專利名稱：抵抗胞內(nèi)勞森菌的疫苗的制作方法
抵抗胞內(nèi)勞森菌的疫苗本發(fā)明涉及用于抵抗胞內(nèi)勞森菌(Lawsonia intracellularis)感染的疫苗，在這 個(gè)意義上，疫苗是至少提供胞內(nèi)勞森菌感染的負(fù)面影響降低的組合物，如組織損傷和/或 臨床病征(如，下降的體重增加，腹瀉等)的負(fù)面影響。許多動(dòng)物(特別是豬)的增生性腸炎呈現(xiàn)出不成熟隱窩上皮細(xì)胞粘膜增生的臨床 病征和病理癥狀，特別是在末端回腸中?？梢允艿接绊懙男∧c的其他部位包括空腸、盲腸和 結(jié)腸。斷奶幼畜和仔豬主要受到體重快速減輕和脫水的典型臨床表現(xiàn)的影響。豬的自然臨 床疾病在全世界范圍內(nèi)發(fā)生。該疾病始終與胞內(nèi)曲狀細(xì)菌(目前已知為胞內(nèi)勞森菌)的存 在相關(guān)。通常，對(duì)抗胞內(nèi)勞森菌的口服接種疫苗已經(jīng)顯示出是一種在經(jīng)濟(jì)上有效的措施， 以控制回腸炎和更好地開(kāi)發(fā)豬的遺傳生長(zhǎng)潛能(Porcine Proliferative Enteropathy Technical manual 3. 0 (豬增生性腸炎技術(shù)手冊(cè)3. 0)，2006年7月；獲自Boehringer Ingelheim)。此外，口服而非非腸道的疫苗接種將降低血液攜帶感染(如通過(guò)多次使用的 針的PRRS)的傳播以及注射部位反應(yīng)的減少和保留在畜體內(nèi)的針。與單獨(dú)的疫苗接種相 比，這將減少動(dòng)物和人的應(yīng)激、時(shí)間、勞動(dòng)成本和精力(McOrist :"Ileitis-0ne Pathogen, Several Diseases，，，IPVS Ileitis Symposium in Hamburg, 2004 年 6 月 28 日)。通常了解減毒活疫苗方法的優(yōu)勢(shì)是免疫的功效通常是相對(duì)良好的，因?yàn)樗拗鞯拿?疫系統(tǒng)以更“自然”的方式暴露于生物體的所有抗原物質(zhì)。特別地，對(duì)于胞內(nèi)細(xì)菌劑，如胞 內(nèi)勞森菌，由于基于完全的和合適的T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，認(rèn)為活的減毒疫苗方法給接種疫 苗的動(dòng)物給予了最好利用的保護(hù)。這與用于胞內(nèi)細(xì)菌的亞基或殺滅疫苗類型相關(guān)的不定的 差的免疫性相反。這對(duì)于專性胞內(nèi)細(xì)菌(如，胞內(nèi)勞森菌或衣原體(Chlamydia))也特別如 此，這些胞內(nèi)細(xì)菌在粘膜內(nèi)引起致病的感染。研究表明目標(biāo)胞內(nèi)細(xì)菌完整的活減毒形式最 好遞送至靶粘膜，它們需要作為完整的活細(xì)菌形式，以在靶粘膜中產(chǎn)生完全保護(hù)性的免疫 應(yīng)答，而且與使用部分細(xì)菌成分相比，它們?cè)诿庖呱弦彩禽^好的。一般的理解是需要口服給予對(duì)抗胞內(nèi)勞森菌的疫苗(參見(jiàn)上文中提到的 Technical Manual 3.0)。這是基于如下的事實(shí)身體抵抗回腸炎的基礎(chǔ)是小腸中的局部 免疫力，這是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力和通過(guò)抗體(尤其是IgA)的局部防御的結(jié)果。根據(jù)目前 的知識(shí)，血清抗體(IgG)不能給予任何保護(hù)，只是因?yàn)樗鼈儧](méi)有到達(dá)腸腔。已經(jīng)在研究中 證明了口服疫苗接種產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力，以及在腸道中局部產(chǎn)生IgA(Murtaugh，見(jiàn) Agrar-und Veter inar -Akademie, Nutztierpraxis Aktuel 1, Ausgabe 9, Juni 2004 ；禾口 Hyland 等，見(jiàn) Veterinary Immunology and Immunopathology 102 (2004) 329-338)。相反， 肌內(nèi)給藥沒(méi)有產(chǎn)生保護(hù)。此外，緊次于對(duì)抗胞內(nèi)細(xì)菌的成功疫苗必須誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫 力以及局部抗體的產(chǎn)生的一般了解，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道實(shí)際上僅有非常低百分比的口服 攝入的抗原被腸上皮細(xì)胞吸收，并且胞內(nèi)勞森菌摻入細(xì)胞中是通過(guò)細(xì)菌啟動(dòng)的活性過(guò)程。 因此，滅活的疫苗將給腸提供具有不充足的免疫原性抗原(Haesebrouck等，見(jiàn)Veterinary Microbiology 100 (2004) 255-268)。這是為什么認(rèn)為只有減毒的活疫苗在腸細(xì)胞中誘導(dǎo)足 夠的細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)(參見(jiàn)上文中提到的Technical Manual 3.0)。目前，市場(chǎng)上只有一種抵抗胞內(nèi)勞森菌的疫苗，由Boehringer Ingelheim銷售的viz. Enter i SO1 Ileitis。 這種疫苗是真正的用于口服給藥的活疫苗。本發(fā)明的目的是提供抵抗胞內(nèi)勞森菌感染的可替換疫苗。為此，發(fā)明了使用非活 性的含有碳水化合物的組合物，這些碳水化合物在活的胞內(nèi)勞森菌細(xì)胞中也能找到，與這 些細(xì)胞的外細(xì)胞膜相連，將組合物用于制造抵抗胞內(nèi)勞森菌感染的疫苗，該疫苗是適于全 身給藥的形式。令人驚訝地，與長(zhǎng)久以來(lái)對(duì)怎樣對(duì)抗胞內(nèi)勞森菌的一般了解相反，發(fā)現(xiàn)使用 含有碳水化合物的非活性組合物，例如，從胞內(nèi)勞森菌的外細(xì)胞膜提取的，作為疫苗中的抗 原，可以誘導(dǎo)對(duì)抗胞內(nèi)勞森菌的保護(hù)，當(dāng)將抗原全身給藥時(shí)，即，以到達(dá)身體循環(huán)系統(tǒng)的方 式(包括心血管和淋巴系統(tǒng))，這種保護(hù)與使用活疫苗Enteri so 1 ileitis(根據(jù)相應(yīng) 的說(shuō)明書(shū)來(lái)給藥)提供的保護(hù)相當(dāng)或甚至有提高，因此影響作為整體的身體，而不是特定 部位，如胃腸道。例如，可以通過(guò)將抗原給予肌肉組織中(肌內(nèi))、真皮中(皮內(nèi))、皮膚下 (皮下)、粘膜下(膜下)、靜脈中(靜脈內(nèi))等來(lái)進(jìn)行全身給藥。除了可獲得的非常好的保 護(hù)以外，本發(fā)明非活性疫苗的重要優(yōu)點(diǎn)在于當(dāng)與活疫苗比較時(shí)固有的安全性。通常，可以通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的方法將含有碳水化合物的組合物用于制造疫 苗，這些方法基本上包括將含有抗原性碳水化合物的組合物(或從其衍生的組合物，如原 始組合物或提取物的稀釋物或濃縮物，一種或多種純化成分等)與藥物學(xué)上可接受的載體 混合，所述載體例如為液體載體，如(任選緩沖的)水，或固體載體，如通常用于獲得冷凍干 燥疫苗的那些。因此，可以在工業(yè)環(huán)境中進(jìn)行制造，也可以就地(即，在獸醫(yī)處、農(nóng)場(chǎng)等)將 抗原與其他疫苗混合，例如，在實(shí)際給藥于動(dòng)物之前(立即)混合。在疫苗中，抗原應(yīng)當(dāng)以 免疫有效量存在，即，能夠刺激目標(biāo)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)足以至少降低用野生型生物體的接種 后激發(fā)的負(fù)效應(yīng)的含量。任選地，可以加入其他物質(zhì)，如佐劑、穩(wěn)定劑、粘度調(diào)節(jié)劑或其他成 分，這取決于預(yù)期的用途或所需的疫苗特性。對(duì)于全身性疫苗接種，許多形式是合適的，特 別是液體制劑(含有溶解的、乳化的或懸浮的抗原)，以及固體制劑，如植入物或介質(zhì)形式， 如用于抗原懸浮于液體中的固體載體。全身性疫苗接種，特別是非腸道疫苗接種(即，不通 過(guò)消化道)，和用于全身性疫苗接種的合適疫苗(物理)形式已經(jīng)知道有200多年了。注意到已經(jīng)報(bào)道了胞內(nèi)勞森菌細(xì)菌的亞基作為疫苗中的抗原，用于保護(hù)以對(duì)抗這 種細(xì)菌。然而，這些主要是重組蛋白，并且迄今為止沒(méi)有一個(gè)證明了能夠提供良好的保護(hù)。 也提出了將殺滅的細(xì)菌(其固有地含有也能在活的胞內(nèi)勞森菌細(xì)胞中找到的與外細(xì)胞膜 相連的碳水化合物)作為對(duì)抗胞內(nèi)勞森菌的疫苗中的抗原，但實(shí)際上尚未測(cè)試和報(bào)道基于 殺滅的全細(xì)胞的疫苗能提供良好的保護(hù)。除此之外，由于通常的理解是對(duì)全身性給藥抗原 來(lái)局部(即，在腸中)對(duì)抗胞內(nèi)勞森菌不存在合理的期望，因此沒(méi)有結(jié)合這些殺滅的細(xì)菌來(lái) 使用全身性給藥。在這點(diǎn)上，注意到W097/20050 (Daratech PTY Ltd)提及了使用殺滅的胞內(nèi)勞森菌 細(xì)菌來(lái)使豬免疫。然而，沒(méi)有提及全身性給藥。基于目前的支持，只在口服給藥時(shí)，疫苗接 種才是有效的，通常理解口服途徑是為Daratech申請(qǐng)中所述的實(shí)驗(yàn)選擇的給藥途徑。另 一個(gè)提及殺滅細(xì)菌的專利申請(qǐng)是W02005/011731 (Boehringer Ingelheim)。然而，實(shí)際上 公開(kāi)的只是使用了 口服給藥的活疫苗。沒(méi)有顯示殺滅疫苗是有效的，也沒(méi)有公開(kāi)可以全身 性給藥殺滅的疫苗。EP843818 (Boehringer Ingelheim)描述了肌內(nèi)給藥殺滅的疫苗(段 落
，結(jié)合段落
)，在段落W115]中，描述了通過(guò)在標(biāo)準(zhǔn)大氣條件下儲(chǔ)存在4°C下來(lái)殺滅細(xì)菌。然而，如通常所知的，在這樣的條件下，胞內(nèi)勞森菌細(xì)菌能夠存活。因此， 這篇文獻(xiàn)沒(méi)有教導(dǎo)本發(fā)明的主題。還注意到含有碳水化合物的組合物從Kroll等是已知的 (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，2005 年 6 月，693—699)，其中i亥碳水 化合物在活的胞內(nèi)勞森菌中也能找到，與這些細(xì)胞的外細(xì)胞膜相連。然而，這種組合物是用 于診斷的。出于如上所述的原因，尚未測(cè)得其為保護(hù)性抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有碳水化合物的組合物是由胞內(nèi)勞森菌細(xì)菌的殺滅產(chǎn)生的 材料。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了非常方便的提供用于根據(jù)本發(fā)明使用的碳水化合物的方式是簡(jiǎn)單地殺滅 胞內(nèi)勞森菌細(xì)胞并使用獲自作為碳水化合物來(lái)源的材料。從活細(xì)胞提取碳水化合物在理 論上也是可行的(類似于通過(guò)除去細(xì)胞壁形成活的形骸細(xì)胞)，但需要更精密復(fù)雜的并因 此更昂貴的技術(shù)。該材料可以作為整體使用，例如，胞內(nèi)勞森菌細(xì)胞的全細(xì)胞懸浮液或裂解 物，或可以從該材料中純化或甚至分離出碳水化合物?？梢酝ㄟ^(guò)使用相對(duì)簡(jiǎn)單的本領(lǐng)域已 知的技術(shù)來(lái)進(jìn)行這種方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，含有碳水化合物的組合物含有殺滅的胞內(nèi)勞森菌細(xì)菌的完 整細(xì)胞。已經(jīng)證明了這是最方便用于提供碳水化合物作為疫苗中的抗原的方式。此外，甚 至可進(jìn)一步提高疫苗的功效，可能是因?yàn)檫@種將抗原給予目標(biāo)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的方式可更 好地模擬碳水化合物的天然環(huán)境。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗包含水包油型佐劑，其含有亞微米大小的油滴。通常，佐 劑是非特異性的免疫刺激劑。原則上，可以將在免疫事件的級(jí)聯(lián)中能夠促進(jìn)或擴(kuò)大特定的 過(guò)程并最終導(dǎo)致更好免疫應(yīng)答(即，對(duì)抗原的綜合身體應(yīng)答，特別是通過(guò)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的 應(yīng)答，并且通常涉及特定抗體或之前敏化的淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別)的每種物質(zhì)定義為佐 劑。已經(jīng)顯示出使用含有亞微米大小油滴的水包油型佐劑可提供非常好的對(duì)抗胞內(nèi)勞森菌 的保護(hù)。實(shí)際上，水包油型佐劑這樣結(jié)合非活性抗原的應(yīng)用是常見(jiàn)的。然而，通常知道當(dāng)油 滴直徑大時(shí)獲得最好的免疫刺激特性。特別是，當(dāng)認(rèn)為安全性是重要問(wèn)題時(shí)，特別地使用具 有1微米以下直徑的油滴。在這種情況下，可以使用小的液滴，因?yàn)橐阎@些引起較少的組 織損傷、臨床病征等。然而，對(duì)于通過(guò)全身性疫苗接種獲得腸道相關(guān)疾病保護(hù)(如本發(fā)明中 的情況)來(lái)說(shuō)，可以選擇大的液滴，因?yàn)槠谕庖邞?yīng)答必須得到明顯加強(qiáng)。相反，我們發(fā)現(xiàn) 了對(duì)于對(duì)抗胞內(nèi)勞森菌的保護(hù)，在組合物中使用小的油滴可提供非常好的結(jié)果。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，佐劑包含生物可降解油的液滴和礦物油的液滴，生物可 降解油的液滴的平均大小不同于礦物油的液滴的平均大小。已經(jīng)顯示出使用生物可降解油 和礦物油的混合物對(duì)于功效和安全性提供了非常好的結(jié)果。除此之外，組合物的穩(wěn)定性非 常高，這是重要的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。已經(jīng)證明了穩(wěn)定性是非常好的，特別是當(dāng)生物可降解油液滴或 礦物油液滴的平均(容重)大小小于500nm(優(yōu)選400nm)時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗進(jìn)一步包含豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae) 和豬圓環(huán)病毒的抗原。迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)提出了胞內(nèi)勞森菌的組合疫苗。然而，實(shí) 際上這些組合中沒(méi)有多少的功效得到了測(cè)試。這種情況的原因在于通常理解為抗原與胞內(nèi) 勞森菌抗原的組合只有當(dāng)勞森菌抗原作為活(減毒)細(xì)胞提供時(shí)才能獲得成功的保護(hù)。在 這點(diǎn)上，我們參考W02005/011731，其也提出了基于胞內(nèi)勞森菌的所有種類的組合疫苗。然 而，關(guān)于該專利申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求結(jié)構(gòu)，受讓人(Boehringer Ingelheim)似乎確信 只有當(dāng)勞森菌抗原以活細(xì)胞形式存在時(shí)才能期望組合疫苗具有合理的成功機(jī)會(huì)。這對(duì)于W02006/099561同樣如此，受讓人也是Boehringer Ingelheim)。實(shí)際上，基于普通常識(shí)，這 是顯而易見(jiàn)的想法。使用以下實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明。實(shí)施例1描述了獲得基本上無(wú)蛋白質(zhì)的含碳水化合物的組合物的方法以及使用 該組合物制得的疫苗。實(shí)施例2描述了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，其中將根據(jù)本發(fā)明的第二種疫苗與目前市場(chǎng)上的疫苗 和含有胞內(nèi)勞森菌亞基蛋白的實(shí)驗(yàn)疫苗進(jìn)行比較。實(shí)施例3描述了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，其中將根據(jù)本發(fā)明的兩種不同的疫苗與目前市場(chǎng)上的 疫苗進(jìn)行比較。實(shí)施例4描述了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，其中確定了根據(jù)本發(fā)明的疫苗的劑量影響。實(shí)施例1在這個(gè)實(shí)施例中，描述了獲得基本上無(wú)蛋白質(zhì)的與胞內(nèi)勞森菌細(xì)胞的外細(xì)胞膜相 連的碳水化合物組合物的方法以及可以使用這種組合物制得的疫苗。通常，碳水化合物是 含有碳、氫和氧的有機(jī)化合物，碳、氫和氧的比例通常為1 2 1。碳水化合物的實(shí)例是糖 (糖類)、淀粉、纖維素和樹(shù)膠。通常，它們作為動(dòng)物膳食中的主要能源。胞內(nèi)勞森菌是革蘭 氏陰性細(xì)菌，因此其含有不完全是由磷脂和蛋白質(zhì)構(gòu)成的外膜，而是外膜還含有碳水化合 物，特別是多糖(通常是如脂多糖、脂寡糖或甚至非脂多糖這樣的多糖)。用于疫苗制備的碳水化合物級(jí)分取二十微升含有濃度為3.7E8( = 3. 7X IO8)細(xì)胞/ml的胞內(nèi)勞森菌的緩沖水 (0. 04M PBS，磷酸鹽緩沖的鹽水)。通過(guò)將它們?cè)?00°C下保持10分鐘來(lái)裂解細(xì)胞。將0. 04M PBS中的蛋白酶K(10mg/ml)加入，至1. 7mg/ml的終濃度。將該混合物在60°C下培養(yǎng)60分 鐘，以降解所有蛋白質(zhì)并保持碳水化合物完整。隨后，將混合物在100°C下培養(yǎng)10分鐘，以 滅活蛋白酶K。將所得到的材料在2-8°C下儲(chǔ)存，直至進(jìn)一步使用，所得到的材料是含有碳 水化合物的組合物，特別是含有存在于活的胞內(nèi)勞森菌細(xì)菌中的與其外細(xì)胞膜相連的碳水 化合物(參見(jiàn)以下的段落)。將組合物配制于Diluvac forte佐劑中。這種佐劑(參閱EP 0382271)包括7. 5%重量的具有大約400nm的平均容重大小的醋酸維生素E液滴，液滴懸 浮于水中，并用0.5%重量的吐溫80(聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯)穩(wěn)定。每微菌升疫苗含 有從1. 2E8胞內(nèi)勞森菌提取的材料。勞森菌碳水化合物抗原的免疫沉淀根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序，在室溫下，用飽和的Na2SO4,將兩批對(duì)抗胞內(nèi)勞森菌完整細(xì)胞產(chǎn)生 的單克隆抗體(MoAb’s)進(jìn)行沉淀。通過(guò)離心(10.000g，10分鐘)將沉淀物沉淀。用20% Na2SO4洗滌沉淀物，并重懸浮于0. 04M PBS中。根據(jù)制造商的手冊(cè)，用0. IM NaPO4(pH 7. 4) 預(yù)先洗滌酪氨酰(Tylosyl)激活的Dynal珠粒(DynaBeads，DK)。從每批MoAb，s取出 140 μ g，并加入到2E8預(yù)先洗滌過(guò)的珠粒中，并在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。通過(guò)離心沉淀珠粒并通 過(guò)抽吸上清液來(lái)除去未結(jié)合的MoAb’ s。分光光度計(jì)測(cè)量顯示出20至35%加入的MoAb，s 已經(jīng)與珠粒結(jié)合。將0. 04M PBS中的兩批Iml胞內(nèi)勞森菌細(xì)胞(3. 7E8/ml)超聲波處理1分鐘。將 所得到的細(xì)胞裂解物加入到酪氨酰激活的珠粒-單克隆復(fù)合物中，并在4°C下培養(yǎng)過(guò)夜。用 0. IM NaPO4(pH 7. 4)將酪氨酰激活的珠粒-單克隆復(fù)合物洗滌三次。以連續(xù)的方式，將珠粒在 0. 5ml 的 0. 04M PBS 中的 8M 脲(El) ；0. 5ml IOmM 甘氨酸 pH2. 5 (E2)；和 0. 5ml 50mM HCl (E3)中洗滌來(lái)洗脫結(jié)合的化合物。洗脫后，用100 μ 1和200 μ 1 IM Tris/HCl (pH 8. 0) 中禾口 E2禾口 E3。從每個(gè)步驟取樣并裝載于SDS-PAGE凝膠上。使用考馬斯亮藍(lán)(CBB)和銀染將凝膠 染色或弄污。使用如上所述的相同MoAb’s來(lái)產(chǎn)生斑點(diǎn)。凝膠和斑點(diǎn)的觀察顯示出MoAb’s 識(shí)別具有21和24kDa表觀分子量的條帶，這些條帶在CBB凝膠上未看到，但在銀染的凝膠 上看到了。此外，確定了結(jié)合MoAb’s的細(xì)胞級(jí)分是蛋白酶K抗性的。因此，基于這些結(jié)果， 可以推斷出該級(jí)分含有碳水化合物(即，所有蛋白被裂解了，并且超聲波處理的DNA級(jí)分在 銀染中沒(méi)有作為清晰的條帶顯示出來(lái))，并且碳水化合物與胞內(nèi)勞森菌的外細(xì)胞膜(即對(duì) 抗這種級(jí)分產(chǎn)生的MoAb’s也識(shí)別完整的胞內(nèi)勞森菌細(xì)胞)相連(即，形成其的一部分或與 其結(jié)合)。已知胞內(nèi)勞森菌是革蘭氏陰性細(xì)菌的事實(shí)，因此認(rèn)為碳水化合物組合物包括多 糖。實(shí)施例2進(jìn)行該實(shí)施例來(lái)測(cè)試在疫苗中配制碳水化合物抗原的方便方法，S卩，通過(guò)殺滅的 完整細(xì)胞(也稱為菌苗)。作為對(duì)照，使用了可購(gòu)得的疫苗Enterisol iieitis和包含 蛋白質(zhì)亞基的實(shí)驗(yàn)亞基疫苗。接著，將未接種疫苗的動(dòng)物用作對(duì)照。實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下制得滅活的完整細(xì)胞疫苗。收集源自患有PPE的豬的腸的活胞內(nèi)勞森菌細(xì) 胞。用0.01%BPL(i3-丙內(nèi)酯)將細(xì)胞滅活。所得到的材料，在本發(fā)明的意義上固有地是 非活性的含有碳水化合物的組合物(特別是因?yàn)樗写嬖谟诨畎麅?nèi)勞森菌細(xì)菌中的與 外細(xì)胞膜相連的碳水化合物)，將其以大約2. 8 X IO8細(xì)胞/ml疫苗的濃度配制于Diluvac forte佐劑中(參見(jiàn)實(shí)施例1)。亞基疫苗含有重組Ρ1Λ和P4，如從EP1219711中所知的(分別為19/21和37kDa 蛋白)，并且該重組蛋白通過(guò)基因5074、4320和5464來(lái)表達(dá)，如W02005/070958中所述。將 蛋白質(zhì)配制于Diluvac forte佐劑中。疫苗含有大約50 μ g每種蛋白/微升。使用了四十六周大的SPF豬。將豬分成4組，每組十頭豬。根據(jù)制造商的說(shuō)明，組 1 口服接種一次(T = (m)2ml “Enter i sol ileitis”(Boehringer Ingelheim)。組 2和組3肌內(nèi)接種兩次(在T = O和T = 4周時(shí))，分別接種2ml如上所述的滅活勞森菌完 整細(xì)胞疫苗和重組亞基組合疫苗。組4留著作為未接種的對(duì)照。在T = 6周時(shí)，所有的豬 用均質(zhì)的胞內(nèi)勞森菌感染的粘膜口服激發(fā)。隨后，每日觀察所有豬的豬增生性腸病(PPE) 的臨床病征。在激發(fā)之前和之后，以規(guī)則的時(shí)間，從豬取樣血清血液(用于血清學(xué))和糞便 (用于PCR)。在T = 9周時(shí)，將所有豬安樂(lè)死并進(jìn)行尸檢。獲取回腸的組織學(xué)樣品并通過(guò) 顯微鏡進(jìn)行檢查。從感染的粘膜制備激發(fā)接種物將500克感染的粘膜(從感染的腸刮下來(lái)的)與 500ml生理鹽水混合。將該混合物在通用勻漿器中在冰上全速均質(zhì)一分鐘。在T = 6周時(shí)， 用20ml激發(fā)接種物口服激發(fā)所有豬。在T = 0、4、6、7、8和9w時(shí)，獲取每只豬的糞便樣品(克含量)和血清血樣并冷凍 儲(chǔ)存直至測(cè)試。在定量PCR(Q-PCR)中測(cè)試糞便樣品并表示為以皮克(pg)計(jì)的量的對(duì)數(shù)。 在常用的IFT測(cè)試(檢測(cè)對(duì)抗血清中完整胞內(nèi)勞森菌細(xì)菌的抗體的免疫熒光抗體測(cè)試)中測(cè)試血清樣品。對(duì)于組織學(xué)評(píng)分，獲取回腸的相關(guān)樣品，在4%緩沖的福爾馬林中固定，常規(guī) 包埋并切片。用蘇木精-曙紅(HE染色)和使用抗胞內(nèi)勞森菌單克隆抗體的免疫組織化學(xué) 染色(IHC染色)將這些切片染色。通過(guò)顯微鏡檢查這些切片。組織學(xué)評(píng)分如下HE染色
未檢測(cè)到異常分:=0
可疑損傷分:=1/2
輕微損傷分:=1
中度損傷分:=2
嚴(yán)重?fù)p傷分:=3
IHC染色
無(wú)明顯的胞內(nèi)勞森菌細(xì)菌分:=0
可疑的細(xì)菌存在分:=1/2
切片中存在單個(gè)/少量細(xì)菌分·改=1
切片中存在中等數(shù)量的細(xì)菌分:=2
切片中存在大量細(xì)菌分:=3
單獨(dú)記錄每只豬的所有數(shù)據(jù)。按照激發(fā)后不同參數(shù)的陽(yáng)性動(dòng)物的平均值來(lái)計(jì)算每
組的分?jǐn)?shù)。使用非參數(shù)Marm-Whitney U測(cè)試來(lái)評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(雙側(cè)檢驗(yàn)的并將顯著 性水平設(shè)定為0. 05)。實(shí)施例2的結(jié)果血清學(xué)在第一次接種之前，測(cè)試IFT抗體滴度時(shí)，所有豬是血清反應(yīng)陰性的。用完整細(xì) 胞菌苗(組2)接種疫苗后，豬產(chǎn)生了高IFT抗體滴度，而對(duì)照和接種亞基疫苗的豬仍然是 陰性的，直至激發(fā)(表1)。接種Enterisol 的豬(組1)中的兩只產(chǎn)生了中等的ift滴 度，而該組中的所有其他豬保持血清反應(yīng)陰性。激發(fā)后，所有豬產(chǎn)生了高ift抗體滴度。表 1中描述了平均結(jié)果(使用所用的稀釋度，1.0是下側(cè)的檢測(cè)水平)。表1.接種和激發(fā)后豬血清的平均IFT抗體滴度(21og)
組T = O周T = 4周Τ = 6周Τ = 9周1< 1. 01. 11. 7> 11. 42< 1. 03. 7> 11. 8> 12. 03< 1. 0< 1. 0< 1. 0> 11. 64< 1. 0< 1. 0< 1. 0> 12. 0糞便樣品的實(shí)時(shí)PCR在激發(fā)之前，所有糞便樣品是陰性的。激發(fā)后，在所有組中發(fā)現(xiàn)了陽(yáng)性反應(yīng)。組 1 (P = 0. 02)、組2 (ρ = 0. 01)和組3 (ρ = 0. 03)與對(duì)照相比較，具有明顯較低的泄出水平。 表2中給出了激發(fā)后的概述。
表2.接種和激發(fā)后糞便樣品的PCR平均結(jié)果(log pg)
權(quán)利要求
1.非活性的含有碳水化合物的組合物的用途，該碳水化合物在活的胞內(nèi)勞森菌細(xì)胞中 也能找到，與這些細(xì)胞的外細(xì)胞膜相連，該組合物用于制造抵抗胞內(nèi)勞森菌感染的疫苗，該 疫苗是適于全身給藥的形式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于含有碳水化合物的組合物是從殺滅胞內(nèi)勞森菌 細(xì)菌獲得的材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其特征在于含有碳水化合物的組合物含有殺滅的胞內(nèi)勞森 菌細(xì)菌的完整細(xì)胞。
4.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其特征在于所述疫苗包含水包油型佐劑，該佐劑 含有亞微米大小的油滴。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其特征在于所述佐劑包含生物可降解油的液滴和礦物油的 液滴，生物可降解油的液滴的平均大小不同于礦物油的液滴的平均大小。
6.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其特征在于所述疫苗進(jìn)一步包含豬肺炎支原體和 豬圓環(huán)病毒的抗原。
7.非活性的含有碳水化合物的組合物，該碳水化合物在活的胞內(nèi)勞森菌細(xì)胞中也能找 到，與這些細(xì)胞的外細(xì)胞膜相連，該組合物用于制造抵抗胞內(nèi)勞森菌感染的疫苗，該疫苗是 適于全身給藥的形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及非活性的含有碳水化合物的組合物的用途，該碳水化合物在活的胞內(nèi)勞森菌細(xì)胞中也能找到，與這些細(xì)胞的外細(xì)胞膜相連，該組合物用于制造抵抗胞內(nèi)勞森菌感染的疫苗，該疫苗是適于全身給藥的形式。
文檔編號(hào)A61K39/106GK102006883SQ200980113679
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2009年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日
發(fā)明者A·A·C·雅各布斯, C·C·施里爾, P·維爾梅吉, R·P·A·M·塞吉爾斯 申請(qǐng)人:英特威國(guó)際有限公司