專利名稱：一種人糖基磷脂酰肌醇－cd80融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及蛋白質(zhì)，特別是與抗腫瘤有關(guān)的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
上世紀(jì)80年代以后，有關(guān)腫瘤疫苗的各種研究呈現(xiàn)階梯狀上升趨勢(shì)，腫瘤疫苗在現(xiàn)代腫瘤治療中作為腫瘤術(shù)后化療、放療的一種重要的輔助治療手段越來越受到人們的關(guān)注，尤其是應(yīng)用基因工程疫苗治療已是近年研究的熱點(diǎn)。
研究證明，缺乏共刺激信號(hào)是腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的重要原因之一，機(jī)體抗腫瘤的免疫必須依賴于腫瘤細(xì)胞的抗原被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，方能激活。CD80是表達(dá)于活化的B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞等有抗原呈遞作用的細(xì)胞上的糖蛋白，與其配體CD28結(jié)合，在T細(xì)胞活化中起協(xié)同刺激作用。用CD80制備腫瘤疫苗的傳統(tǒng)方法是轉(zhuǎn)導(dǎo)法，即將CD80基因直接導(dǎo)入目的腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，該方法存在以下缺點(diǎn)1.需要外源性載體，而病毒等載體進(jìn)入患者體內(nèi)，其活動(dòng)范圍，活動(dòng)過程都無法控制，很可能帶來不良反應(yīng)；2.患者體內(nèi)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，因受體內(nèi)生理微環(huán)境條件的限制，其轉(zhuǎn)染效率往往較低；3.基因表達(dá)的過程復(fù)雜且耗時(shí)；4.外源性基因整合到宿主細(xì)胞核染色體后，往往容易降解，或者表達(dá)不穩(wěn)定，所以目前很難運(yùn)用于臨床。
GPI錨定蛋白是不跨越細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層，只通過其羧基末端的GPI結(jié)構(gòu)錨定于細(xì)胞膜上。當(dāng)GPI錨定蛋白與細(xì)胞共同孵育時(shí)，可以自動(dòng)整合到細(xì)胞膜表面，并可以保持與其天然配體結(jié)合的能力。因此，用GPI修飾的CD80可以克服傳統(tǒng)方法制備腫瘤疫苗的缺點(diǎn)。1999年McHugh首先在小鼠身上證明將GPI-CD80錨定于小鼠腫瘤細(xì)胞上可以增強(qiáng)小鼠的免疫功能，從而起到清除腫瘤的作用(McHugh RS，Nagarajan S，Wang YC，et al.Protein transferof glycosyl-phosphatidylinositol-B7-1 into tumor cell membranesa novel approachto tumor immunotherapy.[J]Cancer Res.1999 May 15；59(10)2433-7.)；2001年P(guān)oloso將患者的腫瘤細(xì)胞或者是腫瘤細(xì)胞碎片經(jīng)GPI-CD80修飾后對(duì)患者的T細(xì)胞起到了刺激增殖的作用(Poloso N，Nagarajan S，Bumgarner GW，et al.Designer cancer vaccines made easyprotein transfer of immunostimulatory molecules for use in therapeutic tumorvaccines.[J]Front Biosci.2001 Jun 1；6D760-75.)；于繼云研究了GPI-CTLA-4Ig嵌合分子的構(gòu)建和在CHO細(xì)胞膜上的表達(dá)(于繼云，沈倍奮，黎燕，等.GPI-CTLA4Ig嵌合分子的構(gòu)建和在CHO-dhfr2細(xì)胞膜上的表達(dá)[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2003，19(3)212-214)，以及GPI-SEA免疫分子在CHO細(xì)胞中的表達(dá)(于繼云，陳興，蔡欣，等.超抗原SEA的GPI錨定修飾和在CHO2dhf細(xì)胞膜上的表達(dá)[J].中國(guó)生物工程雜志，2003，23(3)59-61)。上述研究證明了通過基因工程手段將GPI與CD80嵌合表達(dá)用于制備新型腫瘤疫苗的可行性，但是上述制備的GPI-CD80腫瘤疫苗的GPI部分來源于非人類基因，可能會(huì)由于與人類基因的非同源性影響腫瘤疫苗的作用效果，且安全性差。
易平永、熊茂林設(shè)計(jì)的GPI錨定型B7-1(CD80)融合蛋白具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用(熊茂林，宋暢，羅榮城，等.人糖基磷脂酰肌醇(GPI)-B7-1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J].中國(guó)病理生理雜志2005，21(1)154-158)，該融合蛋白是通過制備CD16和B7-1的融合蛋白得到，具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，能用于腫瘤疫苗的制備，但是該融合蛋白錨定于腫瘤細(xì)胞表面的穩(wěn)定性較差，用該融合蛋白制備所得的腫瘤疫苗的抗腫瘤活性也不夠理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提高GPI-CD80腫瘤疫苗的抗腫瘤活性。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是，一種人糖基磷脂酰肌醇-CD80融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列為SEQ NO.1，具體是Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr1 5 10 15Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys20 25 30Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu35 40 45Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile50 55 60Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp65 70 75 80Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr85 90 95
Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly100 105 110Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg115 120 125Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr130 135 140Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile145 150 155 160Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu165 170 175Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp180 185 190Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met195 200 205Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg210 215 220Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro225 230 235 240Asp Thr Thr Cys Ile Pro Ser Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala245 250 255
Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr260 265 270Met Asn Gly Ile Leu275本發(fā)明所述的融合蛋白的制備方法是1.人GPI-CD80真核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)genebank提供的人CD58(NM 001779)和CD80基因(NM 005191)的參考序列，設(shè)計(jì)引物P1、P2，PCR擴(kuò)增CD80基因的胞外段，設(shè)計(jì)引物P3、P4 PCR擴(kuò)增CD58基因的GPI信號(hào)序列，各引物序列如下P1AGCAGGCTTGGAAGGAGT(SEQ NO.2)P2GGTTGTATCAGGAAAATGC(SEQ NO.3)P3CCTGATACAACCTGTATCCCAAG(SEQ NO.4)P4TCCGCACTCGAGCAGAATACCAT(SEQ NO.5)然后利用重疊延伸PCR技術(shù)將兩片段連接起來，反應(yīng)體系總體積50μl，其中pfuMasterMix 24μl，引物P1 0.4μM，引物P4 0.4μM，CD80胞外段0.04ng/μl，CD58基因的GPI信號(hào)段0.04ng/μl，其余為ddH2O；反應(yīng)循環(huán)的設(shè)置 將上述PCR產(chǎn)物連入T載體，再用NspV和XhoI 37℃酶切2h，將含編碼蛋白SEQ NO.1的片段連接于真核表達(dá)載體pReciever-M10。
2.真核表達(dá)載體在CHO細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染和表達(dá)(1)陽(yáng)性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)G418加壓篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)GPI-hCD80的CHO細(xì)胞株；(2)提取穩(wěn)定表達(dá)GPI-hCD80蛋白的CHO細(xì)胞的膜蛋白后，選用鼠抗人CD80單抗，通過與溴化氫活化的Sepharose 4B藕聯(lián)制備親和層析柱，分離純化GPI-hCD80膜蛋白。
本發(fā)明所述的融合蛋白的鑒定1、間接免疫熒光染色檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)染后CHO細(xì)胞膜上CD80的表達(dá)情況①分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)染了pRM10/GPI-CD80的CHO細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pRM10的CHO細(xì)胞，用0.25％的胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種到預(yù)先放置蓋玻片的培養(yǎng)皿中，置37℃，5％CO2培養(yǎng)1～3d，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層，取出蓋玻片，用PBS緩沖液洗2次，每片蓋玻片滴加純丙酮200μl，-20℃固定15min。
②將已經(jīng)固定的細(xì)胞蓋玻片用PBS緩沖液振洗5min，去除丙酮。
③滴加適當(dāng)稀釋的鼠抗人CD80抗體(1∶100)，置于濕盒內(nèi)，37℃保溫1h。
④PBS緩沖液振洗2次，每次5min。
⑤滴加適當(dāng)稀釋的羊抗鼠FITC-CD80二抗(1∶50)，置于濕盒內(nèi)，37℃保溫1h。
⑥PBS緩沖液振洗2次，每次5min，然后用蒸餾水振洗1次。
⑦取以上處理好的轉(zhuǎn)染pRM10/GPI-CD80的CHO細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pRM10的CHO細(xì)胞玻片各一，50％緩沖甘油封片，在熒光顯微鏡下以波長(zhǎng)488nm光源激發(fā)，觀察并拍照；再取處理好的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞和空CHO細(xì)胞玻片各一，滴加0.25％伊文氏蘭復(fù)染，37℃保溫30min，PBS振洗2次后用緩沖甘油封片，在熒光顯微鏡下以波長(zhǎng)488nm光源激發(fā)，觀察并拍照。
2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)染后CHO細(xì)胞膜上CD80的表達(dá)情況用以上制備好的轉(zhuǎn)染了pRM10/GPI-CD80的CHO單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，用鼠抗人FITC-CD80標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CHO細(xì)胞膜上的GPI-CD80蛋白的表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度。每份樣品檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞。將pRM10轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CHO細(xì)胞分別設(shè)為陰性對(duì)照和空白對(duì)照。
3、Western-blot鑒定表達(dá)蛋白(選用鼠抗人CD80單抗和HRP-羊抗鼠IgG進(jìn)行實(shí)驗(yàn))(1)灌制分離膠和濃縮膠表1 聚丙稀酰胺凝膠的配方(分離膠為10％，濃縮膠為5％)

在三角錐瓶中按表1中的配方依次混合各成分，一加入TEMED立即快速混勻，迅速在兩玻璃板間隙中灌注至距離頂部約3cm處，用微量加樣器輕輕在頂層加入0.5-1ml雙蒸水，覆蓋其界面，使界面平整，并防止空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的抑制作用，室溫下放置約30min使之聚合；傾去分離膠上面的水，并盡量用濾紙吸干凝膠頂端殘存的液體；配置5％SDS-聚丙稀酰胺濃縮膠，加入濃縮膠，立即平行插入梳子，避免氣泡，室溫下放置30min；平行拔出梳子，立即用去離子水沖洗孔道，防止未聚合的TEMED聚合造成孔道不平整；將凝膠電泳板放入電泳槽。
(2)煮樣及上樣取50μl蛋白樣品及10μl蛋白Marker，分別加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸3min，每孔分別用微量加樣器加20μl轉(zhuǎn)染pRM10的CHO細(xì)胞蛋白、GPI-CD80蛋白及純化后的GPI-CD80上樣電泳。
(3)電泳接通電源，電壓180V，當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后，電壓改為100V，繼續(xù)電泳直至染料的前沿接近凝膠的底端。切斷電源，從電泳槽中取出玻璃板并小心撬開，取出凝膠，標(biāo)明方位。
(4)染色及脫色將其放入盛有新配考馬斯亮藍(lán)染液的容器中，37℃恒溫?fù)u床染色45min；用脫色液浸泡凝膠，于搖床上使其脫色至背景清晰。
(5)蛋白質(zhì)的凝膠半干轉(zhuǎn)印。
①戴手套將剪好的濾紙及硝酸纖維素薄膜在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡30min。
②在電轉(zhuǎn)移槽內(nèi)從下向上依次放置濾紙、硝酸纖維素薄膜、凝膠、濾紙，做好標(biāo)記，精確對(duì)齊并用玻棒趕走氣泡。
③接通電源，在100mA電流下轉(zhuǎn)移3h，切斷電源，取出硝酸纖維素薄膜。
(6)蛋白質(zhì)印跡①封閉將硝酸纖維素薄膜正面向下放入玻璃平皿中，加入封閉液，室溫平搖1h。
②將膜轉(zhuǎn)入1∶500稀釋的鼠抗人CD80抗體，室溫平搖1h。
③洗滌洗滌液洗3min×5次。
④將硝酸纖維素薄膜加入1∶1000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，室溫平搖1h。
⑤洗滌洗滌液洗3min×5次。
⑥D(zhuǎn)AB顯色用含DAB和H2O2的PBS顯色，去離子水漂洗終止反應(yīng)。
結(jié)果判定的方法是在蛋白MARKER60kDa附近出現(xiàn)褐色條帶即說明融合蛋白為GPI-CD80。
4、融合蛋白錨定形式的鑒定用磷脂酰肌醇磷脂酶C(PI-PLC)處理錨定于腫瘤細(xì)胞膜表面的本發(fā)明融合蛋白，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的陽(yáng)性率和熒光強(qiáng)度。
用流式細(xì)胞儀檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)GPI-CD80的CHO細(xì)胞膜上的蛋白，鑒定蛋白是否為GPI錨定形式。將上述細(xì)胞用0.2U/mlPIPLC處理，30℃孵育4h并間斷振蕩。加入鼠抗人FITC-CD80抗體，流式細(xì)胞儀分析PIPLC處理前后細(xì)胞膜上GPI-CD80蛋白表達(dá)的熒光陽(yáng)性率及熒光強(qiáng)度。分別以質(zhì)粒pRM10轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞和CHO細(xì)胞設(shè)為陰性對(duì)照和空白對(duì)照。
結(jié)果判定的方法是GPI-CD80融合蛋白在PIPLC處理前后的熒光陽(yáng)性率和平均熒光強(qiáng)度發(fā)生極大變化，由高變低，即說明GPI-CD80融合蛋白的GPI可以被PIPLC特異性洗脫，該融合蛋白為GPI錨定形式。
5、穩(wěn)定性檢測(cè)用PBS緩沖液洗HepG2細(xì)胞3遍，重懸于RPMI1640培養(yǎng)基中，使其細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，加入GPI-CD80融合蛋白(10μg/ml)，分別在37℃孵育30min，2h，4h，8h，16h，并間斷振蕩，用PBS緩沖液洗細(xì)胞3遍，加入鼠抗人FITC-CD80抗體進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞表面的CD80熒光陽(yáng)性細(xì)胞率。以不加GPI CD80融合蛋白的HepG2細(xì)胞為空白對(duì)照組，如果錨定各時(shí)間段腫瘤細(xì)胞表面熒光陽(yáng)性率和熒光強(qiáng)度與新制備的樣本比較，無明顯降低，說明錨定是穩(wěn)定的。
本發(fā)明所述的人糖基磷脂酰肌醇-CD80融合蛋白與腫瘤細(xì)胞膜的錨定相當(dāng)穩(wěn)定，可用于制備腫瘤疫苗，該腫瘤疫苗具有較高的抗腫瘤活性。
本發(fā)明腫瘤疫苗的方法是1、腫瘤細(xì)胞樣本的處理取新鮮腫瘤組織剪碎并反復(fù)研磨后懸浮于保存液內(nèi)，200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾制備成單細(xì)胞懸液，保存液為新鮮配置的含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基。
2、腫瘤細(xì)胞與GPI-CD80融合蛋白共孵育用PBS緩沖液洗腫瘤細(xì)胞3遍，重懸于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，使腫瘤細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，加入本發(fā)明GPI-CD80融合蛋白，調(diào)整終濃度為10μg/ml，37℃孵育4h并間斷振蕩；PBS緩沖液洗3遍后加入絲裂霉素(終濃度為100μg/ml，37℃，5％CO2溫育1h)滅活，制成腫瘤疫苗。
本發(fā)明腫瘤疫苗能刺激脾淋巴細(xì)胞增殖、IL-2和IFN-γ、CTL的分泌，抑制腫瘤生長(zhǎng)，具有很高的抗腫瘤活性。
具體實(shí)施例方式
例1 GPI-CD80融合蛋白的制備1.人GPI-CD80真核表達(dá)載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建根據(jù)genebank提供的人CD58(NM 001779)和CD80基因(NM 005191)的參考序列，設(shè)計(jì)引物P1(SEQ NO.2)、P2(SEQ NO.3)，PCR擴(kuò)增CD80基因的胞外段，設(shè)計(jì)引物P3(SEQ NO.4)、P4(SEQ NO.5)PCR擴(kuò)增CD58基因的GPI信號(hào)序列，各引物序列如下P1AGCAGGCTTGGAAGGAGTP2GGTTGTATCAGGAAAATGCP3CCTGATACAACCTGTATCCCAAGP4TCCGCACTCGAGCAGAATACCAT然后利用重疊延伸PCR技術(shù)(splicing overlap extension，SOE)將兩片段連接起來，反應(yīng)體系為pfu MasterMix 24μl，引物P1(10μM)2μl，引物P4(10μM)2μl，CD80胞外段(2ng/μl)1μl，GPI信號(hào)段(2ng/μl)1μl，ddH2O 20μl；反應(yīng)循環(huán)的設(shè)置94℃，2min；(94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，2min)25個(gè)循環(huán)；72℃，10min。
加A反應(yīng)后連入T載體，再NspV和XhoI 37℃酶切2h，連接真核表達(dá)載體pReciever-M10。
2、GPI-CD80融合蛋白的表達(dá)與檢測(cè)(1)陽(yáng)性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)G418加壓篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)GPI-CD80的CHO細(xì)胞株；陽(yáng)性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的具體方法為紫外吸收檢測(cè)DNA的濃度和純度分光光度計(jì)先用蒸餾水在260nm和280nm波長(zhǎng)下校零，取質(zhì)粒DNA樣品轉(zhuǎn)入濾紙洗干水分后的分光光度計(jì)石英比色杯中，在260nm和280nm分別讀出OD值。根據(jù)OD260/OD280的值估計(jì)DNA的純度，純凈DNA的比值為1.8。
利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組體pRM10/GPI-CD80質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞，參照Invitrogen公司LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染操作說明，步驟簡(jiǎn)述如下轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化CHO細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪板，加入含10％胎牛血清的DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90％。在一無菌的eppendoff管中，將pRM10，pRM10/GPI-CD80各1μg，分別用50μl的無血清無抗生素的DMEM-F12進(jìn)行稀釋，混勻，制成溶液A。在另一eppendoff管中，將2μlLipofectamineTM2000用50μl的無血清無抗生素的DMEM-F12進(jìn)行稀釋，混勻，制成溶液B。在5min內(nèi)將A、B兩液混勻，室溫靜置20min。在此期間，將培養(yǎng)板中的CHO細(xì)胞用無血清的DMEM-F12培養(yǎng)液洗滌3次。將A、B混合物加于CHO細(xì)胞表面，輕輕來回晃動(dòng)培養(yǎng)板，使混合物均勻覆蓋于細(xì)胞表面，37℃，5％CO2孵育5h，吸去培養(yǎng)液，將細(xì)胞用新鮮的培養(yǎng)液洗滌2次，加入含10％胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h。隨后換成含篩選濃度的G418的10％胎牛血清DMEM-F12，直至抗性克隆長(zhǎng)成，依次挑取單個(gè)克隆，繼續(xù)用含篩選濃度G418的10％胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)2w。
確定CHO細(xì)胞的G418篩選濃度具體方法為用含10％胎牛血清的DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)CHO細(xì)胞使之貼壁生長(zhǎng)成單層細(xì)胞，經(jīng)0.25％的胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，待貼壁細(xì)胞開始變圓時(shí)加入含10％胎牛血清的DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液終止反應(yīng)。離心，去除上清，加入新鮮的10％胎牛血清的DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，接種于24孔板內(nèi)，每孔1ml。待細(xì)胞貼壁后，加入G418，調(diào)整G418的終濃度依次為400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml和1 000μg/ml，每個(gè)稀釋度做三個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)一個(gè)不含G418的培養(yǎng)基對(duì)照組。37℃，5％CO2培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞G3418的最佳篩選濃度為在此期間能使細(xì)胞全部死亡的最低濃度。
轉(zhuǎn)染細(xì)胞在G418選擇培養(yǎng)基中篩選后得到了穩(wěn)定表達(dá)GPI-hCD80的CHO細(xì)胞株；免疫熒光化學(xué)法顯示該細(xì)胞株的膜上有強(qiáng)烈的綠色熒光，而對(duì)照組中轉(zhuǎn)染了pReceiver-M10質(zhì)粒的CHO細(xì)胞膜上未見熒光，表明GPI-hCD80融合蛋白是錨定在細(xì)胞膜上的；流式細(xì)胞儀檢測(cè)篩選得到的CHO細(xì)胞，細(xì)胞膜上表達(dá)GPI-hCD80的陽(yáng)性細(xì)胞率和平均熒光強(qiáng)度分別高達(dá)90.02％、42，而對(duì)照組陽(yáng)性率和熒光強(qiáng)度均極低CHO細(xì)胞的陽(yáng)性標(biāo)記率和平均熒光強(qiáng)度分別為0.50％、3，轉(zhuǎn)染了pReceiver-M10的CHO細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記率和平均熒光強(qiáng)度分別為8.95％、10。
將CHO細(xì)胞、轉(zhuǎn)染了pReceiver-M10的CHO細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)GPI-hCD80的CHO細(xì)胞用胰酶消化后以PBS重懸，加入鼠抗人FITC-CD80抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各樣本中CD80熒光陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞的陽(yáng)性率及平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示CHO細(xì)胞CD80陽(yáng)性標(biāo)記率和平均熒光強(qiáng)度分別為0.47％、2，轉(zhuǎn)染了pReceiver-M10的CHO細(xì)胞CD80陽(yáng)性標(biāo)記率和平均熒光強(qiáng)度分別為7.62％、9，穩(wěn)定表達(dá)了GPI-hCD80的CHO細(xì)胞CD80陽(yáng)性標(biāo)記率和平均熒光強(qiáng)度分別為90.02％、42。將這些細(xì)胞用PIPLC處理4h后再進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可見兩個(gè)對(duì)照組的CD80細(xì)胞陽(yáng)性率和平均熒光強(qiáng)度幾乎沒有發(fā)生改變，而穩(wěn)定表達(dá)了GPI-hCD80的CHO細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記率和平均熒光強(qiáng)度分別改變?yōu)?.34％、7。說明在穩(wěn)定表達(dá)GPI-hCD80的CHO細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白為GPI錨定蛋白。
(2)提取穩(wěn)定表達(dá)GPI-hCD80蛋白的CHO細(xì)胞的膜蛋白后，選用鼠抗人CD80單抗，通過與溴化氫活化的Sepharose 4B藕聯(lián)制備親和層析柱，分離純化GPI-hCD80膜蛋白；提取CHO細(xì)胞膜蛋白的具體方法為①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液后用冰預(yù)冷的PBS緩沖液(0.01M pH 7.2～7.3)洗三次；②用冰預(yù)冷的含有蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF，1mM)的PBS緩沖液(0.01M pH7.2～7.3)重懸細(xì)胞，冰浴中最大功率超聲破碎細(xì)胞(3×10s)；③4℃下采用差速離心法，去除未破碎細(xì)胞、細(xì)胞核及大部分線粒體。小心吸取上清(含有胞質(zhì)成分和細(xì)胞膜成分)，并適當(dāng)富集。
④采用20％～45％蔗糖線性密度梯度離心，12000g在4℃下離心2h，收集質(zhì)膜部分；⑤加入TritonX-114溶液冰浴15min，4℃下10000g離心5min；⑥溶液37℃水浴10min以分離水相和去污劑相，然后37℃2000g離心5min；⑦將上述沉淀(TritonX-114與膜蛋白的混合物)加入9倍體積冰凍丙酮，冰浴40min，10000rpm離心30min，這時(shí)就可以將上層的丙酮和TritonX-114一起去除，從而得到膜蛋白。
⑧真空濃縮膜蛋白。
親和層析的具體方法為①膨脹填料稱取1g CNBr Sepharose 4B，用新鮮配制的0.001mol/L的HCL室溫浸泡15min。
②稀釋鼠抗人CD80抗體20mg鼠抗人CD80抗體溶解于4ml，pH9，0.25mol/L碳酸氫鈉緩沖液中。
③填料與鼠抗人CD80抗體藕聯(lián)浸泡后的填料離心2000rpm×5s，緩沖液洗滌2次。與鼠抗人CD80混合，混勻后20℃放置4h，并緩慢攪拌溶液。離心后收集上清測(cè)未藕聯(lián)的鼠抗人CD80抗體的量，記做G1。
④洗去與鼠抗人CD80抗體藕聯(lián)后的填料中非特異性吸附的鼠抗人CD80抗體藕聯(lián)后裝柱，用20倍體積的緩沖液洗去未結(jié)合的鼠抗人CD80抗體，再用5倍體積的pH2.8，0.1mol/LHCL-甘氨酸緩沖液(16.8ml0.2mol/LHCl，50ml0.2mol/L的甘氨酸，用水補(bǔ)足至100ml終體積)洗去非特異性吸附的鼠抗人CD80抗體。最后用pH7.4，0.01mol/L的PBS平衡后待用。收集洗脫液并測(cè)定其蛋白含量，記做G2，與上步中G1合并，計(jì)算鼠抗人CD80抗體的吸附載量(抗體的吸附載量＝(抗體的總使用量-G1-G2)/填料的體積)。
⑤穩(wěn)定表達(dá)GPI-CD80的CHO細(xì)胞膜蛋白的吸附將膜蛋白以0.5～1ml/min的流速吸附于鼠抗人CD80-CNBr Sepharose 4B上，4℃保持4h，然后用10倍體積的PBS緩沖液以及1ml/min的流速洗脫未結(jié)合的雜蛋白，直到洗脫液的OD280nm≤0.05為止。
⑥解離結(jié)合在CD80-CNBr Sepharose 4B填料中的GPI-CD80蛋白用0.1mol/L的pH2.4，HCl-甘氨酸緩沖液洗脫與鼠抗人CD80-CNBr Sepharose 4B填料中的配基結(jié)合的GPI-CD80蛋白，流速為1ml/min，洗至OD280nm≤0.02，立即用1mol/L的NaHCO3中和洗脫的蛋白溶液。
Western-Blot顯示在60KD附近有一明顯的褐色蛋白條帶出現(xiàn)。將GPI-hCD80融合蛋白與HepG2細(xì)胞共同孵育30min，2h，4h，8h，16h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面呈現(xiàn)熒光的CD80陽(yáng)性細(xì)胞率分別為78.02％、75.46％、78.29％、80.40％、82.12％，各樣本進(jìn)行比較，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分率變化不明顯，表明GPI-hCD80融合蛋白與HepG2腫瘤細(xì)胞共孵育后，能夠錨定在腫瘤細(xì)胞膜上，而且這種錨定具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。
例2 制備治療HePG2細(xì)胞腫瘤的GPI-CD80疫苗1、HePG2細(xì)胞樣本的處理取新鮮肝癌組織剪碎并反復(fù)研磨后懸浮于保存液內(nèi)，200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾制備成單細(xì)胞懸液，保存液為新鮮配置的含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基；2、HePG2細(xì)胞與本發(fā)明GPI-CD80融合蛋白共孵育用PBS緩沖液洗HePG2細(xì)胞3遍，重懸于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，使HePG2細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，加入本發(fā)明GPI-CD80融合蛋白使其終濃度為10μg/ml，37℃孵育4h并間斷振蕩；PBS緩沖液洗3遍后加入絲裂霉素(終濃度為100μg/ml，37℃，5％CO2溫育1h)滅活，制成腫瘤疫苗。
例3效果實(shí)驗(yàn)1、腫瘤疫苗對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響刺激原分別為經(jīng)過絲裂霉素滅活的HepG2、HepG2/GPI-CD80(制備方法見實(shí)施例2)，反應(yīng)細(xì)胞為正常的小鼠脾淋巴細(xì)胞。將刺激原和反應(yīng)細(xì)胞按1∶5的比例混合培養(yǎng)3d，具體為將分離的脾淋巴細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個(gè)/ml，加到96孔板中，每孔100μl，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，每份8復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組每孔加入經(jīng)絲裂霉素滅活的HepG2/GPI-CD80細(xì)胞，陰性對(duì)照組加入經(jīng)過絲裂霉素滅活的HepG2細(xì)胞，空白對(duì)照組只加培養(yǎng)液。于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)的0h、24h、48h、72h后，每孔加入20μlMTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，加DMSO100μl孔，振蕩10min，在酶聯(lián)儀上測(cè)定吸光度(A570)值。陰性組實(shí)際OD值＝陰性組A570-空白對(duì)照組A570；陽(yáng)性組實(shí)際OD值＝陽(yáng)性組A570-空白對(duì)照組A570。
結(jié)果如表2所示，陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組脾淋巴細(xì)胞OD值在接受刺激后均升高(F＝51.912，P＝0.003)，但陰性對(duì)照組升高不及實(shí)驗(yàn)組升高明顯(F＝63.958，P＝0.000)。進(jìn)一步兩兩比較顯示實(shí)驗(yàn)組在72h時(shí)OD值最高，可見本發(fā)明腫瘤疫苗刺激脾淋巴細(xì)胞的增殖。
表2 腫瘤疫苗對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響(n＝8，x±s)

注分組之間F＝63.958，P＝0.000，說明分組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；時(shí)間點(diǎn)之間F＝51.912，P＝0.003，說明各時(shí)間點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；分組與時(shí)間點(diǎn)間交互效應(yīng)的F＝23.351，P＝0.000，說明分組與時(shí)間點(diǎn)間有交互作用。進(jìn)一步兩兩比較顯示實(shí)驗(yàn)組在72h時(shí)OD值最高。
2、腫瘤疫苗刺激脾淋巴細(xì)胞后對(duì)分泌細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的量的影響分別將正常的小鼠脾淋巴細(xì)胞和刺激細(xì)胞[絲裂霉素滅活的HepG2(陰性對(duì)照組)、絲裂霉素滅活的HepG2/GPI-CD80(實(shí)驗(yàn)組)]放在24孔板中培養(yǎng)，每孔淋巴細(xì)胞和刺激細(xì)胞分別為1×107個(gè)/ml和5×104個(gè)/ml，每個(gè)樣本做6個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24h后，收集上清液，按試劑盒說明書測(cè)IL-2含量；常規(guī)培養(yǎng)72h后，收集上清液，按試劑盒說明書測(cè)IFN-γ含量，均以樣品稀釋液做為空白對(duì)照組，結(jié)果以pg/ml表示。陰性組實(shí)際值＝陰性組-空白對(duì)照組；陽(yáng)性組實(shí)際值＝陽(yáng)性組-空白對(duì)照組。
結(jié)果如表3所示，實(shí)驗(yàn)組IL-2和IFN-γ的水平均明顯高于陰性對(duì)照組，可見本發(fā)明腫瘤疫苗能有效刺激IL-2和IFN-γ的分泌。
表3 各組小鼠脾細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的水平(pg/ml，n＝6，x±s)

3、腫瘤疫苗刺激脾淋巴細(xì)胞后CTL的活性變化將分離的小鼠脾淋巴細(xì)胞調(diào)整濃度至1×107個(gè)/ml，分別與經(jīng)過絲裂霉素滅活的HepG2細(xì)胞(陰性對(duì)照組)、HepG2/GPI-CD80細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱孵育48h，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔。均以PBS做為空白對(duì)照組，吸取各孔上清備用。
根據(jù)乳酸脫氫酶(CTL)測(cè)試盒說明書測(cè)定CTL活力。
CTL活力(U/L)＝(測(cè)定管OD值-測(cè)定空白管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-標(biāo)準(zhǔn)空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(2umol/ml)×1000ml×測(cè)試前樣品稀釋倍數(shù)結(jié)果如表4所示，實(shí)驗(yàn)組CTL的水平明顯高于陰性對(duì)照組，可見本發(fā)明腫瘤疫苗能刺激CTL的分泌。
表4各組小鼠脾細(xì)胞分泌CTL的水平(U/L，n＝3，x±s)

例4從人CD16中截取GPI信號(hào)肽制備的GPI_B7_1融合蛋白與本發(fā)明融合蛋白的效果對(duì)比實(shí)驗(yàn)現(xiàn)有技術(shù)《人糖基磷脂酰肌醇_GPI_B7_1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)》中公開的GPI-B7_1蛋白，其融合蛋白中的GPI信號(hào)肽來源于人CD16(熊茂林等，中國(guó)病理生理雜志，2005，21(1)154-158)，B7_1即CD80，為了區(qū)別于本發(fā)明，下述實(shí)驗(yàn)中均簡(jiǎn)稱為GPI_B7_1蛋白，用該蛋白制備的腫瘤疫苗簡(jiǎn)稱為HepG2/GPI-B7_1。
1、與本發(fā)明融合蛋白GPI錨定的穩(wěn)定性的比較(1)方法將GPI-B7_1蛋白和本發(fā)明融合蛋白(制備方法見實(shí)施例1)分別與HepG2細(xì)胞共同孵育30min，2h，4h，8h，16h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面呈現(xiàn)熒光的CD80陽(yáng)性細(xì)胞率。
(2)結(jié)果GPI-B7_1蛋白與HepG2細(xì)胞共同孵育30min，2h，4h，8h，16h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面呈現(xiàn)熒光的CD80陽(yáng)性細(xì)胞率分別為79.65％、75.46％、64.29％、66.72％、65.79％，呈明顯的下降的趨勢(shì)。而本發(fā)明融合蛋白與HepG2細(xì)胞共同孵育30min，2h，4h，8h，16h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面呈現(xiàn)熒光的CD80陽(yáng)性細(xì)胞率分別為78.02％、75.46％、78.29％、80.40％、82.12％，各樣本進(jìn)行比較，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分率變化不明顯，可見本發(fā)明融合蛋白與HepG2腫瘤細(xì)胞共孵育后，能夠錨定在腫瘤細(xì)胞膜上，而且這種錨定具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。
2、與本發(fā)明融合蛋白對(duì)小鼠腫瘤的免疫治療作用的比較(1)方法于8周齡BALB/C-Nu裸鼠的左后肢背部皮下注射1×106個(gè)活HepG2細(xì)胞，體積為100μl。第4d，將荷瘤BALB/C-Nu裸鼠隨機(jī)分為3組(組與組之間按照腫瘤體積的大小配對(duì)，以盡可能地減小個(gè)體差異帶來的系統(tǒng)誤差)，每組3只，第1d，3d，6d，9d按分組分別于小鼠右后肢皮下注射相應(yīng)制劑。分組(1)絲裂霉素滅活的HepG2細(xì)胞組(空白對(duì)照組)100μl的1×106個(gè)HepG2細(xì)胞；(2)絲裂霉素滅活的HepG2/GPI-B7_1組(GPI-B7_1組)100μl的1×106個(gè)HepG2/GPI-B7_1腫瘤疫苗細(xì)胞；(3)絲裂霉素滅活的本發(fā)明疫苗組(本發(fā)明組，制備方法見實(shí)施例2)100μl的1×106個(gè)本發(fā)明腫瘤疫苗細(xì)胞；注射腫瘤疫苗后，每天觀察腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài)。每3d用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄各組荷瘤裸鼠瘤體的長(zhǎng)短徑，計(jì)算瘤體的體積(體積＝0.5×長(zhǎng)徑×短徑2)。
(2)結(jié)果如表5所示，本發(fā)明組和GPI-B7_1組的腫瘤增長(zhǎng)速度均比空白對(duì)照組的慢，可見本發(fā)明腫瘤疫苗和HepG2/GPI-B7_1均能抑制腫瘤的增長(zhǎng)，但是本發(fā)明腫瘤疫苗對(duì)腫瘤增長(zhǎng)的抑制作用明顯高于HepG2/GPI-B7_1，證明本發(fā)明腫瘤疫苗具有更高的抗腫瘤活性。
表5 兩種腫瘤疫苗對(duì)小鼠腫瘤的免疫治療作用的比較

注分組之間F＝801.801，P＝0.000；進(jìn)一步組間LSD兩兩比較顯示空白對(duì)照組-陰性對(duì)照組P＝0.011；空白對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組P＝0.000；陰性對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組P＝0.037；時(shí)間點(diǎn)之間F＝1206.107，P＝0.000。
綜上所述，用經(jīng)過絲裂霉素滅活的本發(fā)明腫瘤疫苗刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞后，脾淋巴細(xì)胞增殖能力、IL-2和IFN-γ、CTL的水平均明顯提高，且經(jīng)過絲裂霉素滅活的本發(fā)明腫瘤疫苗治療過的裸鼠腫瘤體積增長(zhǎng)速度減慢，這些結(jié)果均提示本發(fā)明腫瘤疫苗能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，減慢腫瘤的生長(zhǎng)速度，具有很高的抗腫瘤活性。
SEQUENCE LISTING<110>南方醫(yī)科大學(xué)<120>一種人糖基磷脂酰肌醇-CD80融合蛋白<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>277<212>PRT<213>人工序列<400>1Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr1 5 10 15Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys20 25 30Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu35 40 45Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile50 55 60Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp65 70 75 80Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr85 90 95Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly100 105 110
Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg115 120 125Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr130 135 140Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile145 150155 160Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu165 l70 175Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp180 185 190Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met195 200 205Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg210 215 220Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro225 230 235 240Asp Thr Thr Cys Ile Pro Ser Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala245 250 255Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr260 265 270Met Asn Gly Ile Leu275<210>2
<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2agcaggcttg gaaggagt 18<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3ggttgtatca ggaaaatgc 19<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4cctgatacaa cctgtatccc aag 23<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5tccgcactcg agcagaatac cat 2權(quán)利要求
1.一種人糖基磷脂酰肌醇-CD80融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列為SEQ NO.1。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的人糖基磷脂酰肌醇-CD80融合蛋白的真核表達(dá)載體，該表達(dá)載體由以下方法制備得到(1)用引物P1、P2，PCR擴(kuò)增CD80基因的胞外段，引物P3、P4 PCR擴(kuò)增CD58基因的GPI信號(hào)序列，其中，引物P1AGCAGGCTTGGAAGGAGT，引物P2GGTTGTATCAGGAAAATGC，引物P3CCTGATACAACCTGTATCCCAAG，引物P4TCCGCACTCGAGCAGAATACCAT；(2)利用重疊延伸PCR技術(shù)將兩片段連接起來，反應(yīng)體系總體積50μl，其中pfuMasterMix 24μl，引物P1 0.4μM，引物P4 0.4μM，CD80胞外段0.04ng/μl，CD58基因的GPI信號(hào)段0.04ng/μl，其余為ddH2O；反應(yīng)循環(huán)的設(shè)置94℃，2min； 72℃，10mim；(3)將步驟(2)得到的PCR產(chǎn)物連入T載體，再NspV和XhoI 37℃酶切2h，然后將含編碼蛋白SEQ NO.1的片段連接于真核表達(dá)載體pReciever-M10，即得。
3.權(quán)利要求1所述的人糖基磷脂酰肌醇-CD80融合蛋白在制備腫瘤疫苗中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求3所述的人糖基磷脂酰肌醇-CD80融合蛋白在制備腫瘤疫苗中的應(yīng)用，其中腫瘤疫苗的制備方法由以下步驟組成a.腫瘤細(xì)胞樣本的處理取新鮮腫瘤組織剪碎并反復(fù)研磨后懸浮于保存液內(nèi)，200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾制備成單細(xì)胞懸液，保存液為新鮮配置的含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基。b.腫瘤細(xì)胞與GPI-CD80融合蛋白共孵育用PBS緩沖液洗腫瘤細(xì)胞3遍，重懸于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，使腫瘤細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，加入本發(fā)明GPI-CD80融合蛋白，調(diào)整終濃度為10μg/ml，37℃孵育4h并間斷振蕩；PBS緩沖液洗3遍后加入絲裂霉素使其終濃度為100μg/ml，37℃，5％CO2溫育1h滅活，即可。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人糖基磷脂酰肌醇－CD80融合蛋白，該融合蛋白的的氨基酸序列為SEQNO.1，其人糖基磷脂酰肌醇信號(hào)肽來源于人CD58，能穩(wěn)定地錨定于腫瘤細(xì)胞表面。該融合蛋白錨定于腫瘤細(xì)胞表面后能促使脾淋巴細(xì)胞增殖以及IL－2和IFN－γ、CTL的分泌，可作為腫瘤疫苗用于腫瘤的治療。
文檔編號(hào)A61K39/00GK101067001SQ20071002841
公開日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月5日
發(fā)明者林敬明, 劉煜, 張雪 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)