專利名稱：來自脂肪細胞的磷脂酰肌醇多糖(pig)結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及源自于脂肪細胞質(zhì)膜的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)對磷脂酰肌醇多糖具有特異結(jié)合親和性。
已肯定地確定了磷脂和磷脂酶在跨膜信號傳導傳導中的作用。同樣充分地建立了通過共價鍵連接的糖基磷酯酰肌醇(GPI)錨定蛋白而使蛋白進入細胞膜的概念，并且對于幾種GPI-錨定蛋白，例如源自于人紅細胞的乙酰膽堿酯酶(AchE)、大鼠Thy-1、及幾種寄生蟲的外被蛋白如源自于布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)的變體表面糖蛋白(VSG)，已得出GPI錨的精確化學結(jié)構(gòu)。脂類錨定通過由二?；视突蛲轷；视托偷牧字M成的磷脂酰肌醇(PI)而發(fā)生。其中，由于后者出現(xiàn)于哺乳動物錨中，且不同于存在于膜中的大量PI，因而其可以提供由GPI產(chǎn)生第二信使時涉及的新分子種類。由GPI進行的信號傳導是人們所特別關(guān)注的，因為這些脂類錨定分子不跨越膜，但是在大部分情況下，嵌合于脂雙層的外層。對于在從激素到生長因子范圍內(nèi)的多種內(nèi)分泌及旁分泌分子，已顯示出它們由GPI的細胞膜產(chǎn)生的信號介導釋放。至今，似乎已確定了GPI參與跨膜信號傳導及其在胞內(nèi)的效應，但關(guān)于導致觀察到的代謝效應的信號傳導途徑知之甚少。
GPI錨定分子擁有信號傳導特性這一概念，源自于早期實驗，在實驗中顯示了胰島素結(jié)合到其受體上從而刺激GPI水解。鑒定了模擬胰島素對代謝酶產(chǎn)生某些作用的低分子量物質(zhì)。所述物質(zhì)具有肌醇多糖結(jié)構(gòu)，且在質(zhì)膜內(nèi)引起胰島素敏感的GPI水解。盡管最初認為作為肌醇多糖酶調(diào)節(jié)子的GPI前體在結(jié)構(gòu)上類似于GPI膜蛋白錨，但是信號轉(zhuǎn)導GPI和膜蛋白的GPI錨之間在糖部分有明顯差異。GPI膜蛋白錨總是由連著磷酸乙醇胺的三甘露糖核心組成，其提供了與所結(jié)合蛋白C末端氨基酸的連接。
不僅胰島素可調(diào)節(jié)GPI水解，也觀察到許多其它激素調(diào)節(jié)GPI水解。
實際上在所有情況下，激素或生長因子刺激細胞都導致GPI錨定蛋白從細胞表面瞬時釋放。這些激動劑的大部分受體是酪氨酸激酶受體或是與酪氨酸激酶偶聯(lián)的受體。
已在分子水平上確定了涉及胰島素作用的許多蛋白質(zhì)。胰島素受體是跨膜酪氨酸激酶，當其受胰島素結(jié)合活化時，迅速進行自身磷酸化，同時使許多胞內(nèi)底物磷酸化，在這些底物中，一個或多個是50-60kDa蛋白質(zhì)，包括1 5kDa脂肪酸結(jié)合蛋白Shc和胰島素受體的幾種底物蛋白質(zhì)IRS-1/2/3/4。酪氨酸磷酸化后，IRS多肽作為幾種Src同源性2結(jié)構(gòu)域的?？康鞍?，其包括銜接分子和酶，這些酶包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-K)、Grb2、SHP2、Nck和Fyn。通過酶的p85調(diào)節(jié)亞單位產(chǎn)生IRS蛋白和PI 3-K間的相互作用，進而導致p110亞單位的催化活性增強。對于許多胰島素敏感的代謝過程，包括葡萄糖轉(zhuǎn)運和糖原合成的刺激，PI 3-K是必不可少的。在IRS蛋白的酪氨酸磷酸化刺激的所有情況下，這些蛋白質(zhì)同時?？恐罰I3-K的p85亞單位，并且，除了胰島素與血管緊張素信號傳導系統(tǒng)間的通訊外，這種?？颗cPI 3-K活性的刺激有關(guān)。
除了鑒定直接引導從胰島素受體到下游目標的信號轉(zhuǎn)導途徑外，在通過胰島素和其它激素/生長因子或不同的外源刺激物間進行的信號傳導，已描繪了幾種通訊，其中所述刺激物在多種細胞系統(tǒng)內(nèi)，要么模擬(到某種程度)要么以正的或負的方式調(diào)節(jié)胰島素代謝的和/或促有絲分裂作用。由于這些配基中無一直接活化胰島素受體激酶，因而，它們的信號傳導途徑可能與胰島素的信號傳導途徑在較遠的信號傳導階段處匯合。這種特性由不同類型的磷脂酰肌醇多糖-肽(PIG-P)分子共有，例如對于從酵母Gce1p的糖基磷酯酰肌醇錨制備的PIG-P，其模擬胰島素的代謝作用達到顯著程度而不同時誘導胰島素受體激酶活性。
在胰島素反應性目標細胞中，磷脂酰肌醇多糖(PIG)和PIG-肽(PIG-P)對胰島素信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)的正向作用，涉及到糖基磷酯酰肌醇(GPI)-錨定的質(zhì)膜蛋白(GPI蛋白)和雙?；姆鞘荏w酪氨酸激酶從去污劑抗性的富含糖脂的高膽固醇含量的質(zhì)膜筏域(rafe domain)(hcDIGs)重新分配到較低膽固醇含量的筏域(lcDIGs)。
在分離的大鼠脂肪細胞中，PIG-P的主要目標定位于hcDIGs。放射性標記的PIG-P、Tyr-Cys-Asn-NH-(CH2)2-O-PO(OH)O-6Manα1-2)-2Manα1-6Manα1-4Glu N1-6Ino-1，2-(環(huán))-磷酸(YCN-PIG)和放射性標記的用于衍生YCN-PIG的來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的經(jīng)脂解GPI蛋白(lcGce1p)都以可飽和方式結(jié)合hcDIGs，但不結(jié)合lcDIGs、微粒體或全部質(zhì)膜。YCN-PIG與lcGce1這兩者的結(jié)合是特異的，因為過量的化學合成的未標記YCN-PIG或脂肪細胞用胰蛋白酶然后用NaCl或N-乙基馬來酰亞胺(NEM)進行預處理完全破壞了其結(jié)合，這表明一種細胞表面受體識別YCN-PIG。在源自于用GPI特異的磷脂酶C預處理的脂肪細胞的hcDIGs內(nèi)，PIG-P的結(jié)合顯著增加，其中所述酶相當于通過脂解去除內(nèi)源性配體例如GPI蛋白質(zhì)/脂類。YCN-PIG結(jié)合親和力是最高的，然后是Tyr-Cys-Asn-NH-(CH2)2-OH(YCN)和HO-PO(H)O-6Manα1(Manα1-2)-2-Manα1-6Manα1-4GluN1-6Ino-1，2-(環(huán))-磷酸(PIG37)成分的組合，而肽變體YMN-PIG、PIG37和YCN單獨表現(xiàn)出中親和力和低親和力。對于YCN-PIG與脂肪細胞的培養(yǎng)，依次用胰蛋白酶/NaCl處理從細胞表面釋放出來的115kDa多肽使得通過[14C]NEM進行的后續(xù)標記減少。這些數(shù)據(jù)表明，在大鼠脂肪細胞中，作為GPI蛋白受體的hcDIGs的胰蛋白酶/NaCl/NEM敏感的115kDa蛋白識別模擬胰島素的PIG(-P)。
幾種類型的DIGs似乎存在于相同細胞內(nèi)。由標志物和結(jié)構(gòu)蛋白(小窩蛋白1-3)豐富表達引起的瓶形內(nèi)陷，細胞膜穴樣內(nèi)陷代表末期分化細胞特異的DIGs。
占脂肪細胞質(zhì)膜表面積20％的細胞膜穴樣內(nèi)陷參與受體介導的細胞攝液作用、細胞內(nèi)吞作用、胞吞轉(zhuǎn)運作用和信號轉(zhuǎn)導。在分離的大鼠脂肪細胞中，可以辨別出表現(xiàn)高浮力密度(根據(jù)蔗糖密度梯度離心)的低膽固醇/小窩蛋白含量的lcDIGs和以低浮力密度為特征的高膽固醇/小窩蛋白含量的典型hcDIGs。GPI蛋白的主要級分，例如Gce1和Nuc，以及雙?；鞍椎闹饕壏郑鏝RTK非受體酪氨酸激酶、pp59Lyn，都定位于hcDIGs。響應模擬胰島素的刺激物例如合成的PIG或磺酰脲、格列美脲(glimepiride)，GPI蛋白和NRTKs都從hcDIGs轉(zhuǎn)移位置到lcDIGs。這種重新分配不是由于缺失其脂類修飾引起的。
無(PIG)或有(PIG-P)相鄰的源自于GPI蛋白多肽部分的羧基末端氨基酸的極性核心多糖首基，提供處于基礎狀態(tài)的GPI蛋白在hcDIGs和lcDIGs之間分配的分子基礎，且它們的重新分配響應于胰島素模擬物的刺激。
GPI蛋白是細胞表面抗原、胞外酶、受體或細胞粘附分子，其在從酵母菌到人的真核細胞內(nèi)表達，并通過共價結(jié)合的糖基磷酯酰肌醇(GPI)脂類部分錨定于質(zhì)膜外層。盡管缺少跨膜結(jié)構(gòu)域，但在穿越質(zhì)膜的信號轉(zhuǎn)導中還是涉及到了它們。
GPI蛋白與特定脂類筏域的相關(guān)性，其中所述筏域即所謂的不溶于去污劑的富含糖脂的筏DIGs，而不與明顯的跨膜結(jié)合/連接蛋白具相關(guān)性，這一發(fā)現(xiàn)表明，對于通過GPI蛋白介導的信號轉(zhuǎn)導來說，可能脂類-脂類的相互作用為主要的偶聯(lián)機制。
DIGs的基本結(jié)構(gòu)元件是(糖)鞘脂類和膽固醇的邊側(cè)組裝，其在膜脂雙層內(nèi)，呈現(xiàn)不同于相鄰的液相無序(ld)區(qū)的液相有序(lo)組織。哺乳動物細胞的質(zhì)膜包含膽固醇(30-50mol％)及偏愛ld結(jié)構(gòu)域的脂類(如帶有不飽和尾的卵磷脂)和偏愛lo結(jié)構(gòu)域的具有飽和?；湹闹?如[糖]鞘脂類和GPI脂類)的混合物。人們認為，膽固醇通過在脂類分子間填充細胞間隙而在lo域內(nèi)，對脂類的緊密包裝有貢獻，并且僅在膽固醇濃度的特定范圍內(nèi)才能看到lo域的構(gòu)成。
胰島素是非常重要的激素，其對生物體代謝起顯著影響。通常，它促進合成代謝過程并抑制分解代謝過程。特別是它增強糖原、脂肪酸和蛋白質(zhì)的合成速率，并抑制蛋白質(zhì)和糖原的分解。激素的至關(guān)重要的作用是刺激來自于肝臟、肌肉和脂肪的細胞，以從血液內(nèi)移除葡萄糖、一些其它糖和氨基酸。
牛胰島素由兩條多肽鏈組成，多肽A包含21個AA，且多肽B包含30個AA，它們通過兩個-s-s(二硫橋)連接。這種相同結(jié)構(gòu)模式出現(xiàn)在包括人的許多哺乳動物的胰島素內(nèi)。結(jié)構(gòu)為被壓縮的圓筒狀，只有B鏈的羧基端從蛋白質(zhì)的其它部分伸出。有許多疏水殘基，其相互作用形成中央疏水核心，且在每一邊上的內(nèi)部散布的極性殘基進一步使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。三個二硫橋，即兩個鏈間和一個鏈內(nèi)二硫橋，將結(jié)構(gòu)鉗夾在一起。許多蛋白質(zhì)(特別對于從細胞輸出的蛋白質(zhì))生物合成的共同特性是蛋白質(zhì)以前體形式產(chǎn)生，然后經(jīng)修飾以產(chǎn)生在貯存期間與釋放前的最終形式。胰島素通過一群在所謂胰島的胰腺內(nèi)的細胞合成，以顆粒貯存，然后在需要的時候釋放到血液中。
在胰島素最初合成時，其由100個AA的單多肽鏈組成，該鏈由16個AA的信號序列、B鏈、33個AA的稱作連接鏈的C鏈和A鏈組成。該結(jié)構(gòu)叫前胰島素原(PPI)。人們認為，在細胞內(nèi)信號區(qū)負責引導PPI從合成位點到ER(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))，其收集并包裹胰島素，以形成貯存顆粒。當定位于ER時，信號肽通過蛋白酶移除。
糖尿病是需要長期藥物維護的慢性病，這種維護，既要限制其破壞性并發(fā)癥的出現(xiàn)，又要在其真正出現(xiàn)時進行控制。糖尿病與急性和慢性并發(fā)癥有關(guān)，如低血糖癥、糖尿病酮酸中毒和高滲透非酮性綜合征。
1型糖尿病通常在瘦弱的年輕患者中發(fā)生，并且其特點是由于β細胞自體免疫的損壞而導致分泌胰島素的胰腺的功能明顯不足?；?型糖尿病患者的辨別特征是若撤出胰島素，就會出現(xiàn)酮病，并最終出現(xiàn)酮酸中毒。因此，這些患者依賴外來胰島素以維持其生命。
2型糖尿病一般在40歲以上的人群發(fā)生，這些人有糖尿病家族史。2型糖尿病的特點是具有不同嚴重程度的胰島素分泌缺陷的周緣胰島素抗性(peripheral insulin resistance)。這些缺陷導致肝糖原異生增強，其產(chǎn)生禁食高血糖?；加?型糖尿病的大部分患者(90％)肥胖，且肥胖本身與胰島素抗性有關(guān)，其進一步惡化糖尿病的狀態(tài)。
多種其它型糖尿病，以前稱為“繼發(fā)性糖尿病”，由其它疾病或藥物引起。根據(jù)所涉及的原發(fā)過程(即胰腺β細胞的破壞或周緣胰島素抗性的產(chǎn)生)，這些型糖尿病同樣地表現(xiàn)為1型或2型糖尿病。最常見的是破壞胰腺β細胞的胰腺疾病(例如血色病、胰腺炎、囊性纖維化、胰腺癌)、干擾胰島素分泌的激素綜合征(例如嗜鉻細胞瘤)或?qū)е轮芫壱葝u素抗性的疾病(例如肢端肥大癥、庫興氏綜合征、嗜鉻細胞瘤)，以及藥物(例如二苯基乙內(nèi)酰脲鈉、糖皮質(zhì)激素、雌激素)誘導的糖尿病。
糖尿病的特點是血清葡萄糖水平的不適當調(diào)節(jié)。在1型糖尿病中，對內(nèi)分泌胰腺的自體免疫攻擊導致胰島素分泌的β細胞受到進行性且不可逆損傷。胰島素缺乏影響胰島素敏感的目標細胞進行葡萄糖攝入與新陳代謝作用。2型糖尿病有幾種病因，大部分通常在細胞對胰島素作用抗性中得到反映，在血清葡萄糖水平調(diào)節(jié)方面也具有隨后的轉(zhuǎn)變。胰島素通過二硫鍵鏈接的異四聚體細胞表面受體起作用，該受體包含經(jīng)二硫鍵與跨膜細胞內(nèi)β亞單位相偶聯(lián)的細胞外α亞單位。在1型糖尿病中，與正常細胞受體在結(jié)構(gòu)與功能上相結(jié)合的配基的缺失通常是隨后的代謝缺陷的起因。以日常胰島素注射形式的激素替代療法提供用于受體作用的配基，盡管在正常生理情況下這不是必要的。在2型糖尿病中，對胰島素作用的抗性常常成為一些由于受體作用的缺陷而導致抗性的疾病的基礎。
已知在胰島素抗性的情況下，胰島素受體需要大量胰島素以使胰島素信號傳導級聯(lián)開始。本發(fā)明涉及能通過避開誘發(fā)信號傳導途徑的胰島素受體而刺激葡萄糖攝入的脂肪細胞的細胞膜蛋白。對于手頭沒有用來識別能擔當胰島素替代物的化合物篩選工具的問題，本發(fā)明提供了強有力的解決辦法。
因而，本發(fā)明涉及源自于脂肪細胞質(zhì)膜的蛋白，其可由質(zhì)膜和/或脂囊泡和/或具有高膽固醇和/或脂囊泡的筏域的同時存在而穩(wěn)定，并且其對磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽具有特異的結(jié)合親和性，其特征在于a]在磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽特異結(jié)合該蛋白質(zhì)后，能引發(fā)脂肪細胞內(nèi)胰島素受體底物1或2的tyr磷酸化，以及b]在磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽特異結(jié)合該蛋白質(zhì)后，能刺激脂肪細胞內(nèi)葡萄糖的攝入。
相對于其它蛋白和/或穩(wěn)定化成分和/或其它化合物(例如鹽、離子、puffer)，該蛋白質(zhì)量的濕重范圍在0.01％到10％之間。
該蛋白質(zhì)量的優(yōu)選濕重范圍為0.1％至5％，且最優(yōu)選濕重范圍為0.1％至1％。
在天然條件下，在質(zhì)膜中，所述蛋白質(zhì)的濕重低于10-6％。
在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽至少由以下一種化合物組成YCN-PIG，YMN-PIG，PIG37，YCN或lcGce1。
磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽結(jié)合蛋白質(zhì)優(yōu)選地發(fā)生在結(jié)合常數(shù)(KD)為0.001至10μM時。
結(jié)合常數(shù)是用于定量描述蛋白質(zhì)和磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽復合體解離以及不解離狀態(tài)之間平衡的熱力學常量。
結(jié)合常數(shù)等于前進反應與后退反應速率常數(shù)之比。結(jié)合常數(shù)的高值(例如大于10mM)定義為弱的非特異結(jié)合，而低值(例如不高于100μM)定義為強的特異結(jié)合。
結(jié)合常數(shù)可通過不同方法測定，例如通過平衡透析、分光光度法、繪圖法(斯卡查德圖(Scatchard-Plot))。
所涉及的脂肪細胞質(zhì)膜優(yōu)選地來自于大鼠、小鼠或人。
蛋白質(zhì)分子量介于100至120kDa之間，優(yōu)選地介于110至120kDa之間，且最優(yōu)選的是115kDa。必須提及一下，通過任一方法，特別是通過SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量時，其誤差在±5至10％之間。
本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明如前所述蛋白與YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1中至少一種化合物形成的復合體。
復合體形成的先決條件是配基特異地結(jié)合蛋白質(zhì)。在配基與蛋白質(zhì)間形成離子鍵或共價鍵而使復合體穩(wěn)定。
本發(fā)明也涉及了本發(fā)明蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，其中a]脂肪細胞可由大鼠、小鼠或人組織提供，b]分離來自a]的脂肪細胞的質(zhì)膜，
c]從來自于b]的質(zhì)膜制備具有高膽固醇的筏域(hcDIGs)，d]用胰蛋白酶/NaCl溶液處理來自于c]的hcDIGs，e]離心來自于d]的培養(yǎng)混合物，并通過SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離上清液中的蛋白，f]將100至120kDa大小的蛋白質(zhì)級分從凝膠洗脫，且用含有去污劑或生物膜的溶液或懸液可能使之溶解。
此外，本發(fā)明涉及鑒定特異結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)的化合物的方法，其中a]提供細胞的級分，其含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)，b]提供化合物，c]將來自于a]的細胞的級分與b]的化合物接觸，d]測定化合物與來自于a]的細胞的級分的結(jié)合，e]通過將d]的結(jié)果與下面實驗結(jié)果的對比推出結(jié)合的特異性在該實驗中，將同樣來自于b]的化合物與這樣的細胞級分進行接觸，其中所述細胞具有與來自于a]的細胞相同的物種和/或組織特異性但所述細胞級分不含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)，一旦來自于b]的化合物與含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的細胞級分之間結(jié)合的量高于來自于b]的化合物與不含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的細胞級分之間結(jié)合的量，就顯示出較高的結(jié)合特異性。
細胞級分優(yōu)選地采于脂肪細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞或肝細胞。這些細胞中的任意一種可以優(yōu)選地源自于小鼠、大鼠或人。細胞級分優(yōu)選地由細胞的細胞膜組成，或更優(yōu)選地由高膽固醇含量的筏域(hcDIGs)組成。可應用于以下方法的化合物可通過放射性核素(例如14C、3H、32P、121J及其它)或熒光標記物進行標記，其中所述方法是可用于鑒定與本發(fā)明蛋白質(zhì)具有特異結(jié)合的化合物的方法。
本發(fā)明進一步涉及用于鑒定與本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有特異結(jié)合的化合物的方法，其中a]提供包含本發(fā)明蛋白質(zhì)的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞，b]提供化合物，c]將源自于a]的細胞與b]的化合物接觸，
d]檢測化合物與葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞間的結(jié)合，e]通過將d]的結(jié)果與下面實驗結(jié)果的對比推出結(jié)合的特異性在該實驗中，將同樣來自于b]的化合物與這樣的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞進行接觸，其為具有與來自于a]的細胞相同的物種和/或組織特異性但不含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞，一旦結(jié)合含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞的化合物的量高于結(jié)合不含本發(fā)明蛋白質(zhì)的細胞的化合物的量，則表明較高的結(jié)合特異性。
通過用胰蛋白酶/NaCl溶液和/或糖苷酶處理包含本發(fā)明蛋白質(zhì)的細胞，就可從含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞產(chǎn)生不含本發(fā)明蛋白質(zhì)的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞。
優(yōu)選的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞是脂肪細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞或肝細胞。這些細胞優(yōu)選地來自于人、小鼠或人源的組織或細胞培養(yǎng)物。
所用的化合物優(yōu)選地用放射核素或熒光標記物進行標記。
此外，本發(fā)明涉及用于鑒定對于本發(fā)明的蛋白質(zhì)是激動劑或拮抗劑的化合物的方法，其中a]提供葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞，其中存在本發(fā)明的蛋白質(zhì)，b]提供本發(fā)明蛋白質(zhì)的天然配基，c]提供化學化合物，d]將a]的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞與來自b]的配基及來自c]的化學化合物進行接觸，e]檢測來自于d]的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞的葡萄糖攝入，f]檢測來自于d]的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞的葡萄糖攝入，其中葡萄糖攝入刺激是指源自于c]的化合物具有激動劑活性，且葡萄糖攝入抑制是指源自于c]的化合物具有拮抗劑活性。
前述用于鑒定本發(fā)明蛋白質(zhì)的激動劑或拮抗劑的方法中的優(yōu)選配基是YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1。用于鑒定本發(fā)明蛋白質(zhì)的激動劑或拮抗劑的方法中的優(yōu)選葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞是優(yōu)選地來自于人、小鼠或大鼠的脂肪細胞、骨骼肌細胞、心臟細胞或肝細胞。
本發(fā)明也涉及包含所述化合物以及輔助成分的藥物，所述化合物已通過鑒定為結(jié)合本發(fā)明的蛋白質(zhì)或是本發(fā)明蛋白質(zhì)的激動劑或拮抗劑，所述輔助成分用于藥物制劑。在優(yōu)選實施方案中，藥物包含至少以下一種化合物 YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1。藥物也可包含至少一種以下化合物的部分或衍生物，所述化合物為YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1。
此外，本發(fā)明涉及所述化合物的用途，用于產(chǎn)生治療胰島素抗性或糖尿病的藥物，所述化合物已鑒定出是可結(jié)合本發(fā)明的蛋白質(zhì)或是本發(fā)明蛋白質(zhì)的激動劑或拮抗劑。
這類化合物優(yōu)選地是YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN、lcGce1或這些化合物之一的一部分或衍生物。
實施例PIG(-P)的化學合成YCN-PIG的合成(對于常規(guī)方案，見

圖1、2、3)對于產(chǎn)物2的合成(圖4；i、ii)，源自于Bachem(德國海德爾堡)的產(chǎn)物1(8.0g，20.6mmol)溶于200ml吡啶，然后加入5g(81.8mmol)乙醇胺和5ml N-乙基嗎啉。靜置(16小時，室溫)后，在5℃下逐滴添加50ml乙酸酐，并攪拌。攪拌反應混合物(2小時，室溫)，然后在高真空下濃縮。殘余物溶于150ml的熱甲醇，然后濃縮溶液。添加100ml二氯甲烷/甲醇(15/1)和200ml正庚烷/乙酸乙酯(2/1)后，產(chǎn)物結(jié)晶。產(chǎn)物2的產(chǎn)量6.1g(84％)白色晶體，熔點175℃。TLC(薄層色譜法)二氯甲烷/甲醇(9/1)，Rf＝0.7。MS(M+Li)+＝358.2，計算得出C16H21N3O6，M＝351.36。
對于產(chǎn)物3的合成(圖4；iii)，將2.0g鈀碳(10％Pd)加入到產(chǎn)物2(12.0g，34.0mmol)的200ml甲醇/乙酸(1/1)溶液中，之后氫化混合物(2小時，室溫)。在硅膠上過濾并濃縮溶液，并通過快速色譜法(二氯甲烷/甲醇/濃縮氨30/5/1)純化殘余物。產(chǎn)物3的產(chǎn)量7.3g(98％)淺黃色油。TLC二氯甲烷/甲醇/濃縮氨(30/5/1)，Rf＝0.5。MS(M+Li)+＝224.2，計算得出C8H15N3O4，M＝217.23。
對于產(chǎn)物4的合成(圖4；iv)，在0℃攪拌條件下，將1.5g(4.5mmol)的1(O-(氰基(乙氧基羰基)-亞甲基)氨基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TOTU)、0.64g(4.5mmol)乙基-(肟基)-氰基乙酸酯(肟)及1.7ml(13.5mmol)N-乙基嗎啉加入到0.8g(3.7mmol)3和2.8g(4.5mmol)TrtCys(Trt)OH在二甲基甲酰胺中的溶液，然后攪拌混合物(0℃，2小時)。加入200ml乙酸乙酯后，用飽和NaHCO3溶液洗混合物3次，經(jīng)MgSO4干燥濃縮。殘余物用正庚烷/乙酸乙酯(6/1)研成粉，然后產(chǎn)物結(jié)晶。產(chǎn)物4的產(chǎn)量2.2g(74％)白色晶體，熔點185℃。TLC二氯甲烷/甲醇(15/1)，Rf＝0.4。MS(M+Li)+＝811.7，計算得出C49H48N4O5S，M＝805.0。
對于產(chǎn)物6的合成(圖4；v，vi)，將4.0g(5.0mmol)產(chǎn)物4溶于200ml二氯甲烷。添加4ml水和3ml三氟乙酸。15分鐘后，用飽和NaHCO3溶液洗混合物3次，經(jīng)MgSO4干燥濃縮，產(chǎn)生99％的粗產(chǎn)物5。將該粗產(chǎn)物溶于50ml甲醇，然后逐滴添加0.5ml的1M的甲醇鈉溶液。15分鐘后，添加50ml二氯甲烷，然后在硅膠上過濾混合物。溶液濃縮后，用快速色譜法(二氯甲烷/甲醇(9/1))純化殘余物。產(chǎn)物6的產(chǎn)量2.2g(85％)的白色無定形固體。TLC二氯甲烷/甲醇(5/1)，Rf＝0.7。MS(M+Li)+＝527.3，計算得出C28H32N4O4S，M＝520.6。
對于產(chǎn)物7的合成(圖4；vii)，2.7g(5.2mmol)產(chǎn)物6、4.2g(10.4mmol)的Ztyr(Bn)OH、3.4g(10.4mmol)的TOTU、1.5g(10.4mmol)的肟和2ml的N-乙基嗎啉在50ml二甲基甲酰胺中反應，類似于產(chǎn)物4的制備。產(chǎn)物7的產(chǎn)量4.2g(89％)的白色晶體。TLC二氯甲烷/甲醇(15/1)，Rf＝0.25。MS(M+Li)+＝914.8，計算得出C25H53N5O8S，M＝908.1。
對于產(chǎn)物8的合成(圖5；viii)，用吡啶濃縮6.0g(73mmol)的亞磷酸4次，然后在180ml無水吡啶中進行處理。在10℃逐滴滴加13ml新戊酰氯。使該反應溶液靜置(45分鐘，室溫)。如前所述，將16.4g(18.1mmol)的產(chǎn)物7加入到反應液中。5小時后，用200ml甲苯和150ml二氯甲烷/甲醇/33％NH3(30/10/3)稀釋。濃縮后，殘余吡啶用200ml甲苯再蒸餾3次。殘余物懸浮于200ml二氯甲烷/甲醇(20/1)中。過濾不溶成份，并用50ml二氯甲烷/甲醇(20/1)洗2次。濃縮濾液，并用快速色譜法純化。產(chǎn)物8的產(chǎn)量11.6g(66％)白色晶體。TLC二氯甲烷/甲醇/33％NH3(30/5/1)，Rf＝0.25。MS(M+Li)+＝978.4，計算得出C52H54N5O10SP，M＝972.08。
對于產(chǎn)物10的合成(圖6；ix，x)，將4.5g產(chǎn)物8(4.6mmol)和6.0g產(chǎn)物9(2.3mmol；按以前文獻47中所述進行合成)溶于80ml無水吡啶中。室溫，30分鐘后，冷卻反應混合物至0℃，并加入5ml水和1.3g碘。攪拌反應混合物(30分鐘，10℃)，然后用500ml二氯甲烷、150ml飽和NaCl溶液和30ml飽和硫代硫酸鹽溶液稀釋，攪拌5分鐘。有機相用MgSO4干燥濃縮。通過用二氯甲烷/甲醇/濃NH3(30/5/1至30/10/3)的快速色譜法純化殘余物。產(chǎn)物10的產(chǎn)量8.0g無定形固體。TLC二氯甲烷/甲醇(20/1)，Rf＝0.5。MS(M+Li)+＝3583.6，計算得出C207H214N8O42SP2，M＝3580.0。
對于產(chǎn)物11的合成(圖6；xi)，在-78℃下濃縮300ml氨水。將2.1g(91mmol)鈉溶于其中。該溶液用150ml無水四氫呋喃稀釋，然后將溶于50ml無水四氫呋喃中的最終保護形式的8.0g產(chǎn)物10(2.2mmol)在反應溫度-78℃下緩慢地逐滴滴加。反應15分鐘后(藍色不能消失)，小心地用5g氯化銨處理混合物。當藍色消失時，用50ml水和150ml甲醇小心地稀釋混合物?？梢詫⑵浣鈨觯缓鬂饪s到約100ml。用500ml二氯甲烷/甲醇/33％NH3(3/3/1)稀釋所述溶液，然后添加到快速硅膠柱中(500ml硅膠)。用1升二氯甲烷/甲醇/33％NH3(3/3/2)和1升二氯甲烷/甲醇/33％NH3(3/3.5/3)依次洗脫。洗脫物用正丁醇/乙醇/水/33％NH3(2/2/2/1)層析。產(chǎn)物11的產(chǎn)量2.4g(67％來自產(chǎn)物9)白色固體。TLC正丁醇/乙醇/水33％NH3(2/2/2/1)，Rf＝0.5。MS(M+NH3)+＝1572.6；計算得出C54H88N6O40P2S，M＝1555.31。對于環(huán)磷酸脂，31P-NMR(D2O)＝15.3ppm，且對于磷酸二酯，31P-NMR(D2O)＝0.3ppm。表1列出了來自1H-NMR和13C-NMR的數(shù)據(jù)。
對于產(chǎn)物YCN的合成(圖7；xii)，與制備產(chǎn)物11相類似地對11.0g(11.3mmol)產(chǎn)物7去保護。YCN的產(chǎn)量4.5g(90％)白色晶體。TLC二氯甲烷/甲醇/濃縮氨(30/15/5)，Rf＝0.25。MS(M+Li)+＝448.3，計算得出C18H27N5O6S，M＝441.51。
對于產(chǎn)物YMN-PIG的合成，用圖2顯示的相同反應順序合成YMN-PIG。用BocMetOH替代TrtCys(Trt)OH產(chǎn)生相似產(chǎn)量的YMN-PIG，為白色固體。TLC正丁醇/乙醇/水/33％NH3(2/2/2/1)，Rf＝0.5。MS(M+NH3)+＝1600.6；計算得出C56H92N6O40P2S，M＝1583.38。對于環(huán)磷酸脂，31P-NMR(D2O)＝15.3ppm，且對于磷酸二酯，31P-NMR(D2O)＝0.3ppm。
制備放射性標記的脂解切割的Gce1p(lcGce1p)從乳酸生長酵母細胞中純化帶有完整GPI錨的Gce1p，所述細胞已用[14C]肌醇進行代謝標記，且該標記細胞已通過酶促轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)球。制備質(zhì)膜、通過菲可(Ficoll)梯度離心進行純化、用0.35％的β-酰胺基?；悄懰崛芙獠⒂肨X-114進行分配。在富含去污劑相中包含的Gce1p通過交聯(lián)葡聚糖凝膠S-300的凝膠過濾色譜法、N6-(2-氨乙基)-cAMP瓊脂糖的親和色譜法和苯基瓊脂糖色譜法純化。對通過色譜柱的洗脫液，在線監(jiān)測3H的放射活性。沉淀部分純化的Gce1p(12％聚乙二醇6000)，然后以0.2mg蛋白質(zhì)/ml重懸于緩沖液G(25mM Tris/乙酸，pH7.4、144mM NaCl、0.1％β-酰胺基牛磺膽酸、0.5mM DTT、0.2mM EDTA、5％甘油、0.1mM PMSF、5μM亮抑酶肽、1mM碘乙酰胺、10μg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑)中，接著在6U/ml PI特異的PLC(蠟狀芽孢桿菌(B.cereus))存在下培養(yǎng)(3小時，25℃)。添加10倍體積冰冷的2％TritonX-114、10mM Tris/HCI(pH7.4)、144mM NaCl的溶液并進行相分離(37℃下培養(yǎng)2分鐘，然后在25℃、12,000×g下離心1分鐘)之后，從上層不含去污劑的相中回收lcGce1p。通過添加等體積的10mM Tris/HCl、144mM NaCl，對下層富含去污劑的相進行兩次再抽提，接著在冰上再次溶解，然后進行相分離，最后沉淀經(jīng)合并且不含去污劑的相(12％聚乙二醇6000)。
放射性標記的lcGce1p懸于缺乏β-酰胺基牛磺膽酸(200-1000dpm/μl)的緩沖液中。
放射性標記的YCN-PIG的制備用V8蛋白酶(金黃色葡萄球菌(S.aureus))和PI-PLC(蠟狀芽孢桿菌)依次消化，從Gce1p獲得放射性標記的YCN-PIG。用TX-114抽提分層后，從不含去污劑相中回收YCN-PIG，然后進行依次純化，步驟為通過陽離子交換層析(Dowex 50W-X8)、BioGel-P4上凝膠過濾、SAX HPLC柱上陰離子交換層析、Si-60 HPTLC板上使用不同溶劑體系進行二次薄層層析，最后在BioGel-P4上進行凝膠過濾。在每步層析分離期間，原料洗脫液都通過3H放射活性、UV吸收(A220)及根據(jù)在分離的大鼠脂肪細胞內(nèi)對葡萄糖轉(zhuǎn)運的刺激進行模擬胰島素活性的檢測。對于放射化學純度的檢測，最終制備的YCN-PIG在pH13經(jīng)過Dionex CarboPac PA-1陰離子交換HPLC(單位Dionex)，所述柱以包括葡萄糖低聚物的標準校正。用脈沖安培檢測儀檢測內(nèi)部標準混合物。14C標記的級分通過RaytestRamona進行在線放射活性監(jiān)測。對于濃度的確定，其為水解YCN-PIG(6MHCl，16小時，110℃)，然后測定無機磷酸(2mol/分子)和酪氨酸(1mol/分子)的量。干燥過的YCN-PIG在使用之前于-80℃貯存，使用時，將其懸于包含2mM DTT的水中，終濃度為100μM。
大鼠脂肪細胞的制備及與PIG(-P)/YCN的孵育從雄性Sprague Dawley大鼠(140-160g，隨意喂食)的附睪脂墊中用膠原酶消化分離脂肪細胞，分離后在含有1％(w/v)BSA、100μg/ml慶大霉素、100mM 1-甲基-2-苯乙基腺苷、0.5U/ml腺苷脫氨酶、0.5mM丙酮酸鈉和5mM D-葡萄糖的KRH緩沖液(0.14mM NaCl、4.7mM KCI、2.5mMCaCl2、1.2mM MgSO4、1.2mM KH2PO4、20mM N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸鈉鹽(Hepes)/KOH，pH 7.4)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為存在PIG(-P)/YCN(溶于20mM Hepes/KOH，pH7.4，2mM DTT)，37℃，搖動水浴，并在指定期間，連續(xù)通入5％CO2/95％O2。
用胰蛋白酶/NaCl或NEM處理大鼠脂肪細胞對于胰蛋白酶/NaCl處理，在100μg/ml胰蛋白酶存在下，培養(yǎng)在含有5mM葡萄糖的KRH中的2ml脂肪細胞懸液(3.5×106細胞/ml)(20分鐘，30℃)。添加大豆胰蛋白酶抑制劑(終濃度100μg/ml)和2ml含有1M NaCl和0.5％BSA的KRH，并繼續(xù)培養(yǎng)(10分鐘，22℃)。對于NEM處理，用NEM(終濃度1.5mM)培養(yǎng)在含有5mM葡萄糖的KRH中的1ml脂肪細胞懸液(3.5×106細胞/ml)(30分鐘，25℃)，然后用DTT(終濃度15mM，5分鐘)培養(yǎng)。處理后，離心細胞(1500×g，5分鐘，外開式轉(zhuǎn)子)，通過抽吸移除下層。用10ml含有0.5％BSA的KRH補充至剩余的細胞懸液(約0.5ml)，然后再次離心(500×g，1分鐘，外開式轉(zhuǎn)子)。再洗滌兩次后，將終細胞懸液移到25ml含有0.5％BSA、50μM葡萄糖和1mM丙酮酸鈉的KRH中。對于lipigenesis，分析0.2ml部分以監(jiān)測對PIG41反應性的喪失。對照細胞經(jīng)歷與處理細胞相同的離心和洗滌過程，僅僅是用水替代了胰蛋白酶/NaCl。對于使用[14C]NEM放射性標記的脂肪細胞，細胞懸液經(jīng)離心(500×g，1分鐘)，然后移出下層。在總體積為60μl時，用2.5μCi[14C]NEM培養(yǎng)50-μl部分(7×106細胞/ml)(10分鐘，30℃)。添加5μl 10mM DTT和55μl含有10mM葡萄糖的KRH之后，如前所述，在總體積為200μl時進行胰蛋白酶/NaCl處理。在0.4-ml離心管內(nèi)將50-μl部分小心地置于200-μl由鄰苯二甲酸二壬酯組成的油層上層。離心(5,000×g，15秒)之后，在離心管中穿過油層。使在離心管下部含有的培養(yǎng)基中的蛋白沉淀(10％TCA，兩次丙酮洗滌)，將沉淀物懸浮于Laemmli樣本緩沖液，然后通過SDS-PAGE分析。
質(zhì)膜、全細胞裂解物和微粒體的制備如前所述，從分離的大鼠脂肪細胞制備后核下層。對于質(zhì)膜的制備，將1ml樣品置于38％(w/v)蔗糖、25mM Tris/HCI(pH7.4)、1mM EDTA的5ml墊層上進行分層，然后離心(110,000×g，1小時)。在兩層間分界面處的膜(0.5ml)用吸管吸出，用4體積均質(zhì)化黃油稀釋，然后使其在28％珀可、0.25M蔗糖、1mM EDTA、25mM Tris/HCI(pH7.0)的8ml墊層的上部。離心(45,000×g，30分鐘)之后，質(zhì)膜用巴氏滴管從下面第三個梯度處移出(0.5ml)，用10體積均質(zhì)化緩沖液稀釋，然后離心(200,000×g，90分鐘)。對于結(jié)合研究，洗滌過的沉淀以濃度為1-2mg蛋白/ml懸浮于結(jié)合緩沖液中。對于全細胞裂解物的制備將脫氧膽酸和NP-40(終濃度分別為0.3％和0.2％)補充到后核下層中，培養(yǎng)(1小時，4℃)，最后離心(100,000×g，1小時，4℃)。上清液用于免疫沉淀反應。對于微粒體的制備，離心(100,000×g，1小時，4℃)后核上層。沉淀以1-2mg蛋白/ml的濃度懸于結(jié)合緩沖液中。
hcDIGs/lcDIGs的制備純化的經(jīng)沉淀質(zhì)膜(0.5-1mg)懸浮于1.5ml冰冷的含有50mM NaF、5mM焦磷酸鈉、10μM岡田酸(Okadaic acid)、1mM原釩酸鈉、20μM亮抑酶肽、5μM抑肽素、1μM抑肽酶、5mM碘醋酸鹽、200μMPMSF、1mMEDTA的0.5M Na2CO3(pH11)中，并進行培養(yǎng)(1小時，4℃，在用吸液管反復攪拌抽吸條件下)。然后用等體積的85％蔗糖在15mMMES/KOH(pH6.5)、75mM NaCl中的溶液與懸液混合，接著，依次用在相同介質(zhì)中的42.5、35、28、22、15、5％蔗糖覆蓋，之后進行離心(230,000×g，Beckman SW41轉(zhuǎn)子，18小時)。使用19-號針和注射器收集在15-22％(級分4和5)和28-35％(級分8和9)蔗糖界面的絮狀物質(zhì)以及42.5％墊層的物質(zhì)(級分12-15)，為散射光的乳白色帶(0.75ml/級分)，其分別為hcDIGs、lcDIGs和溶解的質(zhì)膜蛋白質(zhì)。用測量級分的折射率方法測定濃度。hc/lcDIGs的特點是富含/匱乏如前所述的相應標記物。對于結(jié)合研究，將hc/lcDIGs懸浮于結(jié)合緩沖液(15mM Mes/KOH，pH6.5、0.25M蔗糖、75mMNaCl、2mM MgCl2、0.5mM EDTA、0.5mM DTT、蛋白酶抑制劑)中。
放射性標記的YCN-PIG或lcGce1p與亞細胞級分的結(jié)合將10μl放射性標記的YCN-PIG或lcGce1p(60,000-80,000dpm/nmol，終濃度5μM)加入到40μl存在或不存在未標記競爭物的(如圖的說明所示)懸浮質(zhì)膜、微粒體或hc/lcDIGs(40-80μg蛋白)在結(jié)合緩沖液中的溶液，終體積為100μl，然后培養(yǎng)(30分鐘，4℃)。對于來自于培養(yǎng)介質(zhì)的膜的分離，在質(zhì)膜/微粒體的情況下，45μl試樣小心置于0.4ml預冷(4℃)離心管(microtubes no.72.700，Sarstedt，Germany)內(nèi)的200μl由鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二辛酯組成(1/1體積比，終濃度1.012)的油層上小心地分層，或在hc/lcDIGs的情況下，油層由鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二壬酯組成(1/9體積比，終密度9.863)。離心(48,000×g，2分鐘)后，蓋帽的離心管通過油層刺穿，離心管(開帽)上部和下部分別包含經(jīng)沉淀質(zhì)膜/微粒體和飄浮的hc/lcDIGs，它們滲透或沒有滲透到油層，然后轉(zhuǎn)移入含有1ml 10％SDS的10ml閃爍小瓶。經(jīng)過劇烈搖動(16小時，25℃)之后，在9ml ACSII閃爍劑(Beckman)中計數(shù)放射活性。在這些條件下，粘在離心管壁上及分配在油層中的放射性標記的YCN-PIG和lcGce1p占50-120dpm(即小于每次培養(yǎng)所用的總放射活性的0.5％放射活性)，且因此沒被計入到結(jié)合數(shù)據(jù)中。根據(jù)蛋白質(zhì)測定，質(zhì)膜和微粒體的一般回收量分別為78-85％和65-80％，且hcDIGs和lcDIGs的分別為83-92％和70-78％。
PIG(-P)的化學合成通過下面兩個實驗方法可以從天然物質(zhì)中產(chǎn)生親水GPI結(jié)構(gòu)(i)通過GPI特異的PLC/D從游離GPI脂類釋放出PIG，因為其為極性核心聚糖首基而沒有任何氨基酸，和(ii)通過結(jié)合分解脂肪的和分解蛋白質(zhì)的切割從GPI蛋白產(chǎn)生PIG-P，其具有極性核心聚糖首基和源自于殘留GPI蛋白羧基端的一個至數(shù)個氨基酸。GPI脂類和GPI蛋白質(zhì)都存在于真核細胞質(zhì)膜的外層，其具有在從酵母菌到人類中都存在的保守核心聚糖首基。對于分析GPI核心聚糖首基的結(jié)合，用到了如“Müller等，內(nèi)分泌學138，3459-3475，1997”里描述的合成放射性標記的可信PIG(-P)的結(jié)構(gòu)；從源自于釀酒酵母質(zhì)膜的放射化學純GPI蛋白質(zhì)Gce1p制備YCN-PIG，在體外通過依次使用分解蛋白質(zhì)的和分解脂肪的切割制備，其中所述菌已經(jīng)以[14C]肌醇進行了代謝標記。對于評定結(jié)合的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系，用到了化學合成的YCN-PIG及其衍生物。(圖1YCN-PIG；圖2YMN-PIG；圖3PIG37；圖4YCN)根據(jù)本領域內(nèi)肽合成的描述合成YCN-PIG的三肽。使用如“Frick等，生物化學37，13421-13436；1998”中描述的三氯乙酰亞胺法合成多聚己糖。合成PIG-P的關(guān)鍵步驟是磷酸二酯鍵的形成。在試驗的多種方法中，H-膦酸法產(chǎn)量最多。
在鈉存在于液氨的條件下，通過半胱氨酸(沒有與鈀水合的可能)和酸不穩(wěn)定的環(huán)磷酸脂使最終化合物去保護。全部化合物通過質(zhì)譜、1H-NMR、13C-NMR和31P-NMR法表征。
PIG(-P)特異地結(jié)合hcDIGs用差速離心從未受刺激脂肪細胞制備的全部質(zhì)膜(與全細胞裂解物相對比)富集質(zhì)膜的特異標志酶。富集毒毛花甙G(Quabain)敏感的對硝基苯磷酸酶(對應于Na+/K+-ATP酶的催化亞單位)9.5倍和Nuc 10.9倍(根據(jù)酶活性)，β1-整合蛋白13.9倍和突觸融合蛋白-116.4倍(根據(jù)免疫印跡)，以及Gce1 7.8倍(根據(jù)光親和標記)。同時，從質(zhì)膜制備物去除(與全細胞裂解物相對比)肌質(zhì)網(wǎng)標志(EGTA敏感的Ca2+-腺苷三磷酸酶5.7倍)和內(nèi)體標志(SCAMP(分泌的載體膜蛋白)37/39 8.5倍，和GLUT4(葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4)16.9倍(根據(jù)免疫印跡)。與全細胞裂解物相對比，對未受刺激脂肪細胞的微粒體富集GLUT4 14.4倍、SCAMP 37/39 8.5倍、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體為6.9倍和IGFII受體為9.7倍，且與全細胞裂解物相對比，根據(jù)免疫印跡，去除對硝基苯磷酸酶為24.6倍、Gce1為12.5倍、Nuc為15.8倍、β1-整合蛋白為39.5倍和突觸融合蛋白-1為48.5倍以及Ca2+-敏感的腺苷三磷酸酶活性為19.9倍。這表明，該級分主要是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)體結(jié)構(gòu)，且實質(zhì)上缺乏質(zhì)膜和肌質(zhì)網(wǎng)碎片?；趆cDIGs和lcDIGs在0.5M Na2CO3(pH 11)中的不溶性和在蔗糖密度梯度離心中的低浮力密度，從未受刺激脂肪細胞制備hcDIGs和lcDIGs。它們的特點是喪失了(與全質(zhì)膜對比)GLUT4和胰島素受體β亞單位。hcDIGs不同于lcDIGs，在hcDIGs中比在lcDIGs中有顯著高含量的小窩蛋白、pp59Lyn和Gce1。分離的亞細胞膜級分與數(shù)量漸增的放射性標記的YCN-PIG進行培養(yǎng)，然后用離心機通過適當密度的油層從培養(yǎng)介質(zhì)中快速分離，從而使培養(yǎng)停止。
以濃度依賴的和可飽和的方式回收主要含有hcDIGs且含有少量lcDIGs的膜相關(guān)YCN-PIG，但是質(zhì)膜和微粒體本質(zhì)上不含放射性標記(圖5)。在線性范圍內(nèi)，當存在超出500倍的未經(jīng)標記的合成YCN-PIG或其它競爭物(圖5)進行評測時，對hcDIGs非特異結(jié)合的YCN-PIG小于20％。用YCN-PIG濃縮物進行以下實驗，這些實驗與結(jié)合的線性范圍的結(jié)果一致。
用于檢測受體-配基間相互作用的其它方法，例如快速過濾與基于沉降而非密度的離心，未能檢測到Y(jié)CN-PIG特異結(jié)合任一脂肪細胞膜亞級分(未列出數(shù)據(jù))，可能原因是介質(zhì)結(jié)合親和性和/或高解離速率。斯卡查德圖用于分析YCN-PIG，得出Kd范圍為50nM-500nM和Bmax為50-200pmol/mg hcDIGs蛋白。以下述現(xiàn)象證明YCN-PIG結(jié)合hcDIGs的特異性肽變體即缺失肽乙醇胺部分的YMN-PIG和PIG37的功效顯著降低，以及在競爭試驗中(圖6)肽乙醇胺部分YCN單獨具有非常低的活性。
未標記的YCN與PIG37(等摩爾比率)的組合取代了放射性標記的YCN-PIG與hcDIGs的結(jié)合，其在功效上僅輕微地小于未標記的YCN-PIG，但卻比單獨的PIG或肽乙醇胺部分及YMN-PIG高。該發(fā)現(xiàn)說明了PIG和肽乙醇胺部分同時的且增效的識別。與共價連接的YCN-PIG(圖6)相比，競爭性IC50僅僅比YCN+PIG37高3至4倍。還進一步研究了對于PIG(-P)所鑒定的結(jié)合位點是否是蛋白質(zhì)屬性的位點。hcDIGs用胰蛋白酶/NaCl或NEM進行預處理，然后在有或無過量的未標記的合成YCN-PIG條件下(用于非特異結(jié)合的評定)，用濃度漸增的放射性標記的YCN-PIG進行培養(yǎng)。依次用胰蛋白酶和0.5M NaCl處理或用NEM處理，完全消除了放射性標記的YCN-PIG與hcDIGs的特異結(jié)合，但是僅單獨使用胰蛋白酶或NaCl或在DTT存在下使用NEM時，則沒有顯著效果(圖7)。同一失活模式也在YCN-PIG與lcDIGs間的低親和作用中觀察到。這些數(shù)據(jù)顯示對于在脂肪細胞細胞表面的DIGs處的結(jié)合，對PIG(-P)存在胰蛋白酶/NaCl和NEM敏感的結(jié)合蛋白。對比lcDIGs，YCN-PIG優(yōu)先結(jié)合到hcDIGs上，這一優(yōu)先性通過在脂肪細胞質(zhì)膜使用m-βCD使hcDIGs脫除膽固醇這一過程中的轉(zhuǎn)化，以及通過hc/lcDIGs對于放射性標記的YCN-PIG的特異結(jié)合的后續(xù)分析得到證實。在對照脂肪細胞內(nèi)，回收了帶有hcDIGs的大部分YCN-PIG，而剩余20％與lcDIGs結(jié)合(圖8)。然而，用m-βCD(1-10mM)處理的完整大鼠脂肪細胞顯示出，隨著lcDIGs相應的增加，YCN-PIG結(jié)合hcDIGs的量呈現(xiàn)濃度依賴性下降。脂肪細胞在膽固醇脫除之后但在制備DIGs之前，用胰蛋白酶/NaCl或NEM處理，該處理顯著地削弱了YCN-PIG與hcDIGs和lcDIGs的特異結(jié)合(未列示數(shù)據(jù))。這些發(fā)現(xiàn)證實了PIG(-P)受體主要定位在大鼠脂肪細胞的hcDIGs，其形成主要依賴膽固醇。
脂解切割的GPI蛋白質(zhì)特異地結(jié)合hcDIGsYCN-PIG，YMN-PIG和PIG37(圖1、2和3)的PIG部分，即-NH-(CH2)2-O-PO(OH)O-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1-6Manα1-4GluN1-6Ino-1，2-(環(huán))-磷酸，與所有真核GPI蛋白的極性核心聚糖首基相同。因此，對于PIG-P研究了其蛋白質(zhì)結(jié)合位點是否與lcGPI蛋白相互作用，即如果將其與GPI蛋白完整的多肽部分接觸，其是否識別PIG(-P)部分。為獲得放射性標記的lcGPI蛋白，源自于代謝標記的釀酒酵母細胞的Gce1p用PI-特異的PLC(蠟狀芽孢桿菌)處理，并將親水裂解產(chǎn)物純化成放射化學均勻性。正如PIG(-P)，使用相同的油離心法，發(fā)現(xiàn)lcGce1p以濃度依賴的和可飽和的方式與分離的大鼠脂肪細胞的DIGs結(jié)合，且hcDIGs為lcDIGs功效的11-至15倍。在200倍摩爾的過量未標記lcGce1p存在下，非特異結(jié)合占在非飽和濃度的lcGce1p時所回收DIGs中總lcGce1p的15％以下。根據(jù)斯卡查德圖分析，lcGce1p結(jié)合hcDIGs的Kd范圍為0.1-1μm，Bmax為70-200pmol/mg hcDIGs蛋白質(zhì)。全部質(zhì)膜和微粒體不表現(xiàn)出lcGce1p的特異結(jié)合。因此，對于來自酵母的lcGce1p，脂肪細胞質(zhì)膜的hcDIGs明顯具有特異的結(jié)合位點。為了進一步分析對于PIG(-P)和lcGPI蛋白質(zhì)的結(jié)合位點的特性，其中所述特征以類似的Kd和Bmax值顯示，在競爭研究中，比對了合成的PIG(-P)化合物對于lcGce1p結(jié)合位點在hcDIGs上的相對親和性(圖9)。
放射性標記的lcGce1p與hcDIGs的結(jié)合被過量(大于500倍)的經(jīng)標記合成的YCN-PIG，YMN-PIG和YCN+PIG37置換，置換量大于總結(jié)合的lcGce1p的75％，這證實了lcGce1p與hcDIGs間相互作用的特異性。lcGce1p與PIG37和YCN結(jié)合的競爭極少有效。如在其表觀IC50中所反映的，對于從hcDIGs置換出lcGce1p，不同PIG(-P)的相對等級為YCN-PIG＞YCN+PIG37＞YMN-PIG＞PIG37＞YCN，且因此，與用YCN-PIG結(jié)合的干擾相同(圖6)。此外，對于lcGce1p和YCN-PIG結(jié)合的競爭，表觀IC50值是非常相像的，說明在這兩種情況下識別相同的決定簇，且GPI蛋白質(zhì)的剩余蛋白質(zhì)部分(除了羧基末端三肽乙醇胺殘基)并不參與結(jié)合。其次，在幾乎完全破壞了放射性標記的YCN-PIG結(jié)合的(圖7)條件下，研究了對用胰蛋白酶/NaCl處理的和NEM處理的完整大鼠脂肪細胞lcGce1p與hcDIGs相互作用的敏感性。源自于胰蛋白酶/NaCl處理的和NEM處理的脂肪細胞的hcDIGs顯示出放射性標記的lcGce1p的結(jié)合沒有超過在500倍過量的未標記YCN-PIG(占使用hcDIGs從未處理的對照細胞中回收的總Gce1p的約30％)存在下的非特異結(jié)合(圖10)。相反，在過量DTT(圖10)存在下用NEM，或單獨使用胰蛋白酶或NaCl(未列出數(shù)據(jù))培養(yǎng)脂肪細胞，沒有削弱放射性標記的lcGce1p的結(jié)合，且對比未處理的細胞，其競爭為3μM YCN+PIG37、5μM PIG37和10μM YCN?？傊瑢τ赮CN-PIG與lcGce1p的特異結(jié)合位點，在脂肪細胞質(zhì)膜hcDIGs處的定位、絕對和相對親和性(對結(jié)構(gòu)衍生物)、表達水平和對胰蛋白酶/NaCl及NEM處理敏感性方面顯示出非常相似的特性。
PIG(-P)和lcGPI蛋白的受體的內(nèi)源性配基對于PIG(-P)和lcGPI來說，具有明顯相同結(jié)合位點的生理學配基候選物是未切割的GPI結(jié)構(gòu)，即GPI脂類和/或GPI蛋白質(zhì)錨。為檢測這種可能性，分離的大鼠脂肪細胞用多種GPI特異的PL處理，然后在制備hcDIGs之前用鹽洗(0.5M NaCl)，以特異地移出推定的內(nèi)源性GPI分子，其與受體相互作用并因而掩蓋YCN-PIG/lcGce1p的結(jié)合位點。
濃度漸增的源自于蠟狀芽孢桿菌PI特異性PLC或的源自于人血清的GPI特異PLD培養(yǎng)大鼠脂肪細胞，導致濃度依賴的放射性標記的YCN-PIG和Gce1p數(shù)量上的增加，所述標記物特異地結(jié)合到hcDIGs上(圖11)。從hcDIGs缺失Gce1p和Nuc，平行地顯示出脂解消化的功效。
它們分別缺失達75％和65％，這與YCN-PIG或lcGce1p到hcDIGs的結(jié)合增加了200％和260％有關(guān)。PC特異的PLC(蠟狀芽孢桿菌)和源自于卷心菜的PLD(其不攻擊GPI結(jié)構(gòu))完全不能顯著地代替Gce1或源自于hcDIGs的Nuc以及不能刺激YCN-PIG(lcGce1p)結(jié)合到hcDIGs上顯示出GPI裂解的特異性(圖11，12)。
特異結(jié)合到源自于PI-特異的PLC預處理的脂肪細胞(不顯著地改變非特異結(jié)合)的hcDIGs的斯卡查德圖分析顯示出放射性標記的YCN-PIG/lcGce1p的結(jié)合增強主要歸因于Bmax高出2至3倍和幾乎未改變的Kd。這些發(fā)現(xiàn)表明，在基本狀態(tài)下，可由(G)PI特異的PLC/D裂解的內(nèi)源性GPI結(jié)構(gòu)占據(jù)了約50％的對于PIG(-P)或lcGPI蛋白在分離大鼠脂肪細胞內(nèi)hcDIGs上的結(jié)合位點。引人注意的是，生理濃度的胰島素在大鼠脂肪細胞內(nèi)模擬GPI特異的PLC/D處理的功效達到特定的程度，即引起Gce1p和hcDIGs內(nèi)的Nuc在數(shù)量上是中等的但顯著的下降。胰島素誘導的源自于hcDIGs的GPI蛋白的缺失導致YCN-PIG或lcGce1p的結(jié)合能力顯著增加(圖11，12)。
此外，其可由以下得到顯示PIG(-P)和lcGPI蛋白質(zhì)的受體與對胰蛋白酶/NaCl和NEM敏感的115kDa的稱為CIR的蛋白質(zhì)相同。
PIG-P與受體的結(jié)合將影響其發(fā)生下面現(xiàn)象的機會后續(xù)的通過NEM的共價修飾和/或通過胰蛋白酶/NaCl處理從脂肪細胞的細胞表面裂解和釋放。
大鼠脂肪細胞用PIG(-P)培養(yǎng)，然后用[14C]NEM標記，之后用胰蛋白酶/NaCl處理。通過SDS-PAGE和磷成像對釋放的放射性標記的多肽進行分析顯示出(圖13)，PIG(-P)降低了通過[14C]NEM標記的115kDa多肽的交聯(lián)和/或經(jīng)過胰蛋白酶/NaCl處理后從脂肪細胞的下層對其的回收。YCN-PIG或PIG37為3μM，YCN為30μM時，與對照細胞相比，減少量分別為83、65和28％。該蛋白代表了唯一主要的NEM標記的通過胰蛋白酶/NaCl處理從質(zhì)膜釋放的，但單獨處理不能釋放的成分(圖13)，其與CIR相同。與存在內(nèi)源性配基(例如GPI蛋白)及通過脂解切割使它們從相應結(jié)合位點脫離(見圖11，12)的實驗數(shù)據(jù)一致，使用外源性PI特異的PLC(蠟狀芽孢桿菌)或胰島素輕微但重復地處理脂肪細胞，刺激了胰蛋白酶/NaCl依賴的[14C]NEM標記的CIR的釋放，分別達30％和20％(圖13)。由于通過胰蛋白酶/NaCl處理比對胰蛋白酶處理比對NaCl處理CIR從脂肪細胞細胞表面的釋放的相對比率(100/20/10)可粗略地與對照組相比，即與PIG(-P)刺激的和PLC/胰島素處理的細胞相比，PIG(-P)和內(nèi)源性GPI配基與hcDIGs的結(jié)合明顯削弱使用NEM而不是胰蛋白酶裂解對CIR的標記。這是由于配基與PIG(-P)受體在脂肪細胞質(zhì)膜的hcDIGs處的交互作用引起了CIR構(gòu)象的改變。
表1對于YCN-PIG在D2O中1H和13C的化學位移[ppm]，pD＝8.1(未校正)
附圖簡述圖1PIG的1部分合成的一般性方案圖2PIG的2部分合成的一般性方案圖3PIG的3部分合成的一般性方案圖4YCN-PIG的1部分的合成，圖5YCN-PIG的2部分的合成，圖6YCN-PIG的3部分的合成，圖7YCN的合成圖8YCN-PIG的化學式圖9YMN-PIG的化學式圖10PIG37的化學式圖11YCN的化學式圖12PIG(-P)與hcDIGs的特異結(jié)合用源自于分離的大鼠脂肪細胞的hcDIGs(6.5μg蛋白質(zhì))、lcDIGs(6.5μg)、質(zhì)膜(47.5μg)和微粒體(68μg)與從釀酒酵母分離的數(shù)量漸增的經(jīng)放射性標記的YCN-PIG孵育(1小時，4℃)。將膜級分/DIGs通過油層離心，回收沉淀/油層頂部，溶解并計數(shù)放射性。計算的特異結(jié)合為不存在和存在10μM未標記的YCN-PIG時測定的放射性的差異。每個點代表至少使用4種不同膜制備物進行一式三份孵育的均值±標準差。
圖13PIG-P與hcDIGs的特異結(jié)合在缺乏或存在數(shù)量漸增的未標記YCN-PIG、YCN+PIG37、YMN-PIG、PIG37和YCN(競爭)下，將hcDIGs(6.5μg蛋白質(zhì))與放射性標記的YCN-PIG(18,000-22,000dpm)孵育(1小時，4℃)。將膜級分/DIGs通過油層離心，回收沉淀/油層頂部，溶解并計數(shù)放射性。
圖14PIG-P在hcDIGs上結(jié)合位點的特征用源自于分離的大鼠脂肪細胞的hcDIGs(6.5μg蛋白質(zhì))與數(shù)量漸增的放射性標記的從釀酒酵母分離的YCN-PIG孵育(1小時，4℃)，所述hcDIGs已用胰蛋白酶/NaCl、胰蛋白酶、NEM+DTT、NaCl或NEM預處理，或不進行處理(對照)。將DIGs通過油層離心，從油層頂部回收，溶解并計數(shù)放射性。計算的特異結(jié)合為不存在和存在10μM未標記的YCN-PIG時測定的放射性差異。每個點代表至少使用3種不同脂肪細胞預處理的一式三份的培養(yǎng)物的均值±標準差。
圖15PIG-P在hcDIGs上結(jié)合位點的特征從分離的大鼠脂肪細胞制備的(成比例)量的hcDIGs和lcDIGs培養(yǎng)放射性標記的YCN-PIG(12,000-18,000dpm)(1小時，4℃)，所述細胞用濃度漸增的m-βCD進行預處理(50分鐘，30℃)或不進行處理。將DIGs通過油層離心，從油層頂部回收，溶解并計數(shù)不存在和存在10μM未標記的YCN-PIG時測定的放射性。每個點代表至少使用3種不同脂肪細胞預處理的一式三份的培養(yǎng)物的均值±標準差。
圖16lcGce1p與hcDIGs的特異結(jié)合在不存在或存在未標記的PIG-P條件下，使用從未處理的大鼠脂肪細胞中分離的hcDIGs(6.5μg蛋白質(zhì))培養(yǎng)從釀酒酵母制備的并經(jīng)PI-特異的PLC(蠟狀芽孢桿菌)處理的放射性標記的Gce1p(1小時，4℃)。hcDIGs通過油層離心，溶解并計數(shù)放射性。每個點代表至少分別地使用3種不同的hcDIG制備物和脂肪細胞預處理物進行一式四份培養(yǎng)的均值±標準差。
圖17lcGce p與hcDIGs的特異結(jié)合。
在不存在或存在未標記的YCN-PIG(終濃度3μM)、YCN+PIG37(3μM)、PIG37(5μM)和YCN(10μM)條件下，使用從脂肪細胞分離的hcDIGs(6.5μg蛋白質(zhì))培養(yǎng)從釀酒酵母制備的并經(jīng)PI-特異的PLC(蠟狀芽孢桿菌)處理的放射性標記的Gce1p(1小時，4℃)，所述脂肪細胞已用胰蛋白酶/NaCl、NEM、NEM+DTT進行預處理或不進行處理(對照)。hcDIGs通過油層離心，溶解并計數(shù)放射性。每個點代表至少分別地使用3種不同的hcDIG制備物和脂肪細胞預處理物進行一式四份培養(yǎng)的均值±標準差。
圖18PL和胰島素處理脂肪細胞對YCN-PIG和lcGce1p與hcDIGs結(jié)合的影響在溫和搖動及5％CO2/95％O2條件下，用一定量PI特異性PLC(蠟狀芽孢桿菌)、PC特異性PLC(蠟狀芽孢桿菌)、GPI特異性PLD(人血清)或PLD(卷心菜)或人胰島素培養(yǎng)總體積為2ml的經(jīng)分離大鼠脂肪細胞(7×107細胞/ml)(30分鐘，30℃)。添加2ml 1M NaCl后，通過浮選法洗脂肪細胞。分離hcDIGs，然后，在不存在或存在未標記的YCN-PIG(終濃度10μM)條件下，用從釀酒酵母中制備的放射性標記的lcGce1p和YCN-PIG(15,000-25,000dpm)培養(yǎng)6.5μg hcDIGs(1小時，4℃)，通過油層離心，從油層頂部回收，溶解并計數(shù)放射性。計算的特異結(jié)合為不存在和存在YCN-PIG時的差異。每個點代表至少使用2種不同的hcDIG制備物進行一式三份培養(yǎng)的均值±標準差。
圖19PL和胰島素處理脂肪細胞對YCN-PIG和lcGce1p與hcDIGs結(jié)合的影響在溫和搖動及5％CO2/95％O2條件下，用一定量的PI特異性PLC(蠟狀芽孢桿菌)、PC特異性PLC(蠟狀芽孢桿菌)、GPI特異性PLD(人血清)或PLD(卷心菜)或人胰島素培養(yǎng)總體積為2ml的經(jīng)分離大鼠脂肪細胞(7×107細胞/ml)(30分鐘，30℃)。添加2ml 1M NaCl后，通過浮選法洗脂肪細胞。分離hcDIGs，然后，在不存在或存在未標記的YCN-PIG(終濃度10μM)條件下，用從釀酒酵母中制備的放射性標記的lcGce1p和YCN-PIG(15,000-25,000dpm)培養(yǎng)hcDIGs的6.5μg試樣(1小時，4℃)，通過油層離心，從油層頂部回收，溶解并計數(shù)放射性。
圖20PIG(-P)、PI特異性PLC和胰島素對CIR進行NEM-標記的影響在特定濃度下，在不存在(對照)或存在PIG37、YCN-PIG、YCN、PI-PLC(蠟狀芽孢桿菌)或胰島素條件下，培養(yǎng)分離的大鼠脂肪細胞(30分鐘，37℃)，然后用[14C]NEM標記。如前所述，用胰蛋白酶/NaCl處理后，通過油層用離心法從培養(yǎng)介質(zhì)中分離脂肪細胞。從培養(yǎng)介質(zhì)(油層之下)回收蛋白，然后通過SDS-PAGE分辨。
磷成像從重復三次的具有相似結(jié)果的典型試驗得到顯示。定量評估對四種不同的脂肪細胞培養(yǎng)物以任意單位給出的三個測量值(均值±標準差)，其中將胰蛋白酶/NaCl處理的對照細胞釋放的CIR量的設定為100。
權(quán)利要求
1.源自脂肪細胞質(zhì)膜的蛋白質(zhì)，其與磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽具有特異結(jié)合親和性，其特點是a]在磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽與所述蛋白質(zhì)特異結(jié)合后，能引發(fā)脂肪細胞內(nèi)胰島素受體底物1或2的tyr磷酸化，和b]在磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽與所述蛋白質(zhì)特異結(jié)合后，能刺激脂肪細胞攝入葡萄糖。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽由YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1中的至少一種化合物組成。
3.權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)，其中磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽以0.001至10μM的結(jié)合常數(shù)結(jié)合所述蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)，其中磷脂酰肌醇多糖或磷脂酰肌醇多糖-肽以結(jié)合常數(shù)為0.001至1μM進行結(jié)合。
5.權(quán)利要求1至4的蛋白質(zhì)，其中脂肪細胞是大鼠、小鼠或人源的脂肪細胞。
6.權(quán)利要求1至5的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)分子量為115kDa。
7.復合體，其由權(quán)利要求1至6的蛋白質(zhì)和YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1中的至少一種化合物構(gòu)成。
8.權(quán)利要求1至7的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，其中a]脂肪細胞由大鼠、小鼠或人組織提供，b]從a]分離脂肪細胞的質(zhì)膜，c]從b]的質(zhì)膜制備具有高膽固醇的筏域(hcDIGs)，d]用胰蛋白酶/NaCl溶液處理源自c]的hcDIGs，e]離心來自于d]的培養(yǎng)混合物并用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離上清液中的蛋白，f]從凝膠上洗脫大小為115kDa的蛋白質(zhì)級分并可能用含有去污劑或生物膜的溶液或懸液溶解，g]且可能加入了下述化合物之一YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1。
9.用于鑒定特異結(jié)合至權(quán)利要求1至6的蛋白的化合物的方法，其中a]提供細胞的級分，其含有權(quán)利要求1至6的蛋白，b]提供化合物，c]將來自于a]的細胞級分與b]的化合物接觸，d]檢測所述化合物與a]的細胞級分的結(jié)合，e]通過將d]的結(jié)果與下面實驗結(jié)果進行比較推出結(jié)合的特異性在該實驗中，將來自于b]的同一化合物與這樣的細胞級分進行接觸，其中所述細胞具有與來自于a]的細胞相同的物種和/或組織特異性但所述細胞級分不含有權(quán)利要求1至6的蛋白質(zhì)，一旦來自于b]的化合物結(jié)合到含有權(quán)利要求1至6的蛋白質(zhì)的細胞級分上的量高于來自于b]的化合物結(jié)合到不含有權(quán)利要求1至6的蛋白質(zhì)的細胞級分上的量，則表明所述化合物具有較高的結(jié)合特異性。
10.權(quán)利要求9的方法，其中由其獲得細胞級分的細胞是脂肪細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞或肝細胞。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中細胞是人、小鼠或大鼠物種來源的細胞。
12.權(quán)利要求9至11的方法，其中細胞級分由細胞的細胞膜組成。
13.權(quán)利要求9至12的方法，其中細胞級分由高膽固醇含量的筏域(hcDIGs)組成。
14.權(quán)利要求9至13的方法，其中化合物用放射性核素或熒光標記物進行標記。
15.鑒定特異結(jié)合權(quán)利要求1至6的蛋白質(zhì)的化合物的方法，其中a]提供葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞，其包含權(quán)利要求1至6的蛋白質(zhì)，b]提供化合物，c]將源自于a]的細胞與b]的化合物接觸，d]確定化合物結(jié)合至葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞，e]通過將d]的結(jié)果與下面實驗結(jié)果進行比較推出結(jié)合的特異性在該實驗中，將來自b]的同一化合物與這樣的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞進行接觸，其為具有與來自于a]的細胞相同的物種和/或組織特異性但不含有權(quán)利要求1至6的蛋白質(zhì)的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞，一旦所述化合物結(jié)合至含有權(quán)利要求1至6所述蛋白質(zhì)的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞上的量高于結(jié)合到不含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞上的量，則表明所述化合物具有較高的結(jié)合特異性。
16.權(quán)利要求15的方法，其中細胞是脂肪細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞或肝細胞。
17.權(quán)利要求15或16的方法，其中細胞是人、小鼠或大鼠物種來源的細胞。
18.權(quán)利要求15至17的方法，其中化合物用放射性核素或熒光標記物進行標記。
19.鑒定化合物為權(quán)利要求1至6的蛋白的激動劑或拮抗劑的方法，其中a]提供葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞，其中存在權(quán)利要求1至6的蛋白質(zhì)，b]提供權(quán)利要求1至6的蛋白質(zhì)的天然配基，c]提供化學化合物，d]將a]的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞與b]的配基和c]的化學化合物接觸，e]檢測d]的葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞的葡萄糖攝入，由此認為刺激葡萄糖攝入的源自于c]的化合物具有激動劑活性，且認為抑制葡萄糖攝入的源自于c]的化合物具有拮抗劑活性。
20.權(quán)利要求19的方法，其中天然配基選自YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其中葡萄糖轉(zhuǎn)運細胞是脂肪細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞或肝細胞。
22.權(quán)利要求19至21的方法，其中細胞是人、小鼠或大鼠物種來源的細胞。
23.藥物，其包含通過權(quán)利要求9至22的方法鑒定的化合物以及用于藥物制劑的輔助化合物。
24.權(quán)利要求23的藥物，其中至少一種化合物選自YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1。
25.權(quán)利要求23的藥物，其中化合物由YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1中至少一種中的一部分或衍生物組成。
26.通過權(quán)利要求9至22的方法鑒定的化合物的用途，用于產(chǎn)生治療胰島素抗性或糖尿病的藥物。
27.權(quán)利要求26的用途，其中所述化合物選自YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1。
28.權(quán)利要求26的用途，其中所述化合物由YCN-PIG、YMN-PIG、PIG37、YCN或lcGce1中至少一種中的一部分或衍生物組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自脂肪細胞質(zhì)膜的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)與磷脂酰肌醇多糖具有特異的結(jié)合親和性。其通過避開胰島素信號傳導級聯(lián)而調(diào)控葡萄糖的攝入。
文檔編號C07K14/705GK1665836SQ03815992
公開日2005年9月7日 申請日期2003年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月5日
發(fā)明者G·米勒, W·弗里克, S·佩特里, R·施奈德, M·烏爾曼 申請人:安萬特醫(yī)藥德國有限公司