專(zhuān)利名稱(chēng)：豬脂肪細(xì)胞定向和分化因子1的基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是用于基因工程技術(shù)領(lǐng)域的一種蛋白編碼序列，特別是一種豬脂肪細(xì)胞定向和分化因子1的基因序列。
背景技術(shù)：
脂肪性狀是動(dòng)物體生長(zhǎng)發(fā)育和肉質(zhì)性狀的主要指標(biāo)之一，關(guān)系到動(dòng)物生產(chǎn)中的諸如瘦肉率、生長(zhǎng)速度、飼料轉(zhuǎn)化率、肌內(nèi)脂肪等眾多經(jīng)濟(jì)性狀。在長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐中，人們?cè)缫寻l(fā)現(xiàn)脂肪含量不同的動(dòng)物產(chǎn)品價(jià)格上有很大的差異。人們的消費(fèi)習(xí)慣已經(jīng)從喜食肥肉轉(zhuǎn)移到愛(ài)吃瘦肉，這樣使得肥胖的個(gè)體在動(dòng)物生產(chǎn)的過(guò)程中的經(jīng)濟(jì)效益下降。脂肪對(duì)于動(dòng)物生產(chǎn)中已經(jīng)成為一種副產(chǎn)品。它降低了飼料轉(zhuǎn)化率，同時(shí)降低了動(dòng)物生產(chǎn)過(guò)程的經(jīng)濟(jì)效益。脂肪性狀在過(guò)去的幾十年的育種過(guò)程中已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的飛速發(fā)展，給我們提供另外一種方法來(lái)改良動(dòng)物的遺傳基礎(chǔ)。1950年發(fā)現(xiàn)的肥胖基因(obese，ob)，1998年發(fā)現(xiàn)的黑素皮質(zhì)激素受體4基因(Melanocortin-4 receptor，MC4R)都對(duì)脂肪性狀有一定的影響。
攝入過(guò)多膽固醇與心臟病有直接聯(lián)系，是導(dǎo)致動(dòng)脈硬化及心臟病的最主要原因。心臟病、動(dòng)脈硬化和中風(fēng)等心血管疾病導(dǎo)致死亡的人數(shù)每年大約有100萬(wàn)，平均每天達(dá)到了2500人！而動(dòng)物性食品中膽固醇含量很高，食入過(guò)多的動(dòng)物性食品會(huì)導(dǎo)致上述疾病的發(fā)生。健康的、低膽固醇的雞蛋已經(jīng)問(wèn)世，但是怎樣生產(chǎn)低膽固醇的豬肉還沒(méi)有進(jìn)一步的研究。毫無(wú)疑問(wèn)，健康的、低膽固醇豬肉都會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。脂肪細(xì)胞定向和分化因子1(Adipocyte Detetmination andDifferentiation factor-1，ADD1)基因又稱(chēng)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SterolRegulatory Element Binding proteins-1 SREBP1)基因，編碼脂肪細(xì)胞定向和分化因子1，ADD1是脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，同過(guò)氧化物酶體增殖蛋白激活受體(PPARγ)和CCAAT元件增強(qiáng)結(jié)合蛋白(C/EBPs)共同控制脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程。另外，ADD1還可以通過(guò)固醇調(diào)節(jié)元件來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)的膽固醇水平。
在對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的分析中，雖然“Comparative Biochemistry and PhysiologyPart B，1999，28307-318”對(duì)DD1基因?qū)χ炯?xì)胞的分化和定向作用的功能已經(jīng)做了充分肯定，特別是ADD1基因?qū)φ{(diào)節(jié)其他與脂肪沉積的相關(guān)基因功能的確定使人們?cè)谥境练e方面的應(yīng)用取得了長(zhǎng)足進(jìn)步。但至今尚未發(fā)現(xiàn)ADD1基因序列中有多態(tài)現(xiàn)象，也不能進(jìn)行突變位點(diǎn)的基因型與性狀講的連鎖分析以及進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種豬脂肪細(xì)胞定向和分化因子1的基因序列。本發(fā)明所公開(kāi)的豬的脂肪細(xì)胞定向和分化因子1的cDNA序列、氨基酸序列，對(duì)豬ADD1基因蛋白編碼序列在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用作出了具體說(shuō)明，使其一方面可以通過(guò)制備該基因的蛋白，用于該基因在豬脂肪細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇水平，另一方面可以通過(guò)標(biāo)記輔助選擇(MAS)的方法對(duì)瘦肉型豬和低膽固醇型豬的生產(chǎn)和育種中發(fā)揮指導(dǎo)性作用。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明的是從豬的脾臟細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出的ADD1基因，其cDNA序列和編碼蛋白的氨基酸序列(如下)，該基因全長(zhǎng)3830bp，開(kāi)放閱讀框11bp-3453bp區(qū)段，編碼有1151個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其3’端非編碼序列長(zhǎng)10bp，5’端非編碼序列長(zhǎng)366bp。在蛋白質(zhì)序列的320-380處有螺旋-環(huán)-螺旋(Helix-Loop-Helix，HLH)的核心結(jié)構(gòu)。
在GenBank中搜尋同源序列同已知的兩個(gè)ADD1基因的部分序列同源性是99.9％，即GenBank AY307771和99.1％，即GenBank AF102873，同人的序列同源性82.9％，即GenBank_NM 004176，同鼠的同源性是72.8％，即GenBank U09103，同雞的同源性是65.4％，即GenBank AY029224，相對(duì)AF103873，在全長(zhǎng)序列的1022位g-a、1034位t-c、108位a-g有突變，相對(duì)AY307771，532位a-g、625位c-t有突變，600位c-t突變導(dǎo)致氨基酸序列產(chǎn)成Leu-Pro的突變。以上突變位點(diǎn)均有可能在標(biāo)記輔助選擇中應(yīng)用。
ADD1基因的cDNA序列如下CGCCGGCGCC ATGGACGAGC CGCCCTTCAC AGAGGCAGCC TTGGAGCAGG CGCTGGCCGA 60GCCATGCGAG CTGGACGCGG CGCTGCTGAC CGACATCGAA GACATGCTTC AGCTCATCAA 120CAACCAAGAC AGCGACTTCC CCGGCCTGTT CGACGCGCCC TACGCTGGCG TTGCAGGAGG 180CACGGACCCC ACCAGTCCTG ATGCCAGCTC CCCAGGCAGC CCGACGCCGC CTCCTTCCAC 240CATGAGCTCC CCGCTTGAAG GCTTCCTGGG GGGGGCCAGG ACGCCGCCAC CGCCCCCCGT 300GTCCCCAACC CAGCCTGCAC CCACCCCGCT GAAGATGTAC CCGTCGGTGC CTGCCTTCTC 360GCCTGGGCCG GGCATCAAGG AGGAGCCAGT GCCACTGACC ATCCTGCAGC CCCCCACCCC 420ACAGCCCCTG TCTGGGGCTC TCCTGCCCCA GAGCCTTCCA GCCCTCGCCC CTCCGCAGTT 480
GAGCCCTGCC CCCGTGTTGG GCTACCCCAG CCCTCCTGGA AGCTTCTCCT CGGCGACCCC 540TCCAGGGAGC ACCTCACAGA CGCTGCCTGG CCTGCCGCTG GCCTCTCTGC CCGGGGTCCT 600GCCCGTCTCC GTGCACACCC AGGTTCAAAG TGCGGCCCCC CAGCAGCTGT TGACAGCCAC 660GGCCACCCCC GTGGTGTCCC CTGGAACAAC CACTGTGACC TCGCAGATCC AGCAGGTCCC 720GGTCCTGCTG CAGCCCCACT TCATCAAGGC GGACTCCCTG CTCCTGACGA CCATGAAAAC 780AGACATGGGG ACCCCTGTGA AGGCGGCGGG CATCGGCTCC CTGGCCCCTG GCACAGCCGT 840GCAGGCAGCA CCTTTGCAGA CCCTGGTGAG CGGCGGGACC ATCCTGGCGA CGGTGCCTCT 900GGTAGTGGAC ACTGACAAGC TGCCCATCAA CCGCCTGGCA GCTGGGGGCA AAGCCCTGAG 960CTCAGGCCAG AGCCGTGGTG AGAAGCGGAC GGCTCACAAT GCCATCGAGA AACGCTACCG 1020CTCCTCCATC AATGACAAGA TCATCGAGCT CAAGGACCTG GTGGTGGGCA CGGAGGCGAA 1080GCTGAATAAA TCCGCCGTCT TGCGCAAGGC CATCGACTAC ATCCGCTTCC TTCAGCAGAG 1140CAACCAGAAG CTCAAGCAGG AGAACCTGAG TCTGCGGACT GCTGCCCACA AAAGCAAGTC 1200TCTGAAGGAC CTGGTGTCCT GCAGCAGCGG AGGCCGCACC GACGTGCCCA TGGAGGGTGT 1260GAAGCCGGAG GTGGTAGACA CCCTTAGCCC GCCCCCCTCC GACGCCGGCT CGCCCTCCCA 1320GAGCAGCCCC TTGTCCCTCG GCAGCAGGGG CAGCAGCAGC GGTGGCAGTG GCAGTGACTC 1380AGAGCCCGAC AGCCCGGTTT TTGAGGACAG CCAGATGAAG CCAGAGCAGC TGCCGGCCCC 1440CCACGGCCGG GGCATGCTGG ACCGCTCCCG CCTGGCCCTG TGCGTGCTCG TCTTCCTCTG 1500TCTCTCCTGC AACCCCTTGG CCTCACTGAT GGGCAGCTGG GCTCTCCCTG GCCCCTCCGA 1560TGCCACCAGC GCCTACCACG GGCCCTGGCG CAGCGTACTG GGCGCTGAGG GCAGAGATGG 1620CCCTGGCTGG GTCCTGTGGC TGCTGCCCCC GCTGGTCTGG CTGACGAATG GGCTGCTGGT 1680GCTGCTCTTC TTGGCGCTTC TCTTTGTCTA TGGAGAGCCG GTCACGCGGC CCCACTCGGA 1740TCCAGCTGTG CGCTTCTGGA GGCATCGCAA GCAGGCCGAC CTGGACCTGG CCCGGGGGGA 1800CTTCGCCCAG GCTGCCCAGC AGCTGTGGCT GGCCCTGCGG GCGCTGGGCC GGCCCCTGCC 1860CACCTCCCAC CTGGACCTGG CCTGCAGCCT GCTCTGGAAC CTCATCCGCC ACCTGCTGCA 1920GCGTCTCTGG GTGGGCCGCT GGCTGGCGGG CCGGGCCGGG GGCCTGCGGA GGGACAGCGC 1980CCTGGAGGCG GACACCCGCA CCAGCGCCTG TGACGCGGCC CTCGTCTACC ACAAGCTGCA 2040CCAGCTGCAC ACCATGGGGA AGTACCCAGG CGGCACCTTC GATGCCGCCA ACCTGGCGCT 2100GAGTGCCCTG AACCTGGCGG AGTGTGCGGG TGATGCCCTG TCCGTGGCCG TGCTGGCGGA 2160GGTCTATGTG GCCGCTGCCC TGCGAGTCAA GACCAGTCTC CCCCGGGCCT TGCACTTTCT 2220GACCCGCTTC TTCCTGAGTA GCGCCCGCCA GGCCTGCCTG GCACAAAGCG GCTCGGTGCC 2280TGTTGCCATG CAGTGGCTCT GCCACCCTGT GGGCCAGCGT TTCTTCGTGG ATGGGGACTG 2340GGCCGTGTGC GGTGCCCCCC GGGACAGCTT GTACAGCGTG GCTGGGAACC CAGTGGACCC 2400CCTGGCCCAG GTGACTCAGT TGTTCCGTGA ACACCTCTTG GAGCAAGCCC TGCATTGCGT 2460GGCCCAGCCC AGCCCCGGCC CTGGATCAGC TGATGGGGAC AGGGAATTCT CAGAQQCCCT 2420CGGGTTCCTG CAGCTGCTCA ACAGCTGTTG TGACACAGCC GGGGCTCCTG CCTGCAGCTT 2580CTCCATTGCC TCCAGCACAG CCGCCACGGC CGGCACAGAC CCGGTCGCCA AGTGGTGGGC 2640CTCGCTGACG GCTGTGGTGA CCCACTGGCT GGGGCGGGAC GAGGAGGCGG CCGAGCGGCT 2700GTACCCGCTG GTGGAGCACC TGCCCCGCGC CCTGCAGGAG TCCGAGAGAC CCCTGCCCAG 2760GGCAGCTCTG CACTCCTTCA AGGCCGCCCG GGCCCTGCTG GGCCGCGGGA AGGCAGAGTC 2820TGGCTCAGCC AGCCTGGCCA TGTGTGAGAA GGCCAGTGGG TACCTGCAGG ACAGCCTGGC 2880CGCCACGCCA GCCGGCAGCT CCATTGACAA GGCCATGCAG CTGCTCCTGT GTGTCCTGCT 2940CCTTGTGGCG CGCACCAGCC TGTGGCAGCG GCAGAAGCCG CCCCCACCCT CCCAGGCCTC 3000GCAGGGCTCG AGCAGCGGGG CCCAGGCCTC TGCGCTCGAG CTGCGCGGCT TCCAGAGGGA 3060CCTGAGTGGC CTGAGGCGCC TGGCGCAGAG CTTCCGGCCT GCCATGCGGA GGGTGTTCCT 3120
CCATGAGGCC ACCGCCAGGC TGATGGCCGG GGCCAGCCCC GCGCGGACGC ACCAGCTCCT 3180GGACCGCAGT CTGAGGAGGA GGGCGGGCCC CTGCGGCAGA GGAGGCGCGG CGGCCGCGGC 3240GGCGGCGGAG CTGGAACCGC GGCCCACGCG GCGGGAGCAG GCCGAGGCCC TGCTGCTCGC 3300CTCCTGCTAC CTGCCGCCCG GCTTCCTGTC GGCGCCGGGG CAGCGCGTGG GCATGCTGGC 3360CGAGGCGGCG CGCACGCTCG AGAAGCTCGG CGACCGCCGG CTGCTGCACG ACTGCCAGCA 3420GATGCTCATG CGCCTGGGCG GCGGGACCAC CGTGACCTCC AGCTAGACCC CTGCGGGCGG 3480CCCAGCCCCA GCGACCCCGT CTCAGTCTCG ACGGCCGAGG GCAGCTCTGG AGCCCCGGCC 3540CCCGGCTCGC CGGCGGAGTG CCCGGTCCCT GGGGGTATGG AGACGCGGGG CCCGGCGTTG 3600ACGGGGCCGT CCAGCCCGCA CCCCGGGTCG ACGAGCGGCC GCCAGGGTGG TGCTGGCCTC 3660TGGTGGCCGG CCGAGGGATT GCCGGGGCCT GGCGGCCGCC AGGTGCCTCC CATTCCACCC 3720ACTGGCAGCC ACTCCGCGGC TTTCCCTCTC TGTCCAGGGG GAGGAAAGGG GTGCGTTTCA 3780CTGGGCCGAG GGGCCGGCTT GGCCTTCCTT GCCGCCGGGC GCCTCCTTCC 3830ADD1基因編碼蛋白的氨基酸序列如下MDEPPFTEAA LEQALAEPCE LDAALLTDIE DMLQLINNQD SDFPGLFDAP YAGVAGGTDP 60TSPDASSPGS PTPPPSTMSS PLEGFLGGAR TPPPPPVSPT QPAPTPLKMY PSVPAFSPGP 120GIKEEPVPLT ILQPPTPQPL SGALLPQSLP ALAPPQLSPA PVLGYPSPPG SFSSATPPGS 180TSQTLPGLPL ASLPGVLPVS VHTQVQSAAP QQLLTATATP VVSPGTTTVT SQIQQVPVLL 240QPHFIKADSL LLTTMKTDMG TPVKAAGIGS LAPGTAVQAA PLQTLVSGGT ILATVPLVVD 300TDKLPINRLA AGGKALSSGQ SRGEKRTAHN AIEKRYRSSI NDKIIELKDL VVGTEAKLNK 360SAVLRKAIDY IRFLQQSNQK LKQENLSLRT AAHKSKSLKD LVSCSSGGRT DVPMEGVKPE 420VVDTLSPPPS DAGSPSQSSP LSLGSRGSSS GGSGSDSEPD SPVFEDSQMK PEQLPAPHGR 480GMLDRSRLAL CVLVFLCLSC NPLASLMGSW ALPGPSDATS AYHGPWRSVL GAEGRDGPGW 540VLWLLPPLVW LTNGLLVLLF LALLFVYGEP VTRPHSDPAV RFWRHRKQAD LDLARGDFAQ 600AAQQLWLALR ALGRPLPTSH LDLACSLLWN LIRHLLQRLW VGRWLAGRAG GLRRDSALEA 660DTRTSACDAA LVYHKLHQLH TMGKYPGGHL DAANLALSAL NLAECAGDAL SVAVLAEVYV 720AAALRVKTSL PRALHFLTRF FLSSARQACL AQSGSVPVAM QWLCHPVGHR FFVDGDWAVC 780GAPRDSLYSV AGNPVDPLAQ VTQLFREHLL EQALHCVAQP SPGPGSADGD REFSEALGFL 840QLLNSCCDTA GAPACSFSIA SSTAATAGTD PVAKWWASLT AVVTHWLGRD EEAAERLYPL 900VEHLPRALQE SERPLPRAAL HSFKAARALL GRGKAESGSA SLAMCEKASG YLQDSLAATP 960AGSSIDKAMQ LLLCDLLLVA RTSLWQRQKP PPPSQASQGS SSGAQASALE LRGFQRDLSG 1020LRRLAQSFRP AMRRVFLHEA TARLMAGASP ARTHQLLDRS LRRRAGPCGR GGAAAAAAAE 1080LEPRPTRREQ AEALLLASCY LPPGFLSAPG QRVGMLAEAA RTLEKLGDRR LLHDCQQMLM 1140RLGGGTTVTS S 1151本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，目前，在豬ADD1基因的研究中只有部分的cDNA序列(GenBank AY307771和AF102873)。發(fā)明首次克隆出全長(zhǎng)cDNA序列。本發(fā)明的一方面可以通過(guò)制備該基因的蛋白，用于研究該基因在豬脂肪細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇水平等過(guò)程中的作用。另一方面可以通過(guò)標(biāo)記輔助選擇(MAS)的方法對(duì)瘦肉型豬和低膽固醇型豬的生產(chǎn)和育種中發(fā)揮指導(dǎo)性作用。


圖1為豬脾臟組織總RNA瓊脂糖電泳中28S和18S RNA亮度之比大約為2，說(shuō)明組織總RNA未被降解，可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
圖2用脾臟組織總RNA的反轉(zhuǎn)錄為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖經(jīng)過(guò)凝膠成像系統(tǒng)分析，片斷大小為750bp。
圖3豬同其它物種的ADD1基因(SREBF1基因)和SREBF2基因間編碼序列間的聚類(lèi)分析圖。
圖4為借助rpsBlast軟件分析得到螺旋-環(huán)-螺旋(Helix-Loop-Helix，HLH)核心結(jié)構(gòu)的三維圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步描述這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1豬ADD1基因的克隆1.組織分離(Isolation)從屠宰場(chǎng)采集豬新鮮的脾臟組織(品種為“梅山豬”)迅速放入液氮中冷凍保存，并且將其帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-70℃保存，準(zhǔn)備提取組織總RNA。
2.總RNA的分離(Total RNA isolation)(1)提取RNA的準(zhǔn)備工作玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡過(guò)夜，用自來(lái)水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗2遍，180℃烘烤4小時(shí)。
勻漿器、電泳槽用3％的雙氧水浸泡20-30分鐘，再用0.1％的DEPC水沖洗。由于未滅活的DEPC對(duì)PCR反應(yīng)有影響，可用0.5％的SDS處理。
Tip頭、EP管用0.1％的DEPC水浸泡過(guò)夜，高壓滅菌使DEPC失活。
雙蒸水和溶液用DEPC處理，即每100ml水或溶液加0.1mlDEPC液，室溫放置過(guò)夜，高壓滅菌30分鐘使DEPC失活。
(2)組織總RNA提取取100mg在液氮凍存組織樣加入有1ml Trizol(trizal reagent，invitrogen BRL，USA)在勻漿器中勻漿。4℃12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。吸取上清液，15-30℃溫育5分鐘。加0.2ml氯仿，蓋上蓋子，用手劇烈震蕩15秒。15-30℃溫育2-3分鐘。4℃12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。吸取上清液，加0.8ml異丙醇，混合均勻。15-30℃溫育10分鐘，4℃12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清，加1ml 75％乙醇洗滌RNA，4℃ 7500轉(zhuǎn)/分鐘10分鐘。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分裝，-80℃保存。
(3)組織總RNA的鑒定通過(guò)分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量并且用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量，具體方法如下電泳槽用RNA清洗液(100mM NaOH，1mM EDTA)浸泡4-5小時(shí)，再用DEPC處理過(guò)的水反復(fù)沖洗數(shù)次后倒入1×TBE待用。瓊脂糖凝膠用1×TBE配制。在10ul上樣緩沖液(2×TBE，13％菲可，0.1％溴酚蘭，7M尿素)中加入1ul以上組織總RNA，65℃變性10分鐘后立即放入冰水中2-3分鐘。點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠中電泳。
3.全長(zhǎng)cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據(jù)豬的已知部分的cDNA(GenBank AY307771)設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄引物(5’-ACCGTCGCCAGGAT-3’)和PCR下游引物(5’-CAGGGAGTCCGCCGTTGAT-3’)，根據(jù)人和鼠的氨基酸保守序列設(shè)計(jì)PCR上游引物(5’-CGCCGGCGCCATGGACGAGC-3’)利用同源性基因克隆原理，采用RT-PCR同5’-RACE(TaKaRa試劑盒)相結(jié)合的方法進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分三個(gè)階段進(jìn)行(1)cDNA的合成利用脾臟組織總RNA 5ug按照TaKaRa 5’-RACE試劑盒配置反應(yīng)液和進(jìn)行PCR反應(yīng)。
(2)雜合鏈RAN的分解利用第一步反應(yīng)液按照TaKaRa 5’-RACE試劑盒配置反應(yīng)液，用Rnase H 30℃消化1小時(shí)，消化雜合鏈中的RNA后，將單鏈DNA稀釋備用。
(3)PCR反應(yīng)用稀釋過(guò)的第二步的反應(yīng)液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR[BP001(SEQ ID NO.1)+BP002(SEQ ID NO.2)]。其反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃ 10min.得到760bp的DNA片斷，其中有276bp同豬的已知片斷同源性高達(dá)98.91％(4)測(cè)序?qū)CR產(chǎn)物回收后同PMD 18-T Vector(TaKaRa)相連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌JM109中。經(jīng)過(guò)菌株P(guān)CR和雙酶切鑒定后的菌株在LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過(guò)夜，送交測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)拼接后共760bp。
實(shí)施例2豬ADD1基因的序列分析和同源型比較1、豬ADD1基因的序列分析將cDNA序列中CDS部分用primer priemer 5.0軟件翻譯成氨基酸序列后在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi上用rpsBlast軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。發(fā)現(xiàn)在氨基酸序列的320-380處有螺旋-環(huán)-螺旋(Helix-Loop-Helix，HLH)的核心結(jié)構(gòu)(見(jiàn)附圖4)。
2、豬ADD1基因序列的同源性分析將該基因氨基酸序列和堿基序列在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/BLAST/Blast.cgi上分別用Blastn和Blastp軟件進(jìn)行同源性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因的堿基序列和氨基酸序列同人及鼠的ADD1基因有高度同源性。
3、系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的構(gòu)建用DNAMAN軟件將不同物種的ADD1基因和SREBP2基因(SREBPs家族中另外一個(gè)基因)序列來(lái)繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在豬ADD1基因同哺乳動(dòng)物人、狗和鼠基因間同源性較高，而同雞的同源性只有66％。在SREBPs基因家族中兩個(gè)基因間同源性有51％。(見(jiàn)附圖3)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)所得到的序列為目標(biāo)序列。
在同原有豬的序列的同源性比較中發(fā)現(xiàn)了6處突變位點(diǎn)。同AF103873比較中發(fā)現(xiàn)，在全長(zhǎng)序列的1022位g-a、1034位t-c、108位a-g的突變。同AY307771比較中發(fā)現(xiàn)532位a-g、625位c-t的突變，600位c-t突變導(dǎo)致Leu-Pro的突變。以上突變位點(diǎn)均有可能在標(biāo)記輔助選擇中應(yīng)用。
表1同AF103873Query 994 tcacaatgccatcgagaaacgctaccgctcctccatcaatgacaagatcatcgagctcaa 1053|||||||||||||||||| ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||AF103873301 tcacaatgccatcgagaagcgctaccgctcttccatcaatgacaagatcatcgagctcaa 360
Query1054 ggacctggtggtgggcacggaggcgaagctgaataaatccgccgtcttgcgcaaggccat 1113||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||AF103873361 ggacctggtggtgggcacggaggcgaaactgaataaatccgccgtcttgcgcaaggccat 420同AY307771Query 485 cctgcccccgtgttgggctaccccagccctcctggaagcttctcctcggcgacccctcca 544||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||AY307771 1 cctgcccccgtgttgggctaccccagccctcctggaagcttctcctcagcgacccctcca 60Query 545 gggagcacctcacagacgctgcctggcctgccgctggcctctctgcccggggtcctgccc 604||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||AY30777161 gggagcacctcacagacgctgcctggcctgccgctggcctctctgcccggggtcccgccc 120Query 605 gtctccgtgcacacccaggttcaaagtgcggccccccagcagctgttgacagccacggcc 664|||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||AY307771121 gtctccgtgcacacccaggtccaaagtgcggccccccagcagctgttgacagccacggcc 180Query豬脂肪細(xì)胞分化和定向因子1的核酸序列本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類(lèi)型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1ACCGTCGCCAGGAT(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類(lèi)型寡核苷酸
(iii).序列描述SEQ ID NO.2CGCCGGCGCCATGGACGAGC(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類(lèi)型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.3CAGGGAGTCCGCCTTGAT(4)SEQ ID NO.4的信息
<110>上海交通大學(xué)<120>豬ADD1基因蛋白編碼序列<140>
<141>2004-01-6<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3830<212>DNA<213>豬Sus scrofa ADD1蛋白<400>1CGCCGGCGCC ATGGACGAGC CGCCCTTCAC AGAGGCAGCC TTGGAGCAGG CGCTGGCCGA 60GCCATGCGAG CTGGACGCGG CGCTGCTGAC CGACATCGAA GACATGCTTC AGCTCATCAA 120CAACCAAGAC AGCGACTTCC CCGGCCTGTT CGACGCGCCC TACGCTGGCG TTGCAGGAGG 180CACGGACCCC ACCAGTCCTG ATGCCAGCTC CCCAGGCAGC CCGACGCCGC CTCCTTCCAC 240CATGAGCTCC CCGCTTGAAG GCTTCCTGGG GGGGGCCAGG ACGCCGCCAC CGCCCCCCGT 300GTCCCCAACC CAGCCTGCAC CCACCCCGCT GAAGATGTAC CCGTCGGTGC CTGCCTTCTC 360GCCTGGGCCG GGCATCAAGG AGGAGCCAGT GCCACTGACC ATCCTGCAGC CCCCCACCCC 420ACAGCCCCTG TCTGGGGCTC TCCTGCCCCA GAGCCTTCCA GCCCTCGCCC CTCCGCAGTT 480GAGCCCTGCC CCCGTGTTGG GCTACCCCAG CCCTCCTGGA AGCTTCTCCT CGGCGACCCC 540TCCAGGGAGC ACCTCACAGA CGCTGCCTGG CCTGCCGCTG GCCTCTCTGC CCGGGGTCCT 600GCCCGTCTCC GTGCACACCC AGGTTCAAAG TGCGGCCCCC CAGCAGCTGT TGACAGCCAC 660GGCCACCCCC GTGGTGTCCC CTGGAACAAC CACTGTGACC TCGCAGATCC AGCAGGTCCC 720GGTCCTGCTG CAGCCCCACT TCATCAAGGC GGACTCCCTG CTCCTGACGA CCATGAAAAC 780AGACATGGGG ACCCCTGTGA AGGCGGCGGG CATCGGCTCC CTGGCCCCTG GCACAGCCGT 840GCAGGCAGCA CCTTTGCAGA CCCTGGTGAG CGGCGGGACC ATCCTGGCGA CGGTGCCTCT 900GGTAGTGGAC ACTGACAAGC TGCCCATCAA CCGCCTGGCA GCTGGGGGCA AAGCCCTGAG 960CTCAGGCCAG AGCCGTGGTG AGAAGCGGAC GGCTCACAAT GCCATCGAGA AACGCTACCG 1020
CTCCTCCATC AATGACAAGA TCATCGAGCT CAAGGACCTG GTGGTGGGCA CGGAGGCGAA1080GCTGAATAAA TCCGCCGTCT TGCGCAAGGC CATCGACTAC ATCCGCTTCC TTCAGCAGAG1140CAACCAGAAG CTCAAGCAGG AGAACCTGAG TCTGCGGACT GCTGCCCACA AAAGCAAGTC1200TCTGAAGGAC CTGGTGTCCT GCAGCAGCGG AGGCCGCACC GACGTGCCCA TGGAGGGTGT1260GAAGCCGGAG GTGGTAGACA CCCTTAGCCC GCCCCCCTCC GACGCCGGCT CGCCCTCCCA1320GAGCAGCCCC TTGTCCCTCG GCAGCAGGGG CAGCAGCAGC GGTGGCAGTG GCAGTGACTC1380AGAGCCCGAC AGCCCGGTTT TTGAGGACAG CCAGATGAAG CCAGAGCAGC TGCCGGCCCC1440CCACGGCCGG GGCATGCTGG ACCGCTCCCG CCTGGCCCTG TGCGTGCTCG TCTTCCTCTG1500TCTCTCCTGC AACCCCTTGG CCTCACTGAT GGGCAGCTGG GCTCTCCCTG GCCCCTCCGA1560TGCCACCAGC GCCTACCACG GGCCCTGGCG CAGCGTACTG GGCGCTGAGG GCAGAGATGG1620CCCTGGCTGG GTCCTGTGGC TGCTGCCCCC GCTGGTCTGG CTGACGAATG GGCTGCTGGT1680GCTGCTCTTC TTGGCGCTTC TCTTTGTCTA TGGAGAGCCG GTCACGCGGC CCCACTCGGA1740TCCAGCTGTG CGCTTCTGGA GGCATCGCAA GCAGGCCGAC CTGGACCTGG CCCGGGGGGA1800CTTCGCCCAG GCTGCCCAGC AGCTGTGGCT GGCCCTGCGG GCGCTGGGCC GGCCCCTGCC1860CACCTCCCAC CTGGACCTGG CCTGCAGCCT GCTCTGGAAC CTCATCCGCC ACCTGCTGCA1920GCGTCTCTGG GTGGGCCGCT GGCTGGCGGG CCGGGCCGGG GGCCTGCGGA GGGACAGCGC1980CCTGGAGGCG GACACCCGCA CCAGCGCCTG TGACGCGGCC CTGCTCTACC ACAAGCTGCA2040CCAGCTGCAC ACCATGGGGA AGTACCCAGG CGGGCACCTC GATGCCGCCA ACCTGGCGCT2100GAGTGCCCTG AACCTGGCGG AGTGTGCGGG TGATGCCCTG TCCGTGGCCG TGCTGGCGGA2160GGTCTATGTG GCCGCTGCCC TGCGAGTCAA GACCAGTCTC CCCCGGGCCT TGCACTTTCT2220GACCCGCTTC TTCCTGAGTA GCGCCCGCCA GGCCTGCCTG GCACAAAGCG GCTCGGTGCC2280TGTTGCCATG CAGTGGCTCT GCCACCCTGT GGGCCACCGT TTCTTCGTGG ATGGGGACTG2340GGCCGTGTGC GGTGCCCCCC GGGACAGCTT GTACAGCGTG GCTGGGAACC CAGTGGACCC2400CCTGGCCCAG GTGACTCAGT TGTTCCGTGA ACACCTCTTG GAGCAAGCCC TGCATTGCGT2460GGCCCAGCCC AGCCCCGGCC CTGGATCAGC TGATGGGGAC AGGGAATTCT CAGAGGCCCT2420CGGGTTCCTG CAGCTGCTCA ACAGCTGTTG TGACACAGCC GGGGCTCCTG CCTGCAGCTT2580CTCCATTGCC TCCAGCACAG CCGCCACGGC CGGCACAGAC CCGGTCGCCA AGTGGTGGGC2640CTCGCTGACG GCTGTGGTGA CCCACTGGCT GGGGCGGGAC GAGGAGGCGG CCGAGCGGCT2700GTACCCGCTG GTGGAGCACC TGCCCCGCGC CCTGCAGGAG TCCGAGAGAC CCCTGCCCAG2760
GGCAGCTCTG CACTCCTTCA AGGCCGCCCG GGCCCTGCTG GGCCGCGGGA AGGCAGAGTC2820TGGCTCAGCC AGCCTGGCCA TGTGTGAGAA GGCCAGTGGG TACCTGCAGG ACAGCCTGGC2880CGCCACGCCA GCCGGCAGCT CCATTGACAA GGCCATGCAG CTGCTCCTGT GTGACCTGCT2940CCTTGTGGCG CGCACCAGCC TGTGGCAGCG GCAGAAGCCG CCCCCACCCT CCCAGGCCTC3000GCAGGGCTCG AGCAGCGGGG CCCAGGCCTC TGCGCTCGAG CTGCGCGGCT TCCAGAGGGA3060CCTGAGTGGC CTGAGGCGCC TGGCGCAGAG CTTCCGGCCT GCCATGCGGA GGGTGTTCCT3120CCATGAGGCC ACCGCCAGGC TGATGGCCGG GGCCAGCCCC GCGCGGACGC ACCAGCTCCT3180GGACCGCAGT CTGAGGAGGA GGGCGGGCCC CTGCGGCAGA GGAGGCGCGG CGGCCGCGGC3240GGCGGCGGAG CTGGAACCGC GGCCCACGCG GCGGGAGCAG GCCGAGGCCC TGCTGCTCGC3300CTCCTGCTAC CTGCCGCCCG GCTTCCTGTC GGCGCCGGGG CAGCGCGTGG GCATGCTGGC3360CGAGGCGGCG CGCACGCTCG AGAAGCTCGG CGACCGCCGG CTGCTGCACG ACTGCCAGCA3420GATGCTCATG CGCCTGGGCG GCGGGACCAC CGTGACCTCC AGCTAGACCC CTGCGGGCGG3480CCCAGCCCCA GCGACCCCGT CTCAGTCTCG ACGGCCGAGG GCAGCTCTGG AGCCCCGGCC3540CCCGGCTCGC CGGCGGAGTG CCCGGTCCCT GGGGGTATGG AGACGCGGGG CCCGGCGTTG3600ACGGGGCCGT CCAGCCCGCA CCCCGGGTCG ACGAGCGGCC GCCAGGGTGG TGCTGGCCTC3660TGGTGGCCGG CCGAGGGATT GCCGGGGCCT GGCGGCCGCC AGGTGCCTCC CATTCCACCC3720ACTGGCAGCC ACTCCGCGGC TTTCCCTCTC TGTCCAGGGG GAGGAAAGGG GTGCGTTTCA3780CTGGGCCGAG GGGCCGGCTT GGCCTTCCTT GCCGCCGGGC GCCTCCTTCC 3830<210>2<211>1151<212>PRT<213>豬Sus scrofa ADD1蛋白<400>2MDEPPFTEAA LEQALAEPCE LDAALLTDIE DMLQLINNQD SDFPGLFDAP YAGVAGGTDP60TSPDASSPGS PTPPPSTMSS PLEGFLGGAR TPPPPPVSPT QPAPTPLKMY PSVPAFSPGP120GIKEEPVPLT ILQPPTPQPL SGALLPQSLP ALAPPQLSPA PVLGYPSPPG SFSSATPPGS180TSQTLPGLPL ASLPGVLPVS VHTQVQSAAP QQLLTATATP VVSPGTTTVT SQIQQVPVLL240QPHFIKADSL LLTTMKTDMG TPVKAAGLGS LAPGTAVQAA PLQTLVSGGT ILATVPLVVD300
TDKLPINRLA AGGKALSSGQ SRGEKRTAHN AIEKRYRSSI NDKIIELKDL VVGTEAKLNK360SAVLRKAIDY IRFLQQSNQK LKQENLSLRT AAHKSKSLKD LVSCSSGGRT DVPMEGVKPE420VVDTLSPPPS DAGSPSQSSP LSLGSRGSSS GGSGSDSEPD SPVFEDSQMK PEQLPAPHGR480GMLDRSRLAL CVLVFLCLSC NPLASLMGSW ALPGPSDATS AYHGPWRSVL GAEGRDGPGW540VLWLLPPLVW LTNGLLVLLF LALLFVYGEP VTRPHSDPAV RFWRHRKQAD LDLARGDFAQ600AAQQLWLALR ALGRPLPTSH LDLACSLLWN LIRHLLQRLW VGRWLAGRAG GLRRDSALEA660DTRTSACDAA LVYHKLHQLH TMGKYPGGHL DAANLALSAL NLAECAGDAL SVAVLAEVYV720AAALRVKTSL PRALHFLTRF FLSSARQACL AQSGSVPVAM QWLCHPVGHR FFVDGDWAVC780GAPRDSLYSV AGNPVDPLAQ VTQLFREHLL EQALHCVAQP SPGPGSADGD REFSEALGFL840QLLNSCCDTA GAPACSFSIA SSTAATAGTD PVAKWWVSLT AVVTHWLGRD EEAAERLYPL900VEHLPRALQE SERPLPRAAL HSFKAARALL GRGKAESGSA SLAMCEKASG YLQDSLAATP960AGSSIDKAMQ LLLCDLLLVA RTSLWQRQKP PPPSQASQGS SSGAQASALE LRGFQRDLSG1020LRRLAQSFRP AMRRVFLHEA TARLMAGASP ARTHQLLDRS LRRRAGPCGR GGAAAAAAAE1080LEPRPTRREQ AEALLLASCY LPPGFLSAPG QRVGMLAEAA RTLEKLGDRR LLHDCQQMLM1140RLGGGTTVTS S 115權(quán)利要求
1.一種豬脂肪細(xì)胞定向和分化因子1的基因序列，其特征在于，從豬的脾臟細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出的ADD1基因，其cDNA序列和編碼蛋白的氨基酸序列，該基因全長(zhǎng)3830bp，開(kāi)放閱讀框11bp-3453bp區(qū)段，編碼有1151個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其3’端非編碼序列長(zhǎng)10bp，5’端非編碼序列長(zhǎng)366bp，在蛋白質(zhì)序列的320-380處有螺旋-環(huán)-螺旋的核心結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬脂肪細(xì)胞定向和分化因子1的基因序列，其特征是，在GenBank中搜尋同源序列同已知的兩個(gè)ADD1基因的部分序列同源性是99.9％，即GenBank AY307771和99.1％，即GenBank AF102873，同人的序列同源性82.9％，即GenBank_NM 004176，同鼠的同源性是72.8％，即GenBank U09103，同雞的同源性是65.4％，即GenBank AY029224，相對(duì)AF103873，在全長(zhǎng)序列的1022位g-a、1034位t-c、108位a-g有突變，相對(duì)AY307771，532位a-g、625位c-t有突變，600位c-t突變導(dǎo)致氨基酸序列產(chǎn)成Leu-Pro的突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬脂肪細(xì)胞定向和分化因子1的基因序列，其特征是，ADD1基因的cDNA序列CGCCGGCGCCATGGACGAGCCGCCCTTCACAGAGGCAGCCTTGGAGCAGGCGCTGGCCGAGCCATGCGAGCTGGACGCGGCGCTGCTGACCGACATCGAAGACATGCTTCAGCTCATCAACAACCAAGACAGCGACTTCCCCGGCCTGTTCGACGCGCCCTACGCTGGCGTTGCAGGAGGCACGGACCCCACCAGTCCTGATGCCAGCTCCCCAGGCAGCCCGACGCCGCCTCCTTCCACCATGAGCTCCCCGCTTGAAGGCTTCCTGGGGGGGGCCAGGACGCCGCCACCGCCCCCCGTGTCCCCAACCCAGCCTGCACCCACCCCGCTGAAGATGTACCCGTCGGTGCCTGCCTTCTCGCCTGGGCCGGGCATCAAGGAGGAGCCAGTGCCACTGACCATCCTGCAGCCCCCCACCCCACAGCCCCTGTCTGGGGCTCTCCTGCCCCAGAGCCTTCCAGCCCTCGCCCCTCCGCAGTTGAGCCCTGCCCCCGTGTTGGGCTACCCCAGCCCTCCTGGAAGCTTCTCCTCGGCGACCCCTCCAGGGAGCACCTCACAGACGCTGCCTGGCCTGCCGCTGGCCTCTCTGCCCGGGGTCCTGCCCGTCTCCGTGCACACCCAGGTTCAAAGTGCGGCCCCCCAGCAGCTGTTGACAGCCACGGCCACCCCCGTGGTGTCCCCTGGAACAACCACTGTGACCTCGCAGATCCAGCAGGTCCCGGTCCTGCTGCAGCCCCACTTCATCAAGGCGGACTCCCTGCTCCTGACGACCATGAAAACAGACATGGGGACCCCTGTGAAGGCGGCGGGCATCGGCTCCCTGGCCCCTGGCACAGCCGTGCAGGCAGCACCTTTGCAGACCCTGGTGAGCGGCGGGACCATCCTGGCGACGGTGCCTCTGGTAGTGGACACTGACAAGCTGCCCATCAACCGCCTGGCAGCTGGGGGCAAAGCCCTGAGCTCAGGCCAGAGCCGTGGTGAGAAGCGGACGGCTCACAATGCCATCGAGAAACGCTACCGCTCCTCCATCAATGACAAGATCATCGAGCTCAAGGACCTGGTGGTGGGCACGGAGGCGAAGCTGAATAAATCCGCCGTCTTGCGCAAGGCCATCGACTACATCCGCTTCCTTCAGCAGAGCAACCAGAAGCTCAAGCAGGAGAACCTGAGTCTGCGGACTGCTGCCCACAAAAGCAAGTCTCTGAAGGACCTGGTGTCCTGCAGCAGCGGAGGCCGCACCGACGTGCCCATGGAGGGTGTGAAGCCGGAGGTGGTAGACACCCTTAGCCCGCCCCCCTCCGACGCCGGCTCGCCCTCCCAGAGCAGCCCCTTGTCCCTCGGCAGCAGGGGCAGCAGCAGCGGTGGCAGTGGCAGTGACTCAGAGCCCGACAGCCCGGTTTTTGAGGACAGCCAGATGAAGCCAGAGCAGCTGCCGGCCCCCCACGGCCGGGGCATGCTGGACCGCTCCCGCCTGGCCCTGTGCGTGCTCGTCTTCCTCTGTCTCTCCTGCAACCCCTTGGCCTCACTGATGGGCAGCTGGGCTCTCCCTGGCCCCTCCGATGCCACCAGCGCCTACCACGGGCCCTGGCGCAGCGTACTGGGCGCTGAGGGCAGAGATGGCCCTGGCTGGGTCCTGTGGCTGCTGCCCCCGCTGGTCTGGCTGACGAATGGGCTGCTGGTGCTGCTCTTCTTGGCGCTTCTCTTTGTCTATGGAGAGCCGGTCACGCGGCCCCACTCGGATCCAGCTGTGCGCTTCTGGAGGCATCGCAAGCAGGCCGACCTGGACCTGGCCCGGGGGGACTTCGCCCAGGCTGCCCAGCAGCTGTGGCTGGCCCTGCGGGCGCTGGGCCGGCCCCTGCCCACCTCCCACCTGGACCTGGCCTGCAGCCTGCTCTGGAACCTCATCCGCCACCTGCTGCAGCGTCTCTGGGTGGGCCGCTGGCTGGCGGGCCGGGCCGGGGGCCTGCGGAGGGACAGCGCCCTGGAGGCGGACACCCGCACCAGCGCCTGTGACGCGGCCCTCGTCTACCACAAGCTGCACCAGCTGCACACCATGGGGAAGTACCCAGGCGGGCACCTCGATGCCGCCAACCTGGCGCTGAGTGCCCTGAACCTGGCGGAGTGTGCGGGTGATGCCCTGTCCGTGGCCGTGCTGGCGGAGGTCTATGTGGCCGCTGCCCTGCGAGTCAAGACCAGTCTCCCCCGGGCCTTGCACTTTCTGACCCGCTTCTTCCTGAGTAGCGCCCGCCAGGCCTGCCTGGCACAAAGCGGCTCGGTGCCTGTTGCCATGCAGTGGCTCTGCCACCCTGTGGGCCACCGTTTCTTCGTGGATGGGGACTGGGCCGTGTGCGGTGCCCCCCGGGACAGCTTGTACAGCGTGGCTGGGAACCCAGTGGACCCCCTGGCCCAGGTGACTCAGTTGTTCCGTGAACACCTCTTGGAGCAAGCCCTGCATTGCGTGGCCCAGCCCAGCCCCGGCCCTGGATCAGCTGATGGGGACAGGGAATTCTCAGAGGCCCTCGGGTTCCTGCAGCTGCTCAACAGCTGTTGTGACACAGCCGGGGCTCCTGCCTGCAGCTTCTCCATTGCCTCCAGCACAGCCGCCACGGCCGGCACAGACCCGGTCGCCAAGTGGTGGGCCTCGCTGACGGCTGTGGTGACCCACTGGCTGGGGCGGGACGAGGAGGCGGCCGAGCGGCTGTACCCGCTGGTGGAGCACCTGCCCCGCGCCCTGCAGGAGTCCGAGAGACCCCTGCCCAGGGCAGCTCTGCACTCCTTCAAGGCCGCCCGGGCCCTGCTGGGCCGCGGGAAGGCAGAGTCTGGCTCAGCCAGCCTGGCCATGTGTGAGAAGGCCAGTGGGTACCTGCAGGACAGCCTGGCCGCCACGCCAGCCGGCAGCTCCATTGACAAGGCCATGCAGCTGCTCCTGTGTGACCTGCTCCTTGTGGCGCGCACCAGCCTGTGGCAGCGGCAGAAGCCGCCCCCACCCTCCCAGGCCTCGCAGGGCTCGAGCAGCGGGGCCCAGGCCTCTGCGCTCGAGCTGCGCGGCTTCCAGAGGGACCTGAGTGGCCTGAGGCGCCTGGCGCAGAGCTTCCGGCCTGCCATGCGGAGGGTGTTCCTCCATGAGGCCACCGCCAGGCTGATGGCCGGGGCCAGCCCCGCGCGGACGCACCAGCTCCTGGACCGCAGTCTGAGGAGGAGGGCGGGCCCCTGCGGCAGAGGAGGCGCGGCGGCCGCGGCGGCGGCGGAGCTGGAACCGCGGCCCACGCGGCGGGAGCAGGCCGAGGCCCTGCTGCTCGCCTCCTGCTACCTGCCGCCCGGCTTCCTGTCGGCGCCGGGGCAGCGCGTGGGCATGCTGGCCGAGGCGGCGCGCACGCTCGAGAAGCTCGGCGACCGCCGGCTGCTGCACGACTGCCAGCAGATGCTCATGCGCCTGGGCGGCGGGACCACCGTGACCTCCAGCTAGACCCCTGCGGGCGGCCCAGCCCCAGCGACCCCGTCTCAGTCTCGACGGCCGAGGGCAGCTCTGGAGCCCCGGCCCCCGGCTCGCCGGCGGAGTGCCCGGTCCCTGGGGGTATGGAGACGCGGGGCCCGGCGTTGACGGGGCCGTCCAGCCCGCACCCCGGGTCGACGAGCGGCCGCCAGGGTGGTGCTGGCCTCTGGTGGCCGGCCGAGGGATTGCCGGGGCCTGGCGGCCGCCAGGTGCCTCCCATTCCACCCACTGGCAGCCACTCCGCGGCTTTCCCTCTCTGTCCAGGGGGAGGAAAGGGGTGCGTTTCACTGGGCCGAGGGGCCGGCTTGGCCTTCCTTGCCGCCGGGCGCCTCCTTCC。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬脂肪細(xì)胞定向和分化因子1的基因序列，其特征是，ADD1基因編碼蛋白的氨基酸序列MDEPPFTEAALEQALAEPCELDAALLTDIEDMLQLINNQDSDFPGLFDAPYAGVAGGTDPTSPDASSPGSPTPPPSTMSSPLEGFLGGARTPPPPPVSPTQPAPTPLKMYPSVPAFSPGPGIKEEPVPLTILQPPTPQPLSGALLPQSLPALAPPQLSPAPVLGYPSPPGSFSSATPPGSTSQTLPGLPLASLPGVLPVSVHTQVQSAAPQQLLTATATPVVSPGTTTVTSQIQQVPVLLQPHFIKADSLLLTTMKTDMGTPVKAAGIGSLAPGTAVQAAPLQTLVSGGTILATVPLVVDTDKLPINRLAAGGKALSSGQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIIELKDLVVGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQQSNQKLKQENLSLRTAAHKSKSLKDLVSCSSGGRTDVPMEGVKPEVVDTLSPPPSDAGSPSQSSPLSLGSRGSSSGGSGSDSEPDSPVFEDSQMKPEQLPAPHGRGMLDRSRLALCVLVFLCLSCNPLASLMGSWALPGPSDATSAYHGPWRSVLGAEGRDGPGWVLWLLPPLVWLTNGLLVLLFLALLFVYGEPVTRPHSDPAVRFWRHRKQADLDLARGDFAQAAQQLWLALRALGRPLPTSHLDLACSLLWNLIRHLLQRLWVGRWLAGRAGGLRRDSALEADTRTSACDAALVYHKLHQLHTMGKYPGGHLDAANLALSALNLAECAGDALSVAVLAEVYVAAALRVKTSLPRALHFLTRFFLSSARQACLAQSGSVPVAMQWLCHPVGHRFFVDGDWAVCGAPRDSLYSVAGNPVDPLAQVTQLFREHLLEQALHCVAQPSPGPGSADGDREFSEALGFLQLLNSCCDTAGAPACSFSIASSTAATAGTDPVAKWWASLTAVVTHWLGRDEEAAERLYPLVEHLPRALQESERPLPRAALHSFKAARALLGRGKAESGSASLAMCEKASGYLQDSLAATPAGSSIDKAMQLLLCDLLLVARTSLWQRQKPPPPSQASQGSSSGAQASALELRGFQRDLSGLRRLAQSFRPAMRRVFLHEATARLMAGASPARTHQLLDRSLRRRAGPCGRGGAAAAAAAELEPRPTRREQAEALLLASCYLPPGFLSAPGQRVGMLAEAARTLEKLGDRRLLHDCQQMLMRLGGGTTVTSS。
全文摘要
一種用于基因工程技術(shù)領(lǐng)域的豬脂肪細(xì)胞定向和分化因子1的基因序列，從豬的脾臟細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出的ADD1基因，其cDNA序列和編碼蛋白的氨基酸序列，該基因全長(zhǎng)3830bp，開(kāi)放閱讀框11bp－3453bp區(qū)段，編碼有1151個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其3’端非編碼序列長(zhǎng)10bp，5’端非編碼序列長(zhǎng)366bp，在蛋白質(zhì)序列的320－380處有螺旋－環(huán)－螺旋的核心結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的一方面可以通過(guò)制備該基因的蛋白，用于研究該基因在豬脂肪細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇水平等過(guò)程中的作用。另一方面可以通過(guò)標(biāo)記輔助選擇(MAS)的方法對(duì)瘦肉型豬和低膽固醇型豬的生產(chǎn)和育種中發(fā)揮指導(dǎo)性作用。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1563380SQ200410017860
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月22日
發(fā)明者潘玉春, 李長(zhǎng)龍, 孟和, 趙威 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)