專(zhuān)利名稱(chēng)：一種泌尿生殖系統(tǒng)疾病的治療系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明用于泌尿生殖系統(tǒng)疾病的治療，尤其涉及多肽和二聚體用于泌尿生殖系統(tǒng)疾病的治療。
背景技術(shù)：
泌尿生殖系統(tǒng)疾病通常累及男女兩性，包括泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的感染和/或炎癥。例如，根據(jù)美國(guó)國(guó)家少兒健康和發(fā)育研究所(NICHD)的統(tǒng)計(jì)，“大多數(shù)女性一生中至少患過(guò)一種類(lèi)型的陰道炎?！薄蛾幍姥住?Vaginitis)，發(fā)表于《美國(guó)國(guó)家兒少健康和發(fā)育研究所-在線刊物》(National Institute of Child Health and HumanDevelopment-Publications On-line)，2000年1月12日修定，<http//www.nichd.nih.gov/publications/pubs/vagl.html>)。導(dǎo)致陰道炎的原因包括從細(xì)菌、真菌或病毒感染到乳液、噴霧或者貼身衣物所含的化學(xué)物質(zhì)的刺激。同樣地，對(duì)于有細(xì)菌和真菌感染的女性，這些感染因素經(jīng)常來(lái)自肛門(mén)區(qū)，從此處經(jīng)過(guò)會(huì)陰到達(dá)陰道或尿道。
常見(jiàn)的一類(lèi)陰道炎是念珠菌或酵母菌感染，主要由白色念珠菌感染引起。念珠菌屬于人體正常菌群，存在于皮膚、口腔和消化道(Robbins，《疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)》第五版(pathologic Basis ofDisease 5thed)，Saunders公司，費(fèi)城(1994)p.354)，女性陰道也可有少量存在。它們最適合的生長(zhǎng)環(huán)境是諸如陰道或口腔的溫暖潮濕環(huán)境。念珠菌通常不致病，但當(dāng)環(huán)境改變時(shí)，例如女性絕經(jīng)后、懷孕期、或應(yīng)激時(shí)發(fā)生體內(nèi)激素水平的改變，會(huì)過(guò)度繁殖造成酵母菌感染。此情況也可見(jiàn)于免疫抑制或身體機(jī)能受損的個(gè)體，如接受化療、服用免疫抑制劑的病人，或艾滋病患者。
目前對(duì)于念珠菌感染的治療包括非處方藥物，其活性成分如布康唑硝酸鹽(Femstat)、克霉唑(Gyne-Lotrimin及其它)、咪康唑(Monistat及其它)和噻康唑(Vagistat)。這些藥物作為陰道感染的局部用藥，可以裂解念珠菌的細(xì)胞壁。其它類(lèi)似的治療包括處方藥物，其活性成分來(lái)自與氟康唑(Diflucan)、三康唑(Terazol)和酮康唑(Nizoral)等同一系列。
雖然通常的觀點(diǎn)認(rèn)為陰道炎與念珠菌有關(guān)，但據(jù)NICHD的調(diào)查(《陰道炎》(Vaginitis))，實(shí)際上細(xì)菌性陰道炎是育齡婦女最常見(jiàn)的陰道感染疾病。陰道內(nèi)的細(xì)菌過(guò)度繁殖會(huì)導(dǎo)致與念珠菌性陰道炎相似的細(xì)菌性陰道炎，其治療藥物不同。
另一方面，男性陰莖也可以感染念珠菌，累及陰莖頭和包皮。陰莖頭包皮炎是陰莖頭和包皮的非特異性感染，由多種微生物引起，包括真菌(如念珠菌)和化膿性細(xì)菌(如葡萄球菌)(Robbins，《疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)》第五版(Pathologic Basis of Disease 5th ed).，Saunders公司，費(fèi)城(1994)p.1008)。
葡萄球菌為革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌，通常存在于人體的皮膚和其它粘膜。特別值得一提的是金黃色葡萄球菌，為毒性致病源，可以引起皮膚損傷、心內(nèi)膜炎、呼吸系統(tǒng)感染、食物中毒、甚至中毒性休克綜合征等多種病癥。對(duì)于采用高吸收性月經(jīng)棉條的女性而言，金黃色葡萄球菌可以在陰道內(nèi)形成菌落，并分泌一種稱(chēng)為中毒性休克綜合征毒素(TSST-1)的毒素。據(jù)FDA的統(tǒng)計(jì)，目前報(bào)導(dǎo)的大約半數(shù)中毒性休克綜合征病例與月經(jīng)期棉條關(guān)，多為年輕女性(《月經(jīng)棉條與石棉、二惡英以及中毒性休克綜合征》(Tampons andAsbestos，Dioxin，& Toxic Shock Syndrome)，F(xiàn)DA設(shè)備與放射健康中心(July 23，1999)，<http//www.fda.gov/cdrh/ocd/tamponsabs.html>)。
金黃色葡萄球菌感染一般用甲氧西林(methicillin)治療。此藥雖然很有效，但金黃色葡萄球菌的一些菌株已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性，只有少數(shù)抗生素能有效治療耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)。常用于治療MRSA的抗生素之一是萬(wàn)古霉素(vancomycin)。但是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素敏感性下降的金黃色葡萄球菌菌株(Khuishid，M.A.等，《對(duì)萬(wàn)古霉素敏感性下降的金黃色葡萄球菌》(Staphylococcus aureus with Reduced susceptibility to Vancomycin)，發(fā)表于伊利諾斯1999《發(fā)病率與死亡率周報(bào)》(Morbidity andMortality Weekly Report)，48(51)1165-1167(2000)，<http//www.cdc.gov/epo/mmwr/preview/mmwrhtml/mm4851al.htm>)。抗藥性菌株的出現(xiàn)使應(yīng)用其他方法用于治療細(xì)菌感染成為必要。
除真菌和細(xì)菌感染外，病毒性陰道炎也比較常見(jiàn)。此類(lèi)感染大多通過(guò)性交傳播，包括單純皰疹病毒(HSV)或人類(lèi)乳頭狀病毒(HPV)引起的感染。例如，HSV病毒，在生殖系統(tǒng)的入口處復(fù)制，也感染支配生殖器的神經(jīng)。為了躲避機(jī)體免疫系統(tǒng)，HSV病毒潛伏在這些神經(jīng)元中，在某些環(huán)境條件下活化，如應(yīng)激、免疫抑制、放射或病毒感染等。目前治療HSV感染的藥物包括阿昔洛韋(acyclovir)、法昔洛韋(famciclovir)、或伐昔洛韋(valacyclovir)等。
對(duì)于泌尿系統(tǒng)，根據(jù)美國(guó)醫(yī)藥協(xié)會(huì)的調(diào)查數(shù)據(jù)，泌尿道感染(UTIs)是促使就醫(yī)的最常見(jiàn)疾患之一(《女性健康》—《尿道感染治療的患者指導(dǎo)》(Women’s Health，Urinary Tract infectionsAPatient’s Guide to Treatment)，《在線健康信息-AMA健康透視》(AMA Health Insight，On-line Health Information for Everyone)，1998年10月30日更新，<http//www.ama-assn.org/insight/h_focus/wom_hlth/uti/uti.html>。此類(lèi)感染性疾患主要是由埃希氏大腸桿菌(E.coli.)引起，但念珠菌和葡萄球菌也有參與。同樣地，這些感染始于尿道，向膀胱發(fā)展引起膀胱炎。最后，病菌可沿輸尿管上行至雙腎，導(dǎo)致腎盂腎炎。男性和女性均可感染。
既然泌尿-生殖系統(tǒng)疾病不局限于單一病因，那么目前的治療就需要針對(duì)特定病因采用不同的藥物。當(dāng)然，要先確定病因。檢測(cè)病源需要時(shí)間，但更重要的是對(duì)女性要進(jìn)行婦科檢查以確定是否有特異感染因素存在。
隨著抗生素和其它藥物應(yīng)用的增加，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌這類(lèi)的微生物就越容易對(duì)目前所用藥物產(chǎn)生抗藥性。這樣，就持續(xù)需要新的廣譜抗菌藥物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明用于治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病，它的一個(gè)方面涉及的由單一或多種肽組成的用于泌尿生殖系統(tǒng)疾病的治療體系，其中多肽的氨基酸序列有KPV(序列號(hào)1號(hào))，MEHFRWG(序列號(hào)2號(hào))，HFRWGK(序列號(hào)3號(hào))，SYSMEHFRWGLPV(序列號(hào)4號(hào))。單個(gè)或多個(gè)多肽也可以通過(guò)上述氨基酸序列形成二聚體。泌尿生殖系統(tǒng)疾病包括感染、炎癥，或者二者兼有。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，泌尿-生殖系統(tǒng)疾病包括陰道、外陰、尿道、陰莖和/或直腸的感染和/或炎癥。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，單一或多種多肽溶于載體內(nèi)。在第三個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，一種或多種多肽與棉條結(jié)合，以避免中毒性休克綜合征。在第四個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，一種或多種多肽與避孕工具相結(jié)合，以防止性傳播疾病或感染。在第五個(gè)實(shí)施例中，一種或多種多肽與栓劑結(jié)合，以便于插入陰道或肛門(mén)。在本發(fā)明的第六個(gè)實(shí)施例中，一種或多種多肽溶于液體載體中，以用于陰道灌注。
圖1α-MSH和/或其衍生物對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)。
圖2α-MSH和/或其衍生物對(duì)尿激酶(UK)誘導(dǎo)的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響。
圖3α-MSH和/或其衍生物對(duì)白色念珠菌(C.albicans)生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)。
圖4α-MSH和/或其衍生物與氟康唑抗真菌活性的比較。
圖5A-5Dα-MSH和/或其衍生物對(duì)白色念珠菌芽管形成的抑制效應(yīng)。
圖6α-MSH和/或其衍生物抗念珠菌的強(qiáng)化中性粒細(xì)胞殺傷力的效應(yīng)。
圖7、8、9α-MSH和/或其衍生物抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的機(jī)制。
圖10-13α-MSH和/或其衍生物對(duì)慢性感染細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制和表達(dá)的抑制效應(yīng)。
圖14α-MSH和/或其衍生物抑制病毒復(fù)制、表達(dá)和活化的機(jī)制。
圖15α-MSH和/或其衍生物對(duì)急性感染細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制和表達(dá)的抑制效應(yīng)。
圖16用于本發(fā)明一方面的一種KPV二聚體形式的化學(xué)結(jié)構(gòu)示例。
具體實(shí)施例方式
以下所引用的文獻(xiàn)在此作為參考文獻(xiàn)。本發(fā)明是關(guān)于采用α-黑素細(xì)胞刺激素(α-MSH)和/或其衍生物治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病的一種方法和系統(tǒng)。α-MSH是經(jīng)典的由13個(gè)氨基酸組成的肽(序列號(hào)4號(hào))，由較大的前體分子——前黑阿皮素原經(jīng)翻譯后修飾產(chǎn)生。它與同是來(lái)自前黑阿皮素原的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的1-13氨基酸序列相同。許多種細(xì)胞均可分泌α-MSH，包括垂體細(xì)胞、單核細(xì)胞、黑素細(xì)胞和角化細(xì)胞。α-MSH可見(jiàn)于大鼠皮膚、人體表皮以及正常和垂體切除術(shù)大鼠消化道的粘膜屏障(可參閱Eberie，A.N.，《促黑激素》(The Melanotrophins)，瑞士巴塞爾Karger(1998)；Lipton，J.m.等，《α-MSH神經(jīng)免疫調(diào)質(zhì)的抗炎影響》(Anti-inflammatory influence of the Neuroimmunomodulator α-MSH)，《今日免疫學(xué)》(Immunol. Today)18，140-145(1997)；Thody，A.J.等，《α-MSH的免疫反應(yīng)性，在正常和垂體切除大鼠消化道的分布》(Immunoreactive α-Melanocyte Stimulating Hormone，Its Distribution in the Gastrointestinal Tract of Intact andHypophysectomized Rats)，《生命科學(xué)》(Life.Sci.)18，2127-2132(1981))。
現(xiàn)已知道α-MSH及其衍生物具有很強(qiáng)的解熱和抗炎特性，而且毒性極低。它可以降低宿主細(xì)胞的離體前炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，并且可以降低動(dòng)物炎癥模型的局部和全身反應(yīng)。例如，α-MSH的核心序列(4-10)(序列號(hào)2號(hào))具有學(xué)習(xí)和記憶行為效應(yīng)，但解熱和抗炎活性很低。相反，解熱和抗炎活性的活化信息序列位于α-MSH的C-末端氨基酸序列，即賴氨酸-脯氨酸-纈氨酸(“Lys-Pro-Val”或“KPV”)(序列號(hào)1號(hào))。此三肽在體和離體情況下與母體分子有相同的活性。α-MSH和/或其衍生物的抗炎活性在下述兩項(xiàng)專(zhuān)利有闡述，并包括在所列的參考中美國(guó)專(zhuān)利第5,028,592號(hào)，1991年7月2日提交于Lipton，J.M.，題為《Lys Pro Val解熱和抗炎成分及其使用方法》(Antipyretic and Anti-inflammatory Lys Pro ValCompositions and Method of Use)；美國(guó)專(zhuān)利第5,157,023號(hào)，1992年10月20日提交于Lipton，J.M.，題為《Lys Pro Val解熱和抗炎成分及其使用方法》(Antipyretic and Anti-inflammatory Lys Pro ValCompositions and Method of Use)。(參閱Catania，A.等，《α-MSH對(duì)宿主機(jī)體反應(yīng)的調(diào)節(jié)》(α-Melanocyte Stimulating Hormone in theModulation of Host Reactions)，《內(nèi)分泌綜述》(endocr.Rev.)14，564-576(1993)；Lipton，J.M.等，《α-MSH神經(jīng)免疫調(diào)質(zhì)的抗炎影響》(Anti-inflammatory influence of the Neuroimmunomodulatorα-MSH)，《今日免疫學(xué)》(Immunol.Today)18，140-145(1997)；Rajora，N.等，《α-MSH產(chǎn)生受體及其對(duì)新喋呤的影響，在人單核/巨噬細(xì)胞系》(α-MSH Production Receptors and Influence onNeopterin，in a human Monocyte/macrophage Cell Line)，《白血病生物學(xué)雜志》(J.Leukoc.Biol.)59，248-253(1996)；Star，R.A.等，《α-MSH對(duì)巨噬細(xì)胞一氧化氮合成酶自分泌調(diào)節(jié)的證明》(Evidence ofAutocrine Modulation of Macrophage Nitric Oxide Synthase by α-MSH)，Proc.Nat’l.Acad. Sci.(USA).92，8015-8020(1995)；Lipton，J.M.等，《神經(jīng)肽α-MSH在急慢性全身性炎癥的抗炎作用》(Anti-inflammatory Effects of the Neuropeptide α-MSH in AcuteChronic and systemic inflammation)，Ann.N.Y.Acad. Sci.741，137-148(1994)；Fajora，N.等，《α-MSH調(diào)節(jié)大腦炎癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷木植亢脱h(huán)腫瘤壞死因子-α》(α-MSH Modulation Local and CirculatingTumor Necrosis Factor αin Experimental Brain Inflammation)，《神經(jīng)科學(xué)雜志》(J. Neurosci.)17，2181-2186(1995)；Richards，D.B.等，《α-MSH(11-13)(lys-pro-val)對(duì)兔發(fā)熱的作用》(Effects ofα-MSH(11-13)(lysine-proline-valine)on Fever in the Rabbit)，《肽物質(zhì)》5，815-817(1984)；Hiltz，M.E.等，《神經(jīng)肽α-MSH COOH末端片斷的抗炎活性》(Anti-inflammatory of αCOOH-teminalFragment of the Neuropeptide α-MSH)，F(xiàn)ASEB雜志3，2282-2284(1989)。
除了抗炎和解熱功能外，本發(fā)明的另一方面涉及α-MSH和/或其衍生物的抗微生物和抗感染活性。如下所述，α-MSH和/或其衍生物有重要的抗感染用途，包括如下的應(yīng)用降低微生物生存力，降低酵母菌長(zhǎng)芽，在不損害中性粒細(xì)胞對(duì)微生物的殺傷能力的情況下殺傷微生物，治療與微生物感染有關(guān)的炎癥而不降低微生物的殺傷力，增加微生物細(xì)胞內(nèi)cAMP的積累，抑制病毒性致病源的復(fù)制與表達(dá)。
在本發(fā)明的首選實(shí)施例中，這些抗微生物或抗感染活性最主要與C-末端氨基酸序列-KPV有關(guān)。此三肽與α-MSH及其衍生物在很大濃度范圍內(nèi)均有效，包括通常存在于人體漿液的皮摩爾濃變。
正如在技術(shù)背景部分中所討論的，泌尿生殖系統(tǒng)疾病并不局限于單一病因。從細(xì)菌、真菌到病毒在內(nèi)的多種微生物和感染因素可以單獨(dú)或聯(lián)合引起多種病癥，包括陰道炎、外陰炎、尿道炎、陰莖頭包皮炎、念珠菌病、行傳播疾病以及中毒性休克綜合征。α-MSH和/或其衍生物可局部用于上述疾病狀態(tài)的感染和/或炎癥部位以達(dá)到治療目的，可利用現(xiàn)有技術(shù)的施藥方法。例如，α-MSH及其衍生物可以溶于一些溶液中，諸如磷酸鹽緩沖液、透明質(zhì)酸、甲基纖維素、羧甲基纖維素或乙醇。還可以用一般的載體，如油膏、油脂、膠體、可溶性彈丸、氣溶膠噴霧、栓劑、灌注所用液體溶劑或者具吸收性的物質(zhì)，攜帶α-MSH和/或其衍生物作為活性成分治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病。這些載體可用敷料器施用于感染或炎癥部位，敷料器可以是注射器或類(lèi)注射器式的器具、繃帶、導(dǎo)管、帶活塞的管子、涂藥用抹刀或其它類(lèi)型的平面敷料器、避孕套、海綿、棉簽、或手指。
更明確地說(shuō)，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例是將α-MSH和/或其衍生物溶于以液體基底的載體。然后將溶有α-MSH和/或其衍生物的載體儲(chǔ)存于密封加壓箱內(nèi)。打開(kāi)釋放閥門(mén)或通過(guò)其它方式將載體從密封加壓箱內(nèi)釋放時(shí)，會(huì)形成氣溶膠泡沫并被裝進(jìn)注射器和注射器類(lèi)的器具。接著，注射器部分插入陰道，其內(nèi)容物也就釋放入陰道腔內(nèi)。注射器或注射器類(lèi)的器具及其開(kāi)口也可以有不同的大小、形狀和長(zhǎng)度，以插入不同的泌尿生殖區(qū)，如尿道或肛門(mén)。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例為包含載體的栓劑。此載體如膠體或甘油在常溫下為固體或半固體，但是插入陰道或肛門(mén)后在體溫下便融化。載體融化后，攜帶所溶的α-MSH和/或其衍生物至泌尿生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)病部位。
我們采用油脂、油膏、膠體、噴霧、泡沫材料或止痛香膏等形式將α-MSH和/或其衍生物涂于外陰、陰莖頭和陰莖包皮等外生殖器部分。其組分為本技術(shù)領(lǐng)域所熟知。
在本發(fā)明的另一方面，還可以在棉條的生產(chǎn)加工過(guò)程中用α-MSH和/或其衍生物進(jìn)行處理。這樣棉條中存在α-MSH和/或其衍生物，可以抑制分泌中毒性休克綜合征(TSST-1)的微生物的生長(zhǎng)，如金黃色葡萄球菌。此種棉條的加工處理技術(shù)為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)所熟知。采用α-MSH和/或其衍生物處理的棉條吸收性材料進(jìn)行治療，一種方法是將棉條的吸收性材料浸泡于含有α-MSH和/或其衍生物的溶液，然后予以干燥。可供選擇的另一種方法，是將α-MSH以干燥粉末形式噴灑到棉條的吸收性材料上。
在本發(fā)明的另一方面，α-MSH和/或其衍生物可通過(guò)避孕工具轉(zhuǎn)運(yùn)至感染部位，這些避孕工具包括避孕套、隔膜、海綿或其它用于防止懷孕或性傳播疾病的屏障型工具。α-MSH和/或其衍生物可溶于避孕套所用的潤(rùn)滑劑以及與隔膜共同使用的膠質(zhì)或泡沫材料，或者溶于與避孕套、隔膜或海綿共用的任何類(lèi)型的殺精子溶液。
在本發(fā)明的另一方面，α-MSH和/或其衍生物可溶于灌注用的液體。這些液體可以通過(guò)灌注被轉(zhuǎn)運(yùn)至陰道以治療感染和/或炎癥。
下述實(shí)施例闡明了α-MSH和/或其衍生物抗感染的效力及其應(yīng)用。實(shí)施例中所用的微生物學(xué)、分子生物學(xué)以及細(xì)胞培養(yǎng)的方法沒(méi)有在文中詳細(xì)說(shuō)明，但在科研文獻(xiàn)中有大量的報(bào)導(dǎo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些方法。
下述實(shí)施例中所用的肽類(lèi)包括α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))、(4-10)(序列號(hào)002號(hào))、(6-13)(序列號(hào)003號(hào))、和(11-13)(序列號(hào)1號(hào))，均有乙?；腘末端和酰胺化的C末端，以及促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH(1-39)和(18-39)(CLIP)。這些肽類(lèi)由固相肽合成方法制備，經(jīng)保留相的高效液相色普法純化。部分實(shí)施例還包括氨基酸序列CKPV(序列號(hào)8號(hào))的二聚體(KPV二聚體)，此二聚體同樣也有乙?；腘末端和酰胺化的C末端。圖16顯示了KPV二聚體的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在上述任意一種多肽的N末端加半胱氨酸，并使兩個(gè)多肽的半胱氨酸形成二硫鍵，即可得到二聚體。同源二聚體和異源二聚體均可由此方法獲得。
下述實(shí)施例中所闡述的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義采用方差的單因素分析和斯氏t檢驗(yàn)。概率大于0.05被認(rèn)為是有顯著性差異的。
實(shí)施例I本實(shí)施例目的在于闡明α-MSH和/或其衍生物的抗微生物特性，這里選取金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為例。
金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物(ATCC 29213)由Ospedale Maggiore diMilano微生物學(xué)系提供。金黃色葡萄球菌(于Hank平衡鹽溶液中1×106/毫升)在α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))、α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))或KPV二聚體存在或缺如的情況下，37℃培養(yǎng)2小時(shí)，肽的濃度為10-15-10-4M。隨后細(xì)胞在冷蒸餾水中沖洗，并用HBSS稀釋至100個(gè)生物體/毫升。將-微升的等分試樣涂于血漿瓊脂板，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。然后根據(jù)所形成的菌落評(píng)估微生物的生存力。另一實(shí)驗(yàn)中是在細(xì)菌濃度為105/100毫升的培養(yǎng)液中加入不同的肽段和500單位的尿激酶(金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)促進(jìn)劑)，并且在37℃水浴中振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。
圖1表明α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))、α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))和KPV二聚體均抑制金黃色葡萄球菌菌落的形成。此抑制效應(yīng)在很大濃度范圍內(nèi)均可發(fā)生，并在10-12-10-4M的濃度范圍內(nèi)有顯著性差異(p＞0.01)。圖2說(shuō)明了濃度為10-6摩爾/升的α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))和α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))明顯抑制尿激酶的生長(zhǎng)促進(jìn)作用。這樣，α-MSH或其衍生物可以抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，此細(xì)菌會(huì)引起中毒性休克綜合癥，該病征與月經(jīng)棉條使用、陰道炎、泌尿道感染、以及陰莖頭包皮炎有關(guān)。
實(shí)施例II本實(shí)施例的目的在于闡明α-MSH和/或其衍生物的抗真菌特性，這里選取的實(shí)驗(yàn)菌株是白色念珠菌(Candida albicans)。
白色念珠菌的臨床隔離株由Ospedale Maggiore di Milano微生物學(xué)系提供。白色念珠菌的培養(yǎng)在沙氏瓊脂斜面板上進(jìn)行，并周期性地轉(zhuǎn)移到沙氏瓊脂板上，28℃培養(yǎng)48小時(shí)。為了制備靜止期酵母菌，從瓊脂板上挑取菌落，將其轉(zhuǎn)移到30毫升沙氏葡糖液體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)72小時(shí)。將所得細(xì)胞以1000xg離心10分鐘，用蒸餾水沖洗沉積細(xì)胞兩次。然后計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，并懸浮于Hank平衡鹽溶液(HBSS)中至需要的濃度。通過(guò)0.01％的甲基藍(lán)外排實(shí)驗(yàn)，以此確定細(xì)菌的生存力。結(jié)果顯示其生存能力大于98％。
在HBSS中密度為1×106/毫升時(shí)，這些真菌在α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))、α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))或KPV二聚體存在或缺如的情況下，37℃培養(yǎng)2小時(shí)，肽的濃度為10-15-10-4M。隨后用冷蒸餾水沖洗細(xì)胞，并用HBSS稀釋至100個(gè)生物體/毫升。將一毫升的等分樣品涂于血漿瓊脂板上，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。微生物的生存力根據(jù)所形成的菌落估計(jì)。
圖3表明α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))、α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))和KPV二聚體在10-12-10-4M濃度范圍內(nèi)均抑制白色念珠菌菌落形成的能力(與對(duì)照相比p＜0.01)。此結(jié)果說(shuō)明，α-MSH或其衍生物能夠抑制白色念珠菌的生長(zhǎng)，此真菌是已知導(dǎo)致念珠菌病、陰道炎、尿道炎和陰莖頭包皮炎的因素。
實(shí)施例III本實(shí)施例的目的在于比較α-MSH和/或其衍生物與氟康唑(fluconazole)的抗菌活性，后者是已被承認(rèn)的抗真菌藥物。
檢測(cè)α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))、(4-10)(序列號(hào)2號(hào))、(6-13)(序列號(hào)3號(hào))、(11-13)(序列號(hào)1號(hào))和ACTH(1-39)、(18-39)以及氟康唑在10-6-10-4M濃度下的抗白色念珠菌的能力，方法同實(shí)施例II。圖4表明，與氟康唑相比，α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))、(4-10)(序列號(hào)2號(hào))、(6-13)(序列號(hào)3號(hào))和(1-13)(序列號(hào)4號(hào))抗白色念珠菌是非常有效的，其抑制活性與等摩爾濃度的氟康唑是類(lèi)似的。相比之下，具有行為效應(yīng)但極少抗炎活性的核心α-MSH序列(4-10)(序列號(hào)2號(hào))產(chǎn)生了近50％的對(duì)菌落形成單位抑制效應(yīng)。雖然此抑制效應(yīng)具有顯著性(與對(duì)照相比p＜0.01)，但是明顯弱于含有KPV信號(hào)序列的α-MSH片斷，這些KPV信號(hào)序列包括α-MSH(6-13)(序列號(hào)3號(hào))、(11-13)(序列號(hào)1號(hào))(p＜0.01)，或者母體分子α-MSH(1-13)(p＜0.05)。圖4也表明ACTH(1-39)及其片斷(18-39)不能降低白色念珠菌的生存力。甚至在10-4M濃度下(圖中未顯示)，ACTH肽段也同樣無(wú)效。
由此本實(shí)施例說(shuō)明α-MSH或其衍生物在抑制白色念珠菌生長(zhǎng)方面與氟康唑同樣有效。
實(shí)施例IV本實(shí)施例的目的在于闡明α-MSH及其衍生物對(duì)白色念珠菌出芽或芽管形成的抑制作用。芽管形成是白色念珠菌感染發(fā)病機(jī)理的重要方面，包括粘附于宿主上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程，從橢圓形的芽生孢子到各種絲狀體的形態(tài)轉(zhuǎn)變，如芽管、假菌絲、菌絲。(Gow，N.A.，《白色念珠菌芽管的生長(zhǎng)》(Germ Tube Growth of Candidaalbicans)，《當(dāng)代醫(yī)學(xué)真菌話題》(Curr.Topics Med.Myco.)8，43-55(1997))。
蒸餾水沖洗培養(yǎng)所得的靜止期白色念珠菌兩次，然后將菌體懸浮于HBSS中，密度為2×106/毫升。于此菌液中加入10％的滅活馬血清(由英國(guó)Paisley GIBCO/BRL提供)，37℃振蕩培養(yǎng)45分鐘，可以誘導(dǎo)白色念珠菌菌絲的生長(zhǎng)。HBSS沖洗菌體兩次以去除馬血清，然后在濃度為10-6M的α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))、(6-13)(序列號(hào)3號(hào))或(11-13)(序列號(hào)1號(hào))存在的條件下，37℃繼續(xù)培養(yǎng)60分鐘，并不斷振蕩。采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算出絲狀菌體的百分比。此實(shí)驗(yàn)以重復(fù)三次，至少計(jì)數(shù)了200個(gè)細(xì)胞。采用裝配在Axioskop Zeiss顯微鏡上的MC100相機(jī)拍攝顯微照片。
圖5A至5D表明α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))或(11-13)(序列號(hào)1號(hào))可以抑制由馬血清誘導(dǎo)的白色念珠菌芽管形成。α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))使絲狀菌體數(shù)目降低28-32％，α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))導(dǎo)致絲狀菌體數(shù)目降低54-58％。雖然圖中未顯示，α-MSH(6-13)(序列號(hào)3號(hào))同樣可以引起絲狀菌體數(shù)目降低近50％。由此說(shuō)明α-MSH或其衍生物通過(guò)抑制芽管形成可以抑制念珠菌發(fā)病機(jī)理的一種模式。
實(shí)施例V對(duì)病原體殺傷力的降低是感染期間應(yīng)用皮質(zhì)類(lèi)固醇和其它非甾體類(lèi)消炎藥物治療的負(fù)面作用(Stevens，D.L.，《非甾體類(lèi)消炎藥物(NSAIDs)是否能促進(jìn)細(xì)菌性感染發(fā)展為中毒性休克綜合征》(Could Nonsteriodal Anti-inflammatory Drugs(NSAIDs)EnhanceProgression of Bacterial Infections to Toxic Shoc Syndrome？)，《臨床感染性疾病》(Clin.Infect.Dis.)21，977-80(1997)；Capsoni，F(xiàn).等，《皮質(zhì)類(lèi)固醇對(duì)中性粒細(xì)胞功能的影響抑制抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)》(Effect of Corticosteriods on NeutrophilFunctionInhibition of Antibody-dependent Cell-MediatedCytotoxicity(ADCC))，《免疫藥理學(xué)雜志》(J. Immunopharmacol.)5，217-30(1983))。本實(shí)施例闡明α-MSH和/或其衍生物抑制感染源的生長(zhǎng)，而且不降低中性粒細(xì)胞抗感染的能力。本實(shí)施例進(jìn)一步表明α-MSH和/或其衍生物確實(shí)可以增強(qiáng)中性粒細(xì)胞殺傷感染源的能力。
來(lái)自健康志愿者的靜脈血(20毫升)肝素抗凝處理后，加入右旋糖苷沉淀劑并采用Ficoll-Hypaque(購(gòu)于美國(guó)密蘇里州圣路易斯的Sigma化學(xué)制劑公司)離心機(jī)離心分離中性粒細(xì)胞。低滲休克下紅細(xì)胞溶解，中性粒細(xì)胞則至少占細(xì)胞懸浮液的97％。由胎盤(pán)蘭排除法得到的細(xì)胞生存力大于98％。中性粒細(xì)胞再懸浮于HBSS中，以用于實(shí)驗(yàn)。
將白色念珠菌(1×106)與AB型血清置于37℃振蕩水浴中調(diào)理30分鐘。隨后，在單純培養(yǎng)基上或含有濃度為10-15-10-4M的α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))或α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))培養(yǎng)基上與中性粒細(xì)胞一起培養(yǎng)，于振蕩水浴中37℃培養(yǎng)2小時(shí)。2小時(shí)后，將培養(yǎng)管置于冰上以中斷生長(zhǎng)，沖洗細(xì)胞外生物體兩次，并4℃離心(1000xg)。于懸浮液中加入2.5％的脫氧膽酸鈉溶液，振蕩試管5分鐘。然后加入冷蒸餾水得到密度為106個(gè)細(xì)胞/毫升的菌液，再在HBSS中按1/100地比例依次稀釋兩次，從而得到密度為100個(gè)細(xì)胞/毫升的菌液。從此菌液中取一毫升的等分樣品涂于血瓊脂板，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。48小時(shí)后選取三分之一計(jì)數(shù)菌落形成單位，并采用五個(gè)不同個(gè)體來(lái)源的血漿重復(fù)計(jì)數(shù)。
圖6表明α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))和(11-13)(序列號(hào)1號(hào))在10-12-10-4M濃度范圍內(nèi)(p＜0.01)確實(shí)能夠增強(qiáng)中性粒細(xì)胞對(duì)白色念珠菌的殺傷力。同時(shí)圖6表明它們?cè)诤艽蟮臐舛确秶鷥?nèi)都可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的殺傷力，即使是在相當(dāng)于人血漿α-MSH濃度的皮摩爾濃度條件下。
由此本實(shí)施例說(shuō)明α-MSH或其衍生物可以同時(shí)抗感染和炎癥，此特性也適用于念珠菌病、陰道炎、尿道炎、陰莖頭包皮炎或痔瘡。
實(shí)施例VI本實(shí)施例提示α-MSH和/或其衍生物的抗微生物特性的一般細(xì)胞機(jī)制，以及抗真菌特性的特殊機(jī)制。
經(jīng)甲苯/乙醇滲透作用的白色念珠菌(106/毫升)，在10-6M濃度的α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))、(11-13)(序列號(hào)1號(hào))或毛喉萜(forskolin)(已知能夠增加細(xì)胞內(nèi)cAMP)存在或缺失的條件下，37℃下振蕩培養(yǎng)。三分鐘后加入用冰冷卻的乙醇以中止反應(yīng)。cAMP水平由市售酶免疫試劑盒(購(gòu)于英國(guó)Amersham)測(cè)定兩次，在測(cè)定之前根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明通過(guò)液相方法對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行抽提。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，白色念珠菌暴露于濃度為25、50和1×10-5M的雙脫氧腺苷(ddAdo，Sigma)2小時(shí)，再與α-MSH或其衍生物作用2小時(shí)。雙脫氧腺苷是蛋白抑制劑，抑制腺苷酸環(huán)化酶。采用與實(shí)施例II相同的方法測(cè)定毛喉萜和雙脫氧腺苷對(duì)白色念珠菌菌落形成的影響。
圖7表明α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))和(11-13)(序列號(hào)1號(hào))可提高白色念珠菌內(nèi)cAMP含量，其cAMP的增加量與等摩爾毛喉萜誘導(dǎo)的增加量的數(shù)量級(jí)相同。圖8顯示與α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))和(11-13)(序列號(hào)1號(hào))一樣，毛喉萜也明顯抑制白色念珠菌生長(zhǎng)(與對(duì)照相比p＜0.01)。圖9表明雙脫氧腺苷能過(guò)扭轉(zhuǎn)α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))和(11-13)(序列號(hào)1號(hào))對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)的影響。
本實(shí)施例說(shuō)明α-MSH及其衍生物抑制白色念珠菌和其它微生物生長(zhǎng)的作用最可能是通過(guò)增加cAMP水平實(shí)現(xiàn)的，cAMP含量的提高抑制mRNA和蛋白合成(參閱Bhattacharya A.等，《cAMP對(duì)白色念珠菌RNA和蛋白合成的作用》(Effect of Cyclic AMP on RNAand Protein Synthesis in Candida albicans)，《生化與生理研究通訊》(Biochem.Biophysics.Res.Commun.)771483-44(1997))。
實(shí)施例VIII本實(shí)施例闡明α-MSH或其衍生物抑制人體細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制的能力，或者更確切地說(shuō)，闡明α-MSH抑制慢性感染的人單核細(xì)胞內(nèi)HIV-1病毒的復(fù)制和表達(dá)。
HIV-1慢性感染的幼單核細(xì)胞U1細(xì)胞系是潛伏型單核細(xì)胞HIV感染的體外模型。這些細(xì)胞攜帶兩套整合的HIV原病毒拷貝，HIV的基本表達(dá)較低。但是，根據(jù)RNA轉(zhuǎn)錄、p24抗原或逆轉(zhuǎn)錄酶釋放等測(cè)定的病毒復(fù)制可以被不同的刺激活化，如TNF-α、IL-6、IL-10、PMA或細(xì)胞擁擠狀態(tài)。
上述細(xì)胞置于由完全培養(yǎng)基(含有10毫摩爾Hepes的RPMI1640培養(yǎng)基)、包含2毫摩爾L-谷氨酸(Sigma-Aldrich)、10％熱滅活的FCS(美國(guó)猶他州Logan的Hyclone實(shí)驗(yàn)室提供)、100單位/毫升的青霉素和100微克/毫升的鏈霉素(紐約，Grand Island，Gibco實(shí)驗(yàn)室提供)，組成的培養(yǎng)基中維持對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，以觀察α-MSH和/或其衍生物對(duì)HIV復(fù)制的影響。首次的試驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)用來(lái)確定上述培養(yǎng)條件下的最佳細(xì)胞密度、刺激物濃度HIV-1 p24抗原生成的動(dòng)力學(xué)。在使用前，用HBSS沖洗細(xì)胞三次以去除細(xì)胞外病毒。然后在濃度為10-15-10-4摩爾范圍的α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))或(11-13)(序列號(hào)1號(hào))存在或缺乏的條件下，將細(xì)胞以2×105/毫升的密度(1毫升的最終體積)鋪于24孔的平底培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿中只有培養(yǎng)基或加入TNF-α(10毫微克/毫升)(英國(guó)英格蘭牛津R&D系統(tǒng)提供)。
在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，U1細(xì)胞中單獨(dú)加入濃度為10-5M的α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))，這些細(xì)胞是經(jīng)過(guò)TNF-α(10毫微克/毫升)、IL-6(20毫微克/毫升)、IL-10(20毫微克/毫升)(英國(guó)英格蘭牛津的R&D系統(tǒng)提供)、PMA(1毫微克/毫升)(Sigma-Aldrich)或細(xì)胞擁擠刺激的。將密度為2×105/毫升的U1細(xì)胞在37℃、5％CO2的條件下不更換培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，細(xì)胞即可達(dá)到擁擠狀態(tài)。由細(xì)胞因子或PMA激活的培養(yǎng)只能持續(xù)48小時(shí)。然后離心以分離上清液，采用市售ELISA試劑盒(美國(guó)紐約Buffalo的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn))檢測(cè)p24抗原，采用市售逆轉(zhuǎn)錄酶ELISA反向分析試劑盒(瑞典Lund Innovagen生產(chǎn))檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶的釋放。對(duì)于所有這些實(shí)驗(yàn)，在第一天加入α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))，每一種條件下的結(jié)果的測(cè)定均重復(fù)三次。
圖10表明α-MSH(1-13)(序列號(hào)4號(hào))和(11-13)(序列號(hào)1號(hào))在較大濃度范圍內(nèi)明顯抑制TNF-α刺激的U1細(xì)胞的p24抗原釋放。對(duì)于上述二種肽最有效的濃度均是10-5M，分別產(chǎn)生52.7％和56.0％的抑制效應(yīng)。圖11表明α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))也抑制IL-6、IL-10、PMA或細(xì)胞擁擠狀態(tài)誘導(dǎo)的U1細(xì)胞的p24抗原和逆轉(zhuǎn)錄酶釋放。此外，圖12表明，根據(jù)Northern印記分析的測(cè)定結(jié)果，α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))還可以抑制PMA刺激的U1細(xì)胞的剪切和未剪切HIV-1RNA的轉(zhuǎn)錄。
由此本實(shí)施例說(shuō)明α-MSH或其衍生物能夠抑制由TNF-α、IL-6和IL-10途徑誘導(dǎo)的病毒基因的轉(zhuǎn)錄。
實(shí)施例VIII本實(shí)施例進(jìn)一步闡明了α-MSH抑制病毒復(fù)制和活化的能力，或者更確切地說(shuō)，闡明了向U1細(xì)胞中加入α-MSH的中和性抗體明顯增加p24抗原的釋放。
U1細(xì)胞的培養(yǎng)方法與實(shí)施例VII中所述的類(lèi)似。采用親和純化的兔抗α-MSH抗體(瑞典，Malmo，Euro-Diagnostica提供)阻斷U1細(xì)胞內(nèi)源性α-MSH的產(chǎn)生，此抗體對(duì)介質(zhì)以1∶250稀釋。對(duì)照抗體選用同等稀釋度的兔IgG。抗α-MSH抗體和對(duì)照抗體處理的細(xì)胞(2×105/毫升)在培養(yǎng)基或PMA(1毫微克/毫升)中共同培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)48小時(shí)后，分離上清液并檢測(cè)p24抗原的釋放。在擁擠狀態(tài)實(shí)驗(yàn)中，U1細(xì)胞的培養(yǎng)同上述方法，抗α-MSH抗體和對(duì)照IgG在第一天加入，第七天收集上清液。
圖13表明在靜止?fàn)顟B(tài)、PMA誘導(dǎo)狀態(tài)、或U1細(xì)胞擁擠狀態(tài)，阻斷α-MSH會(huì)明顯增加p24抗原的釋放。本實(shí)施例強(qiáng)有力地提示病毒復(fù)制受α-MSH的影響。
實(shí)施例IX本實(shí)施例闡明了α-MSH和/或其衍生物抑制病毒復(fù)制和表達(dá)的機(jī)制，或者更確切地說(shuō)，闡明了α-MSH或其衍生物抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化和結(jié)合的機(jī)制。
取20×106個(gè)U1細(xì)胞(在完整培養(yǎng)基中密度為2×105/毫升)制備核提取物，以測(cè)定NF-κB活性水平，其中U1細(xì)胞先在濃度為10-5M的α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))存在或缺失的條件下用TNF-α(20毫微克/毫升)刺激4小時(shí)。用冷PBS沖洗細(xì)胞一次，緩沖液A(10毫摩爾Hepes(pH7.9)，1.5毫摩爾MgCl2，10毫摩爾KCl，0.5毫摩爾PMSF和0.5毫摩爾DTT)沖洗兩次，離心，置于冰上，在加入0.1％NP-40的緩沖液A中培養(yǎng)10分鐘。隨后，棄去上清液，核碎片懸浮于15微升的緩沖液C(20毫摩爾Hepes(pH7.9)，1.5毫摩爾MgCl2，0.42摩爾KCl，0.2毫摩爾EDTA，25％甘油，0.5毫摩爾PMSF和0.5毫摩爾DTT)中，冰上培養(yǎng)15分鐘，混勻，離心。用75微升標(biāo)定的緩沖液D(20毫摩爾Hepes(pH7.9)，0.05毫摩爾KCl，0.2毫摩爾EDTA，20％甘油，0.5毫摩爾PMSF和0.5毫摩爾DTT)稀釋上清液，-80℃保存。結(jié)合反應(yīng)于室溫下進(jìn)行10分鐘，反應(yīng)體系中含有10微克核提取蛋白和0.5毫微克32P標(biāo)記的NF-κB(30,000cpm/微升)或者AP1混合于緩沖液A(12毫摩爾Tis-HCl(pH7.8)，60毫摩爾KCl，0.2毫摩爾EDTA和0.3毫摩爾DTT)，再加入10％甘油、2微克/毫升牛血清白蛋白和1微克/毫升單鏈DNA(Pharmacia Biotech)。此研究中用于NF-κB的寡核苷酸有+GAT CCA AGG GGA CTT TCC GCTGGG GAC TTT CCA TG，和-GAT CCA TGG AAA GTC CCC AGCGGA AAG TCC CCT TG。每一個(gè)寡核苷酸退火與其互補(bǔ)結(jié)合，并且用多聚核苷酸酶在末端標(biāo)記32P-γ-ATP。為了確定特定鏈，在與標(biāo)記探針溫浴之前，核提取物先與100倍過(guò)量的未標(biāo)記探針溫浴五分鐘。然后，混合物在1x TBE條件下，于5％(30∶1)聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，再將凝膠干燥，進(jìn)行放射自顯影。
圖14表明TNF-α明顯增強(qiáng)NF-κB的結(jié)合活性，但是與濃度為10-5M的α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))共同培養(yǎng)明顯降低NF-κB的活化。但是α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))并不改變靜止細(xì)胞NF-κB的活化。此現(xiàn)象說(shuō)明α-MSH和/或其衍生物通過(guò)調(diào)控NF-κB的結(jié)合而抑制病毒復(fù)制和表達(dá)。
病毒物質(zhì)的復(fù)制通常依賴被感染細(xì)胞的活化狀態(tài)，受病毒和宿主的相互作用調(diào)控。這些宿主因素可能包括TNF-α和其它細(xì)胞因子，如白介素。與HIV-1感染和活化類(lèi)似，單純皰疹病毒(HSV)在宿主細(xì)胞因子作用下也可以從潛伏狀態(tài)活化。例如，TNF-α和IL-6，但不包括IL-1和IL-3，已經(jīng)確定可以活化HSV感染。用抗IL-6抗體中和IL-6可明顯抑制HSV的活化，相比之下中和α或β干擾素卻沒(méi)有影響。(參閱Baker，M.等，《白介素-6和單純皰疹病毒1型的關(guān)系對(duì)行為和免疫病理的提示》(The Relationshipbetween Interleukin-6 and Herpes Simple virus Type-1Implications forBehavior and Immunopathology)，《大腦行為免疫》(BrainBehav.Immunol.)13(3)201-11(1999)；Noisakran S.等，《體外移植的潛伏感染的三叉神經(jīng)節(jié)中HSV-1活化過(guò)程中淋巴細(xì)胞延遲動(dòng)力學(xué)》(Lymphocytes Delay Kinetics of HSV-1 Reactivation fromin vitro Explanes of Latent Infected Trigeminal Ganglia)，《神經(jīng)免疫學(xué)雜志》(J. Neuroimmunol.)95(1-2)126-35(1999)；Walev，I.等，《TNF-α對(duì)小鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)潛伏單純皰疹病毒的復(fù)活和復(fù)制的增強(qiáng)作用》(Enhancement by TNF-α of Reactivation andReplication of Latent Herpes Simplex Virus from Trigeminal Ganglia ofMice)，《病毒學(xué)文獻(xiàn)》(Arch. Virol.)140(6)987-92(1995)；Domk-Optize，I.等，《內(nèi)源性毒素刺激巨噬細(xì)胞導(dǎo)致持續(xù)單純皰疹病毒感染的復(fù)活》(Stimulation of Macrophages by Endotoxin Results inthe Reactivation of a Persistent Herpes Simplex Virus Infection)，《斯堪的納維亞免疫雜志》(Scand.J.Immunol.)32(2)69-75(1990)；Fauci，A.S.，《HIV所致疾病發(fā)病機(jī)理中宿主因子的作用》(HostFactors in the Pathogenesis of HIV-induced Disease)，《自然》(Nature)384529(1996))。
TNF-α或包括HSV在內(nèi)的病毒感染可以導(dǎo)致IκB的靶向損害，后者又可活化NF-κB的核轉(zhuǎn)位。核轉(zhuǎn)位促進(jìn)NF-κB與DNA操縱子的結(jié)合，從而促進(jìn)大量炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，包括TNF-α、IL-6和其它細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子的表達(dá)又進(jìn)一步復(fù)活其它HSV感染的細(xì)胞以產(chǎn)生HSV病毒(參閱Patel，A.等，《單純皰疹病毒I型對(duì)持續(xù)NF-κB核轉(zhuǎn)位的誘導(dǎo)提高病毒復(fù)制的效率》(HerpesSimplex Virus Type-1 Induction of Persistent NF-κB NuclearTranlocation Increases the Efficiency of Virus Replication)，《病毒學(xué)》(Virology)247(2)212-22(1998))。
因此，α-MSH和/或其衍生物通過(guò)阻斷NF-κB的結(jié)合抑制更多活化HSV的炎癥性細(xì)胞因子的表達(dá)。本實(shí)施例以及實(shí)施例VII-VIII表明α-MSH和/或其衍生物抑制病毒復(fù)制、表達(dá)和復(fù)活，此作用是通過(guò)抑制機(jī)體細(xì)胞因子或其它病毒感染誘發(fā)的NF-κB的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。
實(shí)施例X本實(shí)施例闡明α-MSH和/或其衍生物抑制急性感染人體細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制的能力，或者更確切地說(shuō)，闡明α-MSH抑制實(shí)際感染的人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)內(nèi)HIV-1復(fù)制和表達(dá)的能力。
采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離來(lái)自正常個(gè)體的PBMCs。單核細(xì)胞由Percoll梯度分離，然后選取24孔組織培養(yǎng)板，在加入20％FCS的RPMI完全培養(yǎng)基內(nèi)使其分化7天，成為巨噬細(xì)胞(MDM)，細(xì)胞密度為106/毫升。用嗜單核細(xì)胞的HIVBα-1株(1∶10)感染MDM，過(guò)夜。未稀釋的病毒群包含107個(gè)感染單位/毫升。24小時(shí)后，沖洗MDM并將其重新懸浮于完整介質(zhì)中。一周更換三次，連續(xù)三周。采用市售ELISA Retrosys RT試劑盒(瑞典lund Innovagen生產(chǎn))，感染后每周測(cè)定反轉(zhuǎn)錄酶的釋放量。HIV感染時(shí)及其后的每一天加入10-5M的α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))，直到最后采樣。
圖15表明α-MSH明顯抑制急性感染的MDM中逆轉(zhuǎn)錄酶的釋放。此抑制效應(yīng)在第6天更顯著，但第21天仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
由此本實(shí)施例說(shuō)明感染部位的病毒復(fù)制可以被α-MSH和/或其衍生物抑制。所以，通常性傳播疾病，尤其是HIV，可以通過(guò)α-MSH和/或其衍生物與避孕工具的結(jié)合運(yùn)用而被抑制，避孕工具如用于性交的避孕套、隔膜、海綿和/或性交后所用的含α-MSH和/或其衍生物的栓劑、油脂、油膏、凝膠或氣溶膠泡沫。
實(shí)施例XI本實(shí)施例闡明α-MSH和/或其衍生物的生物學(xué)功能相當(dāng)物。
雖然這里所述特定氨基酸序列是有效的，但對(duì)于熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，很容易做到替換或去除氨基酸而不改變肽類(lèi)的有效性。進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，α-MSH序列的穩(wěn)定可以大幅度提高肽類(lèi)活性，替換D-氨基酸構(gòu)型為L(zhǎng)型可以提高或降低肽類(lèi)活性。例如，α-MSH的穩(wěn)定類(lèi)似物，[Nle4，D-Phe7]-α-MSH，其解熱作用是母體肽分子大約10倍有余。此物質(zhì)已知對(duì)黑素細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞有明顯的生物學(xué)活性。確切地說(shuō)，在α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))的C-末端加入氨基酸能夠降低或加強(qiáng)解熱效應(yīng)。加入甘氨酸形成10-13序列(序列號(hào)5號(hào))，可以略微減弱其效應(yīng)；形成9-13序列(序列號(hào)6號(hào))，幾乎無(wú)解熱作用；而8-13序列(序列號(hào)7號(hào))的解熱效應(yīng)強(qiáng)于11-13序列(序列號(hào)1號(hào))。已知Ac-[D-K11]-α-MSH11-13-NH2具有和α-MSH(11-13)(序列號(hào)1號(hào))的L型三肽相同的總體效應(yīng)。但是在三肽的12位以D-脯氨酸替換將導(dǎo)致其活性的喪失(參閱Holdeman，M.等，《一種有效α-MSH類(lèi)似物的解熱活性》(Antipyretic Activity of a Potent α-MSH Analog)，《肽物質(zhì)》(Peptides)6，273-5(1985)；Deeter，L. B.等，《兔中樞給予α-MSH片斷的解熱特性》(Antipyretic Properties of centrally Administered α-MSH Fragments in the Rabbit)，《肽物質(zhì)》(Peptides)9，1285-8(1989)；Hiltz，M.E.，《α-MSH(11-13)類(lèi)似物的抗炎活性立體化學(xué)改變的影響》(Anti-inflammatory Activity of α-MSH(11-13)AnalogsInfluences of Alterations in Stereochemistry)，《肽物質(zhì)》(Peptides)12，767-71(1991))。
生物學(xué)功能相當(dāng)物也可通過(guò)替換具有近似親水值的氨基酸來(lái)獲得。例如，異亮氨酸和亮氨酸(親水指數(shù)分別是+4.5和+3.8)可以用來(lái)替換纈氨酸(親水指數(shù)為+4.2)，這樣仍可得到具有相似生物學(xué)功能的蛋白?？晒┻x擇的另一種方法針對(duì)親水指數(shù)為負(fù)值的氨基酸，如賴氨酸(-3.9)可用精氨酸(-4.5)替換，等等。一般而言，和被替換氨基酸親水指數(shù)差別在單位+/-1范圍內(nèi)的氨基酸能夠成功地進(jìn)行替換。
此外，這些經(jīng)修飾的α-MSH和/或其衍生物的類(lèi)似物也能夠象圖16中所描述的KPV二聚體一樣形成二聚體。
實(shí)施例XII女性經(jīng)受著陰道、外陰和/或尿道的不適。醫(yī)生的檢查包括上述部位取材的培養(yǎng)。確定了包括任何感染和炎癥在內(nèi)的不適之后，醫(yī)生可以開(kāi)處方，如適當(dāng)?shù)目股?、抗真菌藥、抗病毒藥或消炎藥。此外，治療也可以包括劑量達(dá)到藥理學(xué)效應(yīng)的α-MSH和/或其衍生物的局部應(yīng)用，α-MSH和/或其衍生物由藥膏、油脂、膠體、可溶性藥丸、噴霧、栓劑、用于灌注的溶液、或者棉條吸收材料攜帶到達(dá)局部。根據(jù)醫(yī)生的判斷，局部治療可一次或多次使用，直到疾病治愈。
本實(shí)施例在醫(yī)生的判斷下適用，也可應(yīng)用于有陰莖、睪丸和/或尿道不適的男性病人。此外，α-MSH和/或其衍生物的局部治療也可不在醫(yī)生的指導(dǎo)下進(jìn)行，而以非處方藥物形式使用。
上述實(shí)施例I-XII闡明了α-MSH和/或其衍生物的抗感染活性和應(yīng)用。其中引用數(shù)據(jù)的目的只是便于說(shuō)明實(shí)施例，并不是把本發(fā)明局限于這些實(shí)施例范圍內(nèi)。應(yīng)該明了的是，對(duì)上述實(shí)施例的修改并不偏離本發(fā)明的精神。而且，這些實(shí)施例可單獨(dú)或聯(lián)合進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種包含兩個(gè)連接在一起的多肽的二聚體，其中第一個(gè)多肽包括位于其C末端的Lys-Pro-Val氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聚體，其中第二個(gè)多肽包括位于其C-末端的Lys-Pro-Val氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聚體，其中所述第二個(gè)多肽選自由SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、和SEQ ID NO7組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聚體，其中在所述第一個(gè)多肽的N末端所述第一個(gè)多肽與第二個(gè)多肽連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的二聚體，其中在所述第二個(gè)多肽的N端所述第二個(gè)多肽與所述第一個(gè)多肽連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的二聚體，其中所述二聚體是一個(gè)同型二聚體或者異質(zhì)二聚體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的二聚體，其中所述二聚體包括至少一個(gè)D型氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聚體，其中所述的兩個(gè)多肽通過(guò)共價(jià)鍵連接，其中所述共價(jià)鍵是一個(gè)二硫鍵。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的二聚體，其中每個(gè)所述多肽具有一個(gè)N末端半胱氨酸，所述N末端半胱氨酸通過(guò)一個(gè)二硫鍵將單體連接在一起。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的二聚體，其中所述二聚體具有乙酰化N端、或酰胺化C端、或者二者兼有。
11.一種包含兩個(gè)連接在一起的單體的二聚體，其中所述的兩個(gè)單體中的每個(gè)單體的C末端具有氨基酸序列Lys-Pro-Val。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的二聚體，其中所述單體在N末端連接。
13.一種包含二聚體的組合物，其中所述二聚體包含至少一個(gè)C-末端，所述C-末端具有氨基酸序列Lys-Pro-Val。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述二聚體是一個(gè)同型二聚體或者異質(zhì)二聚體。
15.在C-末端具有氨基酸序列KPV的多肽在制備用于治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其中所述多肽包括至少一個(gè)D型氨基酸。
17.在C-末端具有KPV的二聚體在制備用于治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病的方法。一方面涉及由一種或多種多肽組成的、用于泌尿生殖系統(tǒng)疾病的治療系統(tǒng)，其中多肽的氨基酸序列包括KPV(序列號(hào)1號(hào))、MEHFRWG(序列號(hào)2號(hào))、HFRWGKPV(序列號(hào)3號(hào))、SYSMEHFRWGKPV(序列號(hào)4號(hào))。一種或多種多肽也可以通過(guò)上述氨基酸序列形成二聚體。泌尿生殖系統(tǒng)疾病包括感染、炎癥、或者二者兼有。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，泌尿生殖系統(tǒng)疾病包括陰道、外陰、尿道、陰莖、和/或直腸的感染、和/或炎癥。一種或多種多肽溶于載體內(nèi)。該多肽與棉條結(jié)合，用來(lái)預(yù)防中毒性休克綜合征；或者與避孕工具結(jié)合，以防止性傳播疾病或感染；還可以與栓劑結(jié)合，以便于插入陰道或肛門(mén)。
文檔編號(hào)C07K5/09GK1544461SQ200410038019
公開(kāi)日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2000年3月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月24日
發(fā)明者詹姆斯·利普頓, 安娜·卡塔尼亞, 卡塔尼亞, 詹姆斯 利普頓 申請(qǐng)人:曾根公司