專利名稱：同工型雜質(zhì)水平較低的生長(zhǎng)激素及其拮抗劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及制備所需多肽的重組方法。這些方法生成的多肽產(chǎn)物含有水平較低的同工型雜質(zhì)。具體而言，本發(fā)明涉及(1)制備同工型雜質(zhì)降低的生長(zhǎng)激素的重組方法，以及(2)制備同工型雜質(zhì)同樣降低的生長(zhǎng)激素拮抗劑，諸如派格索曼(pegvisomant)，及其蛋白中間體的重組方法。更具體而言，通過(guò)本發(fā)明方法降低的同工型雜質(zhì)分別為生長(zhǎng)激素和生長(zhǎng)激素拮抗劑(或其中間體)的三硫化物和des-phe同工型雜質(zhì)。
背景技術(shù)：
派格索曼(Somavert；Pharmacia Corp.)為人生長(zhǎng)激素受體拮抗劑。其是人生長(zhǎng)激素(“hGH”)在結(jié)構(gòu)上改變的類似物。派格索曼的蛋白組分/中間體(B-2036)的氨基酸序列與hGH的氨基酸序列區(qū)別在9個(gè)位置上。特定氨基酸取代如下H18D，H21N，G120K，R167N，K168A，D171S，K172R，E174S，和I179T。正如本領(lǐng)域充分認(rèn)識(shí)的，第一個(gè)字母(即，H18D)表示hGH的序列在編號(hào)位置處的氨基酸(即，如H18D所示的氨基酸位置18)，其被第二個(gè)字母所示的氨基酸(即，H18D)所取代。因此，H18D表示在野生型hGH氨基酸序列的第18位氨基酸位置處的氨基酸His被氨基酸Asp取代。


圖1A示意性顯示派格索曼(PEG B-2036)的蛋白成分/中間體(B-2036)的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，星號(hào)表明聚乙二醇聚合物(“PEG”單元)連接的潛在位點(diǎn)。另外，派格索曼的蛋白成分/中間體(B-2036-沒(méi)有PEG單元連接)的氨基酸序列表在此識(shí)別成SEQ.ID.NO.1。相比而言，人生長(zhǎng)激素的氨基酸序列表在此識(shí)別成SEQ.ID.NO.2。這兩個(gè)序列表均隨本發(fā)明一起提供。hGH的序列也可參見(jiàn)，Jorgensen等，“Quantifying biosynthetic human growth hormone in Escherichia coliwith electrophoresis under hydrophobic conditions(利用電泳在疏水性條件下定量測(cè)定大腸桿菌中的生物合成人生長(zhǎng)激素)”，J.ChromatographyA 817205-214(1998)。
在結(jié)構(gòu)上，派格索曼為主要有4-6個(gè)PEG單元與之共價(jià)結(jié)合的蛋白(含有191個(gè)氨基酸殘基)。派格索曼的蛋白成分/中間體(B-2036)的分子量為21,998道爾頓。派格索曼中各個(gè)PEG單元的分子量約為5000道爾頓。由此派格索曼的主要分子量約為42,000(4PEG單元/分子)，47,000(5PEG單元/分子)和52,000(6PEG單元/分子)道爾頓。
提到激動(dòng)劑，無(wú)需受理論的約束，據(jù)信當(dāng)單個(gè)hGH分子與其相鄰(和相同)的兩個(gè)受體分子結(jié)合時(shí)，內(nèi)源性hGH激活其受體，誘導(dǎo)激素介導(dǎo)的受體同型二聚化。參見(jiàn)U.S.專利Nos.5,849,535和6,057,292。hGH的活性依賴于其結(jié)合兩個(gè)相鄰(和相同)受體的能力，這兩個(gè)受體跨越在相同hGH分子上的兩個(gè)單獨(dú)結(jié)合位點(diǎn)(位點(diǎn)1和位點(diǎn)2)。這些hGH結(jié)合位點(diǎn)命名為位點(diǎn)1和位點(diǎn)2，并編號(hào)為1和2以反映它們與介導(dǎo)hGH-依賴性同型二聚化的兩個(gè)相鄰(和相同)hGH受體結(jié)合的次序。
此外，無(wú)需受理論的約束，據(jù)信派格索曼選擇性結(jié)合到細(xì)胞表面上的人生長(zhǎng)激素受體(“GH受體”)，其中它阻斷內(nèi)源性人生長(zhǎng)激素的結(jié)合，由此干擾人生長(zhǎng)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)派格索曼的蛋白部分(也稱“組分”或“中間體”)(相對(duì)于hGH)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，使得派格索曼競(jìng)爭(zhēng)性阻斷hGH分子與hGH受體之間的相互作用。派格索曼結(jié)合到GH受體，因此自受體被占后阻斷GH結(jié)合。結(jié)構(gòu)修飾防止受體二聚化，結(jié)果，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)沒(méi)有發(fā)生。通過(guò)如此阻斷hGH分子和hGH受體之間所需的密切相互作用，派格索曼阻斷hGH-介導(dǎo)的hGH受體的同型二聚化，使派格索曼產(chǎn)生其拮抗劑活性。
該拮抗劑用于治療狀況，包括但不限于對(duì)外科手術(shù)，放療和/或其他常規(guī)醫(yī)學(xué)治療反應(yīng)不足或不耐受這些療法的患者的肢端肥大癥。此外，對(duì)派格索曼的蛋白部分(PEG B-2036)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾導(dǎo)致其對(duì)泌乳刺激素受體展現(xiàn)的結(jié)合親和性低于hGH，從而使因使用派格索曼而導(dǎo)致的不理想的泌乳有關(guān)的副作用最小化。
派格索曼的蛋白中間體(B-2036)是通過(guò)大腸桿菌菌株合成的，所述菌株已通過(guò)導(dǎo)入質(zhì)粒而被遺傳修飾，而所述質(zhì)粒攜帶生長(zhǎng)激素受體拮抗劑(B-2036)的基因。然后，B-2036從微生物細(xì)胞中回收，并加以純化。純化的B-2036再被PEG化以制備派格索曼(PEG B-2036)。U.S.專利5,849,535和6,057,292描述了制備B-2036的方法，以及將一個(gè)或多個(gè)PEG單元與B-2036共軛的方法，盡管沒(méi)有詳細(xì)說(shuō)明如何降低，減少，消除，逆轉(zhuǎn)和/或防止形成不可接受的高水平的三硫化物和des-phe同工型雜質(zhì)。
利用常規(guī)重組生產(chǎn)方法制備B-2036所遭遇到的問(wèn)題之一是形成其同工型雜質(zhì)，諸如其des-phe和三硫化物同工型。在des-phe同工型雜質(zhì)中，B-2036分子的氨基端苯丙氨酸丟失。參見(jiàn)圖1A描述了鄰近B-2036的氨基端苯丙氨酸殘基(即，由字母“F”所示)。在三硫化物同工型雜質(zhì)中，B-2036分子含有額外的硫原子，其在分子內(nèi)形成“三硫化物橋”。參見(jiàn)圖1B中的框。同樣，參見(jiàn)Andersson等，“Isolation andcharacterization of a trisulfide variant of recombinant human growthhormone formed during expression in Escherichia coli(分離和表征在大腸桿菌表達(dá)過(guò)程中形成的重組人生長(zhǎng)激素的三硫化物變體)”，Int.J.Peptide Protein Res.47311-321(1996)和A.Jesperson等，“Characterisation of a trisulphide derivative of biosynthetic humangrowth hormone produced in Escherichia coli(表征大腸桿菌中生產(chǎn)的生物合成的人生長(zhǎng)激素的三硫化物衍生物)”，Eur.J.Biochem.219365-373(1994)。無(wú)需受理論的約束，據(jù)信這些同工型雜質(zhì)通常在細(xì)胞生長(zhǎng)(即，發(fā)酵)和B-2036在遺傳修飾的宿主細(xì)胞中表達(dá)(合成和分泌)的過(guò)程中，和/或B-2036蛋白的提取和純化的過(guò)程中生成。
關(guān)于雜質(zhì)，國(guó)際申請(qǐng)WO 94/24157(公布日1994年10月27日)公開(kāi)了hGH的疏水性衍生物，其與天然hGH比較包含額外的硫原子。參見(jiàn)WO 94/24157第3頁(yè)第3-10行。hGH的疏水衍生物的額外硫原子形成了“三硫化物橋”，從而產(chǎn)生hGH三硫化物變體。參見(jiàn)WO 94/24157第7頁(yè)第11-16行。WO 94/24157進(jìn)一步敘述了通過(guò)用半胱氨酸，谷胱苷肽，2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇等巰基化合物處理hGH三硫化物變體而使該hGH三硫化物變體轉(zhuǎn)化回到其天然hGH形式。參見(jiàn)WO94/24157第4頁(yè)和第5頁(yè)。
國(guó)際申請(qǐng)WO 96/02570(公布日1996年2月1日)描述了另一方法，利用亞硫酸鈉，亞硫酸鉀，亞硫酸銨，或亞硫酸鎂或亞硫酸鈣等堿土金屬亞硫酸鹽，將hGH三硫化物變體轉(zhuǎn)化回到其天然形式。參見(jiàn)WO94/24157第4頁(yè)第17-21行。
國(guó)際申請(qǐng)WO 00/02900(公布日2000年1月20日)的發(fā)明名稱為“Method for the production of recombinant peptides with a low amountoftrisulfides(具有少量三硫化物的重組肽的生產(chǎn)方法)”，其論述了“在生產(chǎn)重組肽，如蛋白和小肽時(shí)減少三硫化物量的方法。本發(fā)明是基于下列意想不到的新發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過(guò)程中或發(fā)酵后，通過(guò)加入金屬鹽，優(yōu)選是過(guò)量加入，可降低重組肽生產(chǎn)中的三硫化物的量，而非如上文所述，通過(guò)將形成的生長(zhǎng)激素的三硫化物轉(zhuǎn)化成天然形式”。(重點(diǎn)加入)。參見(jiàn)WO 00/02900第2頁(yè)第21-27行。WO 00/02900進(jìn)一步敘述了“蛋白可以是任何重組蛋白，但優(yōu)選為人和動(dòng)物的重組生長(zhǎng)激素，諸如人生長(zhǎng)激素(hGH)，牛生長(zhǎng)激素(bGH)和豬生長(zhǎng)激素(pGH)”。(重點(diǎn)加入)。參見(jiàn)WO 00/02900第3頁(yè)第4-6行。
國(guó)際申請(qǐng)No.WO 02/057478(公布日2002年7月25日)的發(fā)明名稱為“Methods and Composition For Extracting Proteins From Cells(從細(xì)胞提取蛋白的方法和組合物)”，涉及通過(guò)將宿主細(xì)胞與還原劑和去污劑接觸而從宿主細(xì)胞中釋放蛋白的方法。該文獻(xiàn)陳述了還原劑的目的是“便于蛋白以其天然構(gòu)型回收”。參見(jiàn)WO 02/057478第2頁(yè)第16-18。此外，WO 02/057478描述了“一種或多種還原劑...還原二硫鍵和/或維持巰基為其還原形式?？墒褂萌魏芜@樣的還原劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的一種或多種還原劑選自二硫蘇糖醇(DTT)；二硫赤蘚糖醇(DTE)；半胱氨酸(CYS)和三2-羧基乙基膦(Tris2-carboxyethyphosphine)(TCEP)”。(重點(diǎn)加入)。參見(jiàn)WO 02/057478第3頁(yè)第24行至第4頁(yè)第4行。
然而，上述參考文獻(xiàn)未提及防止，反轉(zhuǎn)，減少，或消除與派格索曼或其蛋白部分B-2036等生長(zhǎng)激素拮抗劑相關(guān)的同工型雜質(zhì)的形成。因此，需要對(duì)B-2036的制備方法進(jìn)行改進(jìn)，以降低，減弱，防止，最小化，反轉(zhuǎn)和/或消除其同工型雜質(zhì)的形成(三硫化物和/或des-phe)。同樣，這些參考文獻(xiàn)也未提及檢測(cè)，弱化，最小化，反轉(zhuǎn)，減少或消除生長(zhǎng)激素的des-phe同工型雜質(zhì)的形成。因此，需要對(duì)制備生長(zhǎng)激素的方法進(jìn)行改進(jìn)，以降低，弱化，防止，最小化，反轉(zhuǎn)和/或消除其des-phe同工型雜質(zhì)的形成。
附圖簡(jiǎn)述圖1A描述了B-2036的氨基酸序列SEQ.ID.NO.1。圖1A中的星號(hào)(*)指出PEG單元與各個(gè)B-2036分子共價(jià)連接的9個(gè)潛在的位點(diǎn)。注意的是，雖然有9個(gè)可能的位點(diǎn)被鑒定，但不是所有的9個(gè)位點(diǎn)都必須與PEG單元共價(jià)結(jié)合。優(yōu)選地，每個(gè)B-2036分子有4-6個(gè)PEG單元。
圖1B描述了B-2036的三硫化物同工型雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)(命名為“三硫化物(+32amu)”)，與其理想形式(命名為“天然GHA”)結(jié)構(gòu)的比較。
發(fā)明概述鑒于上述需要提供改進(jìn)的方法，用于制備重組生長(zhǎng)激素激動(dòng)劑，重組人生長(zhǎng)激素激動(dòng)劑，重組生長(zhǎng)激素拮抗劑，和/或重組人生長(zhǎng)激素拮抗劑，而其不理想的同工型雜質(zhì)的水平降低，本發(fā)明涉及改進(jìn)的方法用于生產(chǎn)重組生長(zhǎng)激素(包括但不限于人生長(zhǎng)激素)和重組生長(zhǎng)激素拮抗劑(包括但不限于人生長(zhǎng)激素拮抗劑)，而其des-phe和/或三硫化物同工型雜質(zhì)的水平降低。
關(guān)于重組生長(zhǎng)激素(包括但不限于hGH)，通過(guò)分別足量加入(1)螯合劑或(2)金屬鹽，降低了其des-phe同工型雜質(zhì)的形成。
關(guān)于重組生長(zhǎng)激素拮抗劑(包括但不限于人生長(zhǎng)激素拮抗劑)，通過(guò)三硫化物同工型雜質(zhì)分別與下列物質(zhì)充分接觸，降低了其三硫化物同工型雜質(zhì)(1)巰基化合物，(2)螯合劑，(3)金屬鹽，(4)巰基化合物與金屬鹽一起，或(5)與螯合劑接觸后但在缺乏螯合劑下的巰基化合物。
關(guān)于重組生長(zhǎng)激素拮抗劑(包括但不限于人生長(zhǎng)激素拮抗劑)，通過(guò)分別加入(1)螯合劑或(2)金屬鹽，降低其des-phe同工型雜質(zhì)的形成。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)激素拮抗劑”和“生長(zhǎng)激素受體拮抗劑”包括(但不限于)的多肽抑制或拮抗生長(zhǎng)激素與其生長(zhǎng)激素受體結(jié)合以阻斷生長(zhǎng)激素的生物學(xué)效應(yīng)。優(yōu)選地，“生長(zhǎng)激素拮抗劑”或“生長(zhǎng)激素受體拮抗劑”為B-2036或其變體。這種“變體”包括但不限于，(分別)具有生長(zhǎng)激素受體拮抗劑活性的其同系物(尤其是相對(duì)于B-2036具有保守性氨基酸替換，添加或缺失的同系物)，類似物，片段，假肽，抗體等。
術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)激素激動(dòng)劑”和“生長(zhǎng)激素受體激動(dòng)劑”包括(但不限于)與其生長(zhǎng)激素受體結(jié)合并活化該受體的多肽。優(yōu)選地，“生長(zhǎng)激素激動(dòng)劑”或“生長(zhǎng)激素受體激動(dòng)劑”為人生長(zhǎng)激素或其變體。這種“變體”包括但不限于(分別)具有生長(zhǎng)激素受體激動(dòng)劑活性的其同系物(尤其是相對(duì)于人生長(zhǎng)激素具有保守性氨基酸替換，添加或缺失的同系物)，類似物，片段，假肽，抗體等。
術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)激素及其拮抗劑”是指生長(zhǎng)激素激動(dòng)劑(即“生長(zhǎng)激素”)和生長(zhǎng)激素拮抗劑(即“及其拮抗劑”)。
如果合適或必要，在敘述一種方法對(duì)相關(guān)雜質(zhì)的水平(例如，三硫化物或des-phe同工型雜質(zhì))生成所需的降低時(shí)，術(shù)語(yǔ)“和”可表示“和”或者“或”。
如果合適或必要，在敘述一種方法對(duì)相關(guān)雜質(zhì)(例如，三硫化物或des-phe同工型雜質(zhì))的水平生成所需的降低時(shí)，術(shù)語(yǔ)“或”可表示“和”或者“或”。
如本發(fā)明所用，除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“降低”(或其顯然變化)表示消除，最小化，減少，防止和/或弱化相關(guān)同工型雜質(zhì)的量，不管其是三硫化物同工型雜質(zhì)還是des-phe同工型雜質(zhì)。
除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”(或其顯然變化)是指任何其中可形成重組B-2036或重組hGH的宿主細(xì)胞。因此，宿主細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，植物宿主細(xì)胞，或大腸桿菌(E.coli)或甚至是酵母細(xì)胞的微生物宿主細(xì)胞。值得注意的是，宿主細(xì)胞足以生長(zhǎng)所需的重組B-2036蛋白組分或重組hGH。同樣，對(duì)宿主細(xì)胞是什么沒(méi)有限制，除了其能夠重組生產(chǎn)B-2036蛋白組分或目的重組hGH或其“變體”之外。
此外，如本發(fā)明所用，除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“成長(zhǎng)”(或其顯然變化，例如，生長(zhǎng))包括但不限于發(fā)酵和培養(yǎng)，或?qū)е滤拗骷?xì)胞增殖足以生產(chǎn)所需量的重組B-2036蛋白組分或重組hGH。
此外，盡管本發(fā)明對(duì)重組B-2036和重組PEG B-2036進(jìn)行了描述，但是除非另外說(shuō)明，應(yīng)理解本發(fā)明可采用任何重組生長(zhǎng)激素激動(dòng)劑，重組生長(zhǎng)激素拮抗劑，不管其是哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素或其拮抗劑，人生長(zhǎng)激素或其拮抗劑，還是牛生長(zhǎng)激素或其拮抗劑等。
派格索曼(PEG B-2036)是重組宿主細(xì)胞(例如，重組遺傳修飾的大腸桿菌宿主細(xì)胞)中生產(chǎn)的重組蛋白(B-2036)的PEG化形式。B-2036蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)(例如，通過(guò)發(fā)酵)和表達(dá)(合成和分泌)過(guò)程中生產(chǎn)。生產(chǎn)后，分離B-2036(例如，通過(guò)均質(zhì)化)，接著純化(例如，通過(guò)抽提，離心，反相色譜和陰離子交換層析和緩沖液交換)。然而，如上所述，在重組生產(chǎn)B-2036蛋白過(guò)程中，形成了不需要的B-2036的同工型雜質(zhì)，即B-2036的三硫化物和des-phe同工型雜質(zhì)。
如上所述，圖1A用標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫示出B-2036的氨基酸序列，表明哪種氨基酸存在于各個(gè)字母位置。為參考起見(jiàn)，下表1指明字母與其有關(guān)氨基酸之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
表1多肽氨基酸Ala(A)Glu(E)Gln(Q)Asp(D)Asn(N)Leu(L)Gly(G)Lys(K)Ser(S)
Val(V)Arg(R)Thr(T)Pro(P)Ile(I)Met(M)Phe(F)Tyr(Y)Cys(C)Trp(W)His(H)另外，B-2036的氨基酸序列在本發(fā)明中以SEQ.ID.NO.1所示，而hGH的氨基酸序列在本發(fā)明中以SEQ.ID.NO.2所示。
1.重組生長(zhǎng)激素拮抗劑及其三硫化物同工型雜質(zhì)。
圖1B說(shuō)明了B-2036的三硫化物同工型雜質(zhì)的氨基酸序列結(jié)構(gòu)。具體而言，三硫化物同工型雜質(zhì)在B-2036蛋白組分的位置182和189的半胱氨酸之間的橋中含有額外的硫原子。
a.用巰基化合物降低三硫化物同工型雜質(zhì)無(wú)需受理論的約束，據(jù)信選定的巰基化合物與重組生長(zhǎng)激素拮抗劑B-2036的三硫化物同工型雜質(zhì)之間的接觸使得半胱氨酸-S-S-S-半胱氨酸三硫化物橋轉(zhuǎn)化回到其半胱氨酸-S-S-半胱氨酸天然形式。另外，同樣無(wú)需受理論約束，巰基化合物的存在有可能防止三硫化物橋本身的進(jìn)一步形成。
通常，巰基化合物加入到宿主細(xì)胞，其在生長(zhǎng)過(guò)程中和/或生長(zhǎng)之后，合成所需的重組B-2036蛋白組分。此外，在生長(zhǎng)和接觸步驟進(jìn)行之后，優(yōu)選純化B-2036蛋白。其后，純化的蛋白優(yōu)選被PEG化以生成PEG B-2036(派格索曼)。PEG化步驟參見(jiàn)U.S.專利No.5,849,535。
任何巰基化合物可用于本發(fā)明，只要其與B-2036蛋白組分及其三硫化物同工型雜質(zhì)一起接觸時(shí)，足以降低三硫化物同工型雜質(zhì)的水平，優(yōu)選不降解(或基本上不降解)B-2036產(chǎn)物。優(yōu)選的適用于本發(fā)明的巰基化合物包括但不限于亞硫酸鹽，谷胱苷肽，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，巰基乙胺，二硫赤蘚糖醇，三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽，半胱氨酸和半胱氨酸與胱氨酸的組合。
其他用于本發(fā)明的合適的巰基化合物示于下列參考文獻(xiàn)中(1)J.Houk和G.M.Whitesides，“Structure-Reactivity Relations forThiol-Disulfide Interchange(硫醇-二硫化物交換的結(jié)構(gòu)-反應(yīng)性關(guān)系)”，J.M.Chem.Soc.，1096825-6836(1987)；(2)Sigmund，M.，TheChemistry&Biochemistry of the Sulfhydro Group in Amino Acids(巰基在氨基酸中的化學(xué)&生物化學(xué))，Peptides and Proteins，第1版，Pergamon，New York(1973)。具體而言，參見(jiàn)如上(1)項(xiàng)中Houk等所示的表II，列出了適用于本發(fā)明的示例性巰基化合物。
在合適的巰基化合物中，半胱氨酸或半胱氨酸與胱氨酸(二聚化的半胱氨酸)的組合是最優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的半胱氨酸或半胱氨酸與胱氨酸(二聚化的半胱氨酸，如果有的話)的組合的量應(yīng)足以使三硫化物同工型雜質(zhì)降低至少大約10％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度，其中多批次平均)。優(yōu)選地，三硫化物同工型雜質(zhì)的量分別降低至少大約20％，30％，40％，或50％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度)。半胱氨酸與任何適用于本發(fā)明的胱氨酸的初始組合濃度優(yōu)選分別為至少大約0.1mM，大約0.1mM到大約10mM，或大約1mM到大約5mM。
優(yōu)選提供巰基化合物的緩沖液。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的緩沖液不會(huì)防止B-2036蛋白組分的形成或一旦其形成就被降解。適用于本發(fā)明的緩沖液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。優(yōu)選的緩沖液為Tris。優(yōu)選的起始緩沖液濃度為大約1mM到大約200mM，更優(yōu)選大約5mM到大約100mM，甚至更優(yōu)選大約8mM到大約70mM，以及最優(yōu)選大約10mM到大約50mM。其他合適的緩沖液也可使用。優(yōu)選地，這些緩沖液足以維持生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH，范圍分別為大約4到大約9，大約7.5到大約8.5，或大約7.5到大約8.0。顯然，如果使用更高濃度的巰基化合物，可以耐受更高的pH水平，例如，高至大約9.5。因此，例如，如果對(duì)B-2036使用過(guò)量的半胱氨酸，則緩沖液的pH可高達(dá)大約9.5。
如上所述，優(yōu)選提供巰基化合物的緩沖液。此外，緩沖液中巰基化合物的量應(yīng)使巰基化合物的摩爾數(shù)與B-2036蛋白的摩爾數(shù)之比為大約0.5到大約1,000。當(dāng)所用的巰基化合物為半胱氨酸的組合，優(yōu)選半胱氨酸與胱氨酸的組合時(shí)尤其如此。此外，巰基化合物的摩爾數(shù)與B-2036蛋白的摩爾數(shù)之比可以分別為大約1到大約1,000，大約1到大約500，或大約1到大約10。
通常，在巰基化合物和B-2036蛋白組分(宿主細(xì)胞內(nèi)或來(lái)自宿主細(xì)胞)之間充分接觸(以降低三硫化物同工型雜質(zhì)的水平)完成后，緩沖液中B-2036蛋白組分的濃度分別為大約0.1mg/ml到大約30mg/ml，大約0.5mg/ml到大約20mg/ml，或大約1mg/ml到大約10mg/ml。
此外，在巰基化合物加到宿主細(xì)胞或其含有B-2036蛋白組分的裂解液中后，生長(zhǎng)培養(yǎng)基與緩沖液，巰基化合物和其他內(nèi)容物(包括但不限于B-2036)一起的溫度范圍應(yīng)優(yōu)選維持在大約0℃到大約25℃。同樣，優(yōu)選地，宿主細(xì)胞和/或從中獲得的含有B-2036組分的裂解液的溫度分別維持在大約1℃到大約15℃，大約2℃到大約10℃，或大約2℃到大約8℃。值得注意的是，B-2036蛋白在大約40+℃發(fā)生變性。為此，理想的是維持勻漿(即，含有宿主細(xì)胞，生長(zhǎng)培養(yǎng)基，緩沖液，巰基化合物和B-2036等)的溫度低于B-2036的蛋白變性溫度。
另外，B-2036組分與巰基化合物之間的接觸時(shí)間應(yīng)足以降低三硫化物同工型雜質(zhì)的水平。用于降低三硫化物同工型雜質(zhì)水平的合適接觸時(shí)間應(yīng)示例性分別為至少大約30分鐘，大約1小時(shí)到大約24小時(shí)，或大約1小時(shí)到大約4小時(shí)。
通常，在巰基化合物與B-2036組分之間充分接觸后，含有上述同樣成分的緩沖液的體積分別為大約1升到大約5,000升，大約10升到大約500升，或100升到大約300升。其他合適的體積示例性為160升到大約500升。
在巰基化合物與B-2036組分之間接觸的過(guò)程中其他感興趣的參數(shù)包括混合比等?；旌媳葢?yīng)足以形成均勻的混合物(包括宿主細(xì)胞，其裂解液，緩沖液，巰基化合物，B-2036組分以及其他在同一生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的任何組分)，同時(shí)使形成的泡沫量最小化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易地確定，怎樣的混合比應(yīng)是足夠的。顯然，混合比應(yīng)使溫度維持在上述范圍內(nèi)，并且使B-2036蛋白組分的任何降解最小化。
b.用螯合劑降低三硫化物同工型雜質(zhì)無(wú)需受理論約束，據(jù)信選定的螯合劑與下列物質(zhì)的接觸會(huì)使半胱氨酸-S-S-S-半胱氨酸三硫化物橋轉(zhuǎn)化回到其半胱氨酸-S-S-半胱氨酸天然形式或降低雜質(zhì)的水平(1)三硫化物同工型雜質(zhì)，(2)重組生長(zhǎng)激素拮抗劑B-2036，(3)宿主細(xì)胞組分(對(duì)重組生產(chǎn)拮抗劑而言)，以及(4)上述(1)-(3)的全部組合。此外，同樣無(wú)需受理論約束，螯合劑的存在有可能防止三硫化物橋本身的進(jìn)一步形成。
通常，螯合劑加入到宿主細(xì)胞，其在生長(zhǎng)過(guò)程中和/或生長(zhǎng)之后，合成所需的重組B-2036蛋白組分。此外，在生長(zhǎng)和接觸步驟進(jìn)行之后，優(yōu)選純化B-2036蛋白。其后，純化的蛋白優(yōu)選被PEG化以生成PEGB-2036(派格索曼)。PEG化步驟參見(jiàn)U.S.專利No.5,849,535。
任何螯合劑可用于本發(fā)明，只要其與B-2036蛋白組分及其三硫化物同工型雜質(zhì)一起接觸(優(yōu)選足夠混合)時(shí)，足以降低三硫化物同工型雜質(zhì)的水平，優(yōu)選不降解(或基本上不降解)B-2036產(chǎn)物。適用于本發(fā)明的優(yōu)選螯合劑包括但不限于EDTA，EGTA，和DTPA。其他示例性螯合劑包括但不限于去鐵敏(Deferoxamine)，二硫卡鈉(Ditiocarb Sodium)，EDTA鈣二鈉，EDTA二鈉，EDTA鈉，EDTA三鈉，青霉胺，噴替酸鈣鈉(Pentetate Calcium Trisodium)，噴替酸(Pentetic Acid)，二巰丁二酸(Succimer)，和曲恩汀(Trientine)。注意EDTA鈉是EDTA的鹽形式。
其他用于本發(fā)明的合適螯合劑示于下列參考文獻(xiàn)中(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(主編)，Merck & Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治療目錄和生物活性索引)，p.THER-19(“螯合劑”下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(主編)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修訂(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals andLaboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。
在合適的螯合劑中，EDTA是最優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的螯合劑的量應(yīng)足以使三硫化物同工型雜質(zhì)降低至少大約10％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度，其中多批次平均)。優(yōu)選地，三硫化物同工型雜質(zhì)的量分別降低至少大約20％，30％，40％，或50％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度)。適用于本發(fā)明的EDTA的初始濃度優(yōu)選分別為至少大約0.01mM，大約0.01mM到大約100mM，大約0.1mM到大約20mM，大約2mM到大約10mM，或大約2mM到大約5mM。
優(yōu)選提供螯合劑的緩沖液。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的緩沖液不會(huì)防止B-2036蛋白組分的形成或一旦其形成就被降解。適用于本發(fā)明的緩沖液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。優(yōu)選的緩沖液為Tris。優(yōu)選的起始緩沖液濃度為大約1mM到大約200mM，更優(yōu)選大約5mM到大約100mM，甚至更優(yōu)選大約8mM到大約70mM，以及最優(yōu)選大約10mM到大約50mM。其他合適的緩沖液也可使用。優(yōu)選地，這些緩沖液足以維持生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH，范圍分別為大約6到大約9，大約6.5到大約7.5，或大約7.2到大約7.5。
如上所述，優(yōu)選提供螯合劑的緩沖液。此外，緩沖液中螯合劑的量應(yīng)使螯合劑的摩爾數(shù)與B-2036蛋白的摩爾數(shù)之比為大約1到大約1,000。此外，螯合劑的摩爾數(shù)與B-2036蛋白的摩爾數(shù)之比可以分別為大約20到大約1,000，大約50到大約250，或大約60到大約110。
通常，在螯合劑和B-2036蛋白組分(宿主細(xì)胞內(nèi)或來(lái)自宿主細(xì)胞)之間充分接觸(以降低三硫化物同工型雜質(zhì)的水平)完成后，緩沖液中B-2036蛋白組分的濃度分別為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml，大約0.5mg/ml到大約5mg/ml，或大約1mg/ml到大約5mg/ml。
此外，在螯合劑加到宿主細(xì)胞或其含有B-2036蛋白組分的裂解液中后，生長(zhǎng)培養(yǎng)基與緩沖液，螯合劑和其他內(nèi)容物(包括但不限于B-2036)一起的溫度范圍應(yīng)優(yōu)選維持在大約0℃到大約35℃。同樣，優(yōu)選地，宿主細(xì)胞和/或從中獲得的含有B-2036組分的裂解液的溫度分別維持在大約1℃到大約15℃，大約2℃到大約10℃，或大約2℃到大約15℃。優(yōu)選地，在加入螯合劑(例如，EDTA)時(shí)，其溫度為大約4℃，而含有B-2036的勻漿的溫度在均質(zhì)時(shí)會(huì)升至大約30℃。值得注意的是，B-2036蛋白在大約40+℃發(fā)生變性。為此，理想的是維持勻漿(即，含有宿主細(xì)胞，生長(zhǎng)培養(yǎng)基，緩沖液，螯合劑和B-2036等)的溫度低于B-2036的蛋白變性溫度。
另外，B-2036組分與螯合劑之間的接觸時(shí)間應(yīng)足以降低三硫化物同工型雜質(zhì)的水平。用于降低三硫化物同工型雜質(zhì)水平的合適接觸時(shí)間應(yīng)示例性分別為至少大約30分鐘，大約1小時(shí)到大約48小時(shí)，或大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
通常，在螯合劑與B-2036組分之間充分接觸后，含有上述同樣成分的緩沖液的體積分別為大約1升到大約5,000升，大約10升到大約500升，或100升到大約300升。其他合適的體積示例性為160升到大約500升。
在螯合劑與B-2036組分之間接觸的過(guò)程中其他感興趣的參數(shù)包括混合比等?；旌媳葢?yīng)足以形成均勻的混合物(宿主細(xì)胞，其裂解液，緩沖液，螯合劑，B-2036組分以及生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的其他任何組分的混合物)，同時(shí)使形成的泡沫量最小化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易地確定，怎樣的混合比應(yīng)是足夠的。顯然，混合比應(yīng)使溫度維持在上述范圍內(nèi)，并且使B-2036蛋白組分的任何降解最小化。
C.用金屬鹽降低三硫化物同工型雜質(zhì)無(wú)需受理論約束，據(jù)信選定的金屬鹽與下列物質(zhì)的接觸會(huì)使半胱氨酸-S-S-S-半胱氨酸三硫化物橋轉(zhuǎn)化回到其半胱氨酸-S-S-半胱氨酸天然形式或降低雜質(zhì)的水平(1)三硫化物同工型雜質(zhì)，(2)重組生長(zhǎng)激素拮抗劑B-2036，(3)宿主細(xì)胞組分(對(duì)重組生產(chǎn)拮抗劑而言)，以及(4)上述(1)-(3)的全部組合。此外，同樣無(wú)需受理論約束，金屬鹽的存在有可能防止三硫化物橋本身的進(jìn)一步形成。
通常，金屬鹽加入到宿主細(xì)胞，其在生長(zhǎng)過(guò)程中和/或生長(zhǎng)之后，合成所需的重組B-2036蛋白組分。此外，在生長(zhǎng)和接觸步驟進(jìn)行之后，優(yōu)選純化B-2036蛋白。其后，純化的蛋白優(yōu)選被PEG化以生成PEGB-2036(派格索曼)。PEG化步驟參見(jiàn)U.S.專利No.5,849,535。
任何金屬鹽可用于本發(fā)明，只要其與B-2036蛋白組分及其三硫化物同工型雜質(zhì)一起接觸(優(yōu)選足夠混合)時(shí)，足以降低三硫化物同工型雜質(zhì)的水平，優(yōu)選不降解(或基本上不降解)B-2036產(chǎn)物。適用于本發(fā)明的金屬鹽包括但不限于堿金屬鹽(alkali earth metal salt)，堿土金屬鹽，過(guò)渡金屬鹽，及其組合。適用于本發(fā)明的優(yōu)選金屬鹽包括但不限于，磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
其他合適的金屬鹽示于下列參考文獻(xiàn)中(1)The Merck Index，第12版，S.Budavari(主編)，Merck&Co.，Inc.，Therapeutic Category andBiological Activity Index(治療目錄和生物活性索引)，p.THER-19(“螯合劑”下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(主編)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修訂(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagentsfor Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。
在用于本發(fā)明的合適金屬鹽中，磷酸鈉，ZnCl2及其組合也是優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的金屬鹽的量應(yīng)足以使三硫化物同工型雜質(zhì)降低至少大約10％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度，其中多批次平均)。優(yōu)選地，三硫化物同工型雜質(zhì)的量分別降低至少大約20％，30％，40％，或50％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度)。適用于本發(fā)明的金屬鹽(例如，磷酸鈉)的初始濃度優(yōu)選分別為至少大約0.1mM，大約1mM到大約500mM，大約1mM到大約200mM，大約5mM到大約175mM，大約10mM到大約150mM，或大約25mM到大約100mM。
優(yōu)選提供金屬鹽的緩沖液。然而，磷酸鈉可充當(dāng)緩沖液和合適的金屬鹽。其他合適的金屬鹽可加入磷酸鈉緩沖液。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的緩沖液不會(huì)防止B-2036蛋白組分的形成或一旦其形成就被降解。適用于本發(fā)明的緩沖液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。優(yōu)選的起始緩沖液濃度為大約1mM到大約200mM，更優(yōu)選大約5mM到大約100mM，甚至更優(yōu)選大約8mM到大約70mM，以及最優(yōu)選大約10mM到大約50mM。其他合適的緩沖液也可使用。優(yōu)選地，這些緩沖液足以維持生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH，范圍分別為大約4到大約9，大約4.5到大約7.5，或大約5.5到大約7.5。
在金屬鹽提供在緩沖液(或在NaP的情形下，其中NaP溶液充當(dāng)金屬鹽和緩沖液)以后，金屬鹽在緩沖液(或NaP溶液也充當(dāng)緩沖液)中的量應(yīng)使金屬鹽的摩爾數(shù)與B-2036蛋白的摩爾數(shù)之比為大約1到大約10,000。此外，金屬鹽的摩爾數(shù)與B-2036蛋白的摩爾數(shù)之比可以分別為大約300到大約10,000，大約500到大約5,000，或大約500到大約2500。
通常，在金屬鹽和B-2036蛋白組分(宿主細(xì)胞內(nèi)或來(lái)自宿主細(xì)胞)之間充分接觸(以降低三硫化物同工型雜質(zhì)的水平)完成后，緩沖液中B-2036蛋白組分的濃度分別為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml，大約0.5mg/ml到大約5mg/ml，或大約1mg/ml到大約5mg/ml。
此外，在金屬鹽加到宿主細(xì)胞或其含有B-2036蛋白組分的裂解液中后，生長(zhǎng)培養(yǎng)基與緩沖液，金屬鹽和其他內(nèi)容物(包括但不限于B-2036)一起的溫度范圍優(yōu)選應(yīng)維持在大約0℃到大約35℃。同樣，優(yōu)選地，宿主細(xì)胞和/或從中獲得的含有B-2036組分的裂解液的溫度分別維持在大約1℃到大約15℃，大約2℃到大約10℃，或大約2℃到大約15℃。注意，在用金屬鹽(例如，NaP)均質(zhì)時(shí)，勻漿的溫度可能上升。值得注意的是，B-2036蛋白在大約40+℃發(fā)生變性。為此，理想的是維持勻漿(即，含有宿主細(xì)胞，生長(zhǎng)培養(yǎng)基，緩沖液，金屬鹽，B-2036以及任選巰基化合物等)的溫度低于B-2036的蛋白變性溫度。
另外，B-2036組分與螯合劑之間的接觸時(shí)間應(yīng)足以降低三硫化物同工型雜質(zhì)的水平。用于降低三硫化物同工型雜質(zhì)水平的合適接觸時(shí)間應(yīng)示例性分別為至少大約30分鐘，大約1小時(shí)到大約48小時(shí)，或大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
通常，在金屬鹽與B-2036組分之間充分接觸后，含有上述同樣成分的緩沖液的體積分別為大約1升到大約5,000升，大約100升到大約2,000升，或200升到大約1，500升。
在金屬鹽與B-2036組分之間接觸的過(guò)程中其他感興趣的參數(shù)包括混合比等。混合比應(yīng)足以形成均勻的混合物(宿主細(xì)胞，其裂解液，緩沖液，金屬鹽，B-2036組分以及生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的其他任何組分的混合物)，同時(shí)使形成的泡沫量最小化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易地確定，怎樣的混合比應(yīng)是足夠的。顯然，混合比應(yīng)使溫度維持在上述范圍內(nèi)，并且使B-2036蛋白組分的任何降解最小化。
2.重組生長(zhǎng)激素拮抗劑及其Des-Phe同工型雜質(zhì)a.用螯合劑降低Des-Phe同工型雜質(zhì)無(wú)需受理論約束，據(jù)信向重組生長(zhǎng)激素拮抗劑B-2036中加入螯合劑導(dǎo)致des-phe同工型雜質(zhì)水平的降低，或者使其水平真正減少，和/或防止進(jìn)一步形成des-phe。
通常，螯合劑加入到宿主細(xì)胞，其在生長(zhǎng)過(guò)程中和/或生長(zhǎng)之后，合成所需的重組B-2036蛋白組分。此外，在生長(zhǎng)和接觸步驟進(jìn)行之后，優(yōu)選純化B-2036蛋白。其后，純化的蛋白優(yōu)選被PEG化以生成PEGB-2036(派格索曼)。PEG化步驟參見(jiàn)U.S.專利No.5,849,535。
任何螯合劑可用于本發(fā)明，只要其與B-2036蛋白組分及其des-phe同工型雜質(zhì)一起接觸(優(yōu)選足夠混合)時(shí)，足以降低des-phe同工型雜質(zhì)的水平，優(yōu)選不降解(或基本上不降解)B-2036產(chǎn)物。適用于本發(fā)明的優(yōu)選螯合劑包括但不限于EDTA，EGTA，和DTPA。其他示例性螯合劑包括但不限于Deferoxamine，Ditiocarb Sodium，EDTA鈣二鈉，EDTA二鈉，EDTA鈉，EDTA三鈉，青霉胺，Pentetate Calcium Trisodium，Pentetic Acid，Succimer，和Trientine。注意EDTA鈉是EDTA的鹽形式。
其他用于本發(fā)明的合適螯合劑示于下列參考文獻(xiàn)中(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(主編)，Merck&Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治療目錄和生物活性索引)，p.THER-19(“螯合劑”下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(主編)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修訂(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals andLaboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。
在合適的螯合劑中，EDTA是最優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的螯合劑的量應(yīng)足以使des-phe同工型雜質(zhì)降低至少大約10％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度，其中多批次平均)。優(yōu)選地，des-phe同工型雜質(zhì)的量分別降低至少大約20％，30％，40％，或50％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度)。適用于本發(fā)明的EDTA的初始濃度優(yōu)選分別為至少大約0.01mM，大約0.01mM到大約100mM，大約0.1mM到大約20mM，大約2mM到大約10mM，或大約2mM到大約5mM。
優(yōu)選提供螯合劑的緩沖液。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的緩沖液不會(huì)防止B-2036蛋白組分的形成或一旦其形成就被降解。適用于本發(fā)明的緩沖液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。優(yōu)選的緩沖液為Tris。優(yōu)選的起始緩沖液濃度為大約1mM到大約200mM，更優(yōu)選大約5mM到大約100mM，甚至更優(yōu)選大約8mM到大約70mM，以及最優(yōu)選大約10mM到大約50mM。其他合適的緩沖液也可使用。優(yōu)選地，這些緩沖液足以維持生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH，范圍分別為大約6到大約9，大約6.5到大約7.5，或大約7.2到大約7.5。
如上所述，優(yōu)選提供螯合劑的緩沖液。此外，緩沖液中螯合劑的量應(yīng)使螯合劑的摩爾數(shù)與B-2036蛋白的摩爾數(shù)之比為大約1到大約1,000。此外，螯合劑的摩爾數(shù)與B-2036蛋白的摩爾數(shù)之比可以分別為大約20到大約1,000，大約50到大約250，或大約60到大約110。
通常，在螯合劑和B-2036蛋白組分(宿主細(xì)胞內(nèi)或來(lái)自宿主細(xì)胞)之間充分接觸(以降低des-phe同工型雜質(zhì)的水平)完成后，緩沖液中B-2036蛋白組分的濃度分別大約0.1mg/ml到大約20mg/ml，大約0.5mg/ml到大約5mg/ml，或大約1mg/ml到大約5mg/ml。
此外，在螯合劑加到宿主細(xì)胞或其含有B-2036蛋白組分的裂解液中后，生長(zhǎng)培養(yǎng)基與緩沖液，螯合劑和其他內(nèi)容物(包括但不限于B-2036)一起的溫度范圍應(yīng)優(yōu)選維持在大約0℃到大約35℃。同樣，優(yōu)選地，宿主細(xì)胞和/或從中獲得的含有B-2036組分的裂解液的溫度分別維持在大約1℃到大約15℃，大約2℃到大約10℃，或大約2℃到大約15℃。注意，優(yōu)選地，在加入螯合劑(例如，EDTA)時(shí)，其溫度為大約4℃，而含有B-2036的勻漿的溫度在均質(zhì)時(shí)會(huì)升至大約30℃。值得注意的是，B-2036蛋白在大約40+℃發(fā)生變性。為此，理想的是維持勻漿(即，含有宿主細(xì)胞，生長(zhǎng)培養(yǎng)基，緩沖液，螯合劑和B-2036等)的溫度低于B-2036的蛋白變性溫度。
另外，B-2036組分與螯合劑之間的接觸時(shí)間應(yīng)足以降低des-phe同工型雜質(zhì)的水平。用于降低des-phe同工型雜質(zhì)水平的合適接觸時(shí)間應(yīng)示例性分別為至少大約30分鐘，大約1小時(shí)到大約48小時(shí)，或大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
通常，在螯合劑與B-2036組分之間充分接觸后，含有上述同樣成分的緩沖液的體積分別為大約1升到大約5,000升，大約10升到大約500升，或100升到大約300升。其他合適的體積示例性為160升到大約500升。
在螯合劑與B-2036組分之間接觸的過(guò)程中其他感興趣的參數(shù)包括混合比等。混合比應(yīng)足以形成均勻的混合物(宿主細(xì)胞，其裂解液，緩沖液，螯合劑，B-2036組分以及生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的其他任何組分的混合物)，同時(shí)使形成的泡沫量最小化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易地確定，怎樣的混合比應(yīng)是足夠的。顯然，混合比應(yīng)使溫度維持在上述范圍內(nèi)，并且使B-2036蛋白組分的任何降解最小化。
b.用金屬鹽降低Des Phe同工型雜質(zhì)無(wú)需受理論約束，據(jù)信向重組生長(zhǎng)激素拮抗劑B-2036中加入金屬鹽導(dǎo)致des-phe同工型雜質(zhì)水平的降低，或者使其水平真正減少，和/或防止進(jìn)一步形成des-phe。
通常，金屬鹽加入到宿主細(xì)胞，其在生長(zhǎng)過(guò)程中和/或生長(zhǎng)之后，合成所需的重組B-2036蛋白組分。此外，在生長(zhǎng)和接觸步驟進(jìn)行之后，優(yōu)選純化B-2036蛋白。其后，純化的蛋白優(yōu)選被PEG化以生成PEGB-2036(派格索曼)。PEG化步驟參見(jiàn)U.S.專利No.5,849,535。
任何金屬鹽可用于本發(fā)明，只要其與B-2036蛋白組分及其des-phe同工型雜質(zhì)一起接觸(優(yōu)選足夠混合)時(shí)，足以降低des-phe同工型雜質(zhì)的水平，優(yōu)選不降解(或基本上不降解)B-2036產(chǎn)物。適用于本發(fā)明的金屬鹽包括但不限于堿金屬鹽，堿土金屬鹽，過(guò)渡金屬鹽，及其組合。適用于本發(fā)明的優(yōu)選金屬鹽包括但不限于，磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
其他用于本發(fā)明的合適金屬鹽示于下列參考文獻(xiàn)中(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(主編)，Merck & Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治療目錄和生物活性索引)，p.THER-19(“螯合劑”下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(主編)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修訂(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals andLaboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。
在用于本發(fā)明的合適金屬鹽中，磷酸鈉，ZnCl2及其組合也是優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的金屬鹽的量應(yīng)足以使des-phe同工型雜質(zhì)降低至少大約10％形成的最高濃度(或其最高平均濃度，其中多批次平均)。優(yōu)選地，des-phe同工型雜質(zhì)的量分別降低至少大約20％，30％，40％，或50％形成的最高濃度(或其最高平均濃度)。適用于本發(fā)明的金屬鹽(例如，磷酸鈉)的初始濃度優(yōu)選分別為至少大約0.1mM，大約1mM到大約500mM，大約1mM到大約200mM，大約5mM到大約175mM，大約10mM到大約150mM，或大約25mM到大約100mM。
優(yōu)選提供金屬鹽的緩沖液。然而，磷酸鈉可充當(dāng)緩沖液和合適的金屬鹽。其他合適的金屬鹽可加入磷酸鈉緩沖液。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的緩沖液不會(huì)降解B-2036蛋白組分的形成。適用于本發(fā)明的緩沖液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。優(yōu)選的起始緩沖液濃度為大約1mM到大約200mM，更優(yōu)選大約5mM到大約100mM，甚至更優(yōu)選大約8mM到大約70mM，以及最優(yōu)選大約10mM到大約50mM。其他合適的緩沖液也可使用。優(yōu)選地，這些緩沖液足以維持生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH，范圍分別為大約4到大約9，大約4.5到大約7.5，或大約5.5到大約7.5。
在金屬鹽提供在緩沖液(或在NaP的情形下，其中NaP溶液充當(dāng)金屬鹽和緩沖液)以后，金屬鹽在緩沖液(或NaP溶液也充當(dāng)緩沖液)中的量應(yīng)使金屬鹽的摩爾數(shù)與B-2036蛋白的摩爾數(shù)之比為大約1到大約10,000。此外，金屬鹽的摩爾數(shù)與B-2036蛋白的摩爾數(shù)之比可以分別為大約300到大約10,000，大約500到大約5,000，或大約500到大約2500。
通常，在金屬鹽和B-2036蛋白組分(宿主細(xì)胞內(nèi)或來(lái)自宿主細(xì)胞)之間充分接觸(以降低des-phe同工型雜質(zhì)的水平)完成后，緩沖液中B-2036蛋白組分的濃度分別為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml，大約0.5mg/ml到大約5mg/ml，或大約1mg/ml到大約5mg/ml。
此外，在金屬鹽加到宿主細(xì)胞或其含有B-2036蛋白組分的裂解液中后，生長(zhǎng)培養(yǎng)基與緩沖液，金屬鹽和其他內(nèi)容物(包括但不限于B-2036)一起的溫度范圍優(yōu)選應(yīng)維持在大約0℃到大約35℃。同樣，優(yōu)選地，宿主細(xì)胞和/或從中獲得的含有B-2036組分的裂解液的溫度分別維持在大約1℃到大約15℃，大約2℃到大約10℃，或大約2℃到大約15℃。注意，在用金屬鹽(例如，NaP)均質(zhì)時(shí)，勻漿的溫度可能上升。值得注意的是，B-2036蛋白在大約40+℃發(fā)生變性。為此，理想的是維持勻漿(即，含有宿主細(xì)胞，生長(zhǎng)培養(yǎng)基，緩沖液，金屬鹽，B-2036以及任選巰基化合物等)的溫度低于B-2036的蛋白變性溫度。
另外，B-2036組分與金屬鹽之間的接觸時(shí)間應(yīng)足以降低des-phe同工型雜質(zhì)的水平。用于降低des-phe同工型雜質(zhì)水平的合適接觸時(shí)間應(yīng)示例性分別為至少大約30分鐘，大約1小時(shí)到大約48小時(shí)，或大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
通常，在金屬鹽與B-2036組分之間充分接觸后，含有上述同樣成分的緩沖液的體積分別為大約1升到大約5,000升，大約100升到大約2,000升，或200升到大約1,500升。
在金屬鹽與B-2036組分之間接觸的過(guò)程中其他感興趣的參數(shù)包括混合比等?；旌媳葢?yīng)足以形成均勻的混合物(宿主細(xì)胞，其裂解液，緩沖液，金屬鹽，B-2036組分以及生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的其他任何組分的混合物)，同時(shí)使形成的泡沫量最小化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易地確定，怎樣的混合比應(yīng)是足夠的。顯然，混合比應(yīng)使溫度維持在上述范圍內(nèi)，并且使B-2036蛋白組分的任何降解最小化。
3.重組生長(zhǎng)激素及其Des-Phe同工型雜質(zhì)a.用螯合劑降低Des-Phe同工型雜質(zhì)無(wú)需受理論約束，據(jù)信向重組生長(zhǎng)激素中加入螯合劑導(dǎo)致des-phe同工型雜質(zhì)水平的降低，或者使其水平真正減少，和/或防止進(jìn)一步形成des-phe。
通常，螯合劑加入到宿主細(xì)胞，其在生長(zhǎng)過(guò)程中和/或生長(zhǎng)之后，合成所需的重組生長(zhǎng)激素蛋白。此外，在生長(zhǎng)和接觸步驟進(jìn)行之后，優(yōu)選純化生長(zhǎng)激素蛋白。
任何螯合劑可用于本發(fā)明，只要其與生長(zhǎng)激素蛋白及其des-phe同工型雜質(zhì)一起接觸(優(yōu)選足夠混合)時(shí)，足以降低des-phe同工型雜質(zhì)的水平，優(yōu)選不降解(或基本上不降解)生長(zhǎng)激素產(chǎn)物。適用于本發(fā)明的優(yōu)選螯合劑包括但不限于EDTA，EGTA，和DTPA。其他示例性螯合劑包括但不限于Deferoxamine，Ditiocarb Sodium，EDTA鈣二鈉，EDTA二鈉，EDTA鈉，EDTA三鈉，青霉胺，Pentetate Calcium Trisodium，Pentetic Acid，Succimer，和Trientine。注意EDTA鈉是EDTA的鹽形式。
其他用于本發(fā)明的合適螯合劑示于下列參考文獻(xiàn)中(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(主編)，Merck & Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治療目錄和生物活性索引)，p.THER-19(“螯合劑”下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(主編)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修訂(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals andLaboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。
在合適的螯合劑中，EDTA是最優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的螯合劑的量應(yīng)足以使des-phe同工型雜質(zhì)降低至少大約10％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度，其中多批次平均)。優(yōu)選地，des-phe同工型雜質(zhì)的量分別降低至少大約20％，30％，40％，或50％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度)。適用于本發(fā)明的EDTA的初始濃度優(yōu)選分別為至少大約0.01mM，大約0.01mM到大約100mM，大約0.1mM到大約20mM，大約2mM到大約10mM，或大約2mM到大約5mM。
優(yōu)選提供螯合劑的緩沖液。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的緩沖液不會(huì)防止B-2306蛋白組分的形成或一旦其形成就被降解。適用于本發(fā)明的緩沖液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。優(yōu)選的緩沖液為Tris。優(yōu)選的起始緩沖液濃度為大約1mM到大約200mM，更優(yōu)選大約5mM到大約100mM，甚至更優(yōu)選大約8mM到大約70mM，以及最優(yōu)選大約10mM到大約50mM。其他合適的緩沖液也可使用。優(yōu)選地，這些緩沖液足以維持生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH，范圍分別為大約6到大約9，大約6.5到大約7.5，或大約7.2到大約7.5。
如上所述，優(yōu)選提供螯合劑的緩沖液。此外，緩沖液中螯合劑的量應(yīng)使螯合劑的摩爾數(shù)與生長(zhǎng)激素蛋白(例如，hGH)的摩爾數(shù)之比為大約1到大約1,000。此外，螯合劑的摩爾數(shù)與生長(zhǎng)激素蛋白(例如，hGH)的摩爾數(shù)之比可以分別為大約20到大約1,000，大約50到大約250，或大約60到大約110。
通常，在螯合劑和生長(zhǎng)激素蛋白(例如，hGH)(宿主細(xì)胞內(nèi)或來(lái)自宿主細(xì)胞)之間充分接觸(以降低des-phe同工型雜質(zhì)的水平)完成后，緩沖液中生長(zhǎng)激素蛋白(例如，hGH)的濃度分別為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml，大約0.5mg/ml到大約5mg/ml，或大約1mg/ml到大約5mg/ml。
此外，在螯合劑加到宿主細(xì)胞或其含有生長(zhǎng)激素蛋白的裂解液中后，生長(zhǎng)培養(yǎng)基與緩沖液，螯合劑和其他內(nèi)容物(包括但不限于生長(zhǎng)激素蛋白)一起的溫度范圍優(yōu)選應(yīng)維持在大約0℃到大約35℃。同樣，優(yōu)選地，宿主細(xì)胞和/或從中獲得的含有生長(zhǎng)激素蛋白的裂解液的溫度分別維持在大約1℃到大約15℃，大約2℃到大約10℃，或大約2℃到大約15℃。注意，優(yōu)選地，在加入螯合劑(例如，EDTA)時(shí)，其溫度為大約4℃，而含有生長(zhǎng)激素的勻漿的溫度在均質(zhì)時(shí)會(huì)升至大約30℃。值得注意的是，生長(zhǎng)激素蛋白在大約40+℃發(fā)生變性。為此，理想的是維持勻漿(即，含有宿主細(xì)胞，生長(zhǎng)培養(yǎng)基，緩沖液，螯合劑和生長(zhǎng)激素蛋白等)的溫度低于生長(zhǎng)激素的蛋白變性溫度。
另外，生長(zhǎng)激素蛋白與螯合劑之間的接觸時(shí)間應(yīng)足以降低des-phe同工型雜質(zhì)的水平。用于降低des-phe同工型雜質(zhì)水平的合適接觸時(shí)間應(yīng)示例性分別為至少大約30分鐘，大約1小時(shí)到大約48小時(shí)，或大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
通常，在螯合劑與生長(zhǎng)激素蛋白之間充分接觸后，含有上述同樣成分的緩沖液的體積分別為大約1升到大約5,000升，大約10升到大約500升，或100升到大約300升。其他合適的體積示例性為160升到大約500升。
在螯合劑與生長(zhǎng)激素蛋白之間接觸的過(guò)程中其他感興趣的參數(shù)包括混合比等。混合比應(yīng)足以形成均勻的混合物(宿主細(xì)胞，其裂解液，緩沖液，螯合劑，生長(zhǎng)激素蛋白以及生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的其他任何組分的混合物)，同時(shí)使形成的泡沫量最小化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易地確定，怎樣的混合比應(yīng)是足夠的。顯然，混合比應(yīng)使溫度維持在上述范圍內(nèi)，并且使生長(zhǎng)激素蛋白組分的任何降解最小化。
b.用金屬鹽降低Des-Phe同工型雜質(zhì)無(wú)需受理論約束，據(jù)信向重組生長(zhǎng)激素中加入金屬鹽導(dǎo)致des-phe同工型雜質(zhì)水平的降低，或者使其水平真正減少，和/或防止進(jìn)一步形成des-phe。
通常，金屬鹽加入到宿主細(xì)胞，其在生長(zhǎng)過(guò)程中和/或生長(zhǎng)之后，合成所需的重組生長(zhǎng)激素蛋白組分。此外，在生長(zhǎng)和接觸步驟進(jìn)行之后，優(yōu)選純化生長(zhǎng)激素蛋白。
任何金屬鹽可用于本發(fā)明，只要其與生長(zhǎng)激素蛋白組分及其des-phe同工型雜質(zhì)一起接觸(優(yōu)選足夠混合)時(shí)，足以降低des-phe同工型雜質(zhì)的水平，優(yōu)選不降解(或基本上不降解)生長(zhǎng)激素產(chǎn)物。適用于本發(fā)明的金屬鹽包括但不限于堿金屬鹽(alkali earth metal salt)，堿土金屬鹽，過(guò)渡金屬鹽，及其組合。適用于本發(fā)明的優(yōu)選金屬鹽包括但不限于，磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
其他用于本發(fā)明的合適金屬鹽示于下列參考文獻(xiàn)中(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(主編)，Merck&Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治療目錄和生物活性索引)，p.THER-19(“螯合劑”下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(主編)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修訂(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今為止的每個(gè)后續(xù)版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals andLaboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。
在用于本發(fā)明的合適金屬鹽中，磷酸鈉，ZnCl2及其組合也是優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的金屬鹽的量應(yīng)足以使des-phe同工型雜質(zhì)降低至少大約10％形成的最高濃度(或其最高平均濃度，其中多批次平均)。優(yōu)選地，des-phe同工型雜質(zhì)的量分別降低至少大約20％，30％，40％，或50％形成的最高濃度(或其最高平均濃度)。適用于本發(fā)明的金屬鹽(例如，磷酸鈉)的初始濃度優(yōu)選分別為至少大約0.1mM，大約1mM到大約500mM，大約1mM到大約200mM，大約5mM到大約175mM，大約10mM到大約150mM，或大約25mM到大約100mM。
優(yōu)選提供金屬鹽的緩沖液。然而，磷酸鈉可充當(dāng)緩沖液和合適的金屬鹽。其他合適的金屬鹽可加入磷酸鈉緩沖液。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的緩沖液不會(huì)防止B-2036蛋白組分的形成或一旦形成就被降解。適用于本發(fā)明的緩沖液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。優(yōu)選的起始緩沖液濃度為大約1mM到大約200mM，更優(yōu)選大約5mM到大約100mM，甚至更優(yōu)選大約8mM到大約70mM，以及最優(yōu)選大約10mM到大約50mM。其他合適的緩沖液也可使用。優(yōu)選地，這些緩沖液足以維持生長(zhǎng)培養(yǎng)基的pH，范圍分別為大約4到大約9，大約4.5到大約7.5，或大約5.5到大約7.5。
在金屬鹽提供在緩沖液(或在NaP的情形下，其中NaP溶液充當(dāng)金屬鹽和緩沖液)以后，金屬鹽在緩沖液(或NaP溶液也充當(dāng)緩沖液)中的量應(yīng)使金屬鹽的摩爾數(shù)與生長(zhǎng)激素蛋白(例如，hGH)的摩爾數(shù)之比為大約1到大約10,000。此外，金屬鹽的摩爾數(shù)與生長(zhǎng)激素蛋白(例如，hGH)的摩爾數(shù)之比可以分別為大約300到大約10,000，大約500到大約5,000，或大約500到大約2500。
通常，在金屬鹽和生長(zhǎng)激素蛋白(例如，hGH)(宿主細(xì)胞內(nèi)或來(lái)自宿主細(xì)胞)之間充分接觸(以降低des-phe同工型雜質(zhì)的水平)完成后，緩沖液中生長(zhǎng)激素蛋白的濃度分別大約0.1mg/ml到大約20mg/ml，大約0.5mg/ml到大約5mg/ml，或大約1mg/ml到大約5mg/ml。
此外，在金屬鹽加到宿主細(xì)胞或其含有生長(zhǎng)激素蛋白的裂解液中后，生長(zhǎng)培養(yǎng)基與緩沖液，金屬鹽和其他內(nèi)容物(包括但不限于生長(zhǎng)激素蛋白)一起的溫度范圍優(yōu)選應(yīng)維持在大約0℃到大約35℃。同樣，優(yōu)選地，宿主細(xì)胞和/或從中獲得的含有生長(zhǎng)激素蛋白的裂解液的溫度分別維持在大約1℃到大約15℃，大約2℃到大約10℃，或大約2℃到大約15℃。注意，在用金屬鹽(例如，NaP)均質(zhì)時(shí)，勻漿的溫度可能上升。值得注意的是，生長(zhǎng)激素蛋白在大約40+℃發(fā)生變性。為此，理想的是維持勻漿(即，含有宿主細(xì)胞，生長(zhǎng)培養(yǎng)基，緩沖液，金屬鹽，生長(zhǎng)激素蛋白以及任選巰基化合物等)的溫度低于生長(zhǎng)激素的蛋白變性溫度。
另外，生長(zhǎng)激素蛋白與金屬鹽之間的接觸時(shí)間應(yīng)足以降低des-phe同工型雜質(zhì)的水平。用于降低des-phe同工型雜質(zhì)水平的合適接觸時(shí)間應(yīng)示例性分別為至少大約30分鐘，大約1小時(shí)到大約48小時(shí)，或大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
通常，在金屬鹽與生長(zhǎng)激素蛋白之間充分接觸后，含有上述同樣成分的緩沖液的體積分別為大約1升到大約5,000升，大約100升到大約2,000升，或200升到大約1,500升。
在金屬鹽與生長(zhǎng)激素蛋白之間接觸的過(guò)程中其他感興趣的參數(shù)包括混合比等。混合比應(yīng)足以形成均勻的混合物(宿主細(xì)胞，其裂解液，緩沖液，金屬鹽，生長(zhǎng)激素蛋白以及生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的其他任何組分的混合物)，同時(shí)使形成的泡沫量最小化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易地確定，怎樣的混合比應(yīng)是足夠的。顯然，混合比應(yīng)使溫度維持在上述范圍內(nèi)，并且使生長(zhǎng)激素蛋白組分的任何降解最小化。
本發(fā)明的實(shí)施方案1.在遺傳修飾的宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽時(shí)降低雜質(zhì)量的方法，所述包括下列步驟(a)將巰基化合物與所述雜質(zhì)在充分條件下接觸以降低所述雜質(zhì)的量，其中所述雜質(zhì)為所述多肽的三硫化物同工型。
2.實(shí)施方案1的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(b)使所述宿主細(xì)胞生長(zhǎng)以制備所述多肽，其中在所述接觸步驟(a)之前或過(guò)程中，進(jìn)行所述生長(zhǎng)。
3.實(shí)施方案2的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟
(c)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
4.實(shí)施方案3的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(d)使所述純化的多肽PEG化。
5.實(shí)施方案2的方法，其中所述巰基化合物選自亞硫酸鹽，谷胱苷肽，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，巰基乙胺，二硫赤蘚糖醇，三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽，半胱氨酸，和半胱氨酸與胱氨酸的組合。
6.實(shí)施方案1的方法，其中所述巰基化合物選自亞硫酸鹽，谷胱苷肽，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，巰基乙胺，二硫赤蘚糖醇，三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽，半胱氨酸，和半胱氨酸與胱氨酸的組合。
7.實(shí)施方案5的方法，其中所述巰基化合物包括半胱氨酸或半胱氨酸與胱氨酸的組合。
8.實(shí)施方案6的方法，其中所述巰基化合物包括半胱氨酸或半胱氨酸與胱氨酸的組合。
9.實(shí)施方案7的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述三硫化物同工型與所述半胱氨酸或半胱氨酸和胱氨酸的組合接觸足夠的時(shí)間段以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約10％。
10.實(shí)施方案9的方法，其中所述時(shí)間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約50％。
11.實(shí)施方案8的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述三硫化物同工型與所述半胱氨酸接觸足夠的時(shí)間段以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約10％。
12.實(shí)施方案11的方法，其中所述時(shí)間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約50％。
13.實(shí)施方案1的方法，其中所述巰基化合物提供在緩沖液中。
14.實(shí)施方案2的方法，其中所述巰基化合物提供在緩沖液中。
15.實(shí)施方案7的方法，其中所述半胱氨酸或半胱氨酸和胱氨酸的組合提供在緩沖液中。
16.實(shí)施方案8的方法，其中所述半胱氨酸或半胱氨酸和胱氨酸的組合提供在緩沖液中。
17.實(shí)施方案15的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液的起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為至少大約0.1mM。
18.實(shí)施方案16的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液的起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為至少大約0.1mM。
19.實(shí)施方案17的方法，其中所述起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為大約0.1mM到大約10mM。
20.實(shí)施方案18的方法，其中所述起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為大約0.1mM到大約10mM。
21.實(shí)施方案19的方法，其中所述起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為大約1mM到大約5mM。
22.實(shí)施方案20的方法，其中所述起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為大約1mM到大約5mM。
23.實(shí)施方案13的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
24.實(shí)施方案14的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
25.實(shí)施方案15的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
26.實(shí)施方案16的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
27.實(shí)施方案23的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
28.實(shí)施方案26的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
29.實(shí)施方案25的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
30.實(shí)施方案24的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
31.實(shí)施方案29的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
32.實(shí)施方案28的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
33.實(shí)施方案31的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
34.實(shí)施方案32的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
35.實(shí)施方案1的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
36.實(shí)施方案2的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
37.實(shí)施方案25的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
38.實(shí)施方案26的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
39.實(shí)施方案38的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述緩沖液的起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為至少大約0.1mM。
40.實(shí)施方案37的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述緩沖液的起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為至少大約0.1mM。
41.實(shí)施方案37的方法，其中所述緩沖液中半胱氨酸和胱氨酸的所述組合與所述B-2036的摩爾數(shù)之比在所述接觸步驟(a)之前為大約0.5到大約1000。
42.實(shí)施方案38的方法，其中所述緩沖液中半胱氨酸和胱氨酸的所述組合與所述B-2036的摩爾數(shù)之比在所述接觸步驟(a)之前為大約0.5到大約1000。
43.實(shí)施方案37的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約30mg/ml。
44.實(shí)施方案38的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約30mg/ml。
45.實(shí)施方案43的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約20mg/ml。
46.實(shí)施方案44的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約20mg/ml。
47.實(shí)施方案45的方法，其中所述B-2036濃度為大約1mg/ml到大約10mg/ml。
48.實(shí)施方案46的方法，其中所述B-2036濃度為大約1mg/ml到大約10mg/ml。
49.實(shí)施方案37的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
50.實(shí)施方案38的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
51.實(shí)施方案49的方法，其中所述pH為大約7.5到大約8.5。
52.實(shí)施方案50的方法，其中所述pH為大約7.5到大約8.5。
53.實(shí)施方案37的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約25℃的溫度。
54.實(shí)施方案38的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約25℃的溫度。
55.實(shí)施方案53的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約8℃。
56.實(shí)施方案54的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約8℃。
57.實(shí)施方案37的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)行的時(shí)間為至少約30分鐘。
58.實(shí)施方案38的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)行的時(shí)間為至少約30分鐘。
59.實(shí)施方案57的方法，其中所述時(shí)間為大約1小時(shí)到大約24小時(shí)。
60.實(shí)施方案58的方法，其中所述時(shí)間為大約1小時(shí)到大約24小時(shí)。
61.實(shí)施方案59的方法，其中所述時(shí)間為大約1小時(shí)到大約4小時(shí)。
62.實(shí)施方案60的方法，其中所述時(shí)間為大約1小時(shí)到大約4小時(shí)。
63.實(shí)施方案37的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
64.實(shí)施方案38的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
65.實(shí)施方案63的方法，其中所述體積為大約10L到大約500L。
66.實(shí)施方案64的方法，其中所述體積為大約10L到大約500L。
67.實(shí)施方案65的方法，其中所述體積為大約100L到大約300L。
68.實(shí)施方案66的方法，其中所述體積為大約100L到大約300L。
69.在含有細(xì)胞組分的基因修飾的宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽時(shí)降低雜質(zhì)量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將螯合劑與下列物質(zhì)在充分條件下接觸以降低所述雜質(zhì)的量(1)所述雜質(zhì)，(2)所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽，(3)所述細(xì)胞組分以及(4)上述物質(zhì)的組合，其中所述雜質(zhì)為所述多肽的三硫化物同工型。
70.實(shí)施方案69的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(b)使所述宿主細(xì)胞生長(zhǎng)以制備所述多肽，其中在所述接觸步驟(a)之前或過(guò)程中，進(jìn)行所述生長(zhǎng)。
71.實(shí)施方案70的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(c)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
72.實(shí)施方案71的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(d)使所述純化的多肽PEG化。
73.實(shí)施方案70的方法，其中所述螯合劑選自EDTA，EGTA和DTPA。
74.實(shí)施方案69的方法，其中所述螯合劑選自EDTA，EGTA和DTPA。
75.實(shí)施方案73的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
76.實(shí)施方案74的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
77.實(shí)施方案75的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述三硫化物同工型與所述EDTA接觸的時(shí)間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約10％。
78.實(shí)施方案77的方法，其中所述時(shí)間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約50％。
79.實(shí)施方案76的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述三硫化物同工型與所述EDTA接觸的時(shí)間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約10％。
80.實(shí)施方案79的方法，其中所述時(shí)間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約50％。
81.實(shí)施方案69的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中。
82.實(shí)施方案70的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中。
83.實(shí)施方案75的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中。
84.實(shí)施方案76的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中。
85.實(shí)施方案83的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
86.實(shí)施方案84的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
87.實(shí)施方案85的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.01mM到大約100mM。
88.實(shí)施方案86的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.01mM到大約100mM。
89.實(shí)施方案87的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.1mM到大約20mM。
90.實(shí)施方案87的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.1mM到大約20mM。
91.實(shí)施方案89的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約2mM到大約10mM。
92.實(shí)施方案89的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約2mM到大約10mM。
93.實(shí)施方案81的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
94.實(shí)施方案82的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
95.實(shí)施方案83的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
96.實(shí)施方案84的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
97.實(shí)施方案93的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
98.實(shí)施方案96的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
99.實(shí)施方案95的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
100.實(shí)施方案94的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
101.實(shí)施方案99的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液中的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
102.實(shí)施方案98的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液中的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
103.實(shí)施方案101的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
104.實(shí)施方案102的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
105.實(shí)施方案69的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
106.實(shí)施方案70的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
107.實(shí)施方案95的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
108.實(shí)施方案96的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
109.實(shí)施方案107的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
110.實(shí)施方案108的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
111.實(shí)施方案107的方法，其中所述緩沖液中的所述EDTA和所述B-2036的摩爾數(shù)之比在所述接觸步驟(a)之前為大約1到大約1,000。
112.實(shí)施方案108的方法，其中所述緩沖液中的所述EDTA和所述B-2036的摩爾數(shù)之比在所述接觸步驟(a)之前為大約1到大約1,000。
113.實(shí)施方案111的方法，其中所述摩爾比為大約20到大約1,000。
114.實(shí)施方案112的方法，其中所述摩爾比為大約20到大約1,000。
115.實(shí)施方案113的方法，其中所述摩爾比為大約50到大約250。
116.實(shí)施方案114的方法，其中所述摩爾比為大約50到大約250。
117.實(shí)施方案107的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
118.實(shí)施方案108的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
119.實(shí)施方案117的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
120.實(shí)施方案118的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
121.實(shí)施方案107的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
122.實(shí)施方案108的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
123.實(shí)施方案121的方法，其中所述pH為大約6.5到大約7.5。
124.實(shí)施方案122的方法，其中所述pH為大約6.5到大約7.5。
125.實(shí)施方案107的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
126.實(shí)施方案108的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
127.實(shí)施方案125的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
128.實(shí)施方案126的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
129.實(shí)施方案107的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)行的時(shí)間為大約1小時(shí)到大約48小時(shí)。
130.實(shí)施方案108的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)行的時(shí)間為大約1小時(shí)到大約48小時(shí)。
131.實(shí)施方案129的方法，其中所述時(shí)間為大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
132.實(shí)施方案130的方法，其中所述時(shí)間為大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
133.實(shí)施方案107的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
134.實(shí)施方案108的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
135.實(shí)施方案133的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
136.實(shí)施方案134的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
137.在含有細(xì)胞組分的遺傳修飾的宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽時(shí)降低雜質(zhì)量的方法，所述包括下列步驟(a)將金屬鹽與下列物質(zhì)在充分條件下接觸以降低所述雜質(zhì)的量(1)所述雜質(zhì)，(2)所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽，(3)所述細(xì)胞組分，以及(4)上述物質(zhì)的組合，其中所述雜質(zhì)為所述多肽的三硫化物同工型。
138.實(shí)施方案137的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(b)使所述宿主細(xì)胞生長(zhǎng)以制備所述多肽，其中在所述接觸步驟(a)之前或過(guò)程中，進(jìn)行所述生長(zhǎng)。
139.實(shí)施方案138的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(c)任選進(jìn)一步使所述雜質(zhì)與巰基化合物接觸，以及(c’)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
140.實(shí)施方案139的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(d)使所述純化的多肽PEG化。
141.實(shí)施方案138的方法，其中所述金屬鹽選自堿金屬鹽，堿土金屬鹽，過(guò)渡金屬鹽，及其組合。
142.實(shí)施方案137的方法，其中所述金屬鹽選自堿金屬鹽，堿土金屬鹽，過(guò)渡金屬鹽，及其組合。
143.實(shí)施方案141的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
144.實(shí)施方案142的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
145.實(shí)施方案143的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鈉和氯化鋅。
146.實(shí)施方案144的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鈉和氯化鋅。
147.實(shí)施方案137的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述三硫化物同工型與所述金屬鹽接觸的時(shí)間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約10％。
148.實(shí)施方案147的方法，其中所述時(shí)間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約50％。
149.實(shí)施方案138的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述三硫化物同工型與所述金屬鹽接觸的時(shí)間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約10％。
150.實(shí)施方案149的方法，其中所述時(shí)間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約50％。
151.實(shí)施方案137的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中。
152.實(shí)施方案138的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中。
153.實(shí)施方案151的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始金屬鹽濃度為大約1mM到大約500mM。
154.實(shí)施方案152的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始金屬鹽濃度為大約1mM到大約500mM。
155.實(shí)施方案153的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
156.實(shí)施方案154的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
157.實(shí)施方案145的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
158.實(shí)施方案146的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
159.實(shí)施方案151的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
160.實(shí)施方案153的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
161.實(shí)施方案137的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
162.實(shí)施方案138的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
163.實(shí)施方案160的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
164.實(shí)施方案159的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
165.實(shí)施方案163的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
166.實(shí)施方案164的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
167.實(shí)施方案165的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述磷酸鈉的起始濃度為至少大約0.1mM。
168.實(shí)施方案166的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述磷酸鈉的起始濃度為至少大約0.1mM。
169.實(shí)施方案163的方法，其中所述緩沖液中的所述金屬鹽和所述B-2036的摩爾數(shù)之比在所述接觸步驟(a)之前為大約300到大約10,000。
170.實(shí)施方案164的方法，其中所述緩沖液中的所述金屬鹽和所述B-2036的摩爾數(shù)之比在所述接觸步驟(a)之前為大約300到大約10,000。
171.實(shí)施方案169的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約5,000。
172.實(shí)施方案170的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約5,000。
173.實(shí)施方案171的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約2500。
174.實(shí)施方案172的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約2500。
175.實(shí)施方案153的方法，其中所述金屬鹽為磷酸鈉或磷酸鉀。
176.實(shí)施方案154的方法，其中所述金屬鹽為磷酸鈉或磷酸鉀。
177.實(shí)施方案175的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
178.實(shí)施方案176的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
179.實(shí)施方案177的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約25mM到大約100mM。
180.實(shí)施方案178的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約25mM到大約100mM。
181.實(shí)施方案163的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
182.實(shí)施方案164的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
183.實(shí)施方案181的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
184.實(shí)施方案182的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
185.實(shí)施方案163的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約4到大約9。
186.實(shí)施方案184的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約4到大約9。
187.實(shí)施方案185的方法，其中所述pH為大約5.5到大約7.5。
188.實(shí)施方案186的方法，其中所述pH為大約5.5到大約7.5。
189.實(shí)施方案163的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
190.實(shí)施方案164的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
191.實(shí)施方案189的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
192.實(shí)施方案190的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
193.實(shí)施方案163的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)行的時(shí)間為大約1小時(shí)到大約48小時(shí)。
194.實(shí)施方案164的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)行的時(shí)間為大約1小時(shí)到大約48小時(shí)。
195.實(shí)施方案193的方法，其中所述時(shí)間為大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
196.實(shí)施方案194的方法，其中所述時(shí)間為大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
197.實(shí)施方案163的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
198.實(shí)施方案164的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
199.實(shí)施方案197的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
200.實(shí)施方案198的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
201.在含有細(xì)胞組分的基因修飾的宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽時(shí)降低雜質(zhì)量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將螯合劑與下列物質(zhì)在充分條件下接觸以降低所述雜質(zhì)的量(1)所述雜質(zhì)，(2)所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽，(3)所述細(xì)胞組分以及(4)上述物質(zhì)的組合，其中所述雜質(zhì)為所述多肽的des-phe同工型。
202.實(shí)施方案201的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(b)使所述宿主細(xì)胞生長(zhǎng)以制備所述多肽，其中在所述接觸步驟(a)之前或過(guò)程中，進(jìn)行所述生長(zhǎng)。
203.實(shí)施方案202的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(c)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
204.實(shí)施方案203的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(d)使所述純化的多肽PEG化。
205.實(shí)施方案202的方法，其中所述螯合劑選自EDTA，EGTA和DTPA。
206.實(shí)施方案201的方法，其中所述螯合劑選自EDTA，EGTA和DTPA。
207.實(shí)施方案205的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
208.實(shí)施方案206的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
209.實(shí)施方案207的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述EDTA接觸的時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
210.實(shí)施方案209的方法，其中所述時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
211.實(shí)施方案208的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述EDTA接觸的時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
212.實(shí)施方案211的方法，其中所述時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
213.實(shí)施方案201的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中。
214.實(shí)施方案202的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中。
215.實(shí)施方案207的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中。
216.實(shí)施方案208的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中。
217.實(shí)施方案215的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
218.實(shí)施方案216的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
219.實(shí)施方案217的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.01mM到大約100mM。
220.實(shí)施方案218的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.01mM到大約100mM。
221.實(shí)施方案219的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.1mM到大約20mM。
222.實(shí)施方案220的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.1mM到大約20mM。
223.實(shí)施方案221的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約2mM到大約10mM。
224.實(shí)施方案222的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約2mM到大約10mM。
225.實(shí)施方案213的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
226.實(shí)施方案214的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
227.實(shí)施方案215的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
228.實(shí)施方案216的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
229.實(shí)施方案225的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
230.實(shí)施方案226的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
231.實(shí)施方案227的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
232.實(shí)施方案228的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
233.實(shí)施方案229的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液中的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
234.實(shí)施方案230的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液中的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
235.實(shí)施方案233的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
236.實(shí)施方案234的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
237.實(shí)施方案201的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
238.實(shí)施方案202的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
239.實(shí)施方案227的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
240.實(shí)施方案228的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
241.實(shí)施方案239的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
242.實(shí)施方案240的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
243.實(shí)施方案239的方法，其中所述緩沖液中的所述EDTA和所述B-2036的摩爾數(shù)之比在所述接觸步驟(a)之前為大約1到大約1,000。
244.實(shí)施方案240的方法，其中所述緩沖液中的所述EDTA和所述B-2036的摩爾數(shù)之比在所述接觸步驟(a)之前為大約1到大約1,000。
245.實(shí)施方案243的方法，其中所述摩爾比為大約20到大約1,000。
246.實(shí)施方案244的方法，其中所述摩爾比為大約20到大約1,000。
247.實(shí)施方案245的方法，其中所述摩爾比為大約50到大約250。
248.實(shí)施方案246的方法，其中所述摩爾比為大約50到大約250。
249.實(shí)施方案239的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
250.實(shí)施方案240的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
251.實(shí)施方案249的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
252.實(shí)施方案250的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/m1。
253.實(shí)施方案249的方法，其中所述B-2036濃度為大約1mg/ml到大約10mg/ml。
254.實(shí)施方案250的方法，其中所述B-2036濃度為大約1mg/ml到大約10mg/ml。
255.實(shí)施方案239的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
256.實(shí)施方案240的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
257.實(shí)施方案255的方法，其中所述pH為大約6.5到大約7.5。
258.實(shí)施方案256的方法，其中所述pH為大約6.5到大約7.5。
259.實(shí)施方案239的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
260.實(shí)施方案240的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
261.實(shí)施方案259的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
262.實(shí)施方案260的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
263.實(shí)施方案239的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)行的時(shí)間為大約1小時(shí)到大約48小時(shí)。
264.實(shí)施方案240的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)行的時(shí)間為大約1小時(shí)到大約48小時(shí)。
265.實(shí)施方案263的方法，其中所述時(shí)間為大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
266.實(shí)施方案264的方法，其中所述時(shí)間為大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
267.實(shí)施方案239的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
268.實(shí)施方案240的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
269.實(shí)施方案267的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
270.實(shí)施方案268的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
271.在含有細(xì)胞組分的遺傳修飾的宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽時(shí)降低雜質(zhì)量的方法，所述包括下列步驟(a)將金屬鹽與下列物質(zhì)在充分條件下接觸以降低所述雜質(zhì)的量(1)所述雜質(zhì)，(2)所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽，(3)所述細(xì)胞組分，以及(4)上述物質(zhì)的組合，
其中所述雜質(zhì)為所述多肽的des-phe同工型。
272.實(shí)施方案271的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(b)使所述宿主細(xì)胞生長(zhǎng)以制備所述多肽，其中在所述接觸步驟(a)之前或過(guò)程中，進(jìn)行所述生長(zhǎng)。
273.實(shí)施方案272的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(c)任選進(jìn)一步使所述雜質(zhì)與巰基化合物接觸，以及(c’)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
274.實(shí)施方案273的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(d)使所述純化的多肽PEG化。
275.實(shí)施方案272的方法，其中所述金屬鹽選自堿金屬鹽，堿土金屬鹽，過(guò)渡金屬鹽，及其組合。
276.實(shí)施方案271的方法，其中所述金屬鹽選自堿金屬鹽，堿土金屬鹽，過(guò)渡金屬鹽，及其組合。
277.實(shí)施方案275的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
278.實(shí)施方案276的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
279.實(shí)施方案277的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鈉和氯化鋅。
280.實(shí)施方案278的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鈉和氯化鋅。
281.實(shí)施方案271的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述金屬鹽接觸的時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
282.實(shí)施方案281的方法，其中所述時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
283.實(shí)施方案272的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述金屬鹽接觸的時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
284.實(shí)施方案283的方法，其中所述時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
285.實(shí)施方案271的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中。
286.實(shí)施方案272的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中。
287.實(shí)施方案285的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始金屬鹽濃度為大約1mM到大約500mM。
288.實(shí)施方案286的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始金屬鹽濃度為大約1mM到大約500mM。
289.實(shí)施方案287的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
290.實(shí)施方案288的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
291.實(shí)施方案286的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
292.實(shí)施方案285的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
293.實(shí)施方案285的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
294.實(shí)施方案286的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
295.實(shí)施方案271的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
296.實(shí)施方案272的方法，其中所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
297.實(shí)施方案295的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
298.實(shí)施方案296的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
299.實(shí)施方案297的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述磷酸鈉的起始濃度為至少大約0.1mM。
300.實(shí)施方案298的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述磷酸鈉的起始濃度為至少大約0.1mM。
301.實(shí)施方案295的方法，其中所述金屬鹽和所述B-2036的摩爾數(shù)之比在所述接觸步驟(a)之前為大約300到大約10,000。
302.實(shí)施方案296的方法，其中所述金屬鹽和所述B-2036的摩爾數(shù)之比在所述接觸步驟(a)之前為大約300到大約10,000。
303.實(shí)施方案301的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約5,000。
304.實(shí)施方案302的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約5,000。
305.實(shí)施方案303的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約2500。
306.實(shí)施方案304的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約2500。
307.實(shí)施方案287的方法，其中所述金屬鹽為磷酸鈉或磷酸鉀。
308.實(shí)施方案288的方法，其中所述金屬鹽為磷酸鈉或磷酸鉀。
309.實(shí)施方案307的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
310.實(shí)施方案308的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
311.實(shí)施方案309的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約25mM到大約100mM磷酸鈉。
312.實(shí)施方案310的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約25mM到大約100mM。
313.實(shí)施方案295的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
314.實(shí)施方案296的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
315.實(shí)施方案313的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
316.實(shí)施方案314的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
317.實(shí)施方案293的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約4到大約9。
318.實(shí)施方案294的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約4到大約9。
319.實(shí)施方案317的方法，其中所述pH為大約5.5到大約7.5。
320.實(shí)施方案318的方法，其中所述pH為大約5.5到大約7.5。
321.實(shí)施方案295的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
322.實(shí)施方案296的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
323.實(shí)施方案321的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
324.實(shí)施方案322的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
325.實(shí)施方案295的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)行的時(shí)間為大約1小時(shí)到大約48小時(shí)。
326.實(shí)施方案296的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)行的時(shí)間為大約1小時(shí)到大約48小時(shí)。
327.實(shí)施方案325的方法，其中所述時(shí)間為大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
328.實(shí)施方案326的方法，其中所述時(shí)間為大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
329.實(shí)施方案295的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
330.實(shí)施方案296的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
331.實(shí)施方案329的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
332.實(shí)施方案330的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
333.在含有細(xì)胞組分的基因修飾的宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)生長(zhǎng)激素多肽時(shí)降低雜質(zhì)量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將螯合劑與下列物質(zhì)在充分條件下接觸以降低所述雜質(zhì)的量(1)所述雜質(zhì)，(2)所述生長(zhǎng)激素多肽，(3)所述細(xì)胞組分以及(4)上述物質(zhì)的組合，
其中所述雜質(zhì)為所述多肽的des-phe同工型。
334.實(shí)施方案333的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(b)使所述宿主細(xì)胞生長(zhǎng)以制備所述多肽，其中在所述接觸步驟(a)之前或過(guò)程中，進(jìn)行所述生長(zhǎng)。
335.實(shí)施方案334的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(c)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
336.實(shí)施方案333的方法，其中所述螯合劑選自EDTA，EGTA和DTPA。
337.實(shí)施方案334的方法，其中所述螯合劑選自EDTA，EGTA和DTPA。
338.實(shí)施方案336的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
339.實(shí)施方案337的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
340.實(shí)施方案338的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述EDTA接觸的時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
341.實(shí)施方案340的方法，其中所述時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
342.實(shí)施方案339的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述EDTA接觸的時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
343.實(shí)施方案342的方法，其中所述時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
344.實(shí)施方案333的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中。
345.實(shí)施方案334的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中。
346.實(shí)施方案338的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中。
347.實(shí)施方案339的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中。
348.實(shí)施方案346的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
349.實(shí)施方案347的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
350.實(shí)施方案348的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.01mM到大約100mM。
351.實(shí)施方案349的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.01mM到大約100mM。
352.實(shí)施方案350的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.1mM到大約20mM。
353.實(shí)施方案351的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.1mM到大約20mM。
354.實(shí)施方案352的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約2mM到大約10mM。
355.實(shí)施方案353的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約2mM到大約10mM。
356.實(shí)施方案344的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
357.實(shí)施方案345的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
358.實(shí)施方案346的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
359.實(shí)施方案347的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
360.實(shí)施方案356的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
361.實(shí)施方案357的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
362.實(shí)施方案358的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
363.實(shí)施方案359的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
364.實(shí)施方案360的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液中的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
365.實(shí)施方案361的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液中的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
366.實(shí)施方案364的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
367.實(shí)施方案365的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
368.實(shí)施方案333的方法，其中所述生長(zhǎng)激素包括[SEQ.ID.NO.2]的多肽hGH。
369.實(shí)施方案334的方法，其中所述生長(zhǎng)激素包括[SEQ.ID.NO.2]的多肽hGH。
370.實(shí)施方案368的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
371.實(shí)施方案369的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
372.實(shí)施方案370的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
373.實(shí)施方案371的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中，在所述接觸(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.1mM。
374.實(shí)施方案370的方法，其中所述EDTA和所述hGH的摩爾數(shù)之比在所述接觸步驟(a)之前為大約1到大約1,000。
375.實(shí)施方案371的方法，其中所述EDTA和所述hGH的摩爾數(shù)之比在所述接觸步驟(a)之前為大約1到大約1,000。
376.實(shí)施方案374的方法，其中所述摩爾比為大約20到大約1,000。
377.實(shí)施方案375的方法，其中所述摩爾比為大約20到大約1,000。
378.實(shí)施方案376的方法，其中所述摩爾比為大約50到大約250。
379.實(shí)施方案377的方法，其中所述摩爾比為大約50到大約250。
380.實(shí)施方案368的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
381.實(shí)施方案369的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
382.實(shí)施方案380的方法，其中所述hGH濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
383.實(shí)施方案381的方法，其中所述hGH濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
384.實(shí)施方案368的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
385.實(shí)施方案369的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
386.實(shí)施方案384的方法，其中所述pH為大約6.5到大約7.5。
387.實(shí)施方案385的方法，其中所述pH為大約6.5到大約7.5。
388.實(shí)施方案368的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述hGH維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
389.實(shí)施方案369的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述hGH維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
390.實(shí)施方案388的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
391.實(shí)施方案389的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
392.實(shí)施方案368的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)行的時(shí)間為大約1小時(shí)到大約48小時(shí)。
393.實(shí)施方案369的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)行的時(shí)間為大約1小時(shí)到大約48小時(shí)。
394.實(shí)施方案392的方法，其中所述時(shí)間為大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
395.實(shí)施方案393的方法，其中所述時(shí)間為大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
396.實(shí)施方案368的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
397.實(shí)施方案369的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
398.實(shí)施方案396的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
399.實(shí)施方案397的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
400.在含有細(xì)胞組分的遺傳修飾的宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)生長(zhǎng)激素多肽時(shí)降低雜質(zhì)量的方法，所述包括下列步驟(a)將金屬鹽與下列物質(zhì)在充分條件下接觸以降低所述雜質(zhì)的量(1)所述雜質(zhì)，(2)所述生長(zhǎng)激素多肽，(3)所述細(xì)胞組分，以及(4)上述物質(zhì)的組合，其中所述雜質(zhì)為所述多肽的des-phe同工型。
401.實(shí)施方案430的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(b)使所述宿主細(xì)胞生長(zhǎng)以制備所述多肽，其中在所述接觸步驟(a)之前或過(guò)程中，進(jìn)行所述生長(zhǎng)。
402.實(shí)施方案401的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(c)任選進(jìn)一步使所述雜質(zhì)與巰基化合物接觸，以及(c’)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
403.實(shí)施方案400的方法，其中所述金屬鹽選自堿金屬鹽，堿土金屬鹽，過(guò)渡金屬鹽，及其組合。
404.實(shí)施方案401的方法，其中所述金屬鹽選自堿金屬鹽，堿土金屬鹽，過(guò)渡金屬鹽，及其組合。
405.實(shí)施方案403的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
406.實(shí)施方案404的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
407.實(shí)施方案405的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鈉和氯化鋅。
408.實(shí)施方案406的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鈉和氯化鋅。
409.實(shí)施方案400的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述金屬鹽接觸的時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
410.實(shí)施方案409的方法，其中所述時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
411.實(shí)施方案401的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述金屬鹽接觸的時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
412.實(shí)施方案411的方法，其中所述時(shí)間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
413.實(shí)施方案400的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中。
414.實(shí)施方案401的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中。
415.實(shí)施方案413的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始金屬鹽濃度為大約1mM到大約500mM。
416.實(shí)施方案414的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始金屬鹽濃度為大約1mM到大約500mM。
417.實(shí)施方案415的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
418.實(shí)施方案416的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
419.實(shí)施方案417的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
420.實(shí)施方案418的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
421.實(shí)施方案413的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
422.實(shí)施方案414的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
423.實(shí)施方案400的方法，其中所述生長(zhǎng)激素包括[SEQ.ID.NO.2]的多肽hGH。
424.實(shí)施方案401的方法，其中所述生長(zhǎng)激素多肽包括[SEQ.ID.NO.2]的多肽hGH。
425.實(shí)施方案407的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
426.實(shí)施方案408的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
427.實(shí)施方案425的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述磷酸鈉的起始濃度為至少大約0.1mM。
428.實(shí)施方案426的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述磷酸鈉的起始濃度為至少大約0.1mM。
429.實(shí)施方案423的方法，其中所述緩沖液中的所述金屬鹽和所述hGH的摩爾數(shù)之比在所述接觸步驟(a)之前為大約300到大約10,000。
430.實(shí)施方案424的方法，其中所述緩沖液中的所述金屬鹽和所述hGH的摩爾數(shù)之比在所述接觸步驟(a)之前為大約300到大約10,000。
431.實(shí)施方案429的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約5,000。
432.實(shí)施方案430的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約5,000。
433.實(shí)施方案431的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約2500。
434.實(shí)施方案432的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約2500。
435.實(shí)施方案415的方法，其中所述金屬鹽為磷酸鈉或磷酸鉀。
436.實(shí)施方案416的方法，其中所述金屬鹽為磷酸鈉或磷酸鉀。
437.實(shí)施方案435的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
438.實(shí)施方案436的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
439.實(shí)施方案437的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約25mM到大約100mM。
440.實(shí)施方案438的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約25mM到大約100mM。
441.實(shí)施方案423的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
442.實(shí)施方案424的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
443.實(shí)施方案441的方法，其中所述hGH濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
444.實(shí)施方案442的方法，其中所述hGH濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
445.實(shí)施方案413的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約4到大約9。
446.實(shí)施方案414的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約4到大約9。
447.實(shí)施方案445的方法，其中所述pH為大約5.5到大約7.5。
448.實(shí)施方案446的方法，其中所述pH為大約5.5到大約7.5。
449.實(shí)施方案423的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述hGH維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
450.實(shí)施方案424的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述hGH維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
451.實(shí)施方案449的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
452.實(shí)施方案450的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
453.實(shí)施方案423的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)行的時(shí)間為大約1小時(shí)到大約48小時(shí)。
454.實(shí)施方案424的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)行的時(shí)間為大約1小時(shí)到大約48小時(shí)。
455.實(shí)施方案453的方法，其中所述時(shí)間為大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
456.實(shí)施方案454的方法，其中所述時(shí)間為大約5小時(shí)到大約15小時(shí)。
457.實(shí)施方案423的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
458.實(shí)施方案424的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
459.實(shí)施方案457的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
460.實(shí)施方案458的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
461.實(shí)施方案69的方法，其中所述接觸步驟(a)在缺乏巰基化合物的條件下進(jìn)行。
462.實(shí)施方案69的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)一步包括先與所述螯合劑接觸，再在缺乏所述螯合劑的條件下與巰基化合物接觸。
463.實(shí)施方案462的方法，其中所述巰基化合物選自亞硫酸鹽，谷胱苷肽，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，巰基乙胺，二硫赤蘚糖醇，三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽，半胱氨酸，和半胱氨酸與胱氨酸的組合。
464.實(shí)施方案463的方法，其中所述巰基化合物包括半胱氨酸或半胱氨酸與胱氨酸的組合。
465.實(shí)施方案137的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)一步包括與組合有巰基化合物的所述金屬鹽接觸。
466.實(shí)施方案465的方法，其中所述巰基化合物選自亞硫酸鹽，谷胱苷肽，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，巰基乙胺，二硫赤蘚糖醇，三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽，半胱氨酸，和半胱氨酸與胱氨酸的組合。
467.實(shí)施方案466的方法，其中所述巰基化合物包括半胱氨酸或半胱氨酸與胱氨酸的組合。
468.實(shí)施方案137的方法，其中所述接觸步驟(a)進(jìn)一步包括先與所述金屬鹽接觸，再在存在或缺乏所述金屬鹽的條件下與巰基化合物接觸。
下文以實(shí)施例方式示出，不應(yīng)解釋成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。在本申請(qǐng)中所引用的全部書(shū)籍，雜志，期刊文章，專利或其他任何出版物等皆專門在此引作參考。
實(shí)施例實(shí)施例1用巰基化合物降低生長(zhǎng)激素拮抗劑(GHA)的三硫化物同工型雜質(zhì)利用B-2036純化工藝中的滯留物1(參見(jiàn)下文流程圖1)來(lái)完成B-2036-三硫化物水平的減少。如Cunningham等在US專利No.5,849,535中所述，對(duì)表達(dá)B-2036的重組大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵。初始提取和純化步驟(所有步驟在下文流程圖1中獲得滯留物1之前進(jìn)行，例如，全部重懸浮和均質(zhì)，兩相萃取，反相色譜，和陰離子交換層析)如流程圖1中所述進(jìn)行。在第一步超濾/透濾后，產(chǎn)物以蛋白濃度3.7g/L存在于25mM HEPES，pH7.0緩沖液(約150L)。將產(chǎn)物溶液的溫度冷卻至2-8℃，并加入1/10體積(約15L)已冷卻至2-8℃的新鮮制備的200mMTris，20mM半胱氨酸，pH8.0緩沖液處理。B-2036/半胱氨酸溶液維持在2-8℃并混合174分鐘。利用Millipore Biomax 5超濾膜將混合物濃縮至131L，并且對(duì)6×體積的25mM HEPES，pH7.0透析。如下文流程圖1所述，所得產(chǎn)物通過(guò)B-2036純化的剩余工藝進(jìn)行。
在半胱氨酸溫育后，B-2036/三硫化物水平的測(cè)定為3.7％面積。在半胱氨酸溫育后，其水平立即降至2.0％面積(降低大約46％)。




實(shí)施例2用螯合劑降低生長(zhǎng)激素拮抗劑的三硫化物同工型雜質(zhì)參照流程圖1，將165Kg的冷凍GHA細(xì)胞漿加入約1013L的150mM Tris，5mM EDTA，pH7.2。當(dāng)細(xì)胞漿已完成融化后(由穩(wěn)定的A550讀數(shù)測(cè)定)，將混合物以名義流速250L/小時(shí)在950+/-50Bar下通過(guò)Niro均質(zhì)儀。勻漿收集至溫度維持在24-33℃之間的罐中。硫酸銨和PEG-4600加入裂解混合物中使兩種化合物的濃度為10％(w/w)。所得兩相混合物混合60-120分鐘，然后將溶液通過(guò)液/液，固體排出離心而分成兩相。上相含有所需的產(chǎn)物，收集并通過(guò)由“去脂(delipidating)”過(guò)濾器，“深層(depth)”過(guò)濾器以及0.2μm過(guò)濾器組成的系列過(guò)濾器過(guò)濾。過(guò)濾液收集在三個(gè)單獨(dú)的托盤中，對(duì)各個(gè)樣品中的B-2036-三硫化物進(jìn)行分析。水平范圍為3.1-3.8％面積。接著利用如實(shí)施例1中流程圖所述的步驟，將所得物質(zhì)加工成本體中間體。
通過(guò)比較，不同批次的樣品通過(guò)上述步驟處理(但是在裂解緩沖液中沒(méi)有EDTA組分(螯合劑)并且沒(méi)有用半胱氨酸處理滯留物1)，其在上述流程圖1的整個(gè)工藝結(jié)束時(shí)生成的三硫化物水平(n＝10)范圍為3.2-6.4％面積，平均為5.1。當(dāng)EDTA包含在裂解緩沖液中時(shí)，對(duì)滯留物1進(jìn)行半胱氨酸溫育步驟，流程圖1的整個(gè)工藝結(jié)束時(shí)的三硫化物水平為1.5％面積。
實(shí)施例3用金屬鹽降低生長(zhǎng)激素拮抗劑的三硫化物同工型雜質(zhì)參照下文流程圖2，將165Kg的冷凍細(xì)胞漿加入約1013L的100mM磷酸鈉，pH7.0。當(dāng)細(xì)胞漿已完成融化后(由穩(wěn)定的A550讀數(shù)測(cè)定)，將混合物以名義流速250L/小時(shí)在950+/-50Bar下通過(guò)Niro均質(zhì)儀。勻漿收集至溫度維持在24-33℃之間的罐中。硫酸銨和PEG-4600加入裂解混合物中使兩種化合物的濃度為10％(w/w)。所得兩相混合物混合60-120分鐘，然后將溶液通過(guò)液/液，固體排出離心而分成兩相。上相含有所需的產(chǎn)物，收集并通過(guò)由“去脂”過(guò)濾器，“深層”過(guò)濾器以及0.2μm過(guò)濾器組成的系列過(guò)濾器過(guò)濾。如下文流程圖2所述，將此物質(zhì)通過(guò)B-2036的剩余工藝。加工結(jié)束時(shí)B-2036-三硫化物的水平為1.4％面積。相比而言，用普通裂解緩沖液(150mM Tris，pH7.2)處理的B-2036批次(n＝10)的B-2036-三硫化物水平為3.2-6.4％面積。



實(shí)施例4用螯合劑降低生長(zhǎng)激素拮抗劑的Des-Phe同工型雜質(zhì)參照流程圖1，將165Kg的冷凍細(xì)胞漿加入約1013L的150mMTris，5mM EDTA，pH7.2。當(dāng)細(xì)胞漿已完成融化后(由穩(wěn)定的A550讀數(shù)測(cè)定)，將混合物以名義流速250L/小時(shí)在950+/-50Bar下通過(guò)Niro均質(zhì)儀。勻漿收集至溫度維持在24-33℃之間的罐中。硫酸銨和PEG-4600加入裂解混合物中使兩種化合物的濃度為10％(w/w)。所得兩相混合物混合60-120分鐘，然后將溶液通過(guò)液/液，固體排出離心而分成兩相。上相含有所需的產(chǎn)物，收集并通過(guò)由“去脂”過(guò)濾器，“深層”過(guò)濾器以及0.2μm過(guò)濾器組成的系列過(guò)濾器過(guò)濾。過(guò)濾液(上相過(guò)濾后得到；參見(jiàn)流程圖1)收集在三個(gè)單獨(dú)的托盤中，并對(duì)各個(gè)樣品中的B-2036/des-phe進(jìn)行分析。水平范圍為3.2-6.3％面積。相比而言，流程圖1中的其他加工進(jìn)一步使B-2036 des-phe水平降低至滯留物3的0.3％面積。通過(guò)第二步陰離子交換色譜的產(chǎn)物收集參數(shù)而實(shí)現(xiàn)B-2036des-phe水平的進(jìn)一步降低。當(dāng)裂解緩沖液包括EDTA，并且進(jìn)行陰離子交換色譜步驟的收集程序時(shí)，得到的B-2036/des-phe水平為0.3％，與之比較，沒(méi)有EDTA(例如，150mM Tris，pH7.2)和上述收集程序?qū)-2036批次(n＝10)進(jìn)行加工的最終工藝水平為4.6-16.2％面積(平均＝10.2％面積)。
實(shí)施例5用金屬鹽降低生長(zhǎng)激素拮抗劑的Des-Phe同工型雜質(zhì)參照流程圖2，將165Kg的冷凍細(xì)胞漿加入約1013L的100mM磷酸鈉，pH6.0。當(dāng)細(xì)胞漿已完成融化后(由穩(wěn)定的A550讀數(shù)測(cè)定)，將混合物以名義流速250L/小時(shí)在950+/-50Bar下通過(guò)Niro均質(zhì)儀。勻漿收集至溫度維持在24-33℃之間的罐中。硫酸銨和PEG-4600加入裂解混合物中使兩種化合物的濃度為10％(w/w)。所得兩相混合物混合60-120分鐘，然后將溶液通過(guò)液/液，固體排出離心而分成兩相。上相含有所需的產(chǎn)物，收集并通過(guò)由“去脂”過(guò)濾器，“深層”過(guò)濾器以及0.2μm過(guò)濾器組成的系列過(guò)濾器過(guò)濾。過(guò)濾液收集在三個(gè)單獨(dú)的托盤中，對(duì)各個(gè)樣品中的B-2036/des-phe進(jìn)行分析。水平范圍為6.0-9.4％面積。相比而言，流程圖2中的其他加工進(jìn)一步使B-2036 des-phe水平降低至滯留物2的0.8％面積。通過(guò)第二步陰離子交換色譜的產(chǎn)物收集參數(shù)而實(shí)現(xiàn)B-2036/des-phe水平的進(jìn)一步降低。當(dāng)裂解緩沖液包括磷酸鈉，并且進(jìn)行第二步陰離子交換色譜的收集程序時(shí)，得到的B-2036/des-phe水平為0.8％面積，與之比較，沒(méi)有磷酸鈉(例如，150mMTris，pH7.2)和上述收集程序?qū)-2036批次(n＝10)進(jìn)行加工的最終工藝水平為4.6-16.2％面積(平均＝10.2％面積)。
實(shí)施例6用螯合劑降低生長(zhǎng)激素激動(dòng)劑的Des-Phe同工型雜質(zhì)將新鮮或冷凍的表達(dá)生長(zhǎng)激素激動(dòng)劑的重組細(xì)胞懸浮在含有EDTA的緩沖液中。然后，通過(guò)諸如均質(zhì)的過(guò)程完全破壞細(xì)胞，或諸如滲壓休克或冷凍/融化的過(guò)程部分破壞細(xì)胞以釋放生長(zhǎng)激素激動(dòng)劑。接著通過(guò)兩相萃取，固/液離心或過(guò)濾分離破碎的溶液。通過(guò)一系列液相色譜步驟對(duì)激動(dòng)劑進(jìn)行純化。
實(shí)施例7用金屬鹽降低生長(zhǎng)激素激動(dòng)劑的Des-Phe同工型雜質(zhì)將新鮮或冷凍的表達(dá)生長(zhǎng)激素激動(dòng)劑的重組細(xì)胞懸浮在含有磷酸鈉的緩沖液中。然后，通過(guò)諸如均質(zhì)的過(guò)程完全破壞細(xì)胞，或諸如滲壓休克或冷凍/融化的過(guò)程部分破壞細(xì)胞以釋放生長(zhǎng)激素激動(dòng)劑。接著通過(guò)兩相萃取，固/液離心或過(guò)濾分離破碎的溶液。通過(guò)一系列液相色譜步驟對(duì)激動(dòng)劑進(jìn)行純化。
序列表<110>法瑪西亞公司(PHARMACIA CORPORATION)同工型雜質(zhì)水平降低的生長(zhǎng)激素及其拮抗劑的制備方法<120>(Method For The Preparation Of Growth Hormone And Antagonist ThereofHaving Lower Levels Of Isoform Impunties Thereof)<130>SCT05077147<150>US 60/406,553<151>2002-08-28<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>191<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala Asp Arg Leu Asn Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asn ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Lys Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Asn Ala Asp Met Ser Arg Val Ser Thr Phe165 170 175Leu Arg Thr Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190<210>2<211>191<212>PRT<213>Homo sapiens
<400>2Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Pro Iys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155160Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190
權(quán)利要求
1.一種在遺傳修飾的宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽時(shí)降低雜質(zhì)量的方法，所述方法包括下列步驟(a)使巰基化合物與所述雜質(zhì)在充分條件下接觸以降低所述雜質(zhì)的量，其中所述雜質(zhì)為所述多肽的三硫化物同工型。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(b)使所述宿主細(xì)胞生長(zhǎng)以制備所述多肽，其中所述生長(zhǎng)在所述接觸步驟(a)之前或過(guò)程中進(jìn)行。
3.權(quán)利要求2的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(c)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
4.權(quán)利要求3的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(d)使所述純化的多肽PEG化。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述巰基化合物選自亞硫酸鹽，谷胱苷肽，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，巰基乙胺，二硫赤蘚糖醇，三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽，半胱氨酸，和半胱氨酸與胱氨酸的組合。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述巰基化合物選自亞硫酸鹽，谷胱苷肽，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，巰基乙胺，二硫赤蘚糖醇，三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽，半胱氨酸，和半胱氨酸與胱氨酸的組合。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述巰基化合物包括半胱氨酸或半胱氨酸和胱氨酸的組合。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述巰基化合物包括半胱氨酸或半胱氨酸和胱氨酸的組合。
9.權(quán)利要求7的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，所述三硫化物同工型與所述半胱氨酸或半胱氨酸和胱氨酸的組合接觸的時(shí)間段足以使所述三硫化物的量降低至少大約10％。
10.一種在含有細(xì)胞組分的遺傳修飾的宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽時(shí)降低雜質(zhì)量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將螯合劑與下列物質(zhì)在充分條件下接觸以降低所述雜質(zhì)的量(1)所述雜質(zhì)，(2)所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽，(3)所述細(xì)胞組分以及(4)上述物質(zhì)的組合，其中所述雜質(zhì)為所述多肽的三硫化物同工型。
11.一種在含有細(xì)胞組分的遺傳修飾的宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽時(shí)降低雜質(zhì)量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將金屬鹽與下列物質(zhì)在充分條件下接觸以降低所述雜質(zhì)的量(1)所述雜質(zhì)，(2)所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽，(3)所述細(xì)胞組分以及(4)上述物質(zhì)的組合，其中所述雜質(zhì)為所述多肽的三硫化物同工型。
12.一種在含有細(xì)胞組分的遺傳修飾的宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽時(shí)降低雜質(zhì)量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將螯合劑與下列物質(zhì)在充分條件下接觸以降低所述雜質(zhì)的量(1)所述雜質(zhì)，(2)所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽，(3)所述細(xì)胞組分以及(4)上述物質(zhì)的組合，其中所述雜質(zhì)為所述多肽的des-phe同工型。
13.一種在含有細(xì)胞組分的遺傳修飾的宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽時(shí)降低雜質(zhì)量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將金屬鹽與下列物質(zhì)在充分條件下接觸以降低所述雜質(zhì)的量(1)所述雜質(zhì)，(2)所述生長(zhǎng)激素拮抗劑多肽，(3)所述細(xì)胞組分以及(4)上述物質(zhì)的組合，其中所述雜質(zhì)為所述多肽的des-phe同工型。
14.一種在含有細(xì)胞組分的遺傳修飾的宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)生長(zhǎng)激素多肽時(shí)降低雜質(zhì)量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將螯合劑與下列物質(zhì)在充分條件下接觸以降低所述雜質(zhì)的量(1)所述雜質(zhì)，(2)所述生長(zhǎng)激素多肽，(3)所述細(xì)胞組分以及(4)上述物質(zhì)的組合，其中所述雜質(zhì)為所述多肽的des-phe同工型。
15.一種在含有細(xì)胞組分的遺傳修飾的宿主細(xì)胞中重組生產(chǎn)生長(zhǎng)激素多肽時(shí)降低雜質(zhì)量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將金屬鹽與下列物質(zhì)在充分條件下接觸以降低所述雜質(zhì)的量(1)所述雜質(zhì)，(2)所述生長(zhǎng)激素多肽，(3)所述細(xì)胞組分以及(4)上述物質(zhì)的組合，其中所述雜質(zhì)為所述多肽的des-phe同工型。
全文摘要
本發(fā)明總的涉及制備所需多肽的重組方法。這些方法生成的多肽產(chǎn)物含有水平降低的同工型雜質(zhì)。具體而言，本發(fā)明涉及(1)用于制備同工型雜質(zhì)降低的生長(zhǎng)激素的重組方法，以及(2)用于制備同工型雜質(zhì)同樣降低的生長(zhǎng)激素拮抗劑，諸如派格索曼，及其蛋白中間體的重組方法。更具體而言，由本發(fā)明方法降低的同工型雜質(zhì)分別為生長(zhǎng)激素和生長(zhǎng)激素拮抗劑(或其中間體)的三硫化物和des－phe同工型雜質(zhì)。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1697839SQ03824791
公開(kāi)日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2003年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月28日
發(fā)明者阿努拉格·S·拉托, 史蒂芬·B·萊爾, 戴維·E·斯坦邁耶, 斯科特·I·艾倫, 約翰·邁爾, 丹尼斯·M·布瓦萊, 約翰·J·巴克利, 加里·V·約翰遜 申請(qǐng)人:法瑪西亞公司