專利名稱：治療免疫性疾病的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種通過抑制T淋巴細胞的活化來治療免疫性疾病的藥物組合物，其包括選自由以下物質(zhì)組成的組中的兩種或多種物質(zhì)作為活性成分能夠阻斷MHC(主要組織相容性復合體)II類分子與其受體結合的物質(zhì)，能夠阻斷協(xié)同刺激分子與其受體結合的物質(zhì)，能夠阻斷粘附分子與其受體結合的物質(zhì)，以及能夠阻斷細胞因子與其受體結合的物質(zhì)。
背景技術：
免疫反應是保護自身免受異己例如多種雜質(zhì)、細菌或病毒攻擊的過程。免疫系統(tǒng)被精細調(diào)控使得不會攻擊自身。然而，在某些情況下，免疫反應會攻擊自身并損害機體，移植器官或組織的免疫排斥以及自身免疫性疾病是其代表性例子。
治療由器官或組織移植引起的疾病時，最重要的問題涉及到受體嚴重的移植排斥反應，發(fā)生在從供體移植組織或器官后。免疫排斥指的是受體內(nèi)試圖清除來自與受體遺傳背景不同的供體移植物的免疫反應，這是由于受體將移植物識別為外源物質(zhì)。移植排斥是源于復雜的通過T淋巴細胞介導的細胞免疫和通過抗體介導的體液免疫的聯(lián)合作用而發(fā)生，但主要是源于通過T淋巴細胞介導的細胞免疫。
治療移植排斥的一種方法是采用化合物抑制T淋巴細胞的活性。這樣的免疫抑制劑包括咪唑立賓(MZ)、環(huán)胞菌素(CsA)、他克莫司(FK-506)、硫唑嘌呤(AZ)、萊氟米特(LEF)、腎上腺皮質(zhì)類固醇例如潑尼松龍(predonisolone)或甲基潑尼松龍(methylpredonisolone)、deoxypergualin(DGS)和西羅莫司。
PCT公開出版物第WO 1999/65908號披露了一種利用吡咯[2，3-d]嘧啶化合物作為免疫抑制劑治療自身免疫性疾病的方法。PCT公開出版物第WO 2000/21979號披露了一種利用環(huán)四肽化合物治療移植排斥或自身免疫性疾病的方法。另一方面，在某些情況下，免疫細胞不能區(qū)分自身和異己(外源)物質(zhì)并攻擊自身，這種現(xiàn)象稱為“自身免疫”。自身免疫反應可以在全身各個部位引起疾病。自身免疫性疾病的例子包括風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、格雷夫斯病(Grave’sdisease)、慢性淋巴細胞性甲狀腺炎、阿狄森病(Addison’sdisease)、白癜風、硬皮病、肺出血腎炎綜合癥、Becet’s病、節(jié)段性回腸炎(Crohne’s病)、強直性脊柱炎、葡萄膜炎、血小板減少性紫癜、尋常型天皰瘡、兒童糖尿病、自身免疫性貧血、冷球蛋白血癥、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(ALD)以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。
PCT公開出版物第WO1996/40246號闡述了一種治療和預防T細胞介導的自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化的方法。該方法包括給予受治療者治療性或預防性有效量的T細胞表面受體拮抗劑，該受體介導接觸依賴性的輔助效應器功能。該拮抗劑是抗體或其片段，能夠特異性結合T細胞受體gp39。
PCT公開出版物第WO2002/22212號披露了一種治療自身免疫性疾病(尤其B細胞介導的自身免疫性疾病)的方法，利用至少一種免疫調(diào)節(jié)性抗體以及至少一種B細胞消耗性抗體的組合，例如針對CD19、CD20、CD22、CD23或CD37的抗體。
然而，上述化合物用于治療免疫性疾病時引起顯著的不良反應，從而限制了其應用。正如PCT公開出版物第WO1996/40246號中所描述的，當抗體單獨施加時，難以達到預期的療效。而且，由于自身免疫性疾病或移植排斥起因于T淋巴細胞的活化，如PCT公開出版物第WO2002/22212號中所述阻斷B細胞功能不能夠有效的抑制免疫反應。

發(fā)明內(nèi)容
通過對更有效的免疫抑制劑的開發(fā)進行深入而徹底的研究，本發(fā)明的發(fā)明人得到一個結論即當選自參與活化T淋巴細胞的幾組蛋白的至少兩組蛋白被同時阻斷時，與已知的方法相比，T淋巴細胞的活性被有效地抑制，因此促成了本發(fā)明。
一方面，本發(fā)明提供了一種通過抑制T淋巴細胞的活化來治療免疫性疾病的藥物組合物，其包括選自由以下物質(zhì)組成的組中的兩種或多種物質(zhì)作為活性成分能夠阻斷MHCII類分子與其受體結合的物質(zhì)，能夠阻斷協(xié)同刺激分子與其受體結合的物質(zhì)，能夠阻斷粘附分子與其受體結合的物質(zhì)，以及能夠阻斷細胞因子與其受體結合的物質(zhì)。


從以下結合附圖的詳細說明，可以更清楚地理解本發(fā)明的上述以及其他目的、特征和其他優(yōu)點，在附圖中圖1是根據(jù)本發(fā)明的重組表達質(zhì)粒pCD22Ig的遺傳學圖，表達連接融合單體蛋白CD2-CD2/Fc。
圖2是根據(jù)本發(fā)明的重組表達質(zhì)粒pCT44Ig的遺傳學圖，表達連接融合單體蛋白CTLA4-CTLA4/Fc。
圖3是根據(jù)本發(fā)明的重組表達質(zhì)粒pLAG33Ig的遺傳學圖，表達連接融合單體蛋白LAG3-LAG3/Fc。
圖4是根據(jù)本發(fā)明的重組表達質(zhì)粒pTR21Ig-Top’的遺傳學圖，表達連接融合單體蛋白TNFR2-TNFR1/Fc。
圖5a示出了根據(jù)本發(fā)明對簡單融合二聚體蛋白([CD2/Fc]2、[CTLA4/Fc]2和[LAG3/Fc]2)以及連接融合二聚體蛋白([CD2-CD2/Fc]2、[CTLA4-CTLA4/Fc]2和[LAG3-LAG3/Fc]2)進行SDS-PAGE分析的結果。
圖5b示出了根據(jù)本發(fā)明對簡單融合二聚體蛋白(1[TNFR1/Fc]2、2[TNFR2/Fc]2)以及連接融合二聚體蛋白(3[TNFR2-TNFR1/Fc]2、4[TNFR2-TNFR2/Fc]2)進行SDS-PAGE分析的結果。
圖6a示出了根據(jù)本發(fā)明的簡單融合二聚體蛋白([TNFR2/Fc]2、[CD2/Fc]2、[CTLA4/Fc]2和[LAG3/Fc]2)對T淋巴細胞增殖的抑制效應的曲線圖。
圖6b示出了根據(jù)本發(fā)明的簡單融合二聚體蛋白的組合[CTLA4/Fc]2+[TNFR2/Fc]2、[CTLA4/Fc]2+[CD2/Fc]2和[CTLA4/Fc]2+[LAG3/Fc]2以及單獨的[CTLA4/Fc]2對T淋巴細胞增殖的抑制效應的曲線圖。
圖6c示出了根據(jù)本發(fā)明的連接融合二聚體蛋白([TNFR2-TNFR2/Fc]2、[CD2-CD2/Fc]2、[CTLA4-CTLA4/Fc]2和[LAG3-LAG3/Fc]2)對T淋巴細胞增殖的抑制效應的曲線圖。
圖6d示出了根據(jù)本發(fā)明的連接融合二聚體蛋白的組合[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[TNFR2-TNFR2/Fc]2、[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[CD2-CD2/Fc]2和[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[LAG3-LAG3/Fc]2以及單獨的[CTLA4+CTLA4/Fc]2對T淋巴細胞增殖的抑制效應的曲線圖。
圖7a示出了根據(jù)本發(fā)明的簡單融合二聚體蛋白([TNFR2/Fc]2、[CD2/Fc]2、[CTLA4/Fc]2和[LAG3/Fc]2)對小鼠膠原誘導的關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)的嚴重程度的減弱效應曲線圖。
圖7b示出了根據(jù)本發(fā)明的簡單融合二聚體蛋白的組合[CTLA4/Fc]2+[TNFR2/Fc]2、[CTLA4/Fc]2+[CD2/Fc]2和[CTLA4/Fc]2+[LAG3/Fc]2以及單獨的[CTLA4/Fc]2對小鼠CIA嚴重程度的減弱效應曲線圖。
圖7c示出了根據(jù)本發(fā)明的連接融合二聚體蛋白([TNFR2-TNFR2/Fc]2、[CD2-CD2/Fc]2、[CTLA4-CTLA4/Fc]2和[LAG3-LAG3/Fc]2)對小鼠CIA嚴重程度的減弱效應曲線圖。
圖7d示出了根據(jù)本發(fā)明的連接融合二聚體蛋白的組合[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[TNFR2-TNFR2/Fc]2、[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[CD2-CD2/Fc]2和[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[LAG3-LAG3/Fc]2以及單獨的[CTLA4-CTLA4/Fc]2對小鼠CIA嚴重程度的減弱效應曲線圖。
圖8a示出了根據(jù)本發(fā)明的簡單融合二聚體蛋白([CD2/Fc]2、[CTLA4/Fc]2和[LAG3/Fc]2)對小鼠從移植物抗宿主病(GVHD)存活的改善效應曲線圖。
圖8b示出了根據(jù)本發(fā)明的簡單融合二聚體蛋白的組合[CTLA4/Fc]2+[LAG3/Fc]2和[CD2/Fc]2+[CTLA4/Fc]2對小鼠從移植物抗宿主病(GVHD)存活的改善效應曲線圖。
圖8c示出了根據(jù)本發(fā)明的簡單融合二聚體蛋白[CTLA4/Fc]2和連接融合二聚體蛋白[CTLA4-CTLA4/Fc]2對小鼠移植物抗宿主病(GVHD)存活的改善效應曲線圖。
圖8d示出了根據(jù)本發(fā)明的簡單融合二聚體蛋白[TNFR2/Fc]2和連接融合二聚體蛋白[TNFR2-TNFR2/Fc]2對小鼠移植物抗宿主病(GVHD)存活的改善效應曲線圖。
圖8e示出了根據(jù)本發(fā)明的簡單融合二聚體蛋白[TNFR2/Fc]2和連接融合二聚體蛋白[TNFR2-TNFR1/Fc]2和[TNFR2-TNFR2/Fc]2對小鼠移植物抗宿主病(GVHD)存活的改善效應曲線圖；以及圖8f示出了根據(jù)本發(fā)明的連接融合二聚體蛋白[CD2-CD2/Fc]2、[CTLA4-CTLA4/Fc]2和[LAG3-LAG3/Fc]2及其組合[CD2-CD2/Fc]2+CTLA4-CTLA4/Fc]2和[LAG3-LAG3/Fc]2+[CTLA4-CTLA4/Fc]2對小鼠移植物抗宿主病(GVHD)存活的改善效應曲線圖。
具體實施例方式
本文涉及一種通過抑制T淋巴細胞的活化來治療免疫性疾病的藥物組合物，其包括選自由以下物質(zhì)組成的組中的兩種或多種物質(zhì)作為活性成分能夠阻斷MHCII類分子與其受體結合的物質(zhì)，能夠阻斷協(xié)同刺激分子與其受體結合的物質(zhì)，能夠阻斷粘附分子與其受體結合的物質(zhì)，以及能夠阻斷細胞因子與其受體結合的物質(zhì)。
本領域中眾所周知，T淋巴細胞僅識別抗原呈遞細胞表面上與MHC(主要組織相容性復合體)II類分子相連的抗原，然后被活化并引起針對該抗原的免疫反應。除了MHC II類分子，抗原呈遞細胞上還存在其他將活化信號傳遞至T淋巴細胞的分子，這些分子被稱為“協(xié)同刺激分子”。另外，所謂的“粘附分子”通過傳遞信號的功能來增強抗原呈遞細胞和T淋巴細胞之間的細胞間粘附。還有多種“細胞因子”參與包括T細胞活化的免疫反應。
“MHC II類分子”啟動T淋巴細胞的活化，其受體包括CD4和LAG3。MHC II類分子結合抗原，隨后被T淋巴細胞表面上的它們的受體(CD4)識別，從而導致T淋巴細胞的活化。因此，MHCII類分子的這種功能可以通過阻斷MHC II類分子與其受體之間的結合而抑制。能夠表現(xiàn)出這種抑制活性的物質(zhì)包括但不限于MHC II類分子的抗體以及游離形式的MHC II類分子受體。這里所述的MHC II類分子的游離受體包括所有能夠特異性結合MHC II類分子的受體，優(yōu)選為Ig融合蛋白，其中的MHC II類分子受體或者其可溶性的細胞外結構域連接到整個免疫球蛋白或其Fc段上。Ig融合蛋白還可以是另外的糖基化形式。
“協(xié)同刺激分子”包括B7(B7.1和B7.2)、CD154、CD70、0X40L、ICOSL、4-1BBL、HVEM、FASL和PDL(PDL-1和PDL-2)以及它們的受體分別包括分別為CD28、CTLA-4、CD40、CD27、0X40、ICOS、4-1BB(CD137)、LIGHT、FAS(CD95)和PD-1。協(xié)同刺激分子在抗原呈遞細胞的表面表達，結合到其在T淋巴細胞表面表達的受體上，從而引起T淋巴細胞的活化。因此，協(xié)同刺激分子引起的T細胞活化可以通過阻斷協(xié)同刺激分子與其受體之間的結合而抑制。能夠表現(xiàn)出這種抑制活性的物質(zhì)包括但不限于協(xié)同刺激分子的抗體以及游離形式的協(xié)同刺激分子的受體。這里所述的協(xié)同刺激分子的游離受體包括所有能夠特異性結合協(xié)同刺激分子的受體，優(yōu)選為Ig融合蛋白，其中協(xié)同刺激分子的受體或者其可溶性的細胞外結構域連接到免疫球蛋白或其Fc段上。此外，Ig融合蛋白還可以是糖基化形式。
“粘附分子”包括LFA-3、ICAM-1和VCAM-1以及它們的受體分別為CD2、LFA-1和VLA-4。粘附分子在抗原呈遞細胞的表面表達，并結合到其在T淋巴細胞表面表達的受體上，從而引起T淋巴細胞的活化。因此，粘附分子引起的T細胞活化可以通過阻斷粘附分子與其受體之間的結合而抑制。能夠表現(xiàn)出這種抑制活性的物質(zhì)包括但不限于粘附分子的抗體以及游離形式的粘附分子的受體。這里所述的粘附分子的游離受體包括所有能夠特異性結合粘附分子的受體，優(yōu)選為Ig融合蛋白，其中粘附分子的受體或者其可溶性的細胞外結構域連接到免疫球蛋白或其Fc段上。此外，Ig融合蛋白還可以是糖基化形式。
“細胞因子”包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、TNF、TGF、IFN、GM-CSF、G-CSF、EPO、TPO、M-CSF以及它們的受體分別包括分別為IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、TNFR、TGFR、IFNR(例如，IFN-γRα鏈、IFN-γRβ鏈)、IFN-αR、-βR和-γR、GM-CSFR、G-CSFR、EPOR、cMpl以及gp130。細胞因子結合其在B淋巴細胞或T淋巴細胞上的受體，誘發(fā)免疫反應。因此，由細胞因子誘發(fā)的免疫反應可以通過阻斷細胞因子與其受體之間的結合而抑制。能夠表現(xiàn)出這種抑制活性的物質(zhì)包括但不限于細胞因子的抗體以及游離形式的細胞因子的受體。這里所述的細胞因子的游離受體包括所有能夠特異性結合細胞因子的受體，優(yōu)選為Ig融合蛋白，其中細胞因子的受體或者其可溶性的細胞外結構域連接到免疫球蛋白或其Fc段上。此外，Ig融合蛋白還可以是糖基化形式。
I.抗體能夠阻斷MHC II類分子與其受體結合的物質(zhì)可包括MHC II類分子的抗體。能夠阻斷協(xié)同刺激分子與其受體結合的物質(zhì)可包括協(xié)同刺激分子的抗體。能夠阻斷粘附分子與其受體結合的物質(zhì)可包括粘附分子的抗體。能夠阻斷細胞因子與其受體結合的物質(zhì)可包括細胞因子的抗體。
抗體可以為多克隆或者單克隆。多克隆和單克隆抗體可以商購獲得，或者可按照本領域所熟知的方法進行生產(chǎn)。多克隆抗體通常通過用合適量的抗原一次或多次免疫哺乳動物來生產(chǎn)，當抗體滴度達到預期水平時從被免疫的哺乳動物收集抗血清。如果需要，抗血清可以用已知的過程進行純化，儲存在冷凍緩沖液中直至使用。另一方面，單克隆抗體可以這樣制備給哺乳動物注射抗原、分離產(chǎn)生的B淋巴細胞、將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合并培養(yǎng)由此得到的雜交瘤細胞。這些過程的細節(jié)在本領域是熟知的。
II.Ig融合蛋白能夠阻斷MHC II類分子與其受體結合的物質(zhì)可包括帶有MHCII類分子受體的Ig融合蛋白。能夠阻斷協(xié)同刺激分子與其受體結合的物質(zhì)可包括帶有協(xié)同刺激分子受體的Ig融合蛋白。能夠阻斷粘附分子與其受體結合的物質(zhì)可包括帶有粘附分子受體的Ig融合蛋白。能夠阻斷細胞因子與其受體結合的物質(zhì)可包括帶有細胞因子受體的Ig融合蛋白。下文中，MHC II類分子受體、協(xié)同刺激分子受體、粘附分子受體以及細胞因子受體統(tǒng)稱為“受體”。
如在本文中所使用的，術語“Ig融合蛋白”指的是一種含有可以連接到免疫球蛋白或其Fc段上的受體蛋白或者可溶性的細胞外結構域的融合蛋白。詳細地，Ig融合蛋白包括簡單融合單體形式、簡單融合二聚體形式、連接融合(concatameric fusion)單體形式、連接融合二聚體形式以及其糖基化形式。
如在本文中所使用的，術語“可溶性的細胞外結構域”指的是含有磷脂的跨越細胞膜的完整膜蛋白的暴露在細胞外區(qū)域的部分，其中完整的膜蛋白含有一個或者多個主要由疏水氨基酸組成的跨膜結構域。這樣的細胞外結構域主要含有親水氨基酸，親水氨基酸通常定位于蛋白質(zhì)折疊結構的表面，因此在水相環(huán)境中可溶。對于大多數(shù)細胞表面受體蛋白，細胞外結構域用來結合特異的配體，而細胞內(nèi)結構域則在信號轉導中發(fā)揮重要作用。
如在本文中所使用的，術語“免疫球蛋白”指的是B細胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子，用作特異性識別多種抗原的抗原受體。這些分子具有Y型結構，含有兩個相同的輕鏈(L鏈)以及兩個相同的重鏈(H鏈)，其中這四條鏈由包括鉸鏈區(qū)的H鏈之間的二硫橋在內(nèi)的多個二硫鍵保持在一起。L鏈和H鏈均含有可變區(qū)和恒定區(qū)。L鏈可變區(qū)與H鏈可變區(qū)相連，從而產(chǎn)生了兩個相同的抗原結合區(qū)。根據(jù)H鏈恒定區(qū)的特征，免疫球蛋白(Ig)可以分為五個亞型A(IgA)、D(IgD)、E(IgE)、G(IgG)和M(IgM)。免疫球蛋白分子的生物學功能例如補體活化、Fc受體介導的噬菌作用以及抗原依賴的細胞毒性，是由H鏈Fc區(qū)的結構決定子(互補決定區(qū))介導的。這樣的H鏈的Fc區(qū)用來構建根據(jù)本發(fā)明的二聚體蛋白，可以從上述免疫球蛋白的所有亞型中得到。
如在本文中所使用的，術語“免疫球蛋白分子的Fc段”指的是不具備抗原結合活性且易于結晶的片段(含有一個鉸鏈區(qū)以及CH2和CH3結構域)以及用于將抗體結合到效應物質(zhì)和效應細胞的部分。
如在本文中所使用的，術語“連接融合”指的是這樣一種狀態(tài)受體蛋白的可溶性細胞外結構域的N末端連接到該受體蛋白的可溶性細胞外結構域的C末端，這樣受體蛋白的兩個可溶性細胞外結構域形成長的多肽。
如在本文中所使用的，術語“簡單融合單體蛋白”指的是具有由單一多肽構成的單體結構的融合蛋白，該多肽由受體蛋白的可溶性細胞外結構域連接至免疫球蛋白分子Fc段鉸鏈區(qū)而形成。在本發(fā)明中，為了方便起見，簡單融合單體蛋白可以命名為“受體蛋白的名稱/Fc”。例如，由LAG3蛋白的可溶性細胞外結構域連接到免疫球蛋白的Fc段而生成的簡單融合單體蛋白命名為LAG3/Fc。如有需要，F(xiàn)c段的來源也可以在命名中指出，例如，如果Fc段來自于IgG1，單體蛋白稱為LAG3/IgG1Fc。
如在本文中所使用的，術語“簡單融合二聚體蛋白”指的是具有二聚體結構的融合蛋白，其中兩個簡單融合單體蛋白通過在鉸鏈區(qū)形成分子間二硫鍵而連接到一起。在本發(fā)明中，為了方便起見，這樣的簡單融合二聚體蛋白可以命名為“[受體蛋白名稱/Fc]2”。例如，當通過在兩個由LAG3蛋白的可溶性細胞外結構域與免疫球蛋白分子的Fc段連接生成的簡單融合單體蛋白的鉸鏈區(qū)形成分子間二硫鍵而融合時，得到的含有二聚體結構的融合蛋白命名為[LAG3/Fc]2。另外，如有需要，F(xiàn)c段的來源也可以在命名中指出，例如，如果Fc段來自于IgG1，二聚體蛋白命名為[LAG3/IgG1Fc]2。
如在本文中所使用的，術語“連接融合單體蛋白”指的是具有由單一多肽組成的單體結構的融合蛋白，其中受體蛋白可溶性細胞外結構域的N末端連接到該受體蛋白可溶性細胞外結構域的C末端，而前一個可溶性細胞外結構域的C末端連接到免疫球蛋白Fc段的鉸鏈區(qū)。在本發(fā)明中，為了方便起見，連接融合單體蛋白可以命名為“受體蛋白名稱-受體蛋白名稱/Fc”。例如，由LAG3蛋白的可溶性細胞外結構域與免疫球蛋白Fc段連接產(chǎn)生的簡單融合單體蛋白的LAG3的可溶性細胞外結構域連接到LAG3的可溶性細胞外結構域時，所得到的連接融合單體蛋白命名為LAG3-LAG3/Fc。如有需要，F(xiàn)c段的來源也可以在命名中指出，例如，如果Fc段來自于IgG1，連接蛋白命名為LAG3-LAG3/IgG1Fc。
如在本文中所使用的，術語“連接融合二聚體蛋白”指的是具有二聚體結構的融合蛋白，其中兩個連接融合單體蛋白通過在鉸鏈區(qū)形成分子間二硫鍵融合。在本發(fā)明中，為了方便起見，連接融合二聚體蛋白可以命名為“[受體蛋白名稱-受體蛋白名稱/Fc]2”。例如，兩個均由簡單融合單體蛋白的LAG3的可溶性細胞外結構域連接到LAG3蛋白的可溶性細胞外結構域生成的連接融合單體蛋白，通過在鉸鏈區(qū)形成分子間二硫鍵而融合，所得到的具有二聚體結構的融合蛋白命名為[LAG3-LAG3/Fc]2，其中該簡單融合單體蛋白通過LAG3的可溶性細胞外結構域連接到免疫球蛋白分子的Fc段而形成。如有需要，F(xiàn)c段的來源也可以在命名中指出，例如，如果Fc段來自于IgG1，融合蛋白命名為[LAG31-LAG3/IgG1Fc]2。
另一方面，簡單融合單體蛋白或簡單融合二聚體蛋白可以通過本領域所熟知的典型方法而制備。連接融合單體蛋白或者連接融合二聚體蛋白可以通過由本發(fā)明人提交的PCT公開出版物第WO2003/010202號中所描述的制備方法而獲得。
根據(jù)本發(fā)明，連接融合二聚體蛋白通常按如下步驟制備(a)利用編碼免疫球蛋白分子Fc段的基因和編碼受體蛋白可溶性細胞外結構域的基因制備編碼簡單融合單體蛋白的DNA構建體；(b)通過聚合酶鏈反應(PCR)，在制備的編碼簡單融合單體蛋白的DNA構建體以及編碼受體蛋白的可溶性細胞外結構域的基因中分別插入限制性酶的識別序列；(c)利用能夠識別該識別序列的限制性酶，切割編碼簡單融合單體蛋白的DNA構建體以及編碼受體蛋白可溶性細胞外結構域的基因中的識別序列；(d)利用連接酶連接經(jīng)切割的DNA片段，以生成編碼連接融合單體蛋白的DNA構建體；(e)將制備的編碼連接融合單體蛋白的DNA構建體可操作地連接到載體上生成重組表達質(zhì)粒；(f)用重組表達質(zhì)粒轉化或轉染宿主細胞；以及(g)在適合編碼連接融合單體蛋白的DNA構建體表達的條件下培養(yǎng)轉化體或轉染體，然后分離并純化感興趣的連接融合二聚體蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，為了允許額外的O-連接或者N-連接糖基化，改變編碼受體蛋白可溶性細胞外結構域的DNA序列中的一個或多個核苷酸，所得到的DNA在合適的動物宿主細胞中表達以利用宿主系統(tǒng)誘發(fā)糖基化。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，根據(jù)本發(fā)明的糖基化的連接融合二聚體蛋白可以通過改變編碼受體蛋白的可溶性細胞外結構域的DNA序列，通過加入Asn-X-Ser/Thr序列誘發(fā)或增強N-連接的糖基化而制備。
本發(fā)明將詳細描述MHC II類分子以及B7分子(作為協(xié)同刺激分子的示例性實例)、LFA-3分子(作為粘附分子的示例性實例)和TNF(作為細胞因子的示例性實例)。
“MHC II類分子”被能夠特異性結合MHC II類分子的CD4和LAG3受體所識別。因此LAG3的Ig融合蛋白可以用來阻斷MHCII類分子與CD4的結合。詳細地，能夠阻斷MHC II類分子與CD4結合的物質(zhì)包括(1)MHC II類分子的抗體；(2)簡單融合單體蛋白，通過LAG3的可溶性細胞外結構域連接到免疫球蛋白分子Fc段鉸鏈區(qū)形成；(3)簡單融合二聚體蛋白，由兩分子的簡單融合單體蛋白通過在鉸鏈區(qū)的分子間二硫鍵而連接得到；(4)連接融合單體蛋白，通過連接在簡單融合單體蛋白鉸鏈區(qū)的LAG3可溶性細胞外結構域的N-末端連接到另一個LAG3分子可溶性細胞外結構域的C-末端而得到；(5)連接融合二聚體蛋白，其中兩分子連接融合單體蛋白通過在鉸鏈區(qū)形成的分子間二硫鍵而連接；以及(6)從(2)到(5)中蛋白的糖基化形式。
“B7分子”被能夠特異性結合到B7分子的CD28和CTLA4所識別。特別的是，B7分子結合到T淋巴細胞表面表達的CD28上，活化T淋巴細胞。與之形成對比的是，當B7分子結合到另一個受體CTLA4(在T淋巴細胞活化后表達)上時則抑制T淋巴細胞的活化。因此，CTLA4的Ig融合蛋白被優(yōu)選用來阻斷B7分子與CD28的結合。詳細地，能夠用于阻斷B7分子與CD4結合的物質(zhì)包括(1)B7分子的抗體；(2)簡單融合單體蛋白，通過CTLA4的可溶性細胞外結構域連接到免疫球蛋白分子Fc段鉸鏈區(qū)而形成；(3)簡單融合二聚體蛋白，其中兩分子簡單融合單體蛋白通過在鉸鏈區(qū)形成分子間二硫鍵而連接；(4)連接融合單體蛋白，通過連接在簡單融合單體蛋白鉸鏈區(qū)的CTLA4可溶性細胞外結構域的N-末端連接到另一個CTLA4分子可溶性細胞外結構域的C-末端而得到；(5)連接融合二聚體蛋白，其中兩分子連接融合單體蛋白通過在鉸鏈區(qū)形成的分子間二硫鍵而連接；以及(6)根據(jù)(2)到(5)中蛋白的糖基化形式。
通過阻斷LFA3與T淋巴細胞表面CD2的結合，可以抑制“LFA3分子”的T淋巴細胞活化功能。這種免疫抑制物質(zhì)包括(1)LFA3分子的抗體；(2)簡單融合單體蛋白，通過CD2的可溶性細胞外結構域連接到免疫球蛋白分子Fc段鉸鏈區(qū)形成；(3)簡單融合二聚體蛋白，由兩分子簡單融合單體蛋白通過在鉸鏈區(qū)的分子間二硫鍵而連接得到；(4)連接融合單體蛋白，通過連接在簡單融合單體蛋白鉸鏈區(qū)的CD2可溶性細胞外結構域的N-末端連接到另一個CD2分子可溶性細胞外結構域的C-末端而形成；(5)連接融合二聚體蛋白，其中兩分子連接融合單體蛋白通過在鉸鏈區(qū)的分子間二硫鍵而連接；以及(6)根據(jù)(2)到(5)中蛋白的糖基化形式。
“TNF”的免疫反應激活功能可以通過阻斷TNF與T淋巴細胞表面的TNFR之間的結合而抑制。這種免疫抑制物質(zhì)包括(1)TNF的抗體；(2)簡單融合單體蛋白，通過TNFR的可溶性細胞外結構域連接到免疫球蛋白分子Fc段的鉸鏈區(qū)而形成；(3)簡單融合二聚體蛋白，其中兩分子簡單融合單體蛋白通過在鉸鏈區(qū)的分子間二硫鍵而連接；(4)連接融合單體蛋白，通過連接在簡單融合單體蛋白鉸鏈區(qū)的TNFR可溶性細胞外結構域的N-末端連接到另一個TNFR分子可溶性細胞外結構域的C-末端而形成；(5)連接融合二聚體蛋白，其中兩分子連接融合單體蛋白通過在鉸鏈區(qū)的分子間二硫鍵而連接；以及(6)根據(jù)(2)到(5)中蛋白的糖基化形式。
III.免疫性疾病根據(jù)本發(fā)明的活性成分因為能夠抑制T淋巴細胞的活化，因此可以用來治療多種由不需要的T淋巴細胞活化而引起的疾病。這樣的疾病的代表性例子是移植排斥和自身免疫性疾病。
“移植排斥”指的是由于移植物(被移植的生命體的部分，細胞、組織或者器官)的供體與受體之間遺傳背景的不同而引起的免疫反應，包括(1)一種被稱為“移植物抗宿主病(GVHD)”的疾病，當來自供體移植物的免疫細胞將受體識別為外源性物質(zhì)并攻擊受體時而引起，以及(2)一種被稱為“移植排斥”的疾病，當受體將供體的移植物識別為外源性物質(zhì)并攻擊移植物時而引起。
另一方面，當免疫細胞不區(qū)分自身與異己(外源)物質(zhì)并攻擊自身時發(fā)生的疾病統(tǒng)稱為“自身免疫性疾病”。詳細地，自身免疫性疾病包括風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、格雷夫斯病(Grave’s病)、慢性淋巴細胞性甲狀腺炎、阿狄森病(Addison’s病)、白癜風、硬皮病、腎炎-肺出血綜合癥(Goodpasture綜合征)、Becet’s病、節(jié)段性回腸炎(Crohne’s病)、強直性脊柱炎、葡萄膜炎、血小板減少性紫癜、尋常型天皰瘡、兒童糖尿病、自身免疫性貧血、冷球蛋白血癥、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(ALD)以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。
IV.藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物可能優(yōu)選這樣一種形式使得有效治療量的兩種或多種活性成分加載在藥學上可接受的載體上，該活性成分選自由以下物質(zhì)組成的組能夠阻斷MHCII類分子與其受體結合的物質(zhì)，能夠阻斷協(xié)同刺激分子與其受體結合的物質(zhì)，能夠阻斷粘附分子與其受體結合的物質(zhì)，以及能夠阻斷細胞因子與其受體結合的物質(zhì)。
本發(fā)明的藥物組合物中所用的載體包括藥學領域中通常所用的載體、佐劑與賦形劑，總稱為“藥學上可接受的載體”。本發(fā)明的藥物組合物中所用的非限制性藥學上可接受的載體包括離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白質(zhì)(例如人血清白蛋白)、緩沖試劑(例如磷酸鈉、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、植物飽和脂肪酸的偏甘油酯混合物)，水，鹽或電解質(zhì)(例如，硫酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉以及鋅鹽)、硅膠、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素的基質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯(聚芳基化物)(polyarylate)、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、聚乙二醇以及羊毛脂。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過任何一種能夠到達預期組織的常用途徑給藥。因此本發(fā)明的藥物組合物可以局部給藥、口服、腸胃外給藥、眼內(nèi)用藥、透皮給藥、直腸內(nèi)以及管腔內(nèi)給藥，可以配制成溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊以及緩釋劑。如在本文中所使用的，“腸胃外(用藥)”包括皮下、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、賁門內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)以及顱內(nèi)注射或者灌注技術。
一方面，本發(fā)明的藥物組合物可以配制成水相溶液用于腸胃外給藥。合適的緩沖液，比如Hank’s液、林格溶液(Ringer’s液)或者生理緩沖鹽水可以優(yōu)選采用。水相注射懸浮液可以補充一些能夠增加其粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和右旋糖酐。另外，活性成分的懸浮液例如油性注射懸浮液含有親脂溶劑或者載體，例如脂油如芝麻油以及合成脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂質(zhì)體。多聚陽離子非脂質(zhì)氨基聚合物也可以用作賦形劑?？蛇x擇地，懸浮液可以包含合適的穩(wěn)定劑或者藥物以增強蛋白變異體的溶解度，獲得高濃度的蛋白變異體。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選為無菌注射制劑的形式，例如無菌注射水相或油相懸浮液。根據(jù)本領域所熟知的方法，利用合適的分散劑或濕潤劑(如Tween 80)以及懸浮劑，即可配制該懸浮液。無菌注射制劑還可以是在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑里的無菌注射溶液或者懸浮液，比如1，3-丁二醇溶液?？山邮艿馁x形劑和溶劑包括甘露醇、水、林格溶液、等滲氯化鈉溶液。此外，無菌不揮發(fā)性油也方便用作溶劑或者懸浮介質(zhì)。任何溫和的不揮發(fā)性油均可用于此目的，包括合成的單甘油酯或甘油二酯。另外脂肪酸例如油酸及其甘油酯衍生物也可用于注射性制劑的制備，例如藥學上可接受的天然油(如橄欖油或蓖麻油)，特別是，其聚氧乙烯(乙烷)化衍生物。
上述水相組合物的滅菌主要是通過用濾器過濾除去細菌、混入消毒劑或者與放射線聯(lián)合使用。無菌組合物可以通過如凍干等方法硬化而獲得硬化產(chǎn)品，在實際應用中，硬化產(chǎn)品可溶于無菌水或無菌稀釋液中。
根據(jù)本發(fā)明，為了增加室溫穩(wěn)定性、降低低溫儲存所需的高費用以及延長存放期，含有根據(jù)本發(fā)明的活性成分的藥物組合物可以凍干。凍干的過程包括以下步驟冷凍、第一次干燥和第二次干燥。冷凍后，組成物在高壓下加熱以蒸發(fā)水蒸氣。在第二次干燥步驟中可以將殘余水分從干燥產(chǎn)品除去。
如在本發(fā)明中與本發(fā)明的藥物組合物聯(lián)合使用的，術語“有效治療量”意指這樣的量，將其中本發(fā)明的藥物組合物應用于免疫性疾病時，活性成分顯示出對免疫性疾病的改善或者治療的效果。本發(fā)明藥物組合物的有效治療量可能隨著患者的年齡和性別、應用部位、給藥頻率、給藥持續(xù)時間、制劑類型以及佐劑類型而變化。通常，本發(fā)明的藥物組合物以如0.01-1000微克/千克/天、更優(yōu)選0.1-500微克/千克/天、最優(yōu)選1-100微克/千克/天的量給藥。
參照以下實施例并結合附圖來更加詳細的解釋本發(fā)明。然而，下面的實施例僅是為了說明本發(fā)明而本發(fā)明不局限于此。
以下實施例1涉及LAG3。關于LAG3/Fc和LAG3-LAG3/Fc融合蛋白的氨基酸序列、編碼該融合蛋白的DNA序列以及用來制備該融合蛋白的引物的信息總結在下面的表1中。
表1關于LAG3/Fc和LAG3-LAG3/Fc的DNA和氨基酸序列以及用來制備融合蛋白的引物的信息

實施例1根據(jù)本發(fā)明的編碼Ig融合蛋白的DNA構建體的制備A.制備編碼簡單融合單體蛋白LAG3/Fc的DNA構建體a.編碼LAG3可溶性細胞外結構域的DNA片段編碼LAG3可溶性細胞外結構域的DNA片段可以通過PCR構建，利用具有EcoRI限制性位點以及編碼引導序列(序列ID號為8的1-22氨基酸序列)的序列(序列ID號為7的核苷酸序列)的引物(序列ID號為1的核苷酸序列)；以及具有SpeI限制性位點以及編碼所述LAG3的可溶性細胞外結構域3’末端的部分的序列(序列ID號為7的核苷酸序列)的反義引物(序列ID號為4的核苷酸序列)。該反應的模板cDNA通過從健康成人單核細胞(T淋巴細胞)提取的mRNA的逆轉錄PCR(RT-PCR)來構建。
抽取健康成人的血液后，用RPMI-1640(Gibco BRL，USA)稀釋成1∶1，用Ficoll-hypaque(Amersham，USA)通過密度梯度離心法可以得到上層部分形成的T淋巴細胞層。該細胞用RPMI-1640洗滌三次，加入含有10％胎牛血清(FBS，Gbico BRL，USA)的RPMI-1640培養(yǎng)基使細胞濃度達到5×105個細胞/毫升，然后在加入植物血球凝集素-M(Calbiochem，Germany)至2微克/毫升之后進行刺激。
mRNA用Tri-Reagent(MRC，USA)mRNA純化試劑盒進行純化。首先，將2×107的人類T淋巴細胞用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.2)洗滌三次，然后混入1毫升Tri-Reagent幾次以溶解RNA。試管中加入0.2毫升氯仿并徹底混勻后，在室溫(RT)孵育該試管15分鐘，然后15,000rpm 4℃離心15分鐘。將溶液的上面部分轉移至1.5毫升管中，加入0.5毫升異丙醇，然后在4℃以15,000rpm離心15分鐘。棄上清后，沉淀用1毫升經(jīng)75％乙醇-25％DEPC(Sigma，USA)處理過的3°蒸餾水重新懸浮，然后15,000rpm 4℃離心15分鐘。在徹底去除上清液并在空氣中干燥以去除殘留乙醇后，將RNA用50微升DEPC處理過的3°蒸餾水重新懸浮。
初始cDNA的合成如下在1.5毫升管中混合2微克純化的mRNA以及1微升oligo-dT(dT30，Promega，USA)引物至10μM，70℃加熱2分鐘，冰上冷卻2分鐘。隨后，在混合物中加入200U的M-MLV逆轉錄酶(Promega，USA)、10微升5×反應緩沖液(250mM Tris-HCl、pH8.3、375mM KCl、15mM MgCl2以及50mMDTT)、1微升dNTP(每種10mM，Takara，Japan)以及DEPC處理過的3°蒸餾水至50微升，于42℃反應1小時。
b.編碼免疫球蛋白G1的Fc段的DNA片段編碼免疫球蛋白G1的Fc段的DNA片段可以利用引物通過PCR構建，該引物(序列ID號為5的核苷酸序列)具有SpeI限制性位點以及編碼免疫球蛋白G1(IgG1)鉸鏈區(qū)5’末端的部分的序列；反義引物(序列ID號為6的核苷酸序列)具有XbaI限制性位點以及編碼IgG1Fc段3’末端的序列。該反應的模板cDNA通過從不明原因發(fā)熱的康復期患者的外周血細胞(B淋巴細胞)提取的mRNA的RT-PCR構建。
c.編碼簡單融合單體蛋白LAG3/Fc的DNA構建體如上所述生成的編碼LAG可溶性細胞外結構域的DNA片段和編碼免疫球蛋白Fc段的DNA片段均采用SpeI限制性切割(restricted)，然后用T4連接酶(USB，USA)進行連接，從而生成簡單融合單體蛋白LAG/Fc。
d.編碼簡單融合單體蛋白LAG/Fc的DNA構建體的克隆如上所述的編碼簡單融合單體蛋白LAG/Fc的DNA構建體用EcoRI和XbaI限制性切割，通過在EcoRI/XbaI位點插入到市售的克隆載體pBluescript KS II(+)(Stratagene，USA)而進行克隆。整個編碼區(qū)的序列通過DNA測序確定(序列ID號7)。作為簡單融合單體蛋白，生成的融合蛋白命名為LAG3/Fc，推測的簡單融合單體蛋白LAG3/Fc氨基酸序列與序列ID號8一致。
B.制備編碼連接融合單體蛋白LAG3-LAG3/Fc的DNA構建體為了生成編碼連接融合單體蛋白LAG3-LAG3/Fc的DNA構建體，編碼LAG3的可溶性細胞外結構域的DNA片段可以利用引物通過PCR構建，引物(序列ID號為1的核苷酸序列)具有EcoRI限制性位點以及編碼引導序列(序列ID號為8的1-22氨基酸序列)的序列(序列ID號為7的核苷酸序列)；反義引物(序列ID號為4的核苷酸序列)具有編碼所述的LAG3的可溶性細胞外結構域的3’末端的部分的序列(序列ID號為7的核苷酸序列)。同樣，編碼簡單融合單體蛋白LAG3/Fc的DNA片段可以利用引物通過PCR構建，引物(序列ID號為3的核苷酸序列)編碼LAG3的可溶性細胞外結構域的引導序列的末端部分(序列ID號為7的核酸序列)，以及反義引物(序列ID號為6的核苷酸序列)具有XbaI限制性位點以及編碼IgG1Fc段3’末端的序列。對于這些PCR，編碼簡單融合單體蛋白LAG3/Fc(序列ID號為7的核苷酸序列)的DNA片段被用作模板。
PCR通過加入1微升初始cDNA、2U的Pfu DNA聚合酶(Stratagene，USA)、10微升10×反應緩沖液[200mM Tris-HCl，pH8.75、100mM(NH4)2SO4、100mM KCl、20mM MgCl2]、1％TritonTMX-100、1毫克/毫升BSA、3微升引物1(10μM)、3微升引物2(10μM)、2微升dNTP(每種10mM)，以及3°蒸餾水至100微升而進行。反應條件如下94℃，5分鐘；95℃，1分鐘；58℃，1分30秒；72℃，1分鐘31個循環(huán)；72℃，15分鐘，以使PCR產(chǎn)物具有完整的平端。
在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳后，PCR產(chǎn)物用QiaexII凝膠提取試劑盒(Qiagen，USA)進行純化。純化的PCR產(chǎn)物用BamHI限制性切割，并用酚-氯仿抽提的方法進行提取。接下來，用BamHI限制性切割的兩種DNA片段用連接酶進行連接。
C.編碼連接融合單體蛋白LAG3-LAG3/Fc的DNA構建體的克隆如上所述的編碼連接融合單體蛋白LAG3-LAG3/Fc的DNA構建體用EcoRI和XbaI限制性切割，通過在EcoRI/XbaI位點插入市售的克隆載體pBluescript KS II(+)(Stratagene，USA)而克隆。整個編碼區(qū)的序列通過DNA測序確定(序列ID號9)。作為連接融合單體蛋白，生成的融合蛋白命名為LAG3-LAG3/Fc，其推測的氨基酸序列與序列ID號10一致。
10微克用作載體的pBluescript KS II(+)(Stratagene，USA)與15U EcoRI、15UXbaI、5微升10×反應緩沖液(100mM Tris-HCl，pH7.5、100mM MgCl2、10mM DTT、500nM NaCl)、5微升0.1％BSA(Takara，Japan)以及3°蒸餾水混合至50微升，通過在37℃孵育2小時DNA被限制性切割。在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳后，PCR產(chǎn)物用Qiaex II凝膠提取試劑盒(Qiagen，USA)進行純化。
100ng被EcoRI和XbaI限制性切割的pBluescript KS II(+)(Stratagene，USA)與20ng被限制性酶切割的PCR產(chǎn)物混合之后，加入0.5U T4DNA連接酶(Amersham，USA)、1微升10×反應緩沖液(300mM Tris-HCl，pH7.8、100mM MgCl2、100mM DTT、10mMATP)和3°蒸餾水至10微升，混合物在16℃水浴孵育16小時。
通過氯化銣(RbCl，Sigma，USA)的方法將E.coli Top10(Novex，USA)制成感應細胞(competent cell)，用上面所述的質(zhì)粒進行轉化，然后涂在含有50微克/毫升氨芐青霉素(Sigma，USA)的固體LB培養(yǎng)基上，37℃孵育16小時。形成的菌落接種在4毫升含有50微克/毫升氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃孵育16小時。根據(jù)Sambrook et al.(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratorypress，p1.25-1.31，p1.63-1.69，p7.26-7.29，1989)的堿裂解法，從1.5毫升上述孵育液中純化質(zhì)粒，克隆的存在用EcoRI和XbaI限制性切割進行確認。
整個編碼區(qū)的序列通過如下的雙脫氧鏈末端終止法(dideoxychain termination method)(Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，745483，1977)的DNA測序方法來確定。根據(jù)操作指南，利用通過如上所述的堿裂解法純化所得的質(zhì)粒和測序酶(SequenaseTM)ver2.0(Amersham，USA)進行DNA測序反應。如上所述的反應混合物加樣到6％聚丙烯酰胺凝膠上，50℃恒定電壓1,800～2,000V電泳(electrophorized)2小時，待凝膠干燥后通過曝光到X射線膠片(Kodak，USA)上，從而確認DNA序列。
實施例2制備根據(jù)本發(fā)明的編碼Ig融合蛋白的DNA構建體其他蛋白TNFR1、TNFR2、CD2和CTLA4的簡單融合二聚體蛋白以及連接融合二聚體蛋白，根據(jù)如實施例1中相同的步驟而制備。詳細的步驟在PCT公開第WO2003/010202號中進行了描述，該PCT申請是由本發(fā)明人提交的。關于TNFR1、TNFR2、CD2和CTLA4的Ig融合蛋白的DNA和氨基酸序列的信息總結在下面的表2中。
表2根據(jù)本發(fā)明的Ig融合蛋白及其DNA和氨基酸序列

實施例3簡單/連接融合二聚體蛋白LAG3/Fc的表達和純化為了在CHO-K1細胞(ATCC CCL-61，卵巢，中國倉鼠，Cricetulus griseus)中表達融合蛋白，含有LAG3-LAG3/Fc融合基因的pBluescript KS II(+)質(zhì)粒DNA從轉化的E.coli中純化后，用EcoRI和XbaI限制性切割產(chǎn)生的LAG3-LAG3/Fc片段在動物表達載體pCRTM3(Invitrogen，USA)質(zhì)粒的EcoRI/XbaI位點插入，從而構建動物細胞表達載體。這些命名為質(zhì)粒pLAG3-TOP10′，以登記號KCCM-10556于2004年1月13日保藏在韓國微生物培養(yǎng)中心(KCCM，361-221，Yurim B/D，Hongje-1-dong，Seodaemun-gu，SEOUL 120-091，韓國)。
將含有如上所述LAG3-LAG3/Fc融合基因的質(zhì)粒pLAG33IgDNA與LipofectaminTM(Gibco BRL，USA)試劑混合后進行轉染。CHO-K1細胞以1～3×105個細胞/孔的濃度接種在6孔組織培養(yǎng)板(Nunc，USA)中，在含10％FBS-DMEM培養(yǎng)基中孵育至50～80％。然后將DNA-脂質(zhì)體復合物(該復合物與1～2微克含有如上所述LAG3-LAG3/Fc融合基因的質(zhì)粒pLAG33Ig DNA和2～25微升LipofectaminTM(Gibco BRL，USA)反應了15～45分鐘)加入細胞培養(yǎng)板的無血清DMEM培養(yǎng)基中。孵育5小時后，加入含有20％血清的DMEM培養(yǎng)基，進一步孵育細胞18～24小時。初次轉染后，細胞在具有1.5毫克/毫升Geneticin(G418，Gibco BRL，USA)的10％FBS-DMEM培養(yǎng)基中孵育3周，篩選形成的菌落用于擴大培養(yǎng)。利用過氧化物酶標記的羊抗人IgG(KPL，USA)通過ELISA分析融合蛋白的表達。
ELISA如下實施首先，將1毫克/毫升過氧化物酶標記的羊抗人IgG(KPL，USA)用0.1M重碳酸鈉稀釋到1∶2000，將100微升該抗體稀釋液等分裝進彈性96孔板(Falcon，USA)中并用塑料覆蓋物密封，4℃孵育16小時以上，以將其覆蓋在板的表面。此后，用洗滌緩沖液(含有0.1％Tween-20的1×PBS)洗3次，然后稀釋緩沖液(48.5毫升1×PBS、1.5毫升FBS、50微升Tween-20)被等分裝成180微升。在第一個孔內(nèi)滴加20微升培養(yǎng)上清(液)，然后用微量加液器進行連續(xù)(serially)稀釋，作為陽性對照的0.01微克/微升人免疫球蛋白G(Sigma，USA)以及作為陰性對照的未轉染的CHO-K1細胞的培養(yǎng)基進行相等的稀釋。稀釋后，96孔ELISA板(Falcon，USA)用鋁箔包裹，在37℃孵育1小時30分鐘，用洗滌緩沖液洗3次。連接羊抗人IgG(KPL，USA)的過氧化物酶用稀釋緩沖液1∶5000稀釋，等分為100微升，用鋁箔包裹，在37℃反應1小時。反應后，將該板洗3次，用TMB微孔過氧化物酶底物系統(tǒng)(KPL，USA)顯色，用微板讀數(shù)儀(Bio-Rad，Model 550，Japan)測量655納米波長處的吸光度而確定表達的存在。
使如上所述的轉染體適應一種無血清培養(yǎng)基CHO-S-SFM II(Gibco BRL，USA)以純化由該轉染體產(chǎn)生的蛋白，方法如下將大約3×105個細胞接種到6孔板后，細胞在5％CO2于37℃培養(yǎng)16個小時以上以附著(貼壁)，顯微鏡下檢查細胞在該板的約30～50％的面積貼壁，然后細胞在含有比例為8∶2的10％FBS DMEM與CHO-S-SFM II的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。在這個比例連續(xù)傳代培養(yǎng)3次后，以6∶4的比例培養(yǎng)三次；以4∶6的比例培養(yǎng)三次；以3∶7的比例培養(yǎng)三次；以2∶8的比例培養(yǎng)三次；以1∶9的比例培養(yǎng)三次；最后在100％CHO-S-SFM II培養(yǎng)基中培養(yǎng)。表達水平通過ELISA進行測量。
當這些轉染細胞在CHO-S-SFM II中大規(guī)模培養(yǎng)后，含有每種融合蛋白的上清液以200×g離心12分鐘去除細胞碎片，蛋白通過利用如下的HiTrap protein A柱(Amersham，USA)的方法進行純化。在20mM磷酸鈉(pH7.0，Sigma，USA)以1毫升/分鐘的速率通過柱子2分鐘之后，使10毫升上清液以同樣的速率通過以使融合蛋白結合到蛋白A上。使20mM磷酸鈉(pH7.0)以同樣的速率通過2分鐘以進行洗滌后，隨著使0.1M檸檬酸(pH3.0，Sigma，USA)以同樣速率通過柱子3分鐘，500微升提取物連續(xù)分裝到1.5毫升管中。其采用1M Tris(pH 11.0，USB，USA)調(diào)整為pH7.0，管中融合蛋白的存在通過如上描述的ELISA來確定。純化的蛋白用Centricon30(Amicon，USA)以2000×g 4℃離心30分鐘而濃縮。
實施例4CD2、CTLA4和TNFR簡單/連接融合二聚體蛋白的表達和純化對于CD2、CTLA4和TNFR的簡單/連接融合二聚體蛋白根據(jù)與實施例3中相同的方法而制備。該方法在PCT公開出版物第WO2003/010202號中進行了詳細的描述，該PCT申請由本發(fā)明人提交。這樣所得到的重組表達質(zhì)粒分別命名為pCD22Ig(圖1)、pCT44Ig(圖2)以及pTR2Ig-Top’(圖4)。
另外，進行SDS-PAGE以確定實施例3和實施例4中純化的蛋白是否是預期的簡單融合二聚體蛋白[CD2/Fc]2、[LAG3/Fc]2和[CTLA4/Fc]2以及是否是預期的連接融合二聚體蛋白[CD2-CD2/Fc]2、[LAG3-LAG3/Fc]2和[CTLA4-CTLA4/Fc]2(圖5a)。對[TNFR1/Fc]2、[TNFR2/Fc]2、[TNFR2-TNFR1/Fc]2和[TNFR2-TNFR2/Fc]2也進行了SDS-PAGE(圖5b)。
實施例5評估簡單融合二聚體蛋白或者連接融合二聚體蛋白單獨使用或聯(lián)合使用時對T淋巴細胞增殖的抑制效應A.簡單融合二聚體蛋白單獨使用時對T淋巴細胞增殖的抑制效應B淋巴細胞的細胞系WT100B1S，通過轉染來自感染了EB病毒的發(fā)熱患者的B淋巴細胞而制備，在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640中培養(yǎng)，以用作T淋巴細胞的抗原呈遞細胞。然后將細胞以2000rpm離心2分鐘，細胞沉淀用含有10％FBS的RPMI1640懸浮，密度為5.0×105個細胞/毫升，并用γ射線照射(3,000rad)。
利用Ficoll-Hypaque(Amersham，USA)從收集的健康人血液樣品中分離T淋巴細胞，并在含有10％FBS的RPMI 1640中培養(yǎng)，以獲得2.0×106個細胞/毫升的細胞懸浮液。
初級混合淋巴細胞反應(MLR)實施如下。將15毫升WT100B1S細胞懸浮液與15毫升T淋巴細胞懸浮液在150毫米培養(yǎng)皿中混合。該細胞培養(yǎng)3天，繼續(xù)在15ml含有10％FBS的RPMI 1640中培養(yǎng)3天。培養(yǎng)6天后，存活的T淋巴細胞利用Ficoll-Hypaque(Amersham，USA)分離。這樣分離所得的T淋巴細胞在含有45％FBS、45％RPMI1640和10％DMSO的培養(yǎng)基中冷凍并保存在液氮中。
來自初級MLR的T淋巴細胞再進行(rechallenged)二級MLR。首先，將冷凍的T淋巴細胞解凍、用RPMI 1640洗滌兩次，重懸在含有10％FBS的RPMI 1640中，密度為3.0×105個細胞/毫升。
將用作抗原呈遞細胞的WT100B 1S按照上述方法重新培養(yǎng)。該細胞用γ射線(3,000rad)照射，懸浮在含有10％FBS的RPMI 1640中，密度為7.5×104個細胞/毫升。100微升WT100B 1S細胞懸浮液平鋪到96孔平底板的每個孔上，簡單融合二聚體蛋白[TNFR2/Fc]2、[CD2/Fc]2、[CTLA4/Fc]2和[LAG3/Fc]2加入每個孔內(nèi)，終濃度為10、1、10-1、10-2、10-3和10-4微克/毫升。然后，100微升來自初級MLR的T淋巴細胞加入每個孔內(nèi)。該板在5％CO2孵箱于37℃孵育2天，每個孔內(nèi)加入100微升含有10％FBS的RPMI 1640，然后再孵育2天。在4天培養(yǎng)期的最后6小時，細胞用1.2μCi/mL3H-胸腺嘧啶核苷(Amersham)進行處理。
隨后，96孔板在110×g 4℃離心10分鐘以沉淀T淋巴細胞。棄上清后，細胞沉淀用200微升1×緩沖磷酸鹽水(PBS)洗滌。96孔板在同樣條件下離心以去除PBS。為了消除殘存的3H-胸苷(Amersham)，每孔加入200微升預冷的10％三氯酸(trichloridicacid)(TCA，Merck)，將該板渦旋2分鐘后，4℃反應5分鐘。
該板在同樣條件下離心。棄上清后，每孔加入200微升預冷的70％乙醇，該板4℃保持5分鐘以固定T淋巴細胞。將該板離心棄上清后，細胞用10％TCA處理，根據(jù)如上所述的相同方法，將殘存的3H-胸腺嘧啶核苷(Amersham)徹底去除。
每孔內(nèi)加入100微升2％SDS(pH8.0)/0.5N NaOH，該板在37℃孵育30分鐘以裂解T淋巴細胞。96孔板在110×g 25℃離心10分鐘以沉淀細胞碎片，50微升每種上清液轉移至96孔樣品板(Wallac)中。每孔內(nèi)加入1.5倍體積(1.5volumes)OptiPhase SuperMix(Wallac)，將該板渦旋5分鐘。通過用液體閃爍計數(shù)器(1450MicroBeta TriLux微板液體閃爍和發(fā)光計數(shù)器，Wallac)測量放射性(記錄為計數(shù)/分鐘，cpm)來估計整合的3H-胸苷，從而確定T淋巴細胞的增殖(圖6a)。
如圖6a所示，簡單融合二聚體蛋白[TNFR2/Fc]2、[CD2/Fc]2、[CTLA4/Fc]2和[LAG3/Fc]2均抑制T淋巴細胞的增殖。具體地，[CTLA4/Fc]2和[LAG3/Fc]2對T淋巴細胞的增殖顯示出比[TNFR2/Fc]2和[CD2/Fc]2更強的抑制效應。
B.簡單融合二聚體蛋白聯(lián)合使用時對T淋巴細胞增殖的抑制效應T淋巴細胞的增殖按照與實施例5A中相同的方法進行評估，只是簡單融合二聚體蛋白不是單獨使用而是聯(lián)合使用[CTLA4/Fc]2+[TNFR2/Fc]2、[CTLA4/Fc]2+[CD2/Fc]2和[CTLA4/Fc]2+[LAG3/Fc]2；單獨使用[CTLA4/Fc]2作為對照(圖6b)。
如圖6b所示，組合[CTLA4/Fc]2+[TNFR2/Fc]2、[CTLA4/Fc]2+[CD2/Fc]2和[CTLA4/Fc]2+[LAG3/Fc]2以及單獨的[CTLA4/Fc]2均抑制T淋巴細胞的增殖。而且發(fā)現(xiàn)簡單融合二聚體蛋白二者聯(lián)合使用比單獨使用時在抑制T淋巴細胞增殖方面更加有效。
C.連接融合二聚體蛋白單獨使用時對T淋巴細胞增殖的抑制效應T淋巴細胞的增殖按照實施例5A中相同的方法進行評估，只是單獨使用的不是簡單融合二聚體蛋白，而是連接融合二聚體蛋白，包括[TNFR2-TNFR2/Fc]2、[CD2-CD2/Fc]2[CTLA4-CTLA4/Fc]2和[LAG3-LAG3/Fc]2(圖6c)。
如圖6c所示，連接融合二聚體蛋白[TNFR2-TNFR2/Fc]2、[CD2-CD2/Fc]2、[CTLA4-CTLA4/Fc]2和[LAG3-LAG3/Fc]2均抑制T淋巴細胞的增殖。而且發(fā)現(xiàn)單獨使用的連接融合二聚體蛋白比單獨使用的簡單融合二聚體蛋白對T淋巴細胞的增殖有更強的抑制效應。
D.連接融合二聚體蛋白聯(lián)合使用時對T淋巴細胞增殖的抑制效應T淋巴細胞的增殖按照與實施例5A中相同的方法進行評估，只是替代簡單融合二聚體蛋白的連接融合二聚體蛋白不是單獨使用而是聯(lián)合使用[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[TNFR2-TNFR2/Fc]2、[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[CD2-CD2/Fc]2和[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[LAG3-LAG3/Fc]2；單獨使用[CTLA4-CTLA4/Fc]2作為對照(圖6d)。
如圖6d所示，組合[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[TNFR2-TNFR2/Fc]2、[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[CD2-CD2/Fc]2和[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[LAG3-LAG3/Fc]2以及單獨使用的[CTLA4-CTLA4/Fc]2均抑制T淋巴細胞的增殖。而且發(fā)現(xiàn)連接融合二聚體蛋白二者聯(lián)合使用比單獨使用時在抑制T淋巴細胞增殖方面更加有效。特別的是，[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[LAG3-LAG3/Fc]2對T淋巴細胞的增殖表現(xiàn)出最強的抑制效應。
實施例6評估簡單融合二聚體蛋白或者連接融合二聚體蛋白單獨使用或聯(lián)合使用時對膠原誘導的關節(jié)炎的減弱效應A.簡單融合二聚體蛋白單獨使用時對膠原誘導的關節(jié)炎的減弱效應一種純化的II型膠原，Arthrogen-CIA佐劑(Chondrex，USA)，以2毫克/毫升的濃度溶于0.05M醋酸中，以每只小鼠100微克的量注射入DBA/1小鼠的尾靜脈，以誘發(fā)膠原誘導關節(jié)炎(CIA)。三周后，用不完全Freund’s佐劑(Difco，USA)進行加強。
DBA/1小鼠用100微克II型膠原免疫三到四周后，開始出現(xiàn)關節(jié)炎。關節(jié)炎開始三到五天后，小鼠足部腫脹，炎癥性關節(jié)炎持續(xù)超過三到四周。盡管炎癥消退了，但關節(jié)卻永久僵直了?；谠u估關節(jié)炎嚴重性的視覺評分系統(tǒng)(列于下面的表3)，每周兩或三次對于關節(jié)的紅斑和腫脹的發(fā)作，檢查關節(jié)炎的嚴重性(計算每個實驗組5只小鼠嚴重性評分的平均值)。
表3評估關節(jié)炎嚴重性的視覺評分系統(tǒng)

簡單融合二聚體蛋白[TNFR2/Fc]2、[CD2/Fc]2、[CTLA4/Fc]2和[LAG3/Fc]2以200微克/0.5毫升的濃度分別溶解到PBS中，經(jīng)腹膜內(nèi)注射入患(developing)CIA的小鼠。從第19天至第45天，每隔一天將CD2/Fc、TNFR2/Fc、CTLA4/Fc和LAG3/Fc的二聚體形式以10微克的劑量注射入每個實驗組的5只小鼠，并評估關節(jié)炎的嚴重性(圖7a)。
如圖7a所示，當簡單融合二聚體蛋白單獨給予患CIA的小鼠時，與注射PBS的對照組相比，第45天時基于嚴重性測量的關節(jié)炎嚴重性減弱了26-38％。
B.簡單融合二聚體蛋白聯(lián)合使用時對CIA的減弱效應CIA小鼠關節(jié)炎的嚴重性按照與實施例6A中相同的方法進行評估，只是簡單融合二聚體蛋白不是單獨使用而是與[CTLA4/Fc]2聯(lián)合使用[CTLA4/Fc]2+[TNFR2/Fc]2、[CTLA4/Fc]2+[CD2/Fc]2和[CTLA4/Fc]2+[LAG3/Fc]2；單獨使用[CTLA4/Fc]2作為對照(圖7b)。
如圖7b所示，以下組合[CTLA4/Fc]2+[TNFR2/Fc]2、[CTLA4/Fc]2+[CD2/Fc]2和[CTLA4/Fc]2+[LAG3/Fc]2以及單獨使用[CTLA4/Fc]2均減弱小鼠關節(jié)炎嚴重性。而且發(fā)現(xiàn)簡單融合二聚體蛋白二者聯(lián)合使用比單獨使用時在減弱小鼠關節(jié)炎嚴重性方面更加有效。
C.連接融合二聚體蛋白單獨使用時對CIA的減弱效應CIA小鼠關節(jié)炎嚴重性按照與實施例6A中相同的方法進行評估，只是不再用簡單融合二聚體蛋白，而是單獨使用連接融合二聚體蛋白[TNFR2-TNFR2/Fc]2、[CD2-CD2/Fc]2、[CTLA4-CTLA4/Fc]2和[LAG3-LAG3/Fc]2(圖7c)。
如圖7c所示，連接融合二聚體蛋白[TNFR2-TNFR2/Fc]2、[CD2-CD2/Fc]2、[CTLA4-CTLA4/Fc]2和[LAG3-LAG3/Fc]2均減弱CIA小鼠關節(jié)炎嚴重性。發(fā)現(xiàn)單獨使用的連接融合二聚體蛋白比單獨使用的簡單融合二聚體蛋白在減弱小鼠關節(jié)炎嚴重性方面更加有效，而且表現(xiàn)出的關節(jié)炎減弱效應類似于簡單融合二聚體蛋白聯(lián)合使用時的效應。
D.連接融合二聚體蛋白聯(lián)合使用時對CIA的減弱效應CIA小鼠關節(jié)炎嚴重性按照與實施例6A中相同的方法進行評估，只是不再用簡單融合二聚體蛋白，而是使用連接融合二聚體蛋白，不是單獨使用，而是聯(lián)合使用[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[TNFR2-TNFR2/Fc]2、[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[CD2-CD2/Fc]2和[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[LAG3-LAG3/Fc]2；單獨使用[CTLA4/Fc]2作為對照(圖7d)。
如圖7d所示，以下組合[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[TNFR2-TNFR2/Fc]2、[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[CD2-CD2/Fc]2和[CTLA4-CTLA4/Fc]2+[LAG3-LAG3/Fc]2以及單獨使用的[CTLA4/Fc]2均能減弱CIA小鼠關節(jié)炎的嚴重性。而且發(fā)現(xiàn)連接融合二聚體蛋白二者聯(lián)合使用比單獨使用時在減弱小鼠關節(jié)炎嚴重性方面更加有效。
實施例7評估簡單融合二聚體蛋白或者連接融合二聚體蛋白單獨使用或聯(lián)合使用時對移植物抗宿主病(GVHD)的療效A.簡單融合二聚體蛋白對GVHD的療效年齡8到12周、重20到25克的雌性C57BL/6和BDF1[(C57BL/6×DBA/2)F1]小鼠，用于本試驗，在無菌濾器蓋微小隔離盒(sterile filter-top microisolator)中生長。在用來自供體小鼠脾細胞進行移植的前一天，受體小鼠接受復方新諾明(bactrim)。獲自韓國延世大學(Yonsei University)微生物實驗室的BDF1(H-2Kb/d)受體小鼠，用700cGyγ射線照射。來自C57BL/6供體小鼠的脾細胞用含10％RPMI和1％青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基制備，然后通過400g離心10分鐘收集細胞。
為了誘發(fā)移植物抗宿主病(GVHD)，使25×106來自異源C57BL/6供體小鼠(H-2Kb)的活的脾細胞通過反向注射法移植進用γ射線照射過的BDF1受體小鼠。
然后，將簡單融合二聚體蛋白[CD2/Fc]2、[LAG3/Fc]2和[CTLA4/Fc]2以200微克/0.5毫升的濃度分別溶解到PBS中，在移植后第0、2、4、6天經(jīng)腹膜內(nèi)注射入患GVHD的受體小鼠。對照受體小鼠給予PBS。通過每兩天稱量小鼠來監(jiān)測受體小鼠的存活情況(圖8a)。
如圖8a所示，對照受體小鼠由于患GVHD體重迅速減輕，而且由于來自供體小鼠活化T淋巴細胞的增殖，還表現(xiàn)出脾細胞數(shù)量的減少。將脾細胞移植到受體小鼠后約兩周，本試驗中所用的所有對照小鼠均表現(xiàn)出體重嚴重減輕，最后死亡。與之形成對比的是，當給予小鼠每一種簡單融合二聚體蛋白[CD2/Fc]2、[LAG3/Fc]2和[CTLA4/Fc]2，與對照組相比其全部小鼠的GVHD死亡率有所降低。當將簡單融合二聚體蛋白單獨給予GVHD小鼠時，[LAG3/Fc]2表現(xiàn)出最長的存活期，約4周，因此其具有最強的免疫抑制效應，其次是[CTLA4/Fc]2，最后是[CD2/Fc]2，這些二聚體單獨使用時也能改善GVHD小鼠的存活。
B.簡單融合二聚體蛋白單獨使用或聯(lián)合使用時對GVHD的療效簡單融合二聚體蛋白[CD2/Fc]2、[LAG3/Fc]2和[CTLA4/Fc]2以200微克/0.5毫升的濃度分別溶解到PBS中，在移植后第0、2、4、6天經(jīng)腹膜內(nèi)注射入患GVHD的受體小鼠。同樣地，將簡單融合二聚體蛋白的組合[CD2/Fc]2+[CTLA4/Fc]2以及[LAG3/Fc]2+[CTLA4/Fc]2以200微克/0.5毫升的濃度分別溶解到PBS中，在移植后第0、2、4、6天經(jīng)腹膜內(nèi)注射入患GVHD的受體小鼠(圖8b)。
如圖8b所示，簡單融合二聚體蛋白的聯(lián)合施藥，與實施例7A(其中簡單融合二聚體蛋白單獨施藥)的結果相比，得到更高的GVHD小鼠存活率。特別的是，當用組合[LAG3/Fc]2+[CTLA4/Fc]2施加給GVHD小鼠時，所有個體存活均超過40天，并且發(fā)現(xiàn)這種組合最能降低GVHD死亡率。這些結果通過測量來自每組的10只小鼠的存活期并計算測得存活期的平均值而得到(圖4)。結果表明簡單融合二聚體蛋白當兩種或多種聯(lián)合給予治療GVHD時比單獨給予更加有效。
表4簡單融合二聚體蛋白單獨使用或聯(lián)合使用對GVHD的療效比較

C.簡單融合二聚體蛋白和連接融合二聚體蛋白對GVHD的療效比較(1)CTLA-4將簡單融合二聚體蛋白[CTLA4/Fc]2以200微克/0.5毫升的濃度溶解到PBS中，在移植后第0、2、4、6天經(jīng)腹膜內(nèi)注射入患GVHD的受體小鼠。同樣地，將連接融合二聚體蛋白[CTLA4-CTLA4/Fc]2以200微克/0.5毫升的濃度溶解到PBS中，在移植后第0、2、4、6天經(jīng)腹膜內(nèi)注射入患GVHD的受體小鼠(圖8c)。
如圖8c所示，當GVHD受體小鼠單獨給予[CTLA4/Fc]2時，小鼠最多存活約26天。與之形成對比的是，當單獨給予GVHD受體小鼠[CTLA4-CTLA4/Fc]2時，小鼠最多存活約38天。這些結果通過測量每組10只小鼠的存活期并計算測得存活期的平均值而得到(表5)。結果表明連接融合二聚體蛋白治療GVHD比簡單融合二聚體蛋白更加有效。
表5簡單融合二聚體蛋白和連接融合二聚體蛋白對GVHD的療效比較

(2)TNFR2將簡單融合二聚體蛋白[TNFR2/Fc]2以200微克/0.5毫升的濃度溶解到PBS中，在移植后第0、2、4、6天經(jīng)腹膜內(nèi)注射入患GVHD的受體小鼠。同樣地，將連接融合二聚體蛋白[TNFR2-TNFR2/Fc]2以200微克/0.5毫升的濃度溶解到PBS中，在移植后第0、2、4、6天經(jīng)腹膜內(nèi)注射入患GVHD的受體小鼠(圖8d)。
如圖8d所示，當GVHD受體小鼠單獨給予[TNFR2/Fc]2時，小鼠最多存活約20天。與之形成對比的是，當GVHD受體小鼠單獨給予[TNFR2-TNFR2/Fc]2時，小鼠最多存活約35天。這些結果表明連接融合二聚體蛋白治療GVHD比簡單融合二聚體蛋白更加有效。
D.[TNFR2/Fc]2、[TNFR2-TNFR2/Fc]2和[TNFR2-TNFR1/Fc]2對GVHD的療效比較將簡單融合二聚體蛋白[TNFR2/Fc]2以200微克/0.5毫升的濃度溶解到PBS中，在移植后第0、2、4、6天經(jīng)腹膜內(nèi)注射入患GVHD的受體小鼠。同樣地，將連接融合二聚體蛋白[TNFR2-TNFR2/Fc]2和[TNFR2-TNFR1/Fc]2以200微克/0.5毫升的濃度分別溶解到PBS中，在移植后第0、2、4、6天經(jīng)腹膜內(nèi)注射入患GVHD的受體小鼠(圖8e)。
如圖8e所示，當GVHD受體小鼠單獨給予[TNFR2/Fc]2時，小鼠最多存活約20天。與之形成對比的是，當GVHD受體小鼠單獨給予[TNFR2-TNFR1/Fc]2和單獨給予[TNFR2-TNFR2/Fc]2時，小鼠最多存活分別為約30天和約35天。這些結果表明連接融合二聚體蛋白治療GVHD比簡單融合二聚體蛋白更加有效。而且與[TNFR2-TNFR1/Fc]2相比，[TNFR2-TNFR2/Fc]2顯示出幾乎相同的效應，但發(fā)現(xiàn)其具有較強的免疫抑制效應。
E.連接融合二聚體蛋白單獨使用或聯(lián)合使用對GVHD的療效將連接融合二聚體蛋白[CD2-CD2/Fc]2、[LAG3-LAG3/Fc]2、[CTLA4-CTLA4/Fc]2和[TNFR2-TNFR1/Fc]2以200微克/0.5毫升的濃度分別溶解到PBS中，在移植后第0、2、4、6天經(jīng)腹膜內(nèi)注射入患GVHD的受體小鼠。同樣地，將連接融合二聚體蛋白的組合[CD2-CD2/Fc]2+[CTLA4-CTLA4/Fc]2和[LAG3-LAG3/Fc]2+[CTLA4-CTLA4/Fc]2以200微克/0.5毫升的濃度分別溶解到PBS中，在移植后第0、2、4、6天經(jīng)腹膜內(nèi)注射入患GVHD的受體小鼠(圖8f)。
如圖8f所示，大約2周后對照組小鼠表現(xiàn)出100％的死亡率(表6)，這些結果與上面的結果類似。與實施例7B(其中，給予簡單融合二聚體蛋白)結果類似，連接融合二聚體蛋白聯(lián)合給予時比單獨使用時在改善GVHD小鼠存活方面更加有效。連接融合二聚體蛋白的聯(lián)合使用，[CD2-CD2/Fc]2+[CTLA4-CTLA4/Fc]2和[LAG3-LAG3/Fc]2+[CTLA4-CTLA4/Fc]2，分別得到40％和50％的存活率，即使在注射脾細胞約10周后。這些結果表明，連接融合二聚體蛋白當兩種或多種聯(lián)合給予時治療GVHD比單獨給予更加有效。
表6連接融合二聚體蛋白單獨使用或聯(lián)合使用對GVHD的療效比較

發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的Ig融合蛋白均發(fā)現(xiàn)抑制T淋巴細胞的活化。尤其是，連接融合二聚體蛋白比簡單融合二聚體蛋白具有更強的抑制效應。另外，發(fā)現(xiàn)簡單融合以及連接融合二聚體蛋白當聯(lián)合給予時均比單獨給予時在抑制T淋巴細胞活化方面更加有效。
涉及微生物或其他生物材料保藏的證明(PCT Rule 13bis)


PCT/RO/134表(1998年7月)
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<221>CDS<222>(1)..(2025)<223>TNFR2-TNFR1/Fc<400>25atg gcg ccc gtc gcc gtc tgg gcc gcg ctg gcc gtc gga ctg gag ctc 48Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu1 5 10 15tgg gct gcg gcg cac gcc ttg ccc gcc cag gtg gca ttt aca ccc tac 96Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr20 25 30gcc ccg gag ccc ggg agc aca tgc cgg ctc aga gaa tac tat gac cag144Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln35 40 45aca gct cag atg tgc tgc agc aaa tgc tcg ccg ggc caa cat gca aaa192Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys50 55 60gtc ttc tgt acc aag acc tcg gac acc gtg tgt gac tcc tgt gag gac240Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp65 70 75 80agc aca tac acc cag ctc tgg aac tgg gtt ccc gag tgc ttg agc tgt288Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys85 90 95ggc tcc cgc tgt agc tct gac cag gtg gaa act caa gcc tgc act cgg336Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg100 105 110gaa cag aac cgc atc tgc acc tgc agg ccc ggc tgg tac tgc gcg ctg384Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu115 120 125agc aag cag gag ggg tgc cgg ctg tgc gcg ccg ctg cgc aag tgc cgc432Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg130 135 140ccg ggc ttc ggc gtg gcc aga cca gga act gaa aca tca gac gtg gtg480Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val145 150 155 160
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1.一種通過抑制T淋巴細胞的活化來治療免疫性疾病的藥物組合物，包括選自由以下物質(zhì)組成的組中的兩種或多種作為活性成分能夠阻斷MHC II類分子與其受體結合的物質(zhì)，能夠阻斷協(xié)同刺激分子與其受體結合的物質(zhì)，能夠阻斷粘附分子與其受體結合的物質(zhì)，以及能夠阻斷細胞因子與其受體結合的物質(zhì)。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于治療免疫性疾病的藥物組合物，其中所述能夠用于阻斷MHC II類分子與CD4結合的物質(zhì)選自由以下物質(zhì)組成的組(1)MHC II類分子的抗體；(2)簡單融合單體蛋白，通過LAG3的可溶性細胞外結構域連接到免疫球蛋白分子的Fc段的鉸鏈區(qū)而形成；(3)簡單融合二聚體蛋白，其中兩分子的所述簡單融合單體蛋白通過在所述鉸鏈區(qū)的分子間二硫鍵而連接；(4)連接融合單體蛋白，通過連接到所述簡單融合單體蛋白的所述鉸鏈區(qū)的LAG3的可溶性細胞外結構域的N-末端連接到另一個LAG3分子的可溶性細胞外結構域的C-末端而形成；(5)連接融合二聚體蛋白，其中兩分子的所述連接融合單體蛋白通過在所述鉸鏈區(qū)的分子間二硫鍵而連接；以及(6)根據(jù)(2)至(5)中所述蛋白的糖基化形式。
3.根據(jù)權利要求1所述的用于治療免疫性疾病的藥物組合物，其中所述協(xié)同刺激分子是B7、CD154、CD70、0X40L、ICOS-L、4-1BBL、HVEM、FASL或PDL，其受體是CD28和CTLA-4、CD40、CD27、0X40、ICOS、4-1BB、LIGHT、FAS或PD-1。
4.根據(jù)權利要求3所述的用于治療免疫性疾病的藥物組合物，其中能夠阻斷B7分子與CD28結合的物質(zhì)選自由以下物質(zhì)組成的組(1)B7分子的抗體；(2)簡單融合單體蛋白，通過CTLA4的可溶性細胞外結構域連接到免疫球蛋白分子的Fc段鉸鏈區(qū)而形成；(3)簡單融合二聚體蛋白，其中兩分子的所述簡單融合單體蛋白通過在所述鉸鏈區(qū)的分子間二硫鍵而連接；(4)連接融合單體蛋白，通過連接到所述簡單融合單體蛋白的所述鉸鏈區(qū)的CTLA4的可溶性細胞外結構域的N-末端連接到另一個CTLA4分子的可溶性細胞外結構域的C-末端而形成；(5)連接融合二聚體蛋白，其中兩分子的所述連接融合單體蛋白通過在所述鉸鏈區(qū)的分子間二硫鍵而連接；以及(6)根據(jù)(2)至(5)中所述蛋白的糖基化形式。
5.根據(jù)權利要求1所述的用于治療免疫性疾病的藥物組合物，其中所述粘附分子是LFA-3、ICAM-1或VCAM-1，以及其受體為CD2、LFA-1或VLA-4。
6.根據(jù)權利要求5所述的用于治療免疫性疾病的藥物組合物，其中所述能夠阻斷LFA-3與CD2結合的物質(zhì)選自由下列物質(zhì)組成的組(1)LFA-3的抗體；(2)簡單融合單體蛋白，通過CD2的可溶性細胞外結構域連接到免疫球蛋白分子的Fc段的鉸鏈區(qū)而形成；(3)簡單融合二聚體蛋白，其中兩分子的所述簡單融合單體蛋白通過在所述鉸鏈區(qū)的分子間二硫鍵而連接；(4)連接融合單體蛋白，通過連接到所述簡單融合單體蛋白的鉸鏈區(qū)的CD2的可溶性細胞外結構域的N-末端連接到另一個CD2分子的可溶性細胞外結構域的C-末端而形成；(5)連接融合二聚體蛋白，其中兩分子的所述連接融合單體蛋白通過在所述鉸鏈區(qū)的分子間二硫鍵而連接；以及(6)根據(jù)(2)至(5)中所述蛋白的糖基化形式。
7.根據(jù)權利要求1所述的用于治療免疫性疾病的藥物組合物，其中所述細胞因子是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、TNF、TGF、IFN、GM-CSF、G-CSF、EPO、TPO或M-CSF，其受體是IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、TNFR、TGFR、IFNR、IFN-αR、-βR和-γR、GM-CSFR、G-CSFR、EPOR、cMpl或gp130。
8.根據(jù)權利要求7所述的用于治療免疫性疾病的藥物組合物，其中所述能夠阻斷TNF與TNFR結合的物質(zhì)選自由下列物質(zhì)組成的組(1)TNF的抗體；(2)簡單融合單體蛋白，通過TNFR的可溶性細胞外結構域連接到免疫球蛋白分子的Fc段的鉸鏈區(qū)而形成；(3)簡單融合二聚體蛋白，其中兩分子的所述簡單融合單體蛋白通過在所述鉸鏈區(qū)的分子間二硫鍵而連接；(4)連接融合單體蛋白，通過連接到所述簡單融合單體蛋白的鉸鏈區(qū)的TNFR的可溶性細胞外結構域的N-末端連接到另一個TNFR分子的可溶性細胞外結構域的C-末端而得到；(5)連接融合二聚體蛋白，其中兩分子的所述連接融合單體蛋白通過在所述鉸鏈區(qū)的分子間二硫鍵而連接；以及(6)根據(jù)(2)至(5)中所述蛋白的糖基化形式。
9.根據(jù)權利要求1到8中任一項所述的用于治療免疫性疾病的藥物組合物，其中所述免疫性疾病是自身免疫性疾病或者移植排斥。
10.根據(jù)權利要求9中所述的用于治療免疫性疾病的藥物組合物，其中所述自身免疫性疾病選自由下列疾病組成的組風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、格雷夫斯病、慢性淋巴細胞性甲狀腺炎、阿狄森病、白癜風、硬皮病、腎炎-肺出血綜合癥、Becet’s病、節(jié)段性回腸炎、強直性脊柱炎、葡萄膜炎、血小板減少性紫癜、尋常型天皰瘡、兒童糖尿病、自身免疫性貧血、冷球蛋白血癥、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(ALD)以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。
全文摘要
本文披露了一種通過抑制T淋巴細胞的活化來治療免疫性疾病的藥物組合物，包括選自由以下物質(zhì)組成的組中的兩種或多種物質(zhì)作為活性成分能夠阻斷MHC(主要組織相容性復合體)II類分子與其受體結合的物質(zhì)，能夠阻斷協(xié)同刺激分子與其受體結合的物質(zhì)，能夠阻斷粘附分子與其受體結合的物質(zhì)，以及能夠阻斷細胞因子與其受體結合的物質(zhì)。
文檔編號C07K14/435GK1942206SQ200580008209
公開日2007年4月4日 申請日期2005年2月18日 優(yōu)先權日2004年2月18日
發(fā)明者鄭用勛, 趙勛埴, 樸洪圭, 李基完 申請人:魅德秀專公司