎo)率，大約5或12mS/cm，包含35或100mM NaCl。對(duì)于原型901035A及901035B，洗脫緩沖液(B-緩沖液)是25mM Bis-Tris，0.5M NaCl，pH值為6.5。對(duì)于以2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇及ABI作為配體的原型，洗脫緩沖液(B-緩沖液)為0.5M乙酸鈉，pH值為4.0。所述流速為0.5mL/min(150cm/h)。
方法平衡5CV A-緩沖液樣品注射5-25mL 樣品含有20或50mg mAb洗滌5CV A-緩沖液梯度洗脫10CV0-100％B-緩沖液洗脫10CV100％B-緩沖液再生5CV A-緩沖液用MAb-rProtein A在原型上進(jìn)行色譜處理
A-緩沖液為25mM Bis-Tris，pH值為6.0。通過添加50mM NaCl，所述電導(dǎo)率為大約7mS/cm，B-緩沖液為0.5M乙酸鈉，pH值為4.0。流速為0.5mL/min(150cm/h)。樣品濃度4mg/mL MAb 1-0.04mg/mLrPrA，得到1％(w/w)。
方法平衡5CVA-緩沖液樣品注射2.5mL 10mg MAb，1％rPrA洗滌5CVA-緩沖液梯度洗脫10CV 0-100％B-緩沖液洗脫10CV 100％B-緩沖液再生5CVA-緩沖液CIP(就地清洗)在每個(gè)色譜操作之后，使所述原型及對(duì)照基質(zhì)Q瓊脂糖TMFF經(jīng)歷以下CIP過程30％異丙醇5CV(柱體積)H2O 5CV1.0M NaOH 4CV(包括15min.暫停)H2O 5CVA-緩沖液 5CVH2O 5CV20％EtOH 5CV蛋白A分析按800μl SPA樣品稀釋劑+200μl樣品的比例將所選擇的餾分與SPA樣品稀釋劑混合。在混合后，在加熱塊上在99℃下將所述餾分加熱10分鐘，然后再次混合。然后分析所述樣品的重組蛋白A。
宿主細(xì)胞蛋白(HCP)分析分析所述樣品(最小600μl)的HCP含量。檢測(cè)下限為10ng/mL。
實(shí)施例1
在原型配體N-芐基-N-甲基乙醇胺(901035A)及N，N-二甲基芐胺(901035B)上純化的含有MAb1的樣品在實(shí)施例1中，將含有50mg MAb1的樣品施加于在pH值為6.5的25mM Bis-Tris，100mM NaCl(～12mS/cm)中的固定在瓊脂糖TM6 FF上的N-芐基-N-甲基乙醇胺(901035A)、固定在瓊脂糖TM6 FF上的N，N-二甲基芐胺(901035B)以及所述對(duì)照基質(zhì)Q瓊脂糖TMFF。采用pH值為6.5的25mM Bis-Tris，0.5M NaCl進(jìn)行洗脫。
實(shí)施例1的色譜圖示于圖2，其顯示所述兩種原型N-芐基-N-甲基乙醇胺瓊脂糖TM6 FF(901035A)及N，N-二甲基芐胺瓊脂糖TM6 FF(901035B)與Q瓊脂糖TMFF的對(duì)比。用于分析而選擇的流通液(FT)餾分用箭頭指示。示于以下表2和3中的HCP及蛋白A的清除率結(jié)果顯示所述原型在這方面優(yōu)于Q瓊脂糖TMFF。
表2HCP分析結(jié)果

表3PrA分析結(jié)果

實(shí)施例2在原型配體2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇及2-氨基苯并咪唑上純化的含有MAb1的樣品在本實(shí)施例中，將含有20mg MAb1的樣品加載到原型及對(duì)照分離基質(zhì)上。用于平衡及加載的緩沖液是pH值為6.5的25mM Bis-Tris，35mM NaCl(5mS/cm)。洗脫緩沖液為0.5M乙酸鈉，pH值為4.0。a)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇，65μmol/mL(1282004)，b)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇128μmol/mL(1282002)，c)Q瓊脂糖TMFF，d)2-氨基苯并咪唑(ABI)，65μmol/mL(1282045)及e)2-氨基苯并咪唑(ABI)，146μmol/mL(1282032)。HCP及蛋白A分析的結(jié)果示于下表4及5。
表4HCP分析結(jié)果

表5PrA分析結(jié)果

實(shí)施例3在原型配體2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇及2-氨基苯并咪唑上純化的含有MAb2的樣品將含有20mg MAb2的樣品施加于原型及對(duì)照。緩沖液為25mMBis-Tris，100mM NaCl(～12mS/cm)，pH值為6.0。用pH值為4.0的0.5M乙酸鈉進(jìn)行洗脫。所得到的色譜圖示于圖3。
3a)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇(1282004，綠色)，65μmol/mL，2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇(1282002，藍(lán)色)，128μmol/mL及Q瓊脂糖TMFF(黑色)；b)2-氨基苯并咪唑(1282045，藍(lán)色)，65μmol/mL，2-氨基苯并咪唑(1282030，綠色)，146μmol/mL及Q瓊脂糖TMFF(黑色)。使用分析型SEC來(lái)選擇用于HCP及蛋白A分析的餾分，如下表6及7中所示。
表6HCP分析結(jié)果

表7PrA分析結(jié)果

實(shí)施例4在原型配體N-芐基-N-甲基乙醇胺、N，N-二甲基芐胺、2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇及2-氨基苯并咪唑上從包含MAb1及重組蛋白A(rPrA)的樣品中純化MAb1在本實(shí)施例中，用含有mAb1-r蛋白A的樣品在原型上進(jìn)行色譜處理。A-緩沖液為25mM Bis-Tris，50mM NaCl，pH值為6.0。所述電導(dǎo)率為大約7mS/cm。B-緩沖液為0.5M乙酸鈉，pH值為4.0。所述流速為0.5mL/min(150cm/h)。樣品為濃度為4mg/mL mAb1及1％rProtein A(w/w)的10mg mAb1及0.10mg rPrA。結(jié)果示于圖4。
最后，針對(duì)具有mAb1，1％rPrA的樣品以及匯集的來(lái)自圖4中的色譜操作的流通液和洗脫液餾分進(jìn)行分析SEC。結(jié)果示于圖5。在圖5a中，陰影峰為mAb1-蛋白A的復(fù)合物。藍(lán)色曲線為流通液(FT)餾分而紅色曲線為洗脫液。
實(shí)施例5在Q苯基瓊脂糖6 Fast Flow上的抗體純化分布在未結(jié)合條件下，將含有大約50mg mAb的樣品加載到原型Q苯基瓊脂糖TM6 Fast Flow上。在5、10及15倍柱體積(CV)時(shí)收集流通液餾分(FT)。分析來(lái)自所述洗脫峰的餾分。
通過按照標(biāo)準(zhǔn)方法將Q-基團(tuán)(-N(CH3)3)連接到苯基瓊脂糖TM6 Fast Flow(45μmol苯基基團(tuán)/ml凝膠)來(lái)制備Q苯基瓊脂糖TM6 FastFlow(參見下文)。Q苯基瓊脂糖TM6 Fast Flow的離子交換容量為108μmol/mL凝膠。在pH值7.0或8.0下，將含50mg mAb(MabSelect純化的)的樣品加載入所述柱中，然后通過分析所選擇的流通液餾分的宿主細(xì)胞蛋白(HCP)及蛋白A含量來(lái)評(píng)價(jià)Q苯基瓊脂糖TM6 FastFlow的性能原料/研究裝置柱及苯基瓊脂糖TM6 Fast Flow得自GE Healthcare，Uppsala，SwedenHR 5/5TM目錄號(hào)18-0338-01 CV＝1mL儀器色譜系統(tǒng)KTAExplorerTM10分光光度計(jì)Spectra MAX plus化學(xué)試劑所使用的所有化學(xué)試劑為分析純。水經(jīng)MiIIiQ過濾。
Q苯基瓊脂糖TM6 Fast Flow的制備一種從交聯(lián)的瓊脂糖凝膠(苯基瓊脂糖TM6 Fast Flow(highsub)，GE Healthcare，Uppsala，Sweden)開始的制備根據(jù)本發(fā)明的分離基質(zhì)的方法被例示如下。
在苯基瓊脂糖TM6 Fast Flow(high sub)上引入Q基團(tuán)
按以下方法通過與縮水甘油基三甲基氯化銨(G-MAC)反應(yīng)而將Q-基團(tuán)(-N(CH3)3引入到苯基瓊脂糖TM6 Fast Flow(high sub)上將15g抽干了的苯基瓊脂糖TM6 Fast Flow(high sub)與5ml水、5ml 50％NaOH水溶液、0.02g NaBH4及40ml G-MAC混合。在30℃下將所述混合物攪拌16小時(shí)。在過濾所述混合物之后，依次用100ml蒸餾水、100ml乙醇及100ml蒸餾水洗滌所述凝膠。滴定給出0.11mmol胺/ml凝膠的取代度。
樣品在CHO培養(yǎng)物中表達(dá)所使用的單克隆抗體，然后在本實(shí)驗(yàn)之前用常規(guī)蛋白A親和色譜法對(duì)該抗體加以純化。
mAb的濃度測(cè)定用緩沖液將所述mAb樣品稀釋十倍。在A280處測(cè)量一式兩份的所述樣品溶液。使用平均值根據(jù)Lambert Beer定律計(jì)算所述濃度C＝A/(l×ε)C＝IgG的濃度A＝在280nm處的吸光度l＝光程長(zhǎng)度ε＝mAb的摩爾吸光系數(shù)，mg-1ml＝1.46在Q苯基瓊脂糖TM6 Fast Flow上的色譜法在未結(jié)合條件下試驗(yàn)來(lái)自宿主細(xì)胞蛋白的mAb與蛋白A的分離。施加于所述柱的樣品為MabSelect純化過的mAb。所述流速為0.5mL/min(150cm/h)。在所有操作期間測(cè)定在280nm處的吸光度。試驗(yàn)兩種不同的緩沖液(參見下文)。在每次操作之前將緩沖液更換為A-緩沖液。取決于所述樣品體積，使用HiPrep脫鹽柱及HiTrap脫鹽柱。
緩沖液A-緩沖液25mM Tris/HCl，pH值8.0B-緩沖液25mM Tris/HCl，0.5M NaCl，pH值8.0
A-緩沖液25mM磷酸鹽緩沖液，pH值7.0B-緩沖液25mM磷酸鹽緩沖液，0.5M NaCl，pH值7.0方法將來(lái)自MabSelect的并且pH值調(diào)節(jié)過的洗脫液用作起始材料。
平衡 5CV A-緩沖液樣品注射 16CV(50mg mAb)洗滌 5CV A-緩沖液梯度 5CV 100％B-緩沖液在梯度后清洗 5CV A-緩沖液在樣品注射、洗滌及洗脫期間收集1ml餾分。
在每次操作后用1M NaOH進(jìn)行CIP(就地清洗)。所述保留時(shí)間為大約25分鐘。
蛋白A分析將所選擇的餾分按800μl SPA樣品稀釋劑+200μl樣品的比例與SPA樣品稀釋劑混合?；旌虾?，在加熱塊上在99℃下將所述餾分加熱10分鐘，然后再次混合。然后分析所述樣品的重組蛋白A。
宿主細(xì)胞蛋白(HCP)的分析分析所述樣品(最小600μl)的HCP含量。所述測(cè)量下限為10ng/mL。
結(jié)果在未結(jié)合的條件下，在兩種不同pH值(pH值7.0及8.0)下將大約50mg mAb加載到裝填有Q苯基瓊脂糖TMFast Flow的HR 5/5柱上。根據(jù)圖1在5、10及15倍柱體積(CV)時(shí)收集流通液餾分(FT)。表8及9給出了所述流通液餾分的蛋白A及HCP分析結(jié)果。沒有殘余的蛋白A可在所述餾分中被檢測(cè)到。此外，當(dāng)所使用的樣品pH值為8.0時(shí)，沒有宿主細(xì)胞蛋白可在FTl及FT2中被檢測(cè)到。當(dāng)所使用的樣品pH值為7.0時(shí)，觀察到少量宿主細(xì)胞蛋白，但與所述樣品中的HCP含量相比，HCP減少了大約50倍。圖6還表明所述單克隆抗體分子沒有被吸附到Q苯基瓊脂糖TMFast Flow，因?yàn)樵谔荻认疵摰纳V圖中僅觀察到非常小的峰(圖6)。
表8.蛋白A分析結(jié)果。

所述樣品體積為16ml而所述FT1-FT3為1ml餾分。所匯集的洗脫液體積為2ml。
表9.宿主細(xì)胞蛋白分析結(jié)果。

所述樣品體積為16ml而FT1-FT3為1ml餾分。所匯集的洗脫液體積為2ml。
權(quán)利要求
1.一種將液體樣品中的一種或多種抗體與一種或多種其他化合物分離的方法，其中將包含所述液體樣品的流動(dòng)相與多模式分離基質(zhì)接觸，從而吸附一種或多種目標(biāo)化合物而同時(shí)所述抗體在所述流動(dòng)相中仍保持游離，其中所述多模式分離基質(zhì)包含能夠與所述目標(biāo)化合物的帶負(fù)電荷的位點(diǎn)相互作用的第一基團(tuán)以及能夠與所述目標(biāo)化合物進(jìn)行除電荷-電荷相互作用以外的至少一種相互作用的第二基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在色譜柱中提供所述多模式分離基質(zhì)，所述流動(dòng)相靠重力和/或泵送流過所述柱，并且在所述柱的流通液中回收所述抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述液體樣品包含從細(xì)胞發(fā)酵過程獲得的上清液。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在與所述多模式分離基質(zhì)的接觸之前進(jìn)行機(jī)械過濾和/或色譜的步驟。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述液體樣品包括粗原料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述目標(biāo)化合物是宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)并且基本上所有的所述蛋白質(zhì)被吸附到所述的多模式分離基質(zhì)上。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述液體樣品包含來(lái)自分離基質(zhì)的洗脫液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中從其中獲得所述洗脫液的分離基質(zhì)包含蛋白配體，優(yōu)選蛋白A或G配體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中蛋白A和/或蛋白G配體被吸附到所述的多模式分離基質(zhì)上。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述流動(dòng)相的電導(dǎo)率在0-25，例如10-15mS/cm的范圍內(nèi)。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一基團(tuán)是季銨。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二基團(tuán)是氫鍵鍵合基團(tuán)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述第二基團(tuán)是疏水性基團(tuán)，例如含有芳香族或雜芳香族環(huán)結(jié)構(gòu)的基團(tuán)。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述分離基質(zhì)包含偶聯(lián)到相同配體的第一和第二基團(tuán)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述第一和第二基團(tuán)彼此間被1-3個(gè)碳原子的烴鏈隔開。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述配體已經(jīng)經(jīng)由它們的第一基團(tuán)被固定到載體上。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述分離基質(zhì)包含偶聯(lián)到不同配體的第一和第二基團(tuán)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述分離基質(zhì)是顆粒狀的并且包含第一顆粒與第二顆粒的混合物，包含所述第一基團(tuán)的配體已經(jīng)被固定到所述第一顆粒上，包含所述第二基團(tuán)的配體已經(jīng)被固定到所述第二顆粒上。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述分離基質(zhì)是濾料，并且包含所述第一基團(tuán)的第一配體與包含所述第二基團(tuán)的第二配體的混合物已經(jīng)被固定到所述濾料。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述分離基質(zhì)包含能夠與目標(biāo)化合物進(jìn)行第三相互作用的第三基團(tuán)。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述抗體是人源化抗體。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所分離的抗體是治療級(jí)的單克隆抗體。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在一次性色譜柱中提供所述的多模式分離基質(zhì)。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述一次性柱在與所述流動(dòng)相接觸之前已經(jīng)被滅菌。
26.一種用于從液體中的一種或多種其他組分中純化抗體的成套組件，該成套組件在分離的隔室中包括裝填有第一分離基質(zhì)的第一色譜柱、裝填有包含能夠與所述目標(biāo)化合物的帶負(fù)電荷的位點(diǎn)相互作用的第一基團(tuán)以及能夠與所述目標(biāo)化合物進(jìn)行除電荷-電荷相互作用以外的至少一種相互作用的第二基團(tuán)的多模式分離基質(zhì)的第二色譜柱、一種或多種緩沖液以及教導(dǎo)從多模式分離基質(zhì)的流通液中純化抗體的書面說明書。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的成套組件，其中在所述第一色譜柱中，所述分離基質(zhì)包含蛋白配體，優(yōu)選蛋白A或G配體。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或27的成套組件，其中所述分離基質(zhì)包含偶聯(lián)到相同配體的第一和第二基團(tuán)。
29.根據(jù)權(quán)利要求26或27的成套組件，其中所述分離基質(zhì)包含偶聯(lián)到不同的配體的第一和第二基團(tuán)。
30.根據(jù)權(quán)利要求26-29中任一項(xiàng)的成套組件，其中所述第一和/或第二色譜柱是一次性柱。
31.一種用于從液體中的一種或多種其他組分收集抗體的成套組件，該成套組件在分離的隔室中包括裝填有包含能夠與所述目標(biāo)化合物的帶負(fù)電荷的位點(diǎn)相互作用的第一基團(tuán)以及能夠與所述目標(biāo)化合物進(jìn)行除電荷-電荷相互作用以外的至少一種相互作用的第二基團(tuán)的多模式分離基質(zhì)的色譜柱、一種或多種緩沖液以及書面說明書。
32.根據(jù)權(quán)利要求26-31中任一項(xiàng)的成套組件，其中所述第一基團(tuán)是季銨。
33.根據(jù)權(quán)利要求26-32中任一項(xiàng)的成套組件，其中所述第二基團(tuán)是疏水性的和/或氫鍵鍵合基團(tuán)。
34.根據(jù)權(quán)利要求26-33中任一項(xiàng)的成套組件，其中所述分離基質(zhì)包含偶聯(lián)到相同配體的第一和第二基團(tuán)。
35.根據(jù)權(quán)利要求26-34中任一項(xiàng)的成套組件，其中所述分離基質(zhì)包含偶聯(lián)到不同配體的第一和第二基團(tuán)。
36.一種色譜柱，其包含含有能夠與所述目標(biāo)化合物的帶負(fù)電荷的位點(diǎn)相互作用的第一基團(tuán)以及能夠與所述目標(biāo)化合物進(jìn)行除電荷-電荷相互作用以外的至少一種相互作用的第二基團(tuán)的多模式分離基質(zhì)。
37.一種用于純化抗體的一次性色譜柱，該柱包含含有能夠與帶負(fù)電荷的目標(biāo)位點(diǎn)相互作用的第一基團(tuán)以及能夠進(jìn)行除電荷-電荷相互作用以外的至少一種相互作用的第二基團(tuán)的多模式分離基質(zhì)，這些基團(tuán)被偶聯(lián)到多孔載體的表面上。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37的色譜柱，其中所述分離基質(zhì)能夠從流動(dòng)相中吸附除抗體之外的蛋白質(zhì)，其中所述流動(dòng)相的電導(dǎo)率在0-25，例如0-15mS/cm的范圍內(nèi)。
39.一種用于純化抗體的一次性濾料，該濾料包含能夠與帶負(fù)電荷的目標(biāo)位點(diǎn)相互作用的第一基團(tuán)以及能夠進(jìn)行除電荷-電荷相互作用以外的至少一種相互作用的第二基團(tuán)，這些基團(tuán)被偶聯(lián)到所述濾料表面上。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的濾料，其能夠從流動(dòng)相中吸附除抗體之外的蛋白質(zhì)，其中所述流動(dòng)相電導(dǎo)率在0-25，例如0-15mS/cm的范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將液體樣品中的抗體與其他化合物分離的方法，其中將包含所述樣品的流動(dòng)相與多模式分離基質(zhì)接觸，從而吸附不需要的化合物而所述抗體在所述液體中仍保持游離，其中所述多模式分離基質(zhì)包含能夠與所述目標(biāo)化合物的帶負(fù)電荷的位點(diǎn)相互作用的第一基團(tuán)以及能夠與所述目標(biāo)化合物進(jìn)行除電荷－電荷相互作用以外的至少一種相互作用的第二基團(tuán)。本發(fā)明還涉及裝填有以上所描述的多模式分離基質(zhì)的色譜柱及具有吸附到其表面的這種多模式基團(tuán)的濾料。
文檔編號(hào)C07K16/00GK101043947SQ200580036075
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月21日
發(fā)明者C·恩格斯特蘭德, A·福爾斯, G·格拉德, B·-L·約翰森, H·J·約翰森, J·-L·馬洛伊塞爾 申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司