專利名稱：胞內(nèi)勞森氏菌亞單位疫苗的制作方法
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及編碼新型胞內(nèi)勞森氏菌(Lawsonia intracellularis)蛋白質(zhì)的核酸序列，包含這些序列的DNA片段、重組DNA分子、和活體重組載體，包含這些核酸序列、DNA片段、重組DNA分子、和活體重組載體的宿主細(xì)胞，由這些核酸序列編碼的蛋白質(zhì)及其用于制造疫苗的用途，用于抗擊胞內(nèi)勞森氏菌感染的疫苗及其制備方法，以及用于檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌DNA、用于檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌抗原、和用于檢測(cè)針對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌的抗體的的診斷性測(cè)試，等等。

背景技術(shù)：
豬增生性腸病(PPE或PE)已經(jīng)在世界范圍成為現(xiàn)代豬養(yǎng)殖業(yè)地一種重要疾病。它影響15％-50％的成長畜群，和確認(rèn)存在問題的畜群中高達(dá)30％的動(dòng)物個(gè)體。目前，每頭病豬的額外飼料和設(shè)備時(shí)間成本的年度經(jīng)濟(jì)損失估算是5-10美元。PPE是臨床癥候相差很大的一組慢性和急性病況(死亡、蒼白和貧血、流口水、暗紅或鮮紅腹瀉、萎靡、食欲降低和不愿移動(dòng)、生長遲緩、和FCR升高)。然而，存在兩種一致的特征。第一種是只在尸檢時(shí)才看得見的病理學(xué)變化，即小腸和結(jié)腸粘膜變厚。第二種是病腸的腸細(xì)胞中存在胞質(zhì)內(nèi)小型彎曲細(xì)菌。這些細(xì)菌現(xiàn)在已經(jīng)確認(rèn)是PPE的病因，而且已經(jīng)命名為胞內(nèi)勞森氏菌。
幾年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)勞森氏菌侵襲近乎所有動(dòng)物，包括猴、兔、雪貂、倉鼠、狐貍、馬，并廣至鴕鳥和鴯鹋等其它動(dòng)物。胞內(nèi)勞森氏菌是有鞭毛的革蘭氏陰性細(xì)菌，只在真核腸細(xì)胞中繁殖，尚無無細(xì)胞培養(yǎng)的描述。為了在細(xì)胞中駐扎和繁殖，胞內(nèi)勞森氏菌必需穿透分隔的囊細(xì)胞。細(xì)菌結(jié)合細(xì)胞膜，并經(jīng)由進(jìn)入性液泡快速進(jìn)入腸細(xì)胞。然后這個(gè)進(jìn)入液泡快速破裂(3小時(shí)內(nèi))，而細(xì)菌開始活躍并在胞質(zhì)中自由繁殖。尚未理解細(xì)菌致使受感染細(xì)胞不能成熟、繼續(xù)進(jìn)行有絲分裂、并形成發(fā)育不全囊細(xì)胞的機(jī)制。
目前對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌感染的理解、對(duì)該疾病的治療和控制由于無法在無細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)胞內(nèi)勞森氏菌這一事實(shí)而受阻。雖然有在大鼠腸細(xì)胞中成功共培養(yǎng)胞內(nèi)勞森氏菌的報(bào)導(dǎo)，但是這尚未導(dǎo)致用于抗擊胞內(nèi)勞森氏菌的滅活疫苗的開發(fā)，盡管顯然需要這樣的疫苗。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于抗擊胞內(nèi)勞森氏菌感染的疫苗。
現(xiàn)在令人驚訝的發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)勞森氏菌產(chǎn)生六種新型蛋白質(zhì)，它們能夠單獨(dú)或聯(lián)合誘導(dǎo)針對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌的保護(hù)性免疫。
將這些新型蛋白質(zhì)稱為31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白。它們的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO2、4、6、8、10和12中。編碼這些蛋白質(zhì)的基因已經(jīng)測(cè)序，它們的核酸序列顯示于SEQID NO1、3、5、7、9和11中。
本領(lǐng)域眾所周知，許多不同的核酸序列能夠編碼同一種蛋白質(zhì)。這種現(xiàn)象常常稱為每個(gè)編碼氨基酸的三聯(lián)體中第二個(gè)、并且尤其是第三個(gè)堿基的搖擺現(xiàn)象。該現(xiàn)象可以導(dǎo)致異源性約30％的兩種核酸序列仍然編碼相同的蛋白質(zhì)。因此，序列同源性約70％的兩種核酸序列仍然能夠編碼同一種蛋白質(zhì)。
由此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及編碼胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列和編碼所述蛋白質(zhì)之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，其中所述核酸序列或其部分與SEQ ID NO1所示核酸序列具有至少90％的同源性水平。
優(yōu)選的是，編碼所述胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列或其部分與SEQ ID NO1所示核酸序列具有至少92％、優(yōu)選94％、更優(yōu)選95％的同源性。甚至更優(yōu)選98％或甚至100％的同源性水平。
核苷酸同源性水平可以使用計(jì)算機(jī)程序“BLAST 2 SEQUENCES”、選擇子程序“BLASTN”測(cè)定，所述程序可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/b12.html上找到。該程序的一篇參考文獻(xiàn)是Tatiana A.Tatusova、Thomas L.Madden，F(xiàn)EMSMicrobiol.Letters 174247-250，1999。所用參數(shù)是默認(rèn)參數(shù)匹配獎(jiǎng)分+1，錯(cuò)配罰分-2，開放缺口5，延伸缺口2，缺口x_dropoff50。
用于判定某種核酸序列是否是依照本發(fā)明的核酸序列的另一種方法涉及所述核酸序列是否與SEQ ID NO1(或SEQ ID NO3、5、7、9、或11，見下文)所示核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下確能雜交的問題。若核酸序列與SEQ ID NO1、或者SEQ ID NO3、5、7、9、或11所示核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，則認(rèn)為它是依照本發(fā)明的核酸序列。
嚴(yán)謹(jǐn)條件的定義是由Meinkoth和Wahl(1984。固定在固相支持物上的核酸的雜交(Hybridization of nucleic acids immobilized onsolid supports)。Anal.Biochem.138267-284)的公式得出的。
Tm＝[81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L]-1℃/1％錯(cuò)配
在該公式中，M指單價(jià)陽離子的摩爾濃度；％GC指DNA中鳥苷和胞苷的百分比；L指雜合體的堿基對(duì)長度。
嚴(yán)謹(jǐn)條件指核酸序列或其片段與SEQ ID NO1、3、5、7、9、或11中任一所示核酸序列有至多10％錯(cuò)配時(shí)仍然發(fā)生雜交的那些條件。
此實(shí)施方案還涉及編碼胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列和編碼所述蛋白質(zhì)之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，它與SEQ ID NO3所示核酸序列具有至少90％的同源性水平。
優(yōu)選的是，編碼所述胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列或其部分與SEQ ID NO3所示核酸序列具有至少92％、優(yōu)選94％、更優(yōu)選96％的同源性。甚至更優(yōu)選98％或甚至100％的同源性水平。
此實(shí)施方案還涉及編碼胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列和編碼所述蛋白質(zhì)之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，它與SEQ ID NO5所示核酸序列具有至少90％的同源性水平。
優(yōu)選的是，編碼所述胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列或其部分與SEQ ID NO5所示核酸序列具有至少92％、優(yōu)選94％、更優(yōu)選96％的同源性。甚至更優(yōu)選98％或甚至100％的同源性水平。
此實(shí)施方案還涉及編碼胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列和編碼所述蛋白質(zhì)之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，它與SEQ ID NO7所示核酸序列具有至少90％的同源性水平。
優(yōu)選的是，編碼所述胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列或其部分與SEQ ID NO7所示核酸序列具有至少92％、優(yōu)選94％、更優(yōu)選96％的同源性。甚至更優(yōu)選98％或甚至100％的同源性水平。
此實(shí)施方案還涉及編碼胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列和編碼所述蛋白質(zhì)之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，它與SEQ ID NO9所示核酸序列具有至少90％的同源性水平。
優(yōu)選的是，編碼所述胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列或其部分與SEQ ID NO9所示核酸序列具有至少92％、優(yōu)選94％、更優(yōu)選96％的同源性。甚至更優(yōu)選98％或甚至100％的同源性水平。
此實(shí)施方案還涉及編碼胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列和編碼所述蛋白質(zhì)之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，它與SEQ ID NO11所示核酸序列具有至少90％的同源性水平。
優(yōu)選的是，編碼所述胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列或其部分與SEQ ID NO11所示核酸序列具有至少92％、優(yōu)選94％、更優(yōu)選96％的同源性。甚至更優(yōu)選98％或甚至100％的同源性水平。
因?yàn)楸景l(fā)明公開了編碼新型胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列，現(xiàn)在第一次有可能獲得足夠量的這些蛋白質(zhì)。這可以通過例如使用表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)編碼所述蛋白質(zhì)的基因來進(jìn)行。因此，在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含依照本發(fā)明的核酸序列的DNA片段。這些DNA片段可以是例如其中克隆了依照本發(fā)明的核酸序列的質(zhì)粒。這些DNA片段可用于例如增加DNA的量，如下文所述用作引物。
表達(dá)核酸序列的一項(xiàng)必要條件是將核酸序列與合適的啟動(dòng)子功能性相連，使得所述核酸序列處于該啟動(dòng)子的控制下。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，啟動(dòng)子的選擇可延伸至能夠在用作蛋白質(zhì)表達(dá)宿主細(xì)胞的細(xì)胞中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的任何真核、原核、或病毒啟動(dòng)子。
因此，此實(shí)施方案的一種甚至更優(yōu)選的形式涉及包含依照本發(fā)明的DNA片段或核酸序列且其處于功能性相連的啟動(dòng)子控制之下的重組DNA分子。這可以通過例如標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(Maniatis/Sambrook(Sambrook，J.，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》Molecular Cloningalaboratory manual，1989，ISBN 0-87969-309-6))來獲得。功能性相連的啟動(dòng)子指能夠控制相連的核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可以是勞森氏菌啟動(dòng)子，例如參與編碼31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、或31.4kD蛋白之基因的體內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子，只要該啟動(dòng)子在用于表達(dá)的細(xì)胞中有功能即可。它還可以是異源啟動(dòng)子。當(dāng)宿主細(xì)胞是細(xì)菌時(shí)，可以使用的有用表達(dá)控制序列包括Trp啟動(dòng)子和操縱子(Goeddel等，Nucl.Acids Res.84057，1980)、lac啟動(dòng)子和操縱子(Chang等，Nature 275615，1978)、外在膜蛋白啟動(dòng)子(Nakamura，K.和Inouge，M.，EMBO J.1771-775，1982)、λ噬菌體啟動(dòng)子和操縱子(Remaut，E.等，Nucl.Acids Res.114677-4688，1983)、α-淀粉酶(枯草芽孢桿菌)啟動(dòng)子和操縱子，以及與所選宿主細(xì)胞相容的終止序列和其它表達(dá)增強(qiáng)和控制序列。當(dāng)宿主細(xì)胞是酵母時(shí)，有用的表達(dá)控制序列包括例如α-交配因子。對(duì)于昆蟲細(xì)胞而言，可以使用桿狀病毒的多角體蛋白或p10啟動(dòng)子(Smith，G.E.等，Mol.Cell.Biol.32156-2165，1983)。當(dāng)宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞時(shí)，例示性的有用表達(dá)控制序列包括SV40啟動(dòng)子(Berman，P.W.等，Science 222524-527，1983)或金屬硫蛋白啟動(dòng)子(Brinster，R.L.，Nature 29639-42，1982)或熱休克啟動(dòng)子(Voellmy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824949-4953，1985)。
細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是極其頻繁使用的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且通?？梢酝ㄟ^商業(yè)途徑例如Clontech Laboratories公司(費(fèi)邊路4030號(hào)，帕洛阿爾托，加利福尼亞州94303-4607，美國)獲得。在這些表達(dá)系統(tǒng)之外，基于寄生蟲的表達(dá)系統(tǒng)是非常有吸引力的表達(dá)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)描述于例如公開號(hào)為2 714 074的法國專利申請(qǐng)和美國NTIS公開號(hào)US 08/043109(Hoffman，S.和Rogers，W.，
公開日期1993年12月1日)。
本發(fā)明此實(shí)施方案的一種甚至還要更優(yōu)選的形式涉及包含編碼本發(fā)明的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其免疫原性片段的核酸序列、依照本發(fā)明的DNA片段、或依照本發(fā)明的重組DNA分子的活體重組載體(LRC)。這些載體是例如細(xì)菌和病毒。這些LRC是其中已克隆了額外遺傳信息的微生物或病毒。在本案中，所述額外遺傳信息指編碼本發(fā)明的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其免疫原性片段的核酸序列。受到這些LRC感染的動(dòng)物將產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答，不僅針對(duì)于載體的免疫原，還針對(duì)于其遺傳密碼額外地克隆到LRC中的蛋白質(zhì)(例如31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白)的免疫原性部分。作為細(xì)菌LRC的示例，可以使用本領(lǐng)域已知的沙門氏菌減毒株?；铙w重組載體寄生蟲等已被描述于Vermeulen，A.N.，Int.J.Parasitol.281121-1130，1998。同樣，可以使用LRC病毒作為將核酸序列運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞內(nèi)的途徑?；铙w重組載體病毒也稱為載體病毒。常用作載體的病毒有牛痘病毒(Panicali等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 794927，1982)、皰疹病毒(E.P.A.0473210A2)、和逆轉(zhuǎn)錄病毒(Valerio，D.等；Baum，S.J.、Dicke，K.A.、Lotzova，E.、和Pluznik，D.H.編，《今日實(shí)驗(yàn)血液學(xué)》(Experimental Haematology Today)，1988年，Springer Verlag，紐約，第92-99頁，1989年)。
可以使用本領(lǐng)域眾所周知的體內(nèi)同源重組技術(shù)將重組核酸序列導(dǎo)入所選細(xì)菌、寄生蟲、或病毒的基因組，從而能夠誘導(dǎo)所插入的本發(fā)明核酸序列在宿主動(dòng)物中表達(dá)。
最后，本發(fā)明此實(shí)施方案的另一種形式涉及包含編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸序列、包含這種核酸序列的DNA片段、或包含處于功能性相連的啟動(dòng)子控制下的所述核酸序列的重組DNA分子的宿主細(xì)胞。這種形式還涉及包含活體重組載體的宿主細(xì)胞，所述活體重組載體包含編碼依照本發(fā)明的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其片段的核酸。宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌起源的細(xì)胞，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、和乳酸桿菌物種，并聯(lián)合基于細(xì)菌的質(zhì)粒像pBR322或細(xì)菌表達(dá)載體像pGEX或是聯(lián)合噬菌體。宿主細(xì)胞還可以是真菌起源的，例如聯(lián)合酵母特異性載體分子的酵母細(xì)胞，或是聯(lián)合載體或重組桿狀病毒的高等真核細(xì)胞，像昆蟲細(xì)胞(Luckow等，Bio-technology 647-55，1988)，聯(lián)合例如基于Ti質(zhì)粒的載體或植物病毒載體的植物細(xì)胞(Barton，K.A.等，Cell 321033，1983)，同樣聯(lián)合適當(dāng)載體或重組病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，像Hela細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、或Crandell貓腎細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及依照本發(fā)明的新型蛋白質(zhì)及其免疫原性片段。
免疫原性片段的概念將在下文中定義。
此實(shí)施方案的一種形式涉及具有與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)及其免疫原性片段等。
在一種優(yōu)選的形式中，此實(shí)施方案涉及與SEQ ID NO2所示氨基酸序列具有至少92％、優(yōu)選94％、更優(yōu)選96％的序列同源性的所述胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)及其免疫原性片段。甚至更優(yōu)選98％或甚至100％的同源性水平。
蛋白質(zhì)同源性水平可以使用計(jì)算機(jī)程序“BLAST 2 SEQUENCES”、并選擇子程序“BLASTP”測(cè)定，所述程序可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/b12.html上找到。該程序的一篇參考文獻(xiàn)是Tatiana A.Tatusova、Thomas L.Madden，F(xiàn)EMSMicrobiol.Letters 174247-250，1999。所用矩陣是“blosum62”。所用參數(shù)是默認(rèn)參數(shù)開放缺口11，延伸缺口1，缺口x_dropoff 50。
此實(shí)施方案的另一種形式涉及具有與SEQ ID NO4所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)及其免疫原性片段等。
一種優(yōu)選的形式涉及與SEQ ID NO4所示氨基酸序列具有至少92％、優(yōu)選94％、更優(yōu)選96％的序列同源性的所述胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)及其免疫原性片段。甚至更優(yōu)選98％或甚至100％的同源性水平。
此實(shí)施方案的另一種形式涉及具有與SEQ ID NO6所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)及其免疫原性片段，等等。
一種優(yōu)選的形式涉及與SEQ ID NO6所示氨基酸序列具有至少92％、優(yōu)選94％、更優(yōu)選96％的序列同源性的所述胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)及其免疫原性片段。甚至更優(yōu)選98％或甚至100％的同源性水平。
此實(shí)施方案的另一種形式涉及具有與SEQ ID NO8所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)及其免疫原性片段，等等。
一種優(yōu)選的形式涉及與SEQ ID NO8所示氨基酸序列具有至少92％、優(yōu)選94％、更優(yōu)選96％的序列同源性的所述胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)及其免疫原性片段。甚至更優(yōu)選98％或甚至100％的同源性水平。
此實(shí)施方案的另一種形式涉及具有與SEQ ID NO10所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)及其免疫原性片段，等等。
一種優(yōu)選的形式涉及與SEQ ID NO10所示氨基酸序列具有至少92％、優(yōu)選94％、更優(yōu)選96％的序列同源性的所述胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)及其免疫原性片段。甚至更優(yōu)選98％或甚至100％的同源性水平。
此實(shí)施方案的另一種形式涉及具有與SEQ ID NO12所示氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列的胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)及其免疫原性片段，等等。
一種優(yōu)選的形式涉及與SEQ ID NO12所示氨基酸序列具有至少92％、優(yōu)選94％、更優(yōu)選96％的序列同源性的所述胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)及其免疫原性片段。甚至更優(yōu)選98％或甚至100％的同源性水平。
可以理解，對(duì)于本文所涵蓋的具體蛋白質(zhì)而言，單個(gè)胞內(nèi)勞森氏菌菌株之間可以存在天然變異。這些變異可以表現(xiàn)為整個(gè)序列中的氨基酸差異，或是所述序列中氨基酸的缺失、替代、插入、倒置、或添加?；旧喜桓淖兩飳W(xué)和免疫學(xué)活性的氨基酸替代描述于例如Neurath等，《蛋白質(zhì)》(The Proteins)，Academic出版社，紐約，1979。相關(guān)氨基酸之間的氨基酸取代或進(jìn)化中頻繁發(fā)生的取代特別地有Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val(參閱Dayhof，M.D.，蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)集(Atlas of proteins sequence and structure)，Nat.Biomed.Res.Found.，華盛頓特區(qū)，1978，第5卷，增刊3)。其它氨基酸替代包括Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Leu/Ile、Leu/Val、和Ala/Glu。根據(jù)這一信息，Lipman和Pearson開發(fā)了用于快速且靈敏的比較蛋白質(zhì)(Science 2271435-1441，1985)并測(cè)定同源蛋白質(zhì)之間功能相似性的方法。本發(fā)明例示性實(shí)施方案的這種氨基酸替代以及具有缺失和/或插入的變化屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要由此得到的蛋白質(zhì)保持了它們的免疫反應(yīng)性即可。這解釋了為何由不同野外隔離種群分離得到的本發(fā)明胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)可能具有約90％的同源性水平、但仍然代表具有相同免疫學(xué)特征的相同蛋白質(zhì)。如果依照本發(fā)明的某種蛋白質(zhì)中存在氨基酸序列的變異，但是提供的蛋白質(zhì)仍然能夠誘發(fā)針對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌感染或至少針對(duì)該感染的臨床表現(xiàn)的免疫應(yīng)答，那么認(rèn)為那些變異“基本上不影響免疫原性”。
在將蛋白質(zhì)用于例如接種目的或用于制備抗體時(shí)，并不需要使用完整的蛋白質(zhì)。使用能夠就這樣或在偶聯(lián)載體(諸如例如KLH)后誘發(fā)針對(duì)所述蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的所述蛋白質(zhì)之片段，即所謂的免疫原性片段，也是可能的。“免疫原性片段”理解為仍然保留其在宿主中誘發(fā)免疫應(yīng)答的能力、即包含B或T細(xì)胞表位的全長蛋白質(zhì)之片段。目前，有多種技術(shù)可用于容易的鑒定編碼抗原性片段(決定簇)的DNA片段。由Geysen等(專利申請(qǐng)WO 84/03564；專利申請(qǐng)WO 86/06487；美國專利NR.4,833,092；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002，1984；J.Imm.Meth.102259-274，1987)描述的方法(即所謂的PEPSCAN法)易于執(zhí)行，是快速檢測(cè)表位(即蛋白質(zhì)中的免疫學(xué)重要區(qū)域)的完善方法。該方法在世界范圍得到使用，而且在本領(lǐng)域技術(shù)人員中同樣是眾所周知的。這種(經(jīng)驗(yàn))方法尤其適合于檢測(cè)B細(xì)胞表位。同樣，在給出編碼任何蛋白質(zhì)的基因序列后，計(jì)算機(jī)算法能夠根據(jù)其與目前已知的表位在序列和/或結(jié)構(gòu)上的一致性指出特定蛋白質(zhì)片段是免疫學(xué)上重要的表位。這些區(qū)域的確定基于的是依照Hopp和Woods(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7838248-3828，1981)的親水性標(biāo)準(zhǔn)和依照Chou和Fasman(Advances in Enzymology 4745-148，1987；美國專利4,554,101)的二級(jí)結(jié)構(gòu)方面的綜合。同樣可以使用計(jì)算機(jī)借助Berzofsky氏兩親性標(biāo)準(zhǔn)(Science 2351059-1062，1987；美國專利申請(qǐng)NTIS US 07/005,885)由序列預(yù)測(cè)T細(xì)胞表位。其簡明綜述參見關(guān)于一般原理，Shan和Lu，Tibtech 9238-242，1991；關(guān)于Malaria表位，Good等，Science 2351059-1062，1987；關(guān)于回顧，Lu，Vaccine 103-7，1992；關(guān)于HIV表位，Berzowsky，The FASEB Journal 52412-2418，1991。
因此，本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案的一種形式涉及能夠保護(hù)豬免于胞內(nèi)勞森氏菌感染的疫苗，它包含一種或多種上文所述依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段以及制藥學(xué)可接受載體。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于疫苗的本發(fā)明蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)用于制造抗擊胞內(nèi)勞森氏菌感染的疫苗的用途。
生產(chǎn)依照本發(fā)明的疫苗的一種方法是由取自受感染腸壁的粘膜拭樣獲得細(xì)菌，并通過生物化學(xué)方法由細(xì)菌純化依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段。然而，這種生產(chǎn)疫苗的方法非常費(fèi)時(shí)。
因此，在疫苗中使用編碼依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段的基因的表達(dá)產(chǎn)物要方便得多。本發(fā)明列出了編碼31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白的基因的核酸序列。
通過混合一種或多種依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)或依照本發(fā)明的其免疫原性片段以及下文所述制藥學(xué)可接受載體，可以容易的生產(chǎn)基于這些基因表達(dá)產(chǎn)物的疫苗。
或者，依照本發(fā)明的疫苗可以包含上文所述能夠表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)或其依照本發(fā)明的免疫原性片段的活體重組載體。例如基于感染腸上皮或例如呼吸道上皮的沙門氏菌載體或病毒載體的這種疫苗具有優(yōu)于亞單位疫苗的優(yōu)勢(shì)，即它們更好的模擬了胞內(nèi)勞森氏菌感染的天然途徑。此外，它們的自主繁殖也是優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槊庖咧恍枰倭康闹亟M載體。
上文所述疫苗都促成主動(dòng)接種，即宿主的免疫系統(tǒng)受到一種或多種依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段的觸發(fā)而生成針對(duì)這些蛋白質(zhì)的抗體?；蛘?，可以在例如兔中制備這些抗體，或者可以如下所述由生成抗體的細(xì)胞系獲得這些抗體。然后，可以對(duì)宿主動(dòng)物施用這些抗體。這種接種方法即被動(dòng)接種是動(dòng)物已受到感染且沒有時(shí)間來觸發(fā)天然免疫應(yīng)答時(shí)的接種選擇。它也是給無免疫應(yīng)答動(dòng)物接種的優(yōu)選方法。在這些情況中，所施用的針對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌的抗體直接結(jié)合細(xì)菌。這具有立即降低或終止胞內(nèi)勞森氏菌生長的優(yōu)勢(shì)。因此，本發(fā)明此實(shí)施方案的一種形式涉及包含針對(duì)依照本發(fā)明的六種胞內(nèi)勞森氏菌蛋白中任一種的抗體的疫苗。
疫苗還可以基于如上所述的宿主細(xì)胞，其中包含依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段。
接種的一種有效的變通方法是直接接種編碼相關(guān)抗原的DNA。直接接種編碼蛋白質(zhì)的DNA已經(jīng)在許多不同蛋白質(zhì)中獲得成功(有關(guān)綜述參見例如Donnelly等，The Immunologist 220-26，1993)。這種接種方法對(duì)于對(duì)豬進(jìn)行針對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌感染的接種而言非常誘人。因此，本發(fā)明此實(shí)施方案的另外一些形式涉及包含編碼依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其依照本發(fā)明的免疫原性片段的核酸序列的疫苗，以及包含含有所述核酸序列的DNA片段的疫苗。此實(shí)施方案的另外一些形式涉及包含依照本發(fā)明的重組DNA分子的疫苗。例如可以使用無針頭注射器通過皮內(nèi)施用而容易的施用DNA疫苗。這種施用方法將DNA直接投遞至待接種動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)。1-100微克范圍的DNA量就能提供很好的效果。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的疫苗額外包含一種或多種衍生自其它豬致病性生物體和病毒的抗原或編碼這些抗原的遺傳信息。這些生物體和病毒優(yōu)選選自下組假狂犬病病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒、可傳染的胃腸炎病毒、輪狀病毒、埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella cholerasuis)、副豬嗜血菌(Haemophilus parasuis)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、豬肺炎枝原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、和大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。
依照本發(fā)明的所有疫苗都包含制藥學(xué)可接受載體。制藥學(xué)可接受載體可以是例如無菌水或無菌生理鹽溶液。在一種更復(fù)雜的形式中，載體可以是例如緩沖液。
用于制備疫苗的方法包括將依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段與制藥學(xué)可接受載體混合。
依照本發(fā)明的疫苗在優(yōu)選的形式中還包含佐劑。佐劑通常包含以非特異方式增強(qiáng)宿主免疫應(yīng)答的物質(zhì)。本領(lǐng)域知道許多不同的佐劑。佐劑的實(shí)例有弗氏完全和不完全佐劑、維生素E、非離子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、Quill A、礦物油例如Bayol或Markol、植物油、Cambopol(一種均聚物)、或DiluvacForte。疫苗中還可以包含所謂的“載體”。載體指多肽與之附著而非共價(jià)結(jié)合的化合物。常用的載體化合物有例如氫氧化鋁、磷酸鋁或氧化鋁、硅石、高嶺土、和斑脫土。這種載體的一種具體形式是所謂的ISCOM(EP 109.942；EP180.564；EP 242.380)中，其中抗原部分包埋在載體中。另外，疫苗可以包含一種或多種合適的表面活性化合物或乳化劑，例如Span或Tween。通常，將疫苗與穩(wěn)定劑混合，例如用于保護(hù)傾向于降解的多肽免于降解、延長疫苗的保存期、或提高凍干效率。有用的穩(wěn)定劑有SPGA(Bovarnik等，J.Bacteriology 59509，1950)；碳水化合物，例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、右旋糖苷、或葡萄糖；蛋白質(zhì)，諸如清蛋白或酪蛋白或其降解產(chǎn)物；和緩沖劑，諸如堿金屬磷酸鹽，等等。另外，可以將疫苗懸浮于生理學(xué)可接受的稀釋劑中。
無需多言，本發(fā)明還包含輔助、添加載體化合物或稀釋劑、乳化或穩(wěn)定多肽的其它方法。
依照本發(fā)明的疫苗可以在1-100微克的數(shù)量范圍內(nèi)非常合適的施用，盡管原則上可以使用更少的劑量。超過100微克的劑量盡管在免疫學(xué)上很合適，但出于商業(yè)原因而不太誘人。
可以以低得多的劑量施用基于活體減毒重組載體(諸如上文所述LRC病毒和細(xì)菌)的疫苗，因?yàn)樗鼈冊(cè)诟腥具^程中自我繁殖。因此，非常合適的用量范圍將是103-109CFU(細(xì)菌)或PFU(病毒)。
可以執(zhí)行許多施用方法?？诜欠浅ＵT人的施用方法，因?yàn)樵摳腥臼窍栏腥??？诜┯玫囊环N優(yōu)選方法是將疫苗包裝到本領(lǐng)域知道且頻繁使用的只在經(jīng)過高度酸性的胃環(huán)境后崩解的膠囊中。同樣，可以將疫苗與本領(lǐng)域知道的可暫時(shí)提高胃pH的化合物混合。全身施用也是合適的，例如通過疫苗的肌肉內(nèi)施用。如果這種路徑是允許的，那么本領(lǐng)域知道的用于全身施用的標(biāo)準(zhǔn)流程是非常合適的。
從針對(duì)疾病的保護(hù)作用這個(gè)角度看，快速且正確診斷胞內(nèi)勞森氏菌感染是重要的。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供適于檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌感染的診斷工具。
用于檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌的診斷性測(cè)試基于例如由待測(cè)動(dòng)物分離的細(xì)菌DNA與特異探針或PCR引物的反應(yīng)，所述探針或引物基于的是編碼31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白的基因的編碼序列。若動(dòng)物中存在胞內(nèi)勞森氏菌DNA，則它將例如與特異PCR引物特異性結(jié)合并隨后將在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增。然后可以在DNA凝膠電泳中容易的檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。DNA可以非常容易地由取自待測(cè)動(dòng)物的消化道的拭樣中存在的微生物中分離。標(biāo)準(zhǔn)PCR教科書中給出了給胞內(nèi)勞森氏菌DNA的選擇性PCR反應(yīng)確定引物長度的方法。常常使用具有至少12個(gè)核苷酸的核苷酸序列的引物，但是超過15個(gè)、更優(yōu)選18個(gè)核苷酸的引物在某種程度上選擇性更高一些。尤其是長度為至少20個(gè)、優(yōu)選至少30個(gè)核苷酸的引物通常非常適用。PCR技術(shù)詳盡描述于Dieffenbach和Dreksler，《PCR引物，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(PCR primers，alaboratorymanual)，ISBN 0-87969-447-5，1995。因此，編碼胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列或其長度至少為12個(gè)、優(yōu)選15個(gè)、更優(yōu)選18個(gè)、以此順序甚至更優(yōu)選20、22、25、30、35、或40個(gè)核苷酸的部分(其中所述核酸序列或其部分與SEQ ID NO1或3所示核酸序列具有至少90％的同源性)，也是本發(fā)明的一部分。這些核酸序列可以在PCR反應(yīng)中作為引物使用，以增加它們所編碼的DNA的量。這可使得快速擴(kuò)增特異核苷酸序列以作為診斷工具使用，例如用于例如如上所述在組織中檢測(cè)勞森氏菌。
另一種基于DNA的測(cè)試依據(jù)的是由拭樣獲得的細(xì)菌材料的生長，隨后是經(jīng)典的DNA純化，然后再是與放射性或顯色標(biāo)記的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白特異性DNA片段的經(jīng)典雜交。PCR反應(yīng)和雜交反應(yīng)二者在本領(lǐng)域都是眾所周知的，而且特別地描述于Maniatis/Sambrook(Sambrook，J.等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》Molecular cloninga laboratory manual，ISBN 0-87969-309-6)。
由此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及用于檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌DNA的診斷性測(cè)試。這種測(cè)試包括依照本發(fā)明的核酸序列或其對(duì)編碼31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白的DNA特異的片段。對(duì)所述DNA特異的片段被理解為由于與胞內(nèi)勞森氏菌DNA有更高同源性、因而在可比條件下與胞內(nèi)勞森氏菌DNA的結(jié)合比與其它細(xì)菌DNA的結(jié)合更好的片段，例如如上所述至少12個(gè)核苷酸的引物。
用于檢測(cè)血清中的胞內(nèi)勞森氏菌抗體的診斷性測(cè)試可以是例如簡單的標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA測(cè)試，其中將依照本發(fā)明的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其抗原性片段包被在ELISA板的孔壁上。用于檢測(cè)這些抗體的一種方法是例如將31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其抗原性片段與來自待測(cè)試哺乳動(dòng)物的血清一起保溫，隨后例如與針對(duì)相關(guān)哺乳動(dòng)物抗體的已標(biāo)記抗體一起保溫。然后顯色反應(yīng)可以揭示針對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌的抗體的存在與否。診斷性測(cè)試系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)例是例如將包含依照本發(fā)明的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其抗原性片段的Western印跡與待測(cè)試哺乳動(dòng)物的血清一起保溫，隨后分析印跡。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于檢測(cè)針對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌的抗體的診斷性測(cè)試。這種測(cè)試包括依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其片段。
同樣，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)血清中針對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌的抗體的方法，其中所述方法包括將血清與依照本發(fā)明的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其抗原性片段一起保溫。
基于檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌抗原的特異31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白的抗原性物質(zhì)、因而適于檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌感染的診斷性測(cè)試還可以是例如標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)試。在這種測(cè)試的一個(gè)實(shí)例中，用針對(duì)31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白的抗體包被ELISA平板的孔壁。與待測(cè)材料一起保溫后，向孔中加入已標(biāo)記的抗胞內(nèi)勞森氏菌抗體。然后顯色反應(yīng)揭示存在來自胞內(nèi)勞森氏菌的抗原性物質(zhì)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌抗原性物質(zhì)的診斷性測(cè)試。這種測(cè)試包括針對(duì)依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其片段的抗體。
如上所述表達(dá)的依照本發(fā)明的多肽或其免疫原性片段可以用于生成抗體，可以是多克隆的、單特異性的、或單克隆的抗體(或其衍生物)。如果想要多克隆抗體，那么用于生成和處理多克隆血清的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的(例如Mayer和Walter編，《細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法》(Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology)，Academic出版社，倫敦，1987)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)(Kohler和Milstein，Nature 256495-497，1975)，通過免疫近交小鼠來制備針對(duì)本發(fā)明多肽(或其變體或片段)有反應(yīng)性的本發(fā)明單克隆抗體。
用于大規(guī)模生產(chǎn)本發(fā)明抗體的方法在本領(lǐng)域也是眾所周知的。這種方法依賴于在用于噬菌體展示的絲狀噬菌體中克隆編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的遺傳信息(的片段)。這種技術(shù)特別地描述于http//aximtl.imt.uni-marburg.de/～rek/aepphage.html中“filamentous phage display”(絲狀噬菌體展示)下的“AntibodyEngineering Page”(抗體工程網(wǎng)頁)，以及下述綜述性論文中Cortese，R.等，Trends Biotechn.12262-267，1994；Clackson，T.和Wells，J.A.，Trends Biotechn.12173-183，1994；Marks，J.D.等，J.Biol.Chem.26716007-16010，1992；Winter，G.等，Annu.Rev.Immunol.12433-455，1994；和Little，M.等，Biotechn.Adv.12539-555，1994。隨后將噬菌體用于篩選表達(dá)駱駝化(camelid)重鏈抗體的駱駝化表達(dá)文庫(Muyldermans，S.和Lauwereys，M.，J.Mol.Recogn.12131-140，1999；和Ghahroudi，M.A.等，F(xiàn)EBS Letters414512-526，1997)。可以擴(kuò)增文庫中表達(dá)期望抗體的細(xì)胞，隨后用于大規(guī)模表達(dá)抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌抗原性物質(zhì)的方法，其中所述方法包括將血清、組織、或體液與針對(duì)本發(fā)明的31.0kD、24.8kD、76.7kD、56.8kD、28.8kD、和31.4kD蛋白或其抗原性片段的抗體一起保溫。
最后，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及編碼胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列或其長度為至少20個(gè)、以此順序優(yōu)選25、30、35、或40個(gè)核苷酸的部分，其中所述核酸序列或其部分與SEQ ID NO1、3、5、7、9、或11所示核酸序列具有至少90％的同源性。這些核酸序列可以在PCR反應(yīng)中作為引物使用，以增加它們所編碼的DNA的量。這可使得快速擴(kuò)增特異核苷酸序列以作為診斷工具使用，用于例如如上所述檢測(cè)組織中的勞森氏菌。
實(shí)施例
實(shí)施例1由受感染的豬的回腸分離胞內(nèi)勞森氏菌
由死于PE的豬采集通過組織病理學(xué)和抗酸Ziehl-Neelsen染色確認(rèn)受胞內(nèi)勞森氏菌感染的回腸，并保存于-80℃。解凍后，由取自受感染腸壁的粘膜拭樣分離胞內(nèi)勞森氏菌。如Lawson等，Vet.Microbiol.10303-323，1985所述，將回腸拭樣在通用勻漿器中在PBS中反復(fù)勻漿，以釋放細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。將低速離心除去細(xì)胞碎片后得到的上清液通過5.0、3.0、1.2、和0.8μm濾器(Millipore)過濾。隨后將濾出液以8000g離心30分鐘，得到胞內(nèi)勞森氏菌的少量沉淀。使用Percoll梯度進(jìn)一步純化這些細(xì)菌。通過PCR評(píng)估已純化的細(xì)菌的身份(Jones等，J.Clin.Microbiol.312611-2615，1993)，通過相差顯微術(shù)評(píng)估分離的細(xì)菌的純度(＞95％)，以顯示存在的任何污染性細(xì)菌或腸碎片。
細(xì)菌菌株和質(zhì)粒
攜帶載體pLysSrare和質(zhì)粒pET22b的大腸桿菌宿主菌株BL21star(DE3)購自Novagen(麥迪遜，威斯康星州，美國)。pET-HIS1(1)如Schaller等，Microbiology 1452105-2116，1999所述構(gòu)建。大腸桿菌菌株TOP10F′購自Invitrogen(格羅寧根，荷蘭)。含30％甘油的所有細(xì)菌菌株原種保存于-70℃。
如上所述由受感染的回腸材料分離胞內(nèi)勞森氏菌細(xì)胞。
培養(yǎng)基、緩沖液和抗體
依照標(biāo)準(zhǔn)流程制備LB培養(yǎng)基。依照標(biāo)準(zhǔn)流程制備LB平板，即在微波爐中熔化LB培養(yǎng)基+1.5％瓊脂，待溶液冷卻至45℃后倒入平板，根據(jù)需要添加氨芐青霉素(ACS-Dophar，Raamsdonksveer，荷蘭)。異丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG)購自Biosynth Ag(Staad，瑞士)。
PCR擴(kuò)增
使用Geneamp 9700PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，加利福尼亞州，美國)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用Expand高保真PCR系統(tǒng)(RocheDiagnostics GmbH，曼海姆，德國)進(jìn)行PCR。PCR混合液中含有52U/mlExpand高保真酶混合液、含2.5mM MgCl2的Expand HF緩沖液、16mM dNTP(Promega，威斯康星州，美國)、20pmol引物、和15ng胞內(nèi)勞森氏菌染色體DNA作為模板。用于擴(kuò)增DNA的所有引物列于表1。
DNA分離
為了獲得高度純化的勞森氏菌染色體DNA，使用Biorad染色體DNA分離試劑盒(Biorad，Veenendaal，荷蘭)依照制造商的說明書制備DNA。
DNA測(cè)序
在ABI 310自動(dòng)化測(cè)序儀(Perkin Elmer，加利福尼亞州，美國)上對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序混合液含有100ng PCR產(chǎn)物、2μl終止物預(yù)制反應(yīng)混合液(Perkin Elmer，加利福尼亞州，美國)、2.4pmol引物、6μl緩沖液(200mM Tris-HCl pH8.5；5mM MgCl2)和水至20μl。將此混合液在Geneamp 9700上進(jìn)行循環(huán)。程序是96℃10秒鐘、50℃5秒鐘、60℃2分鐘，25個(gè)循環(huán)。使用Dye-Ex柱(Qiagen，加利福尼亞州，美國)依照制造商的說明書純化測(cè)序循環(huán)產(chǎn)物，并在ABI 310自動(dòng)化測(cè)序儀上運(yùn)行。使用1.0.4版ABI 310 Collection Software采集軟件(Perkin Elmer，加利福尼亞州，美國)采集測(cè)序結(jié)果，并使用3.1版Sequence Analysis序列分析軟件(Perkin Elmer，加利福尼亞州，美國)進(jìn)行分析。使用1.0.1版Sequence Navigator(序列導(dǎo)航軟件)(Perkin Elmer，加利福尼亞州，美國)進(jìn)行比對(duì)。使用4.1.4版Sequencer(序列分析軟件)(GeneCodes，安阿伯，加利福尼亞州，美國)進(jìn)行序列分析。
連接和轉(zhuǎn)化
在含1單位連接酶(Gibco BRL Life Technologies，美國)的1x連接緩沖液中于16℃進(jìn)行連接過夜。通過熱休克用1μl連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。通過Maniatis/Sambrook的方法，使用緩沖液TFB1(30mM KOAc、100mM RbCl、10mM CaCl2、50mM MnCl2、15％甘油)和TFB2(10mM RbCl、75mM CaCl2、10mM MES、15％甘油)使BL21star(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和TOP10F′大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞處于感受態(tài)。在補(bǔ)充10mM MgSO4和20mM葡萄糖的SOC培養(yǎng)基中于37℃恢復(fù)1小時(shí)后，將細(xì)胞涂布在含合適抗生素的LB平板上。
10xHIS融合蛋白的表達(dá)
將攜帶pLysSrare和表達(dá)載體的大腸桿菌菌株BL21star(DE3)在5ml含氨芐青霉素的LB中于37℃以200rpm培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物在50ml含氨芐青霉素的LB中1∶100稀釋。將培養(yǎng)液在相同條件下培養(yǎng)，直至在NovaspecII分光光度計(jì)(Pharmacia，Woerden，荷蘭)上測(cè)量OD600達(dá)到0.5。此時(shí)(t＝0)用終濃度1mM的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物，并繼續(xù)培養(yǎng)3個(gè)小時(shí)(t＝3)。取100μl樣品用于分析。在相同條件下培養(yǎng)和誘導(dǎo)攜帶pLysSrare的大腸桿菌菌株BL21star(DE3)，并采集樣品作為陰性對(duì)照。如下所述，通過SDS-PAGE及后續(xù)考馬斯亮藍(lán)染色分析樣品。將剩余培養(yǎng)物以5000rpm離心，并將沉淀保存于-20℃直至下一步使用。
聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡
使用來自NuPAGE電泳系統(tǒng)(Novex，圣迭戈，美國)的4-12％Bis-Tris凝膠進(jìn)行SDS-PAGE。分離前，將樣品與含β-巰基乙醇的加樣緩沖液(樣品∶緩沖液＝2∶1)一起煮沸5分鐘。將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，或通過標(biāo)準(zhǔn)半干Western印跡流程轉(zhuǎn)印到Immobulon-P膜(Millipore，貝德福德，美國)上。雞抗勞森氏菌多克隆血清是針對(duì)n-GNE(水∶油＝45∶55)中的全細(xì)胞制劑制備的。血清E2-839是由顯示典型的胞內(nèi)勞森氏菌感染臨床癥候和死后損傷的豬獲得的。將血清用等體積的攜帶載體pLysSrare的BL21star(DE3)粗制細(xì)胞提取物于4℃預(yù)吸收4小時(shí)。
表1用于擴(kuò)增和克隆胞內(nèi)勞森氏菌基因的引物
表2包含克隆的胞內(nèi)勞森氏菌基因的質(zhì)粒一覽表
結(jié)果
在基于T7的表達(dá)載體中克隆勞森氏菌基因
使用表1所列引物，通過PCR擴(kuò)增勞森氏菌基因。用限制酶NcoI和BamHI消化得到的PCR產(chǎn)物。隨后將消化后的PCR產(chǎn)物連接到事先用表2所列相同的兩種酶切割的pET22b或pET-HIS1中。用連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F，并于37℃保溫過夜。通過菌落PCR對(duì)假定的轉(zhuǎn)化子檢查正確的質(zhì)粒。由此得到6個(gè)不同的表達(dá)質(zhì)粒。通過核苷酸序列分析檢查這些質(zhì)粒，而且序列與基于克隆策略的預(yù)期一致。
在大腸桿菌中由T7啟動(dòng)子表達(dá)勞森氏菌基因
對(duì)表2所列的所有質(zhì)粒測(cè)試重組蛋白生成。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21star(DE3)pLysSrare，并進(jìn)行誘導(dǎo)。通過SDS-PAGE凝膠電泳和CBB染色分析誘導(dǎo)培養(yǎng)物(圖1)。所有六種基因在大腸桿菌BL21star(DE3)pLysSrare中都進(jìn)行充分表達(dá)。表達(dá)水平達(dá)到150μg/ml。
通過Western印跡分析表達(dá)產(chǎn)物
使用經(jīng)勞森氏菌全細(xì)胞接種的雞的血清和來自顯示典型的胞內(nèi)勞森氏菌臨床癥候和死后損傷的豬的血清，通過Western印跡分析表達(dá)產(chǎn)物(圖2)。用雞和豬血清確實(shí)鑒定出了重組勞森氏菌蛋白。



圖1胞內(nèi)勞森氏菌基因在大腸桿菌BL21STAR/pLys SRARE中過度表達(dá)的NuPAGE分析
第1道，分子量標(biāo)志；第2道，pET76.7T＝0；第3道，pET76.7T＝3；第4道，pET56.8T＝0；第5道，pET56.8T＝3；第6道，pET24.8T＝0；第7道，pET24.8T＝3；第8道，pET28.8T＝0；第9道，pET28.8T＝3；第10道，pET31.0T＝0；第11道，pET31.0T＝3；第12道，pET31.4T＝0；第13道，pET31.4T＝3；第14道，T＝3，無表達(dá)載體。
箭頭指示表達(dá)產(chǎn)物的位置。
圖2胞內(nèi)勞森氏菌基因在大腸桿菌BL21STAR/pLysSRARE中的表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡分析
第1道，pET31.4；第2道，pET28.8；第3道，pET31.0；第4道，pET24.8；第5道，pET76.7；第6道，pET56.8；第7道，無表達(dá)載體。
箭頭指示表達(dá)產(chǎn)物的位置。
序列表
<110>AKZO Nobel N.V.
<120>胞內(nèi)勞森氏菌亞單位疫苗
<130>2003.xxx
<160>12
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1004
<212>DNA
<213>胞內(nèi)勞森氏菌(Lawsonia intracellularis)
<220>
<221>CDS
<222>(55)..(939)
<400>1
tggtatatcc attgcatgat ttatggtaac caaccatttc aggaggtttg ccat atg 57
Met
1
tct ttg gtc att aac aac aac atg atg gct gca aat gca gcc cgt aac105
Ser Leu Val Ile Asn Asn Asn Met Met Ala Ala Asn Ala Ala Arg Asn
5 10 15
ctc aat gaa agt tat tca cga ctt agc caa tca aca aga cgt cta tct153
Leu Asn Glu Ser Tyr Ser Arg Leu Ser Gln Ser Thr Arg Arg Leu Ser
20 25 30
tct gga ctt cgt gtt ggg aca gca gct gat gat tca gca ggg ctt gct201
Ser Gly Leu Arg Val Gly Thr Ala Ala Asp Asp Ser Ala Gly Leu Ala
35 40 45
att aga gaa ctt atg cga gcc gat att aaa aca ttt caa caa ggt gca249
Ile Arg Glu Leu Met Arg Ala Asp Ile Lys Thr Phe Gln Gln Gly Ala
50 55 60 65
aga aat gca aat gat gct att tca tta gta caa gtt gca gat ggg gca297
Arg Asn Ala Asn Asp Ala Ile Ser Leu Val Gln Val Ala Asp Gly Ala
70 75 80
cta ggt gtt ata gat gaa aag ctt atc cga atg aaa gag ctt gct gaa345
Leu Gly Val Ile Asp Glu Lys Leu Ile Arg Met Lys Glu Leu Ala Glu
85 90 95
caa gct gct aca ggt act tat aat tca aca caa cgc ttg att att gaa393
Gln Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Ser Thr Gln Arg Leu Ile Ile Glu
100 105 110
tct gaa tat caa gca atg gct tca gaa att aca cgt att tct gtt gca441
Ser Glu Tyr Gln Ala Met Ala Ser Glu Ile Thr Arg Ile Ser Val Ala
115 120 125
aca gaa ttt aat ggt ata aaa tta tta gat ggt tct cta tct gga cct489
Thr Glu Phe Asn Gly Ile Lys Leu Leu Asp Gly Ser Leu Ser Gly Pro
130 135 140 145
cat aaa gga act aat cta caa caa aca gga gct cta aga gta cat ttt537
His Lys Gly Thr Asn Leu Gln Gln Thr Gly Ala Leu Arg Val His Phe
150 155 160
ggt cca ggg aat agt tca gca gaa gac tat tat gaa att agc ata cat585
Gly Pro Gly Asn Ser Ser Ala Glu Asp Tyr Tyr Glu Ile Ser Ile His
165 170 175
tcc gct aca gct tct gca cta ggc ctt gga aat gga act act ggt cct633
Ser Ala Thr Ala Ser Ala Leu Gly Leu Gly Asn Gly Thr Thr Gly Pro
180 185 190
ggt gct aca atc tct act caa gct gca gca caa gca gcg tta gac gcc681
Gly Ala Thr Ile Ser Thr Gln Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Asp Ala
195 200 205
atc aat gat gct atc gtt tct aaa gat aat att cgt gct agc ctt ggt729
Ile Asn Asp Ala Ile Val Ser Lys Asp Asn Ile Arg Ala Ser Leu Gly
210 215 220 225
acg cta caa aat agg tta gaa gca aca att aca aac tta aat acc caa777
Thr Leu Gln Asn Arg Leu Glu Ala Thr Ile Thr Asn Leu Asn Thr Gln
230 235 240
gct gaa aac ctc cag gct gca gaa tca cga att tct gat ata gac gtt825
Ala Glu Asn Leu Gln Ala Ala Glu Ser Arg Ile Ser Asp Ile Asp Val
245 250 255
tca aca gaa atg act gaa ttt gta aga aat caa att tta aca caa tct873
Ser Thr Glu Met Thr Glu Phe Val Arg Asn Gln Ile Leu Thr Gln Ser
260 265 270
gga gta gca atg ctt tca cag gca aac tca ctg cca aag atg gca agc921
Gly Val Ala Met Leu Ser Gln Ala Asn Ser Leu Pro Lys Met Ala Ser
275 280 285
caa ctc att agt ggc taa tccatcacta cataatatgg ttaaggcaga 969
Gln Leu Ile Ser Gly
290
ccaaagacac atggcttgga ggaaagaagt tgttg1004
<210>2
<211>294
<212>PRT
<213>胞內(nèi)勞森氏菌
<400>2
Met Ser Leu Val Ile Asn Asn Asn Met Met Ala Ala Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Asn Leu Asn Glu Ser Tyr Ser Arg Leu Ser Gln Ser Thr Arg Arg Leu
20 25 30
Ser Ser Gly Leu Arg Val Gly Thr Ala Ala Asp Asp Ser Ala Gly Leu
35 40 45
Ala Ile Arg Glu Leu Met Arg Ala Asp Ile Lys Thr Phe Gln Gln Gly
50 55 60
Ala Arg Asn Ala Asn Asp Ala Ile Ser Leu Val Gln Val Ala Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Gly Val Ile Asp Glu Lys Leu Ile Arg Met Lys Glu Leu Ala
85 90 95
Glu Gln Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Ser Thr Gln Arg Leu Ile Ile
100 105 110
Glu Ser Glu Tyr Gln Ala Met Ala Ser Glu Ile Thr Arg Ile Ser Val
115 120 125
Ala Thr Glu Phe Asn Gly Ile Lys Leu Leu Asp Gly Ser Leu Ser Gly
130 135 140
Pro His Lys Gly Thr Asn Leu Gln Gln Thr Gly Ala Leu Arg Val His
145 150 155 160
Phe Gly Pro Gly Asn Ser Ser Ala Glu Asp Tyr Tyr Glu Ile Ser Ile
165 170 175
His Ser Ala Thr Ala Ser Ala Leu Gly Leu Gly Asn Gly Thr Thr Gly
180 185 190
Pro Gly Ala Thr Ile Ser Thr Gln Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Asp
195 200 205
Ala Ile Asn Asp Ala Ile Val Ser Lys Asp Asn Ile Arg Ala Ser Leu
210 215 220
Gly Thr Leu Gln Asn Arg Leu Glu Ala Thr Ile Thr Asn Leu Asn Thr
225 230 235 240
Gln Ala Glu Asn Leu Gln Ala Ala Glu Ser Arg Ile Ser Asp Ile Asp
245 250 255
Val Ser Thr Glu Met Thr Glu Phe Val Arg Asn Gln Ile Leu Thr Gln
260 265 270
Ser Gly Val Ala Met Leu Ser Gln Ala Asn Ser Leu Pro Lys Met Ala
275 280 285
Ser Gln Leu Ile Ser Gly
290
<210>3
<211>764
<212>DNA
<213>胞內(nèi)勞森氏菌
<220>
<221>CDS
<222>(25)..(717)
<400>3
acgctaacgt attggaaacc catt atg aaa aaa tta ctc ttt act tca ggc 51
Met Lys Lys Leu Leu Phe Thr Ser Gly
1 5
tgt att ctt att tta aca ggt tgt tct gct cca aac aaa act cct gtt 99
Cys Ile Leu Ile Leu Thr Gly Cys Ser Ala Pro Asn Lys Thr Pro Val
10 15 20 25
gtt gct cct cct ata aca cct cct cca gca tat gta gaa cct gaa gac147
Val Ala Pro Pro Ile Thr Pro Pro Pro Ala Tyr Val Glu Pro Glu Asp
30 35 40
tcc tat agt aat cct ggc tct ctt tac tca tct gct gaa tct gat ggt195
Ser Tyr Ser Asn Pro Gly Ser Leu Tyr Ser Ser Ala Glu Ser Asp Gly
45 50 55
ctt ttt gct gat act cgt gct cga cgt gta ggt gat att gtt atg gta243
Leu Phe Ala Asp Thr Arg Ala Arg Arg Val Gly Asp Ile Val Met Val
60 65 70
aaa att gta gaa aat aat act gct aaa aat aaa gca gat aca aca gct291
Lys Ile Val Glu Asn Asn Thr Ala Lys Asn Lys Ala Asp Thr Thr Ala
75 80 85
gat aaa aaa act gca aat aca tac gga att gat gcg ttt ttt ggt aga339
Asp Lys Lys Thr Ala Asn Thr Tyr Gly Ile Asp Ala Phe Phe Gly Arg
90 95 100 105
caa tat att ggt gga gga tca aca aaa att cct gta ggt agt gtt gct387
Gln Tyr Ile Gly Gly Gly Ser Thr Lys Ile Pro Val Gly Ser Val Ala
110 115 120
ttt gat aca acc tct gaa agt gga acc act agt aca gga gaa aca aaa435
Phe Asp Thr Thr Ser Glu Ser Gly Thr Thr Ser Thr Gly Glu Thr Lys
125 130 135
cgt gaa gga gct ata aat gga aca att gct gct cgt gta tta cga gtt483
Arg Glu Gly Ala Ile Asn Gly Thr Ile Ala Ala Arg Val Leu Arg Val
140 145 150
atg cca ggt gga tta tta gaa ata gaa ggc gtc cgt gaa aca cgt gta531
Met Pro Gly Gly Leu Leu Glu Ile Glu Gly Val Arg Glu Thr Arg Val
155 160 165
aat aat gaa aca cag tat att gtt atc aca gga ctt ata cga cca atg579
Asn Asn Glu Thr Gln Tyr Ile Val Ile Thr Gly Leu Ile Arg Pro Met
170 175 180 185
gat ata gag cca gac aac tcc att atg tca aat aga atc tct gat gca627
Asp Ile Glu Pro Asp Asn Ser Ile Met Ser Asn Arg Ile Ser Asp Ala
190 195 200
aaa att gct tat tat ggt caa ggt gtt ctt tcc gag aaa caa aaa cct675
Lys Ile Ala Tyr Tyr Gly Gln Gly Val Leu Ser Glu Lys Gln Lys Pro
205 210 215
ggt tgg ttt aca cgc ttt atg gat acc ctc tgg cct ttc tag717
Gly Trp Phe Thr Arg Phe Met Asp Thr Leu Trp Pro Phe
220 225 230
tagtctaata tactaagtat aactcaatat ctataaggta aacgtat764
<210>4
<211>230
<212>PRT
<213>胞內(nèi)勞森氏菌
<400>4
Met Lys Lys Leu Leu Phe Thr Ser Gly Cys Ile Leu Ile Leu Thr Gly
1 5 10 15
Cys Ser Ala Pro Asn Lys Thr Pro Val Val Ala Pro Pro Ile Thr Pro
20 25 30
Pro Pro Ala Tyr Val Glu Pro Glu Asp Ser Tyr Ser Asn Pro Gly Ser
35 40 45
Leu Tyr Ser Ser Ala Glu Ser Asp Gly Leu Phe Ala Asp Thr Arg Ala
50 55 60
Arg Arg Val Gly Asp Ile Val Met Val Lys Ile Val Glu Asn Asn Thr
65 70 75 80
Ala Lys Asn Lys Ala Asp Thr Thr Ala Asp Lys Lys Thr Ala Asn Thr
85 90 95
Tyr Gly Ile Asp Ala Phe Phe Gly Arg Gln Tyr Ile Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Thr Lys Ile Pro Val Gly Ser Val Ala Phe Asp Thr Thr Ser Glu Ser
115 120 125
Gly Thr Thr Ser Thr Gly Glu Thr Lys Arg Glu Gly Ala Ile Asn Gly
130 135 140
Thr Ile Ala Ala Arg Val Leu Arg Val Met Pro Gly Gly Leu Leu Glu
145 150 155 160
Ile Glu Gly Val Arg Glu Thr Arg Val Asn Asn Glu Thr Gln Tyr Ile
165 170 175
Val Ile Thr Gly Leu Ile Arg Pro Met Asp Ile Glu Pro Asp Asn Ser
180 185 190
Ile Met Ser Asn Arg Ile Ser Asp Ala Lys Ile Ala Tyr Tyr Gly Gln
195 200 205
Gly Val Leu Ser Glu Lys Gln Lys Pro Gly Trp Phe Thr Arg Phe Met
210 215 220
Asp Thr Leu Trp Pro Phe
225 230
<210>5
<211>2200
<212>DNA
<213>胞內(nèi)勞森氏菌
<220>
<221>CDS
<222>(47)..(2164)
<400>5
atcaccattc acgtcctgag ggcacccttc tttctgggag attgta atg tcg atc 55
Met Ser Ile
1
aat aca ctt ttc ggt att ggg aaa agt gca ata gct gga aac cag aca 103
Asn Thr Leu Phe Gly Ile Gly Lys Ser Ala Ile Ala Gly Asn Gln Thr
5 10 15
gct cta aac gtt act ggt aat aat ata gca aat gtt aat aca caa gga151
Ala Leu Asn Val Thr Gly Asn Asn Ile Ala Asn Val Asn Thr Gln Gly
20 25 30 35
tat tcc cgc caa agt gta cgc ttc gaa gat agg tat gga ctt aat caa199
Tyr Ser Arg Gln Ser Val Arg Phe Glu Asp Arg Tyr Gly Leu Asn Gln
40 45 50
act cca gga atg ctt ggg cag ggt gtc cat aca gct gaa ata tac cgc247
Thr Pro Gly Met Leu Gly Gln Gly Val His Thr Ala Glu Ile Tyr Arg
55 60 65
aat ttt aat aga ttt gta gaa gat gct tac ctt aat cgt ttt tcc caa295
Asn Phe Asn Arg Phe Val Glu Asp Ala Tyr Leu Asn Arg Phe Ser Gln
70 75 80
aat act cga tgg gac gaa caa agt gct att atg aac tct ata gaa agc343
Asn Thr Arg Trp Asp Glu Gln Ser Ala Ile Met Asn Ser Ile Glu Ser
85 90 95
att ttt aac gaa tca aac cgt aca gga att agt tca cta cta gga gaa391
Ile Phe Asn Glu Ser Asn Arg Thr Gly Ile Ser Ser Leu Leu Gly Glu
100 105 110 115
ttt ttt aaa gga tgg caa aat ctt tcc tta cgt cca gaa gat gca gct439
Phe Phe Lys Gly Trp Gln Asn Leu Ser Leu Arg Pro Glu Asp Ala Ala
120 125 130
act cgt gaa gca gtg ctc tct aca gct aaa aat ctc aca caa ctt att487
Thr Arg Glu Ala Val Leu Ser Thr Ala Lys Asn Leu Thr Gln Leu Ile
135 140 145
aac gat gca aaa tca agt cta caa aaa acc caa caa gaa atg gat ctc535
Asn Asp Ala Lys Ser Ser Leu Gln Lys Thr Gln Gln Glu Met Asp Leu
150 155 160
tac atc caa caa agt gtt aat aaa gtt aat gag tta gta gat gct att583
Tyr Ile Gln Gln Ser Val Asn Lys Val Asn Glu Leu Val Asp Ala Ile
165 170 175
aaa aac att aat aaa caa atc tca gca act tat att cct ggt caa caa631
Lys Asn Ile Asn Lys Gln Ile Ser Ala Thr Tyr Ile Pro Gly Gln Gln
180 185 190 195
aac cct aat caa tta ctt gat caa cga gat caa ctt gtt cga gaa tta679
Asn Pro Asn Gln Leu Leu Asp Gln Arg Asp Gln Leu Val Arg Glu Leu
200 205 210
gca aac ctg gta gat ata gaa gta aag gat aaa ggt gga gga aat ttt727
Ala Asn Leu Val Asp Ile Glu Val Lys Asp Lys Gly Gly Gly Asn Phe
215 220 225
gat ata caa tta aaa tct gga caa cct ctc ctg gaa gga caa ata ggt775
Asp Ile Gln Leu Lys Ser Gly Gln Pro Leu Leu Glu Gly Gln Ile Gly
230 235 240
tat aca ctt agc gtt ggg gga caa cga gtt gaa aac tat tta aaa caa823
Tyr Thr Leu Ser Val Gly Gly Gln Arg Val Glu Asn Tyr Leu Lys Gln
245 250 255
gat tca aaa tat aca ggc act ata acc tct agt ggt tca gac tcc cat871
Asp Ser Lys Tyr Thr Gly Thr Ile Thr Ser Ser Gly Ser Asp Ser His
260 265 270 275
gaa tat tca ttt gaa att att aat cct cct tct ggt gga gca cct ggg919
Glu Tyr Ser Phe Glu Ile Ile Asn Pro Pro Ser Gly Gly Ala Pro Gly
280 285 290
agt atg cgt gta tca ctt gat gga gga aaa act tgg ctt cgt aac gaa967
Ser Met Arg Val Ser Leu Asp Gly Gly Lys Thr Trp Leu Arg Asn Glu
295 300 305
gat gga tct gaa ctt aac gta cct att cct act acg cct ggt gaa act 1015
Asp Gly Ser Glu Leu Asn Val Pro Ile Pro Thr Thr Pro Gly Glu Thr
310 315 320
atc aaa gta aaa aat ctt gaa ata tct ttt gat caa gat cct tcg caa 1063
Ile Lys Val Lys Asn Leu Glu Ile Ser Phe Asp Gln Asp Pro Ser Gln
325 330 335
tta gtt tca gga gac agg ttt gat gtt att cca aaa aca ggt tta tac 1111
Leu Val Ser Gly Asp Arg Phe Asp Val Ile Pro Lys Thr Gly Leu Tyr
340 345 350 355
tgg aat tca ccc aca aga cct ccg atc aat att act ccc caa aca cta 1159
Trp Asn Ser Pro Thr Arg Pro Pro Ile Asn Ile Thr Pro Gln Thr Leu
360 365 370
aat gat ggt aca gaa aat aca ggg cgt ctc act gga gga aaa ctt act 1207
Asn Asp Gly Thr Glu Asn Thr Gly Arg Leu Thr Gly Gly Lys Leu Thr
375 380 385
gca tat ttt agt act cgt gat tat aat gca gga aga tat att gat aaa1255
Ala Tyr Phe Ser Thr Arg Asp Tyr Asn Ala Gly Arg Tyr Ile Asp Lys
390 395 400
ctt gat gca tta gca aac tct att gta tgg gaa gta aac cga atc cac1303
Leu Asp Ala Leu Ala Asn Ser Ile Val Trp Glu Val Asn Arg Ile His
405 410 415
agt caa ggt gct gga gaa caa aaa atg act tac tct tta ggg agt agt1351
Ser Gln Gly Ala Gly Glu Gln Lys Met Thr Tyr Ser Leu Gly Ser Ser
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caa gta aat cgt aca gat gta cca ctg gga aca tct caa tct ggt ctt1399
Gln Val Asn Arg Thr Asp Val Pro Leu Gly Thr Ser Gln Ser Gly Leu
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gcc tat gga aac cgt ctt aca act ggg aac tta tca ttc caa atc tat1447
Ala Tyr Gly Asn Arg Leu Thr Thr Gly Asn Leu Ser Phe Gln Ile Tyr
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gat gaa aat gga aaa cct tta cct gta ggc aca cct cca aat gga atc1495
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cca gaa tct tta gat ctt gat cca ggt acg cct gga gtt caa aac ttt1543
Pro Glu Ser Leu Asp Leu Asp Pro Gly Thr Pro Gly Val Gln Asn Phe
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gat cct tca att cat agt ctt gaa gat cta gtt aat gcc att aac cac1591
Asp Pro Ser Ile His Ser Leu Glu Asp Leu Val Asn Ala Ile Asn His
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Pro Asn Asn Tyr Gly Glu Phe Met Lys Ala Ser Ile Val Asn Gly Ser
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Leu Gln Leu Thr Ser Arg Pro Gly Thr Ser Phe Ala Ala Lys Thr Asp
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<213>胞內(nèi)勞森氏菌
<220>
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40 45 50
ctt gtc ctt gat gta cta aga gag cat agc gaa ctt gtc ctt gaa att 250
Leu Val Leu Asp Val Leu Arg Glu His Ser Glu Leu Val Leu Glu Ile
55 60 65
gcc caa caa ggt tct aaa cag cgt caa cat aaa tcc ctt ata gca cag298
Ala Gln Gln Gly Ser Lys Gln Arg Gln His Lys Ser Leu Ile Ala Gln
70 75 80
tgg aaa aaa gac ata act act cca aaa aat atg cat ctg gaa aat aga346
Trp Lys Lys Asp Ile Thr Thr Pro Lys Asn Met His Leu Glu Asn Arg
85 90 95
cca atc cga ggg aat cca aaa gca ccc gta act att gta gca ttt tca394
Pro Ile Arg Gly Asn Pro Lys Ala Pro Val Thr Ile Val Ala Phe Ser
100 105 110 115
gac ttt aca tgt ttg tac tgt tca caa gct tct aaa act gta caa caa442
Asp Phe Thr Cys Leu Tyr Cys Ser Gln Ala Ser Lys Thr Val Gln Gln
120 125 130
atg ctt att gat tat aaa gat aat gta aaa tat att ttt aaa cac ttc490
Met Leu Ile Asp Tyr Lys Asp Asn Val Lys Tyr Ile Phe Lys His Phe
135 140 145
ccg ctt aaa gga cat act att tca caa caa gcg gca ata tat ttc att538
Pro Leu Lys Gly His Thr Ile Ser Gln Gln Ala Ala Ile Tyr Phe Ile
150 155 160
gct gca tct ttc caa agt aat gaa aaa gca tgg gca ctt tat gat ctt586
Ala Ala Ser Phe Gln Ser Asn Glu Lys Ala Trp Ala Leu Tyr Asp Leu
165 170 175
ctt ttt caa aaa aga gat gag cta tta caa aac ggt gaa cag act ctt634
Leu Phe Gln Lys Arg Asp Glu Leu Leu Gln Asn Gly Glu Gln Thr Leu
180 185 190 195
aaa caa gca gta aaa gaa gtg gga cta gat ata aaa aag tta atg agt682
Lys Gln Ala Val Lys Glu Val Gly Leu Asp Ile Lys Lys Leu Met Ser
200 205 210
gac ctc aac aaa gca gaa gta aac aat att ctt gga caa gac ata aaa730
Asp Leu Asn Lys Ala Glu Val Asn Asn Ile Leu Gly Gln Asp Ile Lys
215 220 225
gat gct gca caa ctt gat att agt ggt act cca tac ttt att gtt aat778
Asp Ala Ala Gln Leu Asp Ile Ser Gly Thr Pro Tyr Phe Ile Val Asn
230 235 240
aac ctt atc ctt cgt ggt gca tta cct cct gaa tta ttc aca gaa gca826
Asn Leu Ile Leu Arg Gly Ala Leu Pro Pro Glu Leu Phe Thr Glu Ala
245 250 255
att aat atg gcc tta aaa aat aca aaa gaa gtg tca aca tct cca aaa874
Ile Asn Met Ala Leu Lys Asn Thr Lys Glu Val Ser Thr Ser Pro Lys
260 265 270 275
taa attctaaaag gtgtcataac tacaacacat tactatataa tgaaacctat 927
gctagtatat ttattacaat actt 951
<210>12
<211>275
<212>PRT
<213>胞內(nèi)勞森氏菌
<400>12
Met Leu Phe Ser Phe Arg Phe Ile Thr Tyr Pro Leu Ile Thr Ile Phe
1 5 10 15
Ile Leu Tyr Thr Cys His Asn Ala Leu Ala Ser Asn Asn Asp Ser Met
20 25 30
Ile Thr Ser Glu Asn Phe Glu Ser Gln Leu Arg Leu Leu Leu His Asn
35 40 45
His Pro Glu Leu Val Leu Asp Val Leu Arg Glu His Ser Glu Leu Val
50 55 60
Leu Glu Ile Ala Gln Gln Gly Ser Lys Gln Arg Gln His Lys Ser Leu
65 70 75 80
Ile Ala Gln Trp Lys Lys Asp Ile Thr Thr Pro Lys Asn Met His Leu
85 90 95
Glu Asn Arg Pro Ile Arg Gly Asn Pro Lys Ala Pro Val Thr Ile Val
100 105 110
Ala Phe Ser Asp Phe Thr Cys Leu Tyr Cys Ser Gln Ala Ser Lys Thr
115 120 125
Val Gln Gln Met Leu Ile Asp Tyr Lys Asp Asn Val Lys Tyr Ile Phe
130 135 140
Lys His Phe Pro Leu Lys Gly His Thr Ile Ser Gln Gln Ala Ala Ile
145 150 155 160
Tyr Phe Ile Ala Ala Ser Phe Gln Ser Asn Glu Lys Ala Trp Ala Leu
165 170 175
Tyr Asp Leu Leu Phe Gln Lys Arg Asp Glu Leu Leu Gln Asn Gly Glu
180 185 190
Gln Thr Leu Lys Gln Ala Val Lys Glu Val Gly Leu Asp Ile Lys Lys
195 200 205
Leu Met Ser Asp Leu Asn Lys Ala Glu Val Asn Asn Ile Leu Gly Gln
210 215 220
Asp Ile Lys Asp Ala Ala Gln Leu Asp Ile Ser Gly Thr Pro Tyr Phe
225 230 235 240
Ile Val Asn Asn Leu Ile Leu Arg Gly Ala Leu Pro Pro Glu Leu Phe
245 250 255
Thr Glu Ala Ile Asn Met Ala Leu Lys Asn Thr Lys Glu Val Ser Thr
260 265 270
Ser Pro Lys
27權(quán)利要求
1.編碼胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列或編碼所述蛋白質(zhì)之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，所述核酸序列或其所述部分與SEQID NO1所示核酸序列具有至少90％、優(yōu)選92％、更優(yōu)選94％、甚至更優(yōu)選96％的同源性。
2.編碼胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列或編碼所述蛋白質(zhì)之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，所述核酸序列或其所述部分與SEQID NO3所示核酸序列具有至少90％、優(yōu)選92％、更優(yōu)選94％、甚至更優(yōu)選96％的同源性。
3.編碼胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列或編碼所述蛋白質(zhì)之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，所述核酸序列或其所述部分與SEQID NO5所示核酸序列具有至少90％、優(yōu)選92％、更優(yōu)選94％、甚至更優(yōu)選96％的同源性。
4.編碼胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列或編碼所述蛋白質(zhì)之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，所述核酸序列或其所述部分與SEQID NO7所示核酸序列具有至少90％、優(yōu)選92％、更優(yōu)選94％、甚至更優(yōu)選96％的同源性。
5.編碼胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列或編碼所述蛋白質(zhì)之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，所述核酸序列或其所述部分與SBQID NO9所示核酸序列具有至少90％、優(yōu)選92％、更優(yōu)選94％、甚至更優(yōu)選96％的同源性。
6.編碼胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)的核酸序列或編碼所述蛋白質(zhì)之免疫原性片段的所述核酸序列之部分，所述核酸序列或其所述部分與SEQID NO11所示核酸序列具有至少90％、優(yōu)選92％、更優(yōu)選94％、甚至更優(yōu)選96％的同源性。
7.包含依照權(quán)利要求1-6的核酸序列的DNA片段。
8.包含處于功能性相連的啟動(dòng)子控制之下的依照權(quán)利要求1-6的核酸序列或依照權(quán)利要求7的DNA片段的重組DNA分子。
9.包含依照權(quán)利要求1-6的核酸序列、依照權(quán)利要求7的DNA片段、或依照權(quán)利要求8的重組DNA分子的活體重組載體。
10.包含依照權(quán)利要求1-6的核酸序列、依照權(quán)利要求7的DNA片段、依照權(quán)利要求8的重組DNA分子、或依照權(quán)利要求9的活體重組載體的宿主細(xì)胞。
11.胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)或其免疫原性片段，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少90％、優(yōu)選92％、更優(yōu)選94％、甚至更優(yōu)選96％同源的氨基酸序列。
12.胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)或其免疫原性片段，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO4所示氨基酸序列至少90％、優(yōu)選92％、更優(yōu)選94％、甚至更優(yōu)選96％同源的氨基酸序列。
13.胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)或其免疫原性片段，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO6所示氨基酸序列至少90％、優(yōu)選92％、更優(yōu)選94％、甚至更優(yōu)選96％同源的氨基酸序列。
14.胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)或其免疫原性片段，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO8所示氨基酸序列至少90％、優(yōu)選92％、更優(yōu)選94％、甚至更優(yōu)選96％同源的氨基酸序列。
15.胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)或其免疫原性片段，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO10所示氨基酸序列至少90％、優(yōu)選92％、更優(yōu)選94％、甚至更優(yōu)選96％同源的氨基酸序列。
16.胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)或其免疫原性片段，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO12所示氨基酸序列至少90％、優(yōu)選92％、更優(yōu)選94％、甚至更優(yōu)選96％同源的氨基酸序列。
17.用于疫苗中的依照權(quán)利要求11-16的胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)。
18.依照權(quán)利要求11-16的胞內(nèi)勞森氏菌蛋白質(zhì)用于制備抗擊胞內(nèi)勞森氏菌感染的疫苗的用途。
19.用于抗擊胞內(nèi)勞森氏菌感染的疫苗，其特征是包含依照權(quán)利要求1-6的核酸序列、依照權(quán)利要求7的DNA片段、依照權(quán)利要求8的重組DNA分子、依照權(quán)利要求9的活體重組載體、依照權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞、或依照權(quán)利要求11-16的蛋白質(zhì)，以及制藥學(xué)可接受載體。
20.依照權(quán)利要求19的疫苗，其特征是包含佐劑。
21.依照權(quán)利要求19或20的疫苗，其特征是包含由豬致病性病毒或微生物衍生的額外抗原或編碼所述抗原的遺傳信息。
22.依照權(quán)利要求21的疫苗，其特征是所述豬致病性病毒或微生物選自假狂犬病病毒、豬流感病毒、豬細(xì)小病毒、可傳染的胃腸炎病毒、輪狀病毒、埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella cholerasuis)、副豬嗜血菌(Haemophilus parasuis)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、豬肺炎枝原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、和大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。
23.用于抗擊胞內(nèi)勞森氏菌感染的疫苗，其特征是包含針對(duì)依照權(quán)利要求11-16所述蛋白質(zhì)的抗體。
24.用于制備依照權(quán)利要求19-23的疫苗的方法，所述方法包括將依照權(quán)利要求1-6的核酸序列、依照權(quán)利要求7的DNA片段、依照權(quán)利要求8的重組DNA分子、依照權(quán)利要求9的活體重組載體、依照權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞、依照權(quán)利要求11-16的蛋白質(zhì)、或針對(duì)依照權(quán)利要求11-16所述蛋白質(zhì)的抗體與制藥學(xué)可接受載體混合。
25.用于檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌特異性DNA的診斷性測(cè)試，其特征是所述測(cè)試包含依照權(quán)利要求1-6的核酸序列或其長度為至少12個(gè)、優(yōu)選15個(gè)、更優(yōu)選18個(gè)核苷酸的片段。
26.用于檢測(cè)針對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌的抗體的診斷性測(cè)試，其特征是所述測(cè)試包含權(quán)利要求11-16中所定義的蛋白質(zhì)或其片段。
27.用于檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌的抗原性物質(zhì)的診斷性測(cè)試，其特征是所述測(cè)試包含針對(duì)權(quán)利要求11-16中定義的蛋白質(zhì)或其片段的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼新型胞內(nèi)勞森氏菌(Lawsoniaintracellularis)蛋白質(zhì)的核酸序列。本發(fā)明還涉及包含這些序列的DNA片段、重組DNA分子、和活體重組載體。本發(fā)明還涉及包含這些核酸序列、DNA片段、重組DNA分子、和活體重組載體的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明涉及由這些核酸序列編碼的蛋白質(zhì)及其用于制造疫苗的用途。本發(fā)明還涉及用于抗擊胞內(nèi)勞森氏菌感染的疫苗及其制備方法。最后，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌DNA以及檢測(cè)胞內(nèi)勞森氏菌抗原和針對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌的抗體的診斷性測(cè)試。
文檔編號(hào)C07K16/12GK1849334SQ20048002617
公開日2006年10月18日 申請(qǐng)日期2004年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月12日
發(fā)明者P·韋爾梅杰 申請(qǐng)人:阿克佐諾貝爾公司