專利名稱：一種從脫胚乳的胡蘆巴種子粉中提取4-羥基-異亮氨酸提取物及三種副產(chǎn)品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物提取方法，特別是涉及一種從胡蘆巴種子中提取4-羥基-異亮氨酸及胡蘆巴膠等多種副產(chǎn)品的方法。
背景技術(shù)：
胡蘆巴原產(chǎn)地中海地區(qū)，自漢代傳入我國，自南到北均有栽培，資源豐富。其嫩莖、葉可作香料佐料，種子藥食兩用。胡蘆巴成熟種子入藥，是我國傳統(tǒng)中藥之一，載入藥典?！侗静菥V目》記載“胡蘆巴苦溫純陽入腎補(bǔ)命門……”，具有補(bǔ)腎陽，祛寒濕作用。主治寒疝、腹脅脹滿、寒濕腳氣、腎虛腰痛、陽痿遺精、腹瀉，無毒副作用。國外亦用其作為治療糖尿病、高血壓病、腎結(jié)石、糙皮病、肺病等。
胡蘆巴種子中化學(xué)組成分主要有脂肪類、聚多糖類、三萜類、甾類、黃酮類、生物堿類、蛋白質(zhì)和游離氨基酸。這些化合物因其結(jié)構(gòu)特征不同而呈現(xiàn)出不同的生物活性和藥理功效。
近年來發(fā)現(xiàn)并公認(rèn)了胡蘆巴種子粉有較好的降血糖效果，引起國際上醫(yī)藥界許多專家的興趣和關(guān)注，但對(duì)其降糖活性組分的報(bào)導(dǎo)較為混亂，其中有胡蘆巴肽酯(Fenugreekine)、水溶性食用纖維(即胡蘆巴膠)、胡蘆巴皂苷、煙酸、香豆素(在地上部分)等等。1992年Yres Sauvaire等報(bào)導(dǎo)了從胡蘆巴種子中提取、分離出來特有天然的4-羥基-異亮氨酸，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其具有明顯的刺激胰腺分泌胰島素的功能，因此，呈現(xiàn)出顯著的降低血糖水平和提高耐葡萄糖量的效果。國內(nèi)對(duì)胡蘆巴種子的應(yīng)用，除了藥用之外，已報(bào)道了從胡蘆巴種子中分離出胚乳并用以生產(chǎn)工業(yè)級(jí)或食品級(jí)增稠劑和從胡蘆巴種子(或脫除胚乳后種子粉)中提取薯蕷皂甙的二種綜合利用產(chǎn)物。至今，在國內(nèi)尚未見到從胡蘆巴種子中提取天然游離氨基酸及其特有的4-羥基-異亮氨酸的研究報(bào)道。同時(shí)，無論在國內(nèi)或國外，均未見到從胡蘆巴種子中提取天然的4-羥基-異亮氨酸工業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道，也未見到在一條生產(chǎn)線上同時(shí)提取、制造以4-羥基-異亮氨酸為主的胡蘆巴籽游離氨基酸、胡蘆巴膠、胡蘆巴籽毛油、胡蘆巴黃酮及皂素五種產(chǎn)品的綜合利用技術(shù)與工藝的報(bào)導(dǎo)。
胡蘆巴膠(Fenugreek Gum)，又稱胡蘆巴可溶性食用纖維、香豆膠，即胡蘆巴種子的胚乳部分，其中60％為半乳甘露聚糖(Galactomannan)，總糖含量占80％以上，蛋白質(zhì)占6％左右，其余為水、粗脂肪、粗纖維、灰份等等。曾有人推猜它是降血糖的主要組分，Ali L.在1995年報(bào)導(dǎo)了他的研究結(jié)果，證明了這種可溶性食用纖維對(duì)正常大鼠和非胰島素依賴型糖尿病大鼠無降糖活性，但同時(shí)喂飼葡萄糖時(shí)血糖明顯降低，僅能說明它具有提高耐葡萄糖量的效果。胡蘆巴膠水溶液可抑制旋渦的生成與發(fā)展，顯示出減阻作用，這些特性決定了它的用途。
當(dāng)前胡蘆巴膠的主要產(chǎn)品與用途有以下二種工業(yè)級(jí)胡蘆巴膠，可用于石油開采、日用化工、印染漿紗、配制炸藥等用途；食品藥用級(jí)胡蘆巴膠可制得食品、醫(yī)藥級(jí)胡蘆巴膠增稠劑、賦形劑。
胡蘆巴毛油(Oil of Common Fenugreek seed)，胡蘆巴種子含油量?jī)H為7％左右，屬于低油種子，若作為油料作物處理，沒有經(jīng)濟(jì)效益，但通過綜合利用途徑提取胡蘆巴籽油，可大幅度降低成本，增加經(jīng)濟(jì)效益。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)胡蘆巴毛油有含催乳成分，但無任何性激素樣作用。毛油及其非皂苷成分具有抗菌作用，其中含有羽扇豆醇具有顯著的降血糖功能。毛油經(jīng)精制，可從油腳、皂腳中分離、提取出磷酯、VE、β-谷甾醇等高附加值的營(yíng)養(yǎng)保健品。精制的胡蘆巴油富含不飽和脂肪酸(高于80％)，其中亞油酸和亞麻酸總量達(dá)50％以上。不飽和脂肪酸具有降血脂、抑制血小板聚集、防止動(dòng)脈硬化、抗炎、抗癌、增強(qiáng)免疫功能等生理作用，故可作為保健油。
以天然4-羥基-異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine)為主的天然游離氨基酸，4-羥基-異亮氨酸是一種非蛋白組分，極性非電荷(即中性)的新型氨基酸，學(xué)名是2-氨基-3-甲基-4-羥基-戊酸，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)，僅存在于某些(胡蘆巴種屬)植物中。1973年L Fowdent等首先從胡蘆巴種子中分離并鑒定出4-羥基-異亮氨酸，并提出它有三個(gè)手性碳原子，有4種異構(gòu)體(2S，3R，4R)-，(2R， 3R，4R)-，及它們所形成的二種內(nèi)酯鹽酸鹽，這種開鏈和內(nèi)酯構(gòu)型可以互相轉(zhuǎn)化。4-羥基-異亮氨酸占干燥種子的游離氨基酸總量的30-50％。而在1984年Y.Sauvaire等的研究，也證明了這個(gè)4-羥基-異亮氨酸分子中有三個(gè)手性中心，存在于胡蘆巴種子中這種氨基酸有二個(gè)非對(duì)映的異構(gòu)體形式，主要的一種以(2S，3R，4S)-構(gòu)型占這種氨基酸含量的90％左右。而次要的一種是以(2R，3R，4S)-構(gòu)型，占10％左右，這個(gè)結(jié)果被Hasan(1986)，Alcock等(1989)所確證，其它的4-羥基-異亮氨酸立體構(gòu)型在天然植物中似乎是難以得到的。1992年Y.Sauvaore等研究發(fā)現(xiàn)了從胡蘆巴種子中提取，分離出的天然4-羥基-異亮氨酸有明顯的刺激胰腺分泌胰島素的功能，呈現(xiàn)出顯著的降血糖和提高耐糖量的效果。Masiell等(1998)、C.Broca等(1999，2000)都驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果，并提出了在4-羥基-異亮氨酸的三個(gè)異構(gòu)體中(2S，3R，4S)-構(gòu)型刺激胰腺分泌胰島素效果顯著，而(2R，3R，4S)-構(gòu)型及其內(nèi)脂亦有明顯的效果。但分泌量低于前者。因此，可以認(rèn)為4-羥基-異亮氨酸是一種具有潛在的，有益于II型糖尿病患者的抗糖尿病新制劑(藥劑)。
由于在某種環(huán)境條件作用下，(2S，3R，4S)-構(gòu)型會(huì)轉(zhuǎn)化為(2R，3R，4S)-構(gòu)型或內(nèi)酯構(gòu)型，導(dǎo)致相應(yīng)地削弱了該產(chǎn)品的降血糖和提高耐糖量的功效，在產(chǎn)品的制備過程避免和減少上述轉(zhuǎn)化的發(fā)生是關(guān)鍵。
胡蘆巴總黃酮(Total Flavones of Fenugreek seed)，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)胡蘆巴總皂苷、黃酮苷能促進(jìn)核酸及蛋白質(zhì)合成及膽固醇酯質(zhì)代謝，抗動(dòng)脈硬化，降低膽固醇等功效，；胡蘆巴中黃酮類化合物成分母核多為4’，5，7-三羥基黃酮，如牡荊素，牡荊素-7-葡萄糖苷，異牡荊素，葒草素，異葒草素，葒草素苷，異葒草素苷，芹菜素-6-木糖苷-8-葡萄糖苷，芹菜素-6，8-二碳-葡萄糖苷，牡荊素-2”-O-對(duì)羥基苯基本柚皮素，木樨草素，小麥黃素，小麥黃素-7-O-葡萄糖苷，6，8-二碳-β-D-呋喃葡萄糖苷，金合歡素等十五種黃酮，及二種黃酮醇槲皮素，莰非醇。上述17種黃酮類化合物中十三種是黃酮苷類化合物，其中碳-苷十二種，氧-苷一種，這是胡蘆巴黃酮的特點(diǎn)，但至今尚未見到胡蘆巴總黃酮、黃酮苷的提取和應(yīng)用的報(bào)導(dǎo)。
胡蘆巴皂苷(Fenugreek Saponin，Trigosaponin)，從胡蘆巴種子中已提取鑒定出34種皂苷，其中屬于甾體皂苷有30種，分別為薯芋皂(Diosgenin)、雅莫皂苷元(Yamogenin)、支脫皂苷元(Gitogenin)、新支脫皂苷元(Neogiogenin)、替告皂苷元(Tigogenin)、新替告皂苷元(Neotigogenin)、絲蘭皂苷元(Yuccagenin)等的不同糖苷化合物，三萜皂苷有4種，分別為胡蘆巴皂苷I(Trigosaponin I)、大豆皂苷I(SayasaponinI)、大豆皂苷I甲酯(Methylsayasaponin I)、β-谷甾醇吡喃葡萄糖苷。其中具有薯芋皂苷元母體結(jié)構(gòu)的皂苷，除薯芋皂苷外，胡蘆巴皂苷(Gzaecunin)H、I、J、K、L、M、N和胡蘆巴素B(Fenugrin B)其苷元都是薯芋皂苷元。這類皂苷是胡蘆巴皂苷中主要組分。已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)胡蘆巴皂苷有降血糖、降血脂、降低膽固醇、利尿、抗炎等活性，其中薯芋皂苷、雅莫皂苷元有抗真菌、殺蟲作用，薯芋皂苷元有雌激素作用和降膽固醇作用，大豆皂苷有抗氧化、抗癌、抗肝損傷、抗血栓及增強(qiáng)免疫力作用，但大多皂苷化合物都有溶血性缺陷。由于胡蘆巴皂苷水解成苷元后，其中主要是薯芋皂苷元，可以作為甾體激素，醫(yī)藥工業(yè)的原料，目前還沒有全合成的原料能與其競(jìng)爭(zhēng)或代用。國際市場(chǎng)上甾體藥物總銷售額以每年6-10％的速度遞增，進(jìn)入九十年代以來年產(chǎn)值已突破100億美元，年皂苷元用量(不包括中國)已超過2000噸，市場(chǎng)呈現(xiàn)原料緊張，求過于供的現(xiàn)狀。原來薯芋皂苷元生產(chǎn)的主要原料是盾葉薯芋、穿龍薯芋，而薯芋生長(zhǎng)周期要4-7年才挖掘，造成資源短缺，而我國年需薯芋皂苷元(包括出口)1500噸左右，現(xiàn)有50余家工廠生產(chǎn)總量不足1000噸，缺口甚大，因此從胡蘆巴籽中提取皂苷，經(jīng)水解精制，制造薯芋皂苷元，可以彌補(bǔ)市場(chǎng)供應(yīng)不足之問題。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種以中藥胡蘆巴(TrigonellaFoenum-graecum.L.，Common Fenugreek)的種子為原料，提取天然4-羥基-異亮氨酸為主體的游離氨基酸產(chǎn)品的方法；本發(fā)明目的還在于提供一種提取天然4-羥基-異亮氨酸的同時(shí)可獲得胡蘆巴膠、胡蘆巴籽毛油、胡蘆巴黃酮與皂苷等多種副產(chǎn)品的生物化工技術(shù)。
本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的1、胡蘆巴種子中五種提取物的提取制備胡蘆巴籽毛油取經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后的胡蘆巴種子粉，60-80℃恒溫恒壓下石油醚提取1-3小時(shí)，抽濾上述提取物，濾渣分別用石油醚再提取二次，合并三次提取液，濾渣A另行處理；提取液濃縮回收溶劑，得到胡蘆巴籽毛油；制備胡蘆巴粗黃酮濾渣A在60-80℃恒溫恒壓下用10-90％乙醇提取2-3次，每次1-3小時(shí)，合并提取液，濾渣B另行處理；提取液通過超濾去除大分子蛋白，收集透過2萬分子量膜的濾液；回收乙醇，濃縮，濃縮液加無離子水稀釋，即殘液A；殘液A用液-液萃取法分別用乙酸乙酯萃取三次，水層經(jīng)減壓蒸餾至無乙酸乙酯殘留止，作為殘留液B；合并乙酸乙酯層，濃縮，回收乙酸乙酯，釜?dú)埣蛹兯寥芙?，濃縮，干燥，得到黃色粉末即為胡蘆巴粗黃酮；制備胡蘆巴粗皂苷用液-液萃取法，用正丁醇作為提取劑從殘液B中提取三次，水層作為殘留液c備用，合并醇層，減壓濃縮至干，回收正丁醇得到褐色粗皂苷固體粉末；制備4-羥基-異亮氨酸殘液c調(diào)節(jié)PH為1～6，上陽離子交換樹脂柱，進(jìn)行離子交換，并用無離子水洗滌，樹脂柱用0.05N～2N氨水解吸，脫氨，濃縮至干后，真空干燥4-8hr，得到黃色或黃褐色固體，產(chǎn)物中4-羥基-異亮氨酸的含量為10-60％；制備胡蘆巴膠取濾渣B，加10-18倍水，加熱，攪拌提取1-3h，抽濾，濾渣棄去，濾液濃縮至1/3體積后，加80-95％乙醇沉淀、洗滌、脫水、干燥得到淡黃至白色的藥用或食用胡蘆巴膠粉末。
本發(fā)明上述方法中石油醚可以用正己烷、環(huán)己烷或溶劑汽油代替。
本發(fā)明上述方法胡蘆巴黃酮制備中濾渣A恒溫恒壓下乙醇提取可用甲醇提取代替。
本發(fā)明上述方法乙醇提取液用超濾方法除去蛋白質(zhì)還可用礦物酸(如硫酸、鹽酸)、有機(jī)酸〔如鞣酸、三氯醋酸、乳酸〕或氯仿、聚乙二醇等其他有機(jī)物沉降蛋白質(zhì)來代替。
本發(fā)明上述方法胡蘆巴黃酮制備中殘液A，可用聚酰胺樹脂吸附，無離子水洗滌，合并流出液、洗滌液為殘液B，另行處理；樹脂柱用10～90％乙醇解吸，收集解析液，濃縮回收乙醇，濃縮至干，真空干燥得到黃褐色粗黃酮；本發(fā)明上述方法胡蘆巴粗皂苷制備還可以是殘留液B用大孔徑樹脂吸附，無離子水洗滌，樹脂柱用10～90％乙醇解吸，收集解吸液濃縮至干，得到黃褐色粗皂苷固體粉末。
本發(fā)明上述方法胡蘆巴粗皂苷制備還可以是殘液B加硫酸或鹽酸直接加熱回流5～8hr水解糖苷，使水不溶性的皂苷元呈晶態(tài)析出，過濾，濾餅烘干后，加適量活性碳混勻，用石油醚連續(xù)回流提取8～10hr，提取液經(jīng)濃縮回收溶劑，濃縮至適當(dāng)?shù)臐舛群螅覝胤胖檬菇Y(jié)晶完全析出后，過濾，濾液回收使用，濾餅抽干后呈黃色晶體，經(jīng)乙醇或丙酮溶液重結(jié)晶，呈白色皂苷元晶狀物；本發(fā)明上述方法工業(yè)胡蘆巴膠的制備也可以是胡蘆巴種子經(jīng)浸水軟化后，破碎、篩分出來的胚乳，經(jīng)去雜、磨粉、過篩可制得工業(yè)胡蘆巴膠；本發(fā)明上述方法原料可以是篩分出胚乳后的胡蘆巴種子粉。
2、本發(fā)明4-羥基-異亮氨酸的提取方法，該方法為取經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后的胡蘆巴種子粉，60-80℃恒溫恒壓下石油醚提取1-3小時(shí)，抽濾上述提取物，濾渣分別用石油醚再提取二次，合并三次提取液，濾渣A在60-80℃恒溫恒壓下用10-90％乙醇提取2-3次，每次1-3小時(shí)，合并提取液，濾渣B另行處理；提取液通過超濾，收集透過2萬分子量膜的濾液；，回收乙醇，濃縮，濃縮液加無離子水稀釋，即殘液A；殘液A調(diào)節(jié)PH為1～6，上陽離子交換樹脂柱，進(jìn)行離子交換，并用無離子水洗滌，流出液和洗滌液合并為殘液B另行處理。樹脂柱用0.05N～2N氨水解吸，脫氨，濃縮至干后，真空干燥4-8hr，得到黃色或黃褐色固體，產(chǎn)物中4-羥基-異亮氨酸的含量為10-60％；本發(fā)明上述方法還可以是殘液A調(diào)節(jié)PH為1～6，上陽離子交換樹脂柱，進(jìn)行離子交換，并用無離子水洗滌后，以0.05～2N氨水解吸，用茚三酮試劑檢測(cè)解吸液，當(dāng)出現(xiàn)氨基酸呈色反應(yīng)時(shí)，即開始收集解吸液至流出解吸液呈微黃色止，合并解析液，蒸發(fā)濃縮，脫氨，濃縮至干后，真空干燥4-8hr，得到黃色或黃褐色固體，產(chǎn)物中4-羥基-異亮氨酸的含量為10-60％。
本發(fā)明上述方法還可以是殘液A分別用乙酸乙酯萃取三次，水層分別用正丁醇提取三次，在正丁醇提取后的水層B，用鹽酸調(diào)PH＝5，上陽離子樹脂柱上進(jìn)行離子交換，加3-4倍柱體積的無離子水洗滌，棄去流出液及洗滌液，用1N氨水解吸，用茚三酮試劑檢測(cè)，解吸液呈黃褐色后開始收集，至解吸液呈淡黃色止，合并解吸液，蒸發(fā)濃縮、脫氨，濃縮至干后干燥4-8h，得到黃色粉末狀物質(zhì)，其中4-羥基-異亮氨酸的含量為14.47％。
本發(fā)明所述陽離子交換樹脂還可以是強(qiáng)酸性、中酸性或弱酸性陽離子樹脂；干燥可用噴霧干燥、真空干燥、冷凍干燥。
3、本發(fā)明還提供了一種胡蘆巴種子中四種提取物的提取方法，該方法為制備胡蘆巴毛油取經(jīng)粉碎脫胚乳后的胡蘆巴粉在60～80℃恒溫恒壓下，用10～90％乙醇提取三次，每次1-3hr，合并濾液；濾液經(jīng)濃縮回收乙醇，濃縮液用無離子水稀釋，用用正己烷進(jìn)行液-液萃取，萃取三次，合并油層，水層另行處理；油層經(jīng)濃縮回收溶劑，得到胡蘆巴毛油；制備4-羥基-異亮氨酸水層用稀醋酸調(diào)PH4-6，使蛋白變性析出，經(jīng)沉降過濾，濾液用陽離子交換樹脂吸附氨基酸，并用無離子水洗滌，合并流出液、洗滌液為殘液d，另行處理；陽離子制樹脂柱用0.05～2N氨水解吸，解析液經(jīng)減壓濃縮、脫氨、蒸干，并在80℃下真空干燥4-8hr，得到黃色固體粉末產(chǎn)品，產(chǎn)物中4-羥基-異亮氨酸含量為10-60％；制備胡蘆巴黃酮?dú)堃篸通過聚酰胺樹脂吸附，并用無離子水洗滌，合并流出液和洗滌液為殘液e，另行處理，聚酰胺柱用10-90％乙醇解吸，收集解析液，經(jīng)濃縮回收乙醇，蒸干，在80℃真空干燥4-8hr，得到黃色固體粉末胡蘆巴黃酮；制備胡蘆巴皂苷殘液e通過大孔徑樹脂柱吸附，并用無離子水洗滌，流出液、洗滌液排入污水處理池，大孔徑樹脂柱用10-90％乙醇解吸，收集解析液，經(jīng)濃縮，回收乙醇，蒸干，在80℃真空干燥4-8hr，得到黃褐色固體粉末胡蘆巴皂苷。
本發(fā)明上述方法中制備胡蘆巴毛油還可以是取經(jīng)粉碎脫胚乳后的胡蘆巴粉以乙醇為提取劑用20KHz超聲波提取2-3次，每次30-50min，合并濾液；濾液經(jīng)濃縮回收乙醇，濃縮液用無離子水稀釋，用正己烷進(jìn)行液-液萃取，萃取三次，合并油層，水層另行處理；油層經(jīng)濃縮回收溶劑，得到胡蘆巴毛油。
本發(fā)明上述方法中為制備胡蘆巴毛油還可以是其中乙醇提取液的濃縮液加無離子水稀釋后，還可用礦物酸(如硫酸、鹽酸)、有機(jī)酸〔如鞣酸、三氯醋酸、乳酸〕或氯仿、聚乙二醇等其他有機(jī)物沉降蛋白質(zhì)，過濾，濾液再用非極性溶劑(石油醚，正己烷，環(huán)己烷，溶劑汽油等)萃取胡蘆巴籽油。
本發(fā)明上述方法中制備胡蘆巴黃酮還可以是殘液d用乙酸乙酯萃取，合并酯層，經(jīng)濃縮，干燥，得到黃色固體粉末——胡蘆巴黃酮。
本發(fā)明所述方法中，陽離子交換樹脂為強(qiáng)酸性、中酸性、弱酸性陽離子樹脂均可；本發(fā)明所述方法中干燥方法，可用噴霧干燥、真空干燥、冷凍干燥等方法；本發(fā)明所指的4-羥基-異亮氨酸包括以下幾個(gè)異構(gòu)體(2S，3R，4S)-4-Hydroxylisoleucine，(2R，3R，4S)-4-Hydroxylisoleucine，(2S，3R，4S)-4-Hydroxylisoleucine lactoneHcl，，(2R，3R，4S)-4-Hydroxylisoleucine lactone Hcl。
本發(fā)明所指的4-羥基-異亮氨酸可加入常規(guī)輔料是碳酸氫鈣、硫酸鈉、甘露糖、聚半乳糖、微粉硅膠、淀粉及其衍生物、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素等物質(zhì)。
本發(fā)明方法優(yōu)點(diǎn)在于在一條生產(chǎn)線上可同時(shí)獲得天然4-羥基-異亮氨酸、胡蘆巴膠、胡蘆巴毛油、粗黃酮、粗皂苷等五類產(chǎn)品，這一綜合利用生物化工技術(shù)填補(bǔ)了國內(nèi)空白，具有很好的應(yīng)用前景。目前胡蘆巴籽主要利用以提取胡蘆巴膠和薯蕷皂苷元為主的胡蘆巴皂苷元。以100kg胡蘆巴籽進(jìn)行綜合利用為例，可提取約20kg工業(yè)胡蘆巴膠(20元/公斤)，約1kg皂苷元(500元/公斤)，6kg胡蘆巴種子油(5元/公斤)，合計(jì)930元產(chǎn)值，按本專利工藝進(jìn)行綜合利用，可制得約3kg含10％4-羥基-異亮氨酸為主的天然混合氨基酸產(chǎn)品，以300元/公斤計(jì)，3kg產(chǎn)值為900元，及制得1.5kg胡蘆巴黃酮，為胡蘆巴黃酮的藥效研究和利用提供一定的基礎(chǔ)。從上可知本專利技術(shù)可增加附加值約一倍左右，其經(jīng)濟(jì)效益十分顯著。
1992年Y.Sauvaore等研究發(fā)現(xiàn)了從胡蘆巴種子中提取，分離出的天然4-羥基-異亮氨酸有明顯的刺激胰腺分泌胰島素的功能，呈現(xiàn)出顯著的降血糖和提高耐糖量的效果。Masiell等(1998)、C.Broca等(1999，2000)都驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果。因此，4-羥基-異亮氨酸是一種具有潛在的有益于II型糖尿病患者的抗糖尿的新的輔助藥品和預(yù)防II型糖尿病患者的發(fā)生與擴(kuò)大的良好保健食品，其社會(huì)效益是明顯的。
實(shí)施例1取200g經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后的胡蘆巴種子粉，溫度在75±2℃，800ml石油醚溶媒提取2小時(shí)后，抽濾上述提取物及物料，抽畢，將固體物料在75±2℃分別用600ml石油醚再提取二次，合并三次提取液，濾渣A另行處理；提取液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮回收溶劑，最后減壓濃縮脫除殘留溶劑，得到12.53g胡蘆巴籽毛油，得率為6.265％；制備胡蘆巴粗黃酮將濾渣A在75±2℃下，用800ml、600ml、600ml 80％乙醇提取三次，每次2h，濾渣B另行處理，合并提取液，通過微濾、10萬分子量膜、5萬分子量膜、2萬分子量膜，收集透過2萬分子量膜的濾液，濃縮，回收乙醇，濃縮液加400ml無離子水稀釋，即殘液A；殘液A分別用300ml乙酸乙酯萃取三次，水層經(jīng)減壓蒸餾至無乙酸乙酯殘留止，作為殘留液B；合并乙酸乙酯層，進(jìn)行蒸餾濃縮，回收乙酸乙酯，釜?dú)埣舆m量純水溶解，濃縮，脫除殘留乙酸乙酯，而后蒸干，80℃下干燥，得到3.02g黃色粉末，得率1.51％；該物質(zhì)即為胡蘆巴黃酮；制備胡蘆巴粗皂苷殘液B分別用300ml正丁醇提取三次，水層作為殘留液c備用；合并正丁醇層，濃縮回收正丁醇溶劑，釜?dú)埣礊辄S褐色粗皂苷，重量10.26g，得率為5.13％；制備4-羥基-異亮氨酸殘留液c用鹽酸調(diào)PH＝5，然后用裝有300ml已再生處理好并交換成H+型的陽離子樹脂柱上進(jìn)行離子交換，而后加3-4倍柱體積的無離子水進(jìn)行洗滌，流出液及洗滌液棄之，洗滌后用1N氨水進(jìn)行解吸，用茚三酮試劑檢測(cè)，當(dāng)解吸液呈黃褐色后開始收集，至解吸液呈淡黃色止，合并解吸液，蒸發(fā)濃縮、脫氨，濃縮至干后，在80℃下干燥6h，得到黃色粉末狀物質(zhì)4.32g，得率為2.16％，其中4-羥基-異亮氨酸的含量為14.47％；制備胡蘆巴膠取濾渣B，加15倍的水，加熱，攪拌提取3h，抽濾，濾渣棄去，濾液濃縮至1/3體積后，加95％乙醇進(jìn)行沉淀、過濾、洗滌、風(fēng)干后，80℃下干燥6h，得到胡蘆巴膠淡黃色粉末27.64g，得率為13.32％。
實(shí)施例2取200g經(jīng)粉碎篩分去胚乳的胡蘆巴種子粉，在75±2℃恒溫恒壓下，用800ml，600ml，600ml的80％乙醇提取三次，每次2hr，合并提取液另行處理，提取液進(jìn)行濃縮，回收至濃縮液無醇味止，濃縮液加無離子水600ml稀釋，稀釋液各用200ml正己烷提取三次，水層另行處理，合并油層進(jìn)行濃縮，回收正己烷，最后用減壓蒸餾脫除殘留正己烷，得12.02g粗胡蘆巴毛油，得率為6.01％；制備4-羥基-異亮氨酸水層用稀醋酸調(diào)PH＝5，則有大量蛋白質(zhì)沉淀析出，沉降，過濾，濾液用300gH+型陽離子交換樹脂柱進(jìn)行離子交換，并用600ml無離子水洗滌，合并流出液，洗滌液為殘液d另行處理；陽離子樹脂柱用0.6N氨水解吸，解吸液經(jīng)減壓濃縮，脫氨，蒸干，并在80℃下真空干燥6hr，得到黃色固體粉末5.44g，得率為1.61％，產(chǎn)品中4-羥基-異亮氨酸含量為30.4％；制備胡蘆巴黃酮?dú)堃篸用450g聚酰胺樹脂吸附，用600ml無離子水洗滌，合并流出液、洗滌液為殘液e，另行處理，聚酰胺樹脂柱用80％乙醇進(jìn)行解吸至流出液為淡黃色為止，合并解析液，經(jīng)濃縮至干，回收乙醇，釜?dú)垶辄S色固體，80℃真空干燥4hr，經(jīng)研磨，得2.92g黃色的粗黃酮粉末，得率為1.46％；制備胡蘆巴皂苷殘液e用500gD-X型大孔徑樹脂柱吸附，并用800ml無離子水洗滌，大孔徑樹脂柱用85％乙醇進(jìn)行解吸，至流出液為淡黃色為止，合并解析液，經(jīng)濃縮至干，回收乙醇，釜?dú)垶楹稚腆w，80℃真空干燥4hr，經(jīng)研磨得11.72g粗皂苷，得率為5.68％
權(quán)利要求
1.一種從脫胚乳的胡蘆巴種子粉中提取具有生物活性，富含4-羥基-異亮氨酸提取物及胡蘆巴毛油、胡蘆巴黃酮、胡蘆巴皂苷三種副產(chǎn)品的方法，其特征在于該方法為制備胡蘆巴毛油取經(jīng)粉碎脫胚乳后的胡蘆巴粉在60～80℃恒溫恒壓下，用10～90％乙醇提取三次，每次1-3hr，濾渣棄去，合并濾液；濾液經(jīng)濃縮回收乙醇，濃縮液用無離子水稀釋，用非極性溶劑進(jìn)行液-液萃取，萃取三次，合并油層，水層另行處理；油層經(jīng)濃縮回收溶劑，得到胡蘆巴毛油；制備富含4-羥基-異亮氨酸提取物水層用酸調(diào)PH1-6，使蛋白變性析出，經(jīng)沉降過濾，濾液用陽離子交換樹脂柱吸附氨基酸，并用無離子水洗滌，合并流出液、洗滌液為殘液A，另行處理；陽離子樹脂柱用0.05～2N氨水解吸，解析液經(jīng)減壓濃縮、脫氨、蒸干，并在80℃下真空干燥4-8hr，得到黃色固體粉末產(chǎn)品，產(chǎn)物中4-羥基-異亮氨酸含量為10-60％；制備胡蘆巴黃酮?dú)堃篈通過聚酰胺樹脂柱吸附，并用無離子水洗滌，合并流出液和洗滌液為殘液B，另行處理；聚酰胺柱用10-90％乙醇解吸，收集解析液，經(jīng)濃縮回收乙醇，蒸干，在80℃真空干燥4-8hr，得到黃色固體粉末胡蘆巴黃酮；制備胡蘆巴皂苷殘液B通過大孔徑樹脂柱吸附，并用無離子水洗滌，流出液、洗滌液排入污水處理池，大孔徑樹脂柱用10-90％乙醇解吸，收集解析液，經(jīng)濃縮，回收乙醇，蒸干，在80℃真空干燥4-8hr，得到黃褐色固體粉末胡蘆巴皂苷。
2.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于該方法為制備胡蘆巴毛油取200g經(jīng)粉碎篩分去胚乳后的胡蘆巴種子粉，在75±2℃恒溫恒壓下，用800ml，600ml，600ml的80％乙醇提取三次，每次2hr，濾渣棄去，合并提取液； 提取液進(jìn)行濃縮，回收乙醇，濃縮液加無離子水600ml稀釋，稀釋液各用200ml正己烷提取三次，水層另行處理；合并油層進(jìn)行濃縮，回收正己烷，最后用減壓蒸餾脫除殘留正己烷，得12.02g粗胡蘆巴毛油，得率為6.01％；制備4-羥基-異亮氨酸水層用稀醋酸調(diào)PH＝5，則有大量蛋白質(zhì)沉淀析出，沉降，過濾，濾液用300gH+型陽離子交換樹脂柱進(jìn)行離子交換，并用600ml無離子水洗滌，合并流出液，洗滌液為殘液d另行處理；陽離子樹脂柱用0.6N氨水解吸，棄之前二個(gè)柱體積解吸液，從第三個(gè)柱體積解吸液開始收集，合并解吸液經(jīng)減壓濃縮，脫氨，蒸干，并在80℃下真空干燥6hr，得到黃色固體粉末5.44g，得率為1.61％，產(chǎn)品中4-羥基-異亮氨酸含量為30.4％；制備胡蘆巴黃酮?dú)堃篈用450g聚酰胺樹脂吸附，用600ml無離子水洗滌，合并流出液、洗滌液為殘液B，另行處理，聚酰胺樹脂柱用80％乙醇進(jìn)行解吸至流出液為淡黃色為止，合并解析液，經(jīng)濃縮至干，回收乙醇，釜?dú)垶辄S色固體，經(jīng)研磨，得到2.92g黃色的粗黃酮固體粉末，得率為1.46％；制備胡蘆巴皂苷殘液B用500gD-X型大孔徑樹脂柱吸附，并用800ml無離子水洗滌，大孔徑樹脂柱用85％乙醇進(jìn)行解吸，至流出液為淡黃色為止，合并解析液，經(jīng)濃縮至干，回收乙醇，釜?dú)垶楹稚腆w，經(jīng)研磨得11.72g粗皂苷，得率為5.68％。
3.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于該方法中為制備胡蘆巴毛油為取經(jīng)粉碎脫胚乳后的胡蘆巴粉以乙醇作提取劑提取2-3次，每次1～3hr，濾渣棄去，合并濾液；濾液經(jīng)濃縮回收乙醇，濃縮液用無離子水稀釋，用非極性溶劑進(jìn)行液-液萃取，萃取三次，合并油層，水層另行處理；油層經(jīng)濃縮回收溶劑，得到胡蘆巴毛油。
4.如權(quán)利要求1或3所述的提取方法中其特征在于該方法為富含4-羥基-異亮氨酸提取物為脫除油脂后的水層，用礦物酸、有機(jī)酸沉降蛋白質(zhì)，過濾，濾液上H+-型陽離子樹脂柱吸附氨基酸，并用無離子水洗滌，合并流出液、洗滌液為殘液A，另行處理；陽離子樹脂柱，用0.05～2N氨水解吸，解吸液經(jīng)減壓濃縮、脫氨、蒸干，并在80℃下真空干燥4-8hr，得黃色固體狀含10～60％的4-羥基-異亮氨酸之提取物。
5.如權(quán)利要求1或4所述的提取方法，其特征在于該方法中為制備胡蘆巴黃酮為殘液A，通過聚酰胺樹脂吸附，并用無離子洗滌，合并流出液和洗滌液為殘液B，另行處理；聚酰胺柱用10～90％乙醇解吸，收集解吸液，經(jīng)濃縮，回收乙醇，蒸干，在80℃真空干燥4-8hr，得黃褐色固體粉末胡蘆巴黃酮。
6.如權(quán)利要求1或5所述的提取方法中，其特征在于該方法為制備胡蘆巴皂苷為殘液B，通過大孔徑樹脂柱吸附，并用無離子水洗滌、流出液和洗滌液排入污水處理池；大孔徑樹脂柱用10～90％乙醇解吸，收集解吸液，經(jīng)濃縮回收乙醇，蒸干，在80℃真空干燥4-8hr，得黃褐色粉末胡蘆巴皂苷。
7.如權(quán)利要求1或3所述的提取方法，其特征是用非極性溶劑提取胡蘆巴油，這里非極性溶劑是指石油醚、溶劑汽油、正己烷、環(huán)己烷中的任一種。
8.如權(quán)利要求1或4所述的提取方法，其特征在于調(diào)PH所用的酸是指礦物酸或有機(jī)酸。
9.如權(quán)利要求8所述的提取方法，其特征在于調(diào)PH所用的礦物酸酸是指鹽酸或硫酸；有機(jī)酸是指乙酸、氯乙酸、草酸、檸檬酸、乳酸或鞣酸中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從脫胚乳的胡蘆巴種子粉中提取具有生物活性，富含4－羥基－異亮氨酸提取物及胡蘆巴毛油、胡蘆巴黃酮、胡蘆巴皂苷三種副產(chǎn)品的方法。本發(fā)明方法所提產(chǎn)品具有良好的降血糖，刺激胰島素分泌的生物活性，本發(fā)明可以使脫胚乳的胡蘆巴籽粉得到充分的綜合利用，具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C07H1/00GK1541996SQ20041002992
公開日2004年11月3日 申請(qǐng)日期2002年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月14日
發(fā)明者張可欽, 李勝和, 李長(zhǎng)城, 段建新, 劉彥 申請(qǐng)人:技源科技(中國)有限公司