專利名稱：一種土壤微生物dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種土壤微生物DNA的提取方法。
背景技術(shù)：
土壤中微生物的數(shù)量和種類十分龐大，據(jù)估計，1g土壤中含有1010以上的微生物。長期以來，研究土壤微生物群落的多樣性通過傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法進行，而在營養(yǎng)平板上能生長的只占其中0.001％～10％，另一方面，被分離培養(yǎng)的微生物通常并不是分離者所期望的自然生境中的某些優(yōu)勢種群。顯然，傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)具有較大的局限性，其結(jié)果不能準(zhǔn)確反映系統(tǒng)中微生物群落的真實組成。近年來，分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，使研究者可以不再依賴于微生物的分離培養(yǎng)技術(shù)，而是在基因組DNA水平上對復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)進行分析研究。如聚合酶鏈反應(yīng)—變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)、限制性酶切片段多態(tài)性分析(RFLP)和末端限制性酶切片段多態(tài)性分析(T-RFLP)等相繼用來評價土壤環(huán)境微生物群落多樣性變化，這就是近年來出現(xiàn)的一門新學(xué)科——微生物分子生態(tài)學(xué)。應(yīng)用物理或化學(xué)方法從土壤中提取高質(zhì)量的微生物DNA，則是分子水平上揭示生物群落分布多樣性的基礎(chǔ)。
目前土壤DNA的提取方法主要通過直接原位裂解土壤微生物細胞來提取DNA。DNA提取方法的有效性受各種因素的影響，其中包括細胞裂解不完全，DNA分子吸附在樣品基質(zhì)顆粒的表面，從樣品中同時提取了某些重要酶的活性抑制劑，DNA分子的損耗、降解和破壞等。其中由于提取的DNA中腐殖質(zhì)和有機酸的含量過高(OD260/OD230一般都小于1.5，OD260/OD280一般都小于1.2)，抑制了限制性內(nèi)切酶和Taq酶等酶類的作用，是目前各種DNA提取方法中最大的問題。所提取的DNA必須經(jīng)過一系列的純化手段(主要通過商品化的試劑盒)，DNA的純度才能達到分子操作的要求。因而，目前DNA的提取方法不但涉及到繁多的化學(xué)試劑和復(fù)雜的操作步驟，同時大大增加了操作成本，限制了快速、大量樣品的分析。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的則是克服現(xiàn)有土壤DNA提取涉及繁多化學(xué)試劑和操作復(fù)雜的不足，提供一種可將大量腐殖質(zhì)和蛋白質(zhì)去除、所得到的土壤DNA可直接用于PCR等分子操作的土壤DNA的提取方法。
為達到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種土壤微生物DNA的提取方法，所述的方法步驟如下(1)土壤微生物細胞裂解土壤置于含蛋白酶K0.1～0.4g/L、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)0.01～0.02g/L的細胞裂解緩沖液中，50～60℃振蕩30～60min后，每100mL裂解緩沖液加入1g表面活性劑，60～70℃溫浴，離心，取上清液得細胞裂解液；(2)粗DNA溶液的獲得將步驟(1)所得細胞裂解液加入0.5～1倍體積的聚乙二醇溶液，室溫沉淀1～3h后，離心，取沉淀，用TE溶液溶解，即得粗DNA溶液，所述TE溶液為10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0；(3)土壤微生物DNA的獲得將粗DNA溶液去蛋白，經(jīng)分離純化即得所述的土壤微生物DNA。
所述步驟(2)中所用聚乙二醇為PEG20000，通常采用300g/L的PEG20000與等體積1.6M NaCl的混合溶液，以促進DNA的沉淀。
所述步驟(3)如下往步驟(2)所得粗DNA溶液中加入乙酸鹽或銨鹽沉淀部分蛋白質(zhì)，離心取上清，再用酚/氯仿、氯仿/異戊醇抽提去除蛋白質(zhì)，離心，取上清用異丙醇沉淀過夜，將絮狀DNA沉淀取出用75％乙醇漂洗，干燥后溶于TE溶液，即得純化的土壤微生物DNA。
所述步驟(1)中表面活性劑可用常用的表面活性劑，本發(fā)明中采用十二烷基硫酸鈉。
所述步驟(1)中細胞裂解緩沖液采用常用的細胞裂解緩沖液即可，本發(fā)明中采用的細胞裂解緩沖液為100mM Tris-HCl，100mM EDTA，1.5M NaCl，pH8.0。
所述步驟(3)中去蛋白方法如下往粗DNA溶液中加入乙酸鹽或銨鹽沉淀部分蛋白質(zhì)，離心取上清，再用酚氯仿、氯仿異戊醇抽提去除蛋白質(zhì)。也可采用其他常用的去蛋白的方法進行。
所述步驟(3)中分離純化方法如下將除去蛋白質(zhì)的粗DNA溶液離心，取上清用異丙醇沉淀過夜，將絮狀DNA沉淀取出用75％乙醇漂洗，干燥后溶于TE溶液，即得純化的土壤微生物DNA。也可采用其他常用的分離純化方法來對DNA進行純化。
具體的，所述的方法如下(1)土壤微生物細胞裂解取土壤置于含細胞裂解緩沖液100mMTris-HCl，100mM EDTA，1.5M NaCl，pH 8.0的容器中，每10mL細胞裂解緩沖液加入5g土壤、2mg蛋白酶K、0.1mg交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮和5g小玻璃珠，55℃振蕩30min，加入體積為細胞裂解緩沖液1/10的100g/L十二烷基硫酸鈉溶液，振蕩1min后65℃溫浴1h，離心，取上清液得細胞裂解液；
(2)粗DNA溶液的獲得將步驟(1)所得細胞裂解液加入0.5倍體積的300g/LPEG20000與等體積1.6M NaCl的混合溶液，室溫沉淀2h后，離心，取沉淀，用TE溶液溶解，即得粗DNA溶液；(3)土壤微生物DNA的獲得往步驟(2)所得粗DNA溶液中加入乙酸鉀至終濃度至0.5M，沉淀部分蛋白質(zhì)，離心取上清，再用與上清液等體積的酚∶氯仿體積比為1∶1溶液抽提去除蛋白質(zhì)，離心，取上清液，再用與上清液等體積的氯仿∶異戊醇體積比為24∶1溶液抽提去除蛋白質(zhì)，離心，再取上清，用體積為上清液0.6倍的異丙醇，沉淀，將產(chǎn)生絮狀DNA沉淀取出用75％乙醇漂洗，干燥后溶于TE溶液，即得純化的土壤微生物DNA。。
本發(fā)明所述的方法是利用PVPP、蛋白酶K等化學(xué)物質(zhì)的有效組合，通過PEG20000、異丙醇等有機溶劑的沉淀后，用分光光度計測定OD260/OD230、OD260/OD280值(注OD260/OD230＞2.0時腐殖質(zhì)和有機酸含量極低；OD260/OD280＞1.6時蛋白質(zhì)含量極低)接近于標(biāo)準(zhǔn)值，可直接應(yīng)用于分子操作，具有重大應(yīng)用前景。
(四)

圖1為實施例1所提取DNA擴增16S rDNA和18S rDNA序列圖；泳道1～5為實施例2所提土壤微生物DNA的16S rDNA擴增(引物為27f/1492r)，6～8為實施例1所提取的土壤微生物DNA擴增的16S rDNA片段；9～11為非實施例2所提土壤微生物DNA的18S rDNA擴增(引物為EF4f/Fung5r)；12為DNA Marker；13～14為實施例1所提取的土壤微生物DNA擴增的18S rDNA。
(五)
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1土壤DNA的提取步驟(1)土壤微生物細胞裂解1)將5g土壤放置于含10ml的土壤提取緩沖液(100mM Tris-HCl，100mM EDTA，1.5M NaCl，pH8.0)的三角瓶中，提取液中添加2mg蛋白酶K、0.1mgPVPP和5g小玻璃珠，55℃振蕩30min(轉(zhuǎn)速為180rpm)；2)加入1ml的100g/LSDS，并繼續(xù)振蕩1min；3)樣品轉(zhuǎn)到65℃溫浴1h后，在6000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，取上清液，得細胞裂解液。
(2)粗DNA溶液的獲得1)往細胞裂解液加入1/2體積的PEG20000(300g/L的PEG20000與等體積的1.6M NaCl混合)，室溫沉淀2h；2)在10000rpm轉(zhuǎn)速下，室溫離心20min，取沉淀；3)沉淀用0.5ml的TE溶解，即得粗DNA溶液。
(3)土壤微生物DNA的獲得1)在步驟(2)所得粗DNA溶液中加入乙酸鉀(7.5M)至終濃度為0.5M，顛倒混勻后，冰上放置5min；
2)14000rpm、4℃離心30min，取上清液置于新的離心管，加入等體積的酚/氯仿(體積比1∶1)，上下溫和顛倒混勻；3)10000rpm、4℃離心5min，取上清液置于新的離心管，加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比24∶1)，上下溫和顛倒混勻；4)10000rpm、4℃離心5min，取上清液置于新的離心管，加入0.6體積的異丙醇，上下溫和顛倒混勻，放置于室溫2hr；5)將產(chǎn)生得絮狀DNA沉淀勾出后，用75％乙醇漂洗，并在空氣中自然風(fēng)干，溶于300ulTE中，得到純化的DNA。
實施例2對比實驗對照方法在DNA提取緩沖液中不加PVPP，DNA初沉淀不用PEG20000，而是用異丙醇代替，其它操作步驟不變。
對兩種提取方法所提取的DNA純度進行了對比實驗。用分光光度計分別測定對照方法和本發(fā)明方法所得DNA溶液的OD260/OD230、OD260/OD280值，結(jié)果見表1。從表1中可以看出，對照方法所提取到土壤DNA的OD260/OD230和OD260/280分別只有0.87和1.17遠低于標(biāo)準(zhǔn)的2.0和1.6，說明DNA溶液中的腐殖質(zhì)和蛋白質(zhì)的含量非常高，不經(jīng)過進一步的純化處理無法進行分子操作；而本發(fā)明方法所提取的DNA溶液，OD260/OD230和OD260/280都接近于標(biāo)準(zhǔn)值，說明本發(fā)明所述方法所提取到的土壤DNA純度比對照方法高的多，可直接應(yīng)用于分子操作。
表1將兩種方法所提取的DNA在分光光度計中檢測OD260/OD230、OD260/OD280值

實施例3其它類型土壤中的微生物DNA的提取利用實施例1所述的方法提取來自四川(取自峨嵋山)、浙江杭州、浙江桐廬土壤DNA。對來自三個不同地方的土壤進行DNA提取，用分光光度計分別測定所得DNA溶液的OD260/OD230、OD260/OD280值，結(jié)果見表2。表2結(jié)果顯示用發(fā)明內(nèi)容中所述方法，所提取到的不同地區(qū)的土壤DNA的OD260/OD230都接近2.0，說明DNA溶液中的腐殖質(zhì)類含量非常低；OD260/280接近于1.6，表明DNA溶液中的蛋白質(zhì)含量非常低。因此，本發(fā)明方法也適合提取其它類型的土壤微生物DNA。
表2不同地區(qū)所提取的DNA在分光光度計中檢測OD260/OD230、OD260/OD280值

實施例4PCR擴增檢驗將實施例1本發(fā)明提取方法所得DNA溶液和實施例2非本發(fā)明方法所得DNA溶液分別進行PCR擴增，用引物27f/1492r(27f，5’-AGA GTT TGATCM TGG CTC AG-3’；1492r，5’-TAC GGH TAC CTT ACG ACT T-3’)擴增細菌16SrDNA片段，目的片段約為1500bp；用引物EF4f/5r(GGAAGGG[G/A]TGTATTTATTAG；Fung5r GTAAAAGTCCTGGTTCCC)擴增真菌18srDNA片段。擴增條件為94℃ 3min(1 cycle)，94℃ 1min，55℃ 1min(EF4f/Fung5r48℃)，72℃ 2min(35 cycles)，72℃ 10min(1cycle)；目的片段約為530bp。結(jié)果顯示，本發(fā)明方法所提到的DNA經(jīng)兩對引物擴增后，分別得到與目的片段大小完全一致的DNA條帶(見圖1)，說明本發(fā)明方法所提取的DNA可直接應(yīng)用于分子操作。
權(quán)利要求
1.一種土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述的方法步驟如下(1)土壤微生物細胞裂解土壤置于含蛋白酶K0.1～0.4g/L、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮0.01～0.02g/L的細胞裂解緩沖液中，50～60℃振蕩30～60min后，每100mL裂解緩沖液加入1g表面活性劑，60～70℃溫浴，離心，取上清液得細胞裂解液；(2)粗DNA溶液的獲得將步驟(1)所得細胞裂解液加入0.5～1倍體積的聚乙二醇溶液，室溫沉淀1～3h后，離心，取沉淀，用TE溶液溶解，即得粗DNA溶液，所述TE溶液為10mMTris，1mM EDTA，pH8.0；(3)土壤微生物DNA的獲得將粗DNA溶液去蛋白，經(jīng)分離純化即得所述的土壤微生物DNA。
2.如權(quán)利要求1所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于步驟(2)中所用聚乙二醇為PEG20000。
3.如權(quán)利要求2所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于步驟(2)中所用聚乙二醇溶液為300g/L的PEG20000與等體積1.6MNaCl的混合溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述步驟(3)如下往步驟(2)所得粗DNA溶液中加入乙酸鹽或銨鹽沉淀部分蛋白質(zhì)，離心取上清，再用酚/氯仿、氯仿/異戊醇抽提去除蛋白質(zhì)，離心，取上清用異丙醇沉淀過夜，將絮狀DNA沉淀取出用75％乙醇漂洗，干燥后溶于TE溶液，即得純化的土壤微生物DNA。
5.如權(quán)利要求1～4之一所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述步驟(1)中表面活性劑為十二烷基硫酸鈉。
6.如權(quán)利要求1～4之一所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述步驟(1)中細胞裂解緩沖液為100mM Tris-HCl，100mM EDTA，1.5M NaCl，pH8.0。
7.如權(quán)利要求1～3之一所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述步驟(3)中去蛋白方法如下往粗DNA溶液中加入乙酸鹽或銨鹽沉淀部分蛋白質(zhì)，離心取上清，再用酚氯仿、氯仿異戊醇抽提去除蛋白質(zhì)。
8.如權(quán)利要求1～3之一所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述步驟(3)中分離純化方法如下將除去蛋白質(zhì)的粗DNA溶液離心，取上清用異丙醇沉淀過夜，將絮狀DNA沉淀取出用75％乙醇漂洗，干燥后溶于TE溶液，即得純化的土壤微生物DNA。
9.如權(quán)利要求1所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述的方法如下(1)土壤微生物細胞裂解取土壤置于含細胞裂解緩沖液100mMTris-HCl，100mM EDTA，1.5M NaCl，pH8.0的容器中，每10mL細胞裂解緩沖液加入5g土壤、2mg蛋白酶K、0.1mg交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮和5g小玻璃珠，55℃振蕩30min，加入體積為細胞裂解緩沖液1/10的100g/L十二烷基硫酸鈉溶液，振蕩1min后65℃溫浴1h，離心，取上清液得細胞裂解液；(2)粗DNA溶液的獲得將步驟(1)所得細胞裂解液加入0.5倍體積的300g/LPEG20000與等體積1.6M NaCl的混合溶液，室溫沉淀2h后，離心，取沉淀，用TE溶液溶解，即得粗DNA溶液；(3)土壤微生物DNA的獲得往步驟(2)所得粗DNA溶液中加入乙酸鉀至終濃度至0.5M，沉淀部分蛋白質(zhì)，離心取上清，再用與上清液等體積的酚氯仿體積比為1∶1溶液抽提去除蛋白質(zhì)，離心，取上清液，再用與上清液等體積的氯仿∶異戊醇體積比為24∶1溶液抽提去除蛋白質(zhì)，離心，再取上清，用體積為上清液0.6倍的異丙醇，沉淀，將產(chǎn)生絮狀DNA沉淀取出用75％乙醇漂洗，干燥后溶于TE溶液，即得純化的土壤微生物DNA。。
10.如權(quán)利要求1所述的土壤微生物DNA的提取方法，其特征在于所述的方法如下(1)土壤微生物細胞裂解1)將5g土壤放置于含10ml的土壤提取緩沖液--100mMTris-HCl，100mM EDTA，1.5M NaCl，pH8.0的三角瓶中，提取液中添加2mg蛋白酶K、0.1mgPVPP和5g小玻璃珠，55℃振蕩30min，轉(zhuǎn)速為180rpm，；2)加入1ml的100g/LSDS，并繼續(xù)振蕩1min；3)樣品轉(zhuǎn)到65℃溫浴1h后，在6000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，取上清液，得細胞裂解液。(2)粗DNA溶液的獲得1)往細胞裂解液加入1/2體積的300g/L PEG20000與等體積的1.6M NaCl混合溶液，室溫沉淀2h；2)在10000rpm轉(zhuǎn)速下，室溫離心20min，取沉淀；3)沉淀用0.5ml的TE溶解，即得粗DNA溶液。(3)土壤微生物DNA的獲得1)在步驟(2)所得粗DNA溶液中加入7.5M乙酸鉀至終濃度為0.5M，顛倒混勻后，冰上放置5min；2)14000rpm、4℃離心30min，取上清液置于新的離心管，加入等體積的酚/氯仿體積比1∶1的溶液，上下溫和顛倒混勻；3)10000rpm、4℃離心5min，取上清液置于新的離心管，加入等體積的氯仿/異戊醇體積比24∶1的溶液，上下溫和顛倒混勻；4)10000rpm、4℃離心5min，取上清液置于新的離心管，加入0.6體積的異丙醇，上下溫和顛倒混勻，放置于室溫2h；(4)將產(chǎn)生得絮狀DNA沉淀勾出后，用75％乙醇漂洗，并在空氣中自然風(fēng)干，溶于300ulTE中，得到純化的DNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種土壤微生物DNA的提取方法，所述的方法包括土壤微生物細胞裂解、粗DNA溶液的獲得、土壤微生物DNA的獲得等步驟；本發(fā)明所述的方法是利用PVPP、蛋白酶K等化學(xué)物質(zhì)的有效組合，通過PEG20000、異丙醇等有機溶劑的沉淀后，用分光光度計測定OD260/OD230、OD260/OD280值接近于標(biāo)準(zhǔn)值，可直接應(yīng)用于分子操作，具有重大應(yīng)用前景。
文檔編號C07H1/00GK1978453SQ20051006187
公開日2007年6月13日 申請日期2005年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月7日
發(fā)明者錢海豐, 程秋霞, 王智燁, 徐茜, 許皓 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)