專利名稱：編碼抗肌萎縮蛋白小基因的dna序列及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及保留了全長抗肌萎縮蛋白基因基本生物功能的新抗肌萎縮蛋白小基因，并涉及使用該新抗肌萎縮蛋白小基因對哺乳動物受試者的迪謝納肌營養(yǎng)不良(DMD)和貝克肌營養(yǎng)不良(BMD)進行治療的方法。
抗肌萎縮蛋白為具有3685個氨基酸(aa)的巨大棒狀蛋白質，其定位于肌細胞膜內表面的下面(Watkins，S.C.等，自然333，863-866 )。它通過四個主要的結構域起作用N-末端結構域(1-756aa)、中央棒狀結構域(757-3122aa)、富含半胱氨酸(CR)的結構域(3123-3409aa)和遠端的C-末端結構域(3410-3685aa)。N-末端結構域與細胞骨架結構的F-肌動蛋白結合，而CR結構域與遠端的C-末端結構域一同通過抗肌萎縮蛋白相關蛋白(DAP)復合體錨定于細胞膜，這樣抗肌萎縮蛋白交聯(lián)并穩(wěn)定肌細胞膜和細胞骨架。中央棒狀結構域含有24個三股螺旋棒狀重復序列(R1-R24)和4個鉸合部(H1-H4)。每一重復序列長約109aa。(Koenig等，生物化學雜志(J Biol Chem)265，4560-4566 )。認為中央棒狀結構域在肌肉收縮期間起“減震器”的作用?？辜∥s蛋白交聯(lián)并穩(wěn)定肌肉細胞膜和細胞骨架。功能性抗肌萎縮蛋白的缺乏導致DAP復合體的失去并引起肌纖維質膜的不穩(wěn)定性。這些缺陷接下來導致慢性肌肉損害和退化性病理現(xiàn)象。
絕大多數(shù)DMD突變?yōu)槠茐牧丝辜∥s蛋白mRNA閱讀框或導入了提前結束蛋白質翻譯的終止密碼子(Monaco等，基因組學(Genomics)2，90-95 )。該疾病的較不嚴重等位形式為貝克肌營養(yǎng)不良(BMD)，抗肌萎縮蛋白基因的突變通常為保留了mRNA閱讀框。這樣，對BMD患者而言，合成了一些功能性基因產物，但量和/或質減少，導致較輕的表型(Hoffman等，新英格蘭醫(yī)學雜志(N.Engl.J.Med.)318，1363-1368 )。
mdx小鼠(Bulfield等，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81，1189-1192 )為DMD的動物模型。mdx抗肌萎縮蛋白基因中的遺傳損壞為在mRNA的堿基3185處的無義突變，這引起翻譯在外顯子23內的提前終止。該無義突變排除了功能性蛋白質的合成。
由于對DMD缺乏有效的治療，人們積極探索了一些新的遺傳方法，包括細胞治療和基因治療。但成肌細胞移植的臨床試驗并不成功，這是因為移植細胞的存活性差(Gussoni等，自然醫(yī)學(Nature Med)3，970-977 )。最近報道了用慶大霉素處理mdx小鼠導致對抗肌萎縮蛋白基因中提前終止密碼子的抑制，并導致接下來表達功能性抗肌萎縮蛋白且將其定位至細胞膜(Barton-Davis等，臨床研究雜志(J Clin Invest.)104，375-381 )。這種治療對高達15％的DMD患者證明是有效的。
體細胞基因轉移提供了一種新的置換缺陷抗肌萎縮蛋白基因的方法。用于將編碼基因產物的遺傳物質導入器官或組織的一種優(yōu)選方法是使用病毒載體。在這種情況下，將編碼基因產物的遺傳物質插入病毒基因組(或部分的病毒基因組)。指導基因產物表達的調控元件可與遺傳物質一起插入病毒基因組(即與基因連接插入病毒基因組)，或指導基因產物表達的調控元件可由病毒基因組自身提供，如逆轉錄病毒長末端重復序列(LTR)或腺伴隨病毒(AAV)末端反向重復序列(ITR)。用病毒載體感染細胞的優(yōu)點在于病毒載體編碼的分子(如由包含在病毒載體內的cDNA編碼的分子)可在已攝入了病毒載體核酸的細胞中有效表達，且病毒載體系統(tǒng)可在體內使用。在下面的子部分中分別描述了不同的病毒載體。
1.腺病毒載體可對腺病毒基因組進行操作，使其編碼并表達目標基因產物且喪失在正常裂解性病毒生活周期中復制的能力(Curiel，紐約科學院紀事(Ann N Y Acad Sci)886，158-71 )。來自腺病毒Ad5型dl324毒株或其它腺病毒(如Ad2，Ad3，Ad7等)毒株的合適腺病毒載體為本領域技術人員熟知。重組腺病毒是有利的，因為它們不需要分裂的細胞而成為有效的基因遞送載體，且可用于感染大量的細胞類型，包括呼吸道上皮細胞、內皮細胞和肌細胞。另外，導入的腺病毒DNA(以及其中含有的外源DNA)不整合入宿主細胞的基因組并仍為游離的，因此避免了當導入的DNA在整合入宿主基因組(例如逆病毒DNA)時由于插入誘變而可引發(fā)的潛在問題。
而且，腺病毒基因組攜帶外源DNA的容量相對于其它基因遞送載體要大(高達8千個堿基)(Haj-Ahmand等，病毒學雜志(J.Virol.)57，267-273 )。目前使用的大多數(shù)復制缺陷型腺病毒載體為缺失了全部或部分的病毒E1和E3基因，但保留了多達80％的腺病毒遺傳物質。Kochanek等和Chamberlain等也描述了缺失全部病毒編碼區(qū)的腺病毒載體(美國專利號5,985,846和美國專利號6,083,750)。
已在營養(yǎng)不良的動物模型中成功測試了腺病毒載體(Ragot等，自然361，647-50 ；Howell等，人類基因治療(Hum Gene Ther)9，629-34 )。但腺病毒載體的免疫原性和不能感染成熟肌細胞仍是其在可安全用于人之前有待克服的主要障礙。
2.單純皰疹病毒(HSV)載體HSV載體的主要特征在于它有非常大的包裝容量，它通常是復制缺陷的且不整合入宿主基因組。HSV感染神經系統(tǒng)的細胞(Fink等，神經科學年鑒(Annu Rev Neurosci)19，265-287， )。該病毒含有80多種基因，可替換其中之一(IE3)以產生HSV載體。產生缺失了許多立即早期基因產物的HSV載體可導致載體的毒性和抗原性降低且體內表達時間延長。但這些改變也導致較低的病毒產量。美國專利號5,661,033中描述了HSV載體的構建。
3.逆轉錄病毒載體對缺陷的逆轉錄病毒為用于基因治療目的而在基因轉移中的用途進行了充分描述(Miller AD，血液(Blood)76，271-278 )。逆轉錄病毒科成員的特點在于在它們的毒粒中存在逆轉錄酶。在該科中包括一些屬，包括Cisternavirus A、腫瘤病毒A、腫瘤病毒B、腫瘤病毒C、腫瘤病毒D、慢病毒和泡沫病毒。
重組逆轉錄病毒可通過將編碼目標基因產物的核酸插入逆轉錄病毒基因組而構建。另外，可去除部分的逆轉錄病毒基因組，使逆轉錄病毒復制缺陷。然后將復制缺陷的逆轉錄病毒包裝入毒粒，毒粒再通過標準技術使用輔助病毒可感染靶細胞。在“最新分子生物學方法(Current Protocols inMolecular Biology)，Ausubel，F(xiàn).M.等(編輯)Greene Publishing Associates，(1989)，第9.10-9.14部分”和其它標準實驗手冊中可找到產生重組逆轉錄病毒的方法及用此類病毒體外或體內感染細胞的方法。合適的逆轉錄病毒載體的實例包括為本領域技術人員熟知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。合適的包裝病毒細胞系的實例包括.psi.Crip、.psi.Cre、.psi.2和.psi.Am。
逆轉錄病毒已被用于在體內和/或體外將多種基因導入許多種不同的細胞類型，包括上皮細胞、內皮細胞、淋巴細胞、成肌細胞、肝細胞及造血干細胞(美國專利號4,868,116；美國專利號5,449,614和美國專利號6,207,455)。逆轉錄病毒載體需要靶細胞分裂，以便整合入宿主細胞的基因組，從而將核酸穩(wěn)定導入細胞。因此，刺激靶細胞復制是必需的。已報道了在間接體內法中用逆轉錄病毒載體對造血干細胞或祖細胞的成功轉導。但重組逆轉錄病毒載體只能容納約8kb至10kb的外源DNA。此包裝容量也限制了它在DMD遺傳治療中的用途。
4.慢病毒載體慢病毒也屬于逆轉錄病毒科，但它們可感染分裂及非分裂細胞。最為人們所知的慢病毒為人免疫缺陷病毒(HIV)，其已被滅活并被開發(fā)為用于體內基因遞送的載體。像簡單的逆轉錄病毒一樣，HIV具有稱為gag、pol和env的三種基因，它也攜帶有六種輔助蛋白的基因，稱為tat、rev、vpr、vpu、nef和vif。用逆轉錄病毒載體作為樣板，已制備了慢病毒載體，其中轉基因位于LTRs和包裝序列之間(Naldni等，科學(Science)272，263-267 )?？扇コ糠值妮o助蛋白同時不影響載體的產生或感染效率。
當慢病毒載體注射入嚙齒動物腦、肝臟、肌肉、眼或胰島細胞時，它們可持續(xù)表達六個月以上。人們對與慢病毒載體相關的可能存在的免疫問題知之甚少。而且似乎沒有強的抗體反應。關于慢病毒載體的主要擔心是它在人類應用時的安全性。但是最近對在病毒基因中具更多缺失以及安全性改善的第三代慢病毒載體的研發(fā)使得慢病毒載體可廣泛用于體內基因治療。
5.腺伴隨病毒(AAV)載體AAV是一種天然存在的缺陷病毒，它需要另一種病毒如腺病毒或皰疹病毒作為有效復制和生產性生活周期的輔助病毒(Muzyczka等，微生物學和免疫學的最新專題(Curr.Topics in Micro.and Immunol.)158，97-129 )。AAV載體是僅有的一種基于非致病的且復制缺陷病毒的病毒載體體系。它也是少有的幾種可將其DNA整合入非分裂細胞并表現(xiàn)高頻率穩(wěn)定整合的病毒之一(Flotte等，美國呼吸細胞分子生物學雜志(Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.)7，349-356 ；Samulski等，病毒學雜志63，3822-3828 )?？砂b含有小至300個堿基對的AAVDNA的載體。
AAV載體已成功地用于在體內大量的組織中建立高效和長期的基因表達，且無明顯的免疫反應或毒性(Xiao等，病毒學雜志70，8098-108 ；Kessler等，美國國家科學院院報93，14082-7 ；Xiao等，病毒學雜志72，10222-6 )。不像其它的病毒載體，AAV因其具有小的病毒顆粒大小(20nm)而易于越過胞外屏障，它有利于對不同成熟期肌纖維進行有效轉導(Pruchnic等，人類基因治療11，521-36 )。AAV也可通過血管遞送至大量的肌肉群(Greelish等，自然醫(yī)學5，439-443 )?？涨暗母咝Ш桶踩詫е氯藗儗AV介導的遺傳性肌肉疾病和代謝性疾病的基因治療的興趣增加。而AAV載體應用的主要障礙在于它有限的包裝容量，其僅可包裝小于4.7kb的基因(Song等，美國國家科學院院報95，14384-8 ；Kay等，自然遺傳學(Nat Genet)24，257-261 )，因而排除了像抗肌萎縮蛋白那樣具有14kb cDNA的大基因。
可用于本發(fā)明的其它病毒載體體系來自痘苗病毒(Chen等，免疫治療雜志(J Immunother)24，46-57 )以及一些RNA病毒。正在研發(fā)將正鏈RNA病毒科如脊髓灰質炎病毒(Bledsoe等，自然生物技術(NatBiotechnol.)18，964-9 )、肝炎病毒A(Romano G.干細胞(StemCells)18，19-39 )和辛德畢斯病毒(Wahlfors等，基因治療(GeneTher)7，472-80 )在病毒感染后或用非病毒體系遞送核酸后，用于高水平的基因表達。這些病毒表達可特異性復制病毒RNA的復制酶蛋白質。通過插入轉基因而取代病毒的衣殼基因，可產生在細胞中自主復制的嵌合RNA，并從RNA的正編碼鏈高水平表達蛋白質。這些病毒載體非常適用于免疫策略，后者需要高的、瞬時基因表達，以誘導對被轉導細胞的免疫反應。
除了病毒基因轉移載體外，在過去的幾年中，有效的非病毒基因轉移載體也變得可臨床應用(Ropert等，巴西醫(yī)學生物學研究雜志(Braz J MedBiol Res.)32，163-9 ；Lee RJ等，治療用藥物載體體系的關鍵性評論(Crit Rev Ther Drug Carrier Syst)14，173-206 )。這些載體依賴哺乳動物細胞使用的大分子攝入和胞內轉運的正常機制來將遺傳物質遞送入細胞。這些載體包括陽離子和其它脂質體、DNA-病毒結合物、RNA/DNA寡核苷酸以及令人吃驚地為裸DNA分子。物理方法如基于流體力學和基于電穿孔的方法已用于提高一些非病毒載體的基因轉移效率(Zhang G等，基因治療7，1344-9 ；Yamashita等，癌研究(Cancer Res.)61，1005-12 )。最近，也報道了用與人免疫缺陷病毒TAT蛋白質的蛋白轉導結構域融合的β-半乳糖苷酶腹膜內注射導致該融合蛋白質遞送至小鼠的所有組織(Schwarze等，科學3，1569-1572 )。
已嘗試了用攜帶抗肌萎縮蛋白基因的非病毒載體進行體細胞基因轉移[Acsadi等，自然352，815-818 ；Rando等，美國國家科學院院報97，5363-5368 ]。所獲得的轉基因表達只有非常有限的效率。
以前對產生較全長抗肌萎縮蛋白的1/2短的抗肌萎縮蛋白小基因的嘗試未能保留基本的保護功能。Cox等和Greenberg等報道了在抗肌萎縮蛋白缺陷mdx小鼠的骨骼肌中Dp71的表達使其恢復了正常水平的抗肌萎縮蛋白相關蛋白(DAPs)，其中所述Dp71為抗肌萎縮蛋白基因的一種71kD非肌肉產物，其由抗肌萎縮蛋白的富含半胱氨酸和C-末端結構域(外顯子63-79)組成。但是Dp71的表達不能減輕肌肉退化的癥狀[Cox等，自然遺傳學8，333-339 ；Greenburg等，自然遺傳學8，340-344 ]。同樣地，Yuasa等(Yuasa等，歐洲生物化學會聯(lián)合會快報(FEBS Lett)425，329-336 ；Yamamoto等，人類基因治療11，669-80 )顯示在小鼠骨骼肌中具有完整N-和C-末端結構域以及1至3中央棒狀重復序列的抗肌萎縮蛋白小基因的表達足以恢復DAP復合體，但不足以恢復肌纖維形態(tài)和防止營養(yǎng)不良的病理現(xiàn)象。
圖2a示出了用構建體AAV-MCK-Δ3849或AAV-MCK-Δ3990處理后第3個月對mdx小鼠的腓腸肌中抗肌萎縮蛋白和DAP復合體的免疫熒光(IF)分析。
圖2b示出了對來自15周齡正常C57/B10小鼠、來自用載體AAV-MCK-Δ3849、AAV-MCK-Δ3990或AAV-MCK-Δ4173處理的mdx小鼠或來自未處理的mdx小鼠的腓腸肌中抗肌萎縮蛋白和DAP復合體的IF分析。
圖3a示出了用AAV-MCKΔ3849處理10日齡mdx小鼠，小抗肌萎縮蛋白的表達。動物在病毒感染后的6個月處死。
圖3b示出了在未處理的6月齡mdx小鼠中抗肌萎縮蛋白的表達。
圖3c示出了用AAV-MCKΔ3849處理成年mdx小鼠，小抗肌萎縮蛋白的表達。動物在病毒感染后的2個月處死。
圖3d示出了用AAV-MCKΔ3990處理成年mdx小鼠，小抗肌萎縮蛋白的表達。動物在病毒感染后的2個月處死。
圖3e示出了用AAV-MCKΔ3849處理成年mdx小鼠，小抗肌萎縮蛋白的表達。動物在病毒感染后的4個月處死。
圖3f示出了用AAV-MCKΔ3990處理成年mdx小鼠，小抗肌萎縮蛋白的表達。動物在病毒感染后的4個月處死。
圖3g示出了用AAV-MCKΔ3849處理成年mdx小鼠，小抗肌萎縮蛋白的表達。動物在病毒感染后的6個月處死。
圖3h示出了用AAV-MCKΔ3990處理成年mdx小鼠，小抗肌萎縮蛋白的表達。動物在病毒感染后的6個月處死。
圖4a示出了處理10日齡mdx小鼠，抗肌萎縮蛋白小基因對肌肉質膜完整性的保護。
圖4b示出了處理成年mdx小鼠，抗肌萎縮蛋白小基因對肌肉質膜完整性的保護。
圖5a示出了含有兩個棒(棒1和棒24，見

圖1)的構建體Δ2796的小抗肌萎縮蛋白表達的IF分析。注意在它注入年幼的mdx小鼠后肌細胞形態(tài)學和中央成核現(xiàn)象未改善。
圖5b示出了來自含有一個棒(棒1和棒24的雜合棒，見圖1和Yuasa等)的構建體CMV-M3的小抗肌萎縮蛋白表達的IF分析。注意在它注入年幼的mdx小鼠后肌細胞形態(tài)學和中央成核現(xiàn)象未改善。
圖6示出了在AAV-MCK-Δ3990載體注射入成年mdx小鼠的TA肌后，肌肉力量的改善。對未處理的mdx TA肌(n＝8)進行10個循環(huán)的拉長活化后，只有23％的力輸出保留，而AAV處理的mdx TA肌(n＝8)具有近40％的力輸出保留。
發(fā)明詳述及優(yōu)選的實施方案除非另外指出，本發(fā)明的操作規(guī)程采用本領域內組織學、病毒學、微生物學、免疫學和分子生物學的常規(guī)方法進行。此類技術在文獻中有充分解釋。上文或下文中引用的所有出版物、專利和專利申請全部并入作為本文的參考。
如在本說明書和所附的權利要求書中所用，單數(shù)形式的″a″、″an″和″the″包括復數(shù)形式，除非內容明確指出并非如此。
A.定義在描述本發(fā)明時，將用到以下一些術語，下面將對這些術語進行定義。
“基因轉移”或“基因遞送”指的是可靠地將特定的核苷酸序列(如DNA)導入靶細胞的方法或體系。導入的核苷酸序列在體內可以游離形式存在，或整合入靶細胞的基因組中?；蜣D移提供了一種治療獲得性疾病和遺傳性疾病的獨特方法，本領域已開發(fā)了許多體系用于將基因轉移入哺乳動物細胞。參見例如美國專利號5,399,346。
如此處所用，術語“有效量”指的是通過本發(fā)明的方法，在所感染的器官或組織至少可引起部分所希望的治療或預防效果的感染水平。這樣用有效量的攜帶目標遺傳物質的載體感染可導致用本發(fā)明方法感染的器官或組織中細胞活性的改變(如表型改變)。在一個優(yōu)選的實施方案中，用有效量的攜帶目標遺傳物質的載體感染導致了受感染器官或組織的顯著量的細胞中細胞活性的改變。
基因轉移“載體”指的是可將基因序列轉移入細胞的任一介質，如質粒、噬菌體、轉座子、粘粒、染色體、脂質體、DNA-病毒結合物、RNA/DNA寡核苷酸、病毒、細菌等。這樣，該術語包括克隆載體和表達載體，以及病毒載體和非病毒載體。通過將靶分子連接至載體，可使載體靶向特異的細胞。靶分子是對目標細胞或組織類型具特異性的任一介質，包括如配體、抗體、糖、受體或其它結合分子。本發(fā)明也包括起同等作用以及今后為本領域所知的此類其它載體形式。
“AAV載體”指來自一種腺伴隨病毒血清型的載體以及來自多于一種AAV血清型的載體(雜合AAV載體)，其中所述腺伴隨病毒血清型包括人AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、禽AAV、綿羊AAV等。例如，雜合AAV載體可包括來自AAV-1和AAV-2的DNA序列。AAV載體可為將一種或多種AAV野生型基因優(yōu)選地為rep和/或cap基因全部或部分刪除，但保留了功能性的側翼ITR序列。AAV載體可通過本領域公知的重組技術構建，以包含一段或多段在兩端(5’和3’)側翼具有功能性AAV ITRs的異源核苷酸序列。在操作本發(fā)明時，AAV載體可包括位于異源核苷酸序列上游的至少一個AAV ITR和一個合適的啟動子序列，以及位于異源序列下游的至少一個AAV ITR。
“重組AAV載體質粒”指一類重組AAV載體，其中載體包含質粒。它通常和AAV載體一樣，5’和3’ITRs在所選擇的異源核苷酸序列側翼。AAV載體也可包含轉錄序列(如聚腺苷酸化位點)和選擇性標記基因和報告基因、增強子序列，以及其它誘導轉錄的調控元件。這些控制元件將在下面更充分地描述。另外，“AAV載體”可被穩(wěn)定導入一株或多株細胞系以產生病毒顆粒。這樣的細胞系通常被稱為AAV包裝細胞系。
在此用到的術語“重組AAV”、“重組AAV顆?！被颉爸亟MAAV毒粒”定義為感染性的復制缺陷病毒，它由AAV蛋白外殼包裹(即外被以蛋白衣殼)一段異源核苷酸序列組成，該序列5’和3’側翼同樣也為AAV ITRs。關于這一點，單鏈AAV核酸分子(不論是有義/編碼鏈還是反義/反編碼鏈，如它們通常被定義的那樣)可被包裝入AAV毒粒；有義鏈和反義鏈同樣具有感染性。當重組AAV DNA等于或小于病毒基因組全長的50％(約5,000個核苷酸)時，它能以雙鏈發(fā)夾狀DNA的形式包裝入AAV毒粒。這樣的顆粒也完全具有感染性。
術語“重組AAV顆?！被颉爸亟MAAV毒?！币仓高@樣的雜合AAV顆粒，其中AAV蛋白外殼和被包裹的核苷酸序列可來自不同血清型的AAV。例如，雜合AAV顆?？珊蠥AV-1衣殼蛋白和AAV-2 ITRs，或者反之亦然。也可用來自兩種或更多的AAV衣殼蛋白基因編碼序列來產生雜合的AAV衣殼蛋白。另外，通過氨基酸序列的突變、缺失和/或插入可對重組AAV的衣殼蛋白進行操作，以改變重組AAV的向性(Wu等，病毒學雜志74，8635-47 ；Girod等，自然醫(yī)學5，1052-1056 )。
一些構建重組AAV的技術為本領域所公知。參見例如美國專利號5,173,414，Lebkowski等，分子細胞生物學(Mol Cell Biol)8，3988-3996 ；Carter BJ，生物技術中的最新觀點(Current Opinion inBiotechnology)3，533-539 ；Muzyczka N，同上；和Zhou等，實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med.)179，1867-1875 ；Xiao等，病毒學雜志72，2224-32 。
術語“表達調控元件”或“調節(jié)元件”總起來說是指啟動子序列、聚腺苷酸化信號、轉錄終止序列、上游調控結構域、復制起點、內部核糖體進入位點(“IRES”)、增強子等，它們在受體細胞中共同提供編碼序列的復制、轉錄和翻譯。只要所選的編碼序列在合適的宿主細胞中能夠被復制、轉錄和翻譯，就并不總是需要存在所有的這些調控元件。這里用到的術語“啟動子”通常指的是能夠被RNA聚合酶識別、結合并起始轉錄的一段DNA調控序列。另外，啟動子包含調節(jié)RNA聚合酶識別、結合和轉錄起始活性的序列。此類序列可為順式作用序列或可對反式作用因子起反應。依據(jù)啟動子的調節(jié)特性，它們可為組成型或調節(jié)型啟動子。啟動子的實例有SP6、T4、T7、SV40早期啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、小鼠乳房瘤病毒(MMTV)類固醇誘導的啟動子、莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、肌球蛋白啟動子、α-肌動蛋白啟動子等。另外，以上啟動子的經修飾變體以及甚至合成的肌肉啟動子(Li等，自然生物技術17,241-245， )也包括在內。最后，啟動子也可以是內源AAV啟動子或AAV末端反向重復序列(ITR)。
術語“轉導”指在體內或體外用復制缺陷病毒載體，如用重組AAV毒粒，將DNA分子遞送入受體細胞。
術語“肌細胞”或“組織”指來自肌肉的細胞或細胞群，它包括但不限于來自骨骼肌、心肌、平滑肌(如來自消化道、膀胱和血管)的細胞或組織。本術語包括體外和體內的肌細胞。因此，例如分離的心肌細胞構成本發(fā)明的“肌細胞”，存在于受試對象體內肌肉組織中的肌細胞也構成本發(fā)明的“肌細胞”。本術語也包括分化及未分化肌細胞，如肌原細胞、肌管、成肌細胞、心肌細胞、成心肌細胞和祖細胞，其中所述祖細胞如經分化后可成為肌細胞的肌源性干細胞或骨髓源性干細胞。
“可操作地連接”指的是元件的排列，其中所描述的組分以行使它們通常功能的方式排列。因此可操作地連接至編碼序列的調控元件能影響編碼序列的表達。調控元件不必與編碼序列相鄰，只要這些調控元件能起到指導編碼序列表達的作用即可。這樣，例如在啟動子序列和編碼序列之間可存在插入的不被翻譯但可轉錄的序列，且仍認為啟動子序列為“可操作地連接”至編碼序列。
術語“抗肌萎縮蛋白小基因”是指大范圍刪除了人類抗肌萎縮蛋白cDNA中央棒狀結構域和大范圍刪除了C-末端結構域而產生的新抗肌萎縮蛋白構建體。此外，抗肌萎縮蛋白小基因可包含改變的N-末端結構域，其中原始的蛋白質翻譯起始密碼子ATG周圍的DNA序列被改變。這些改變的序列可增強小抗肌萎縮蛋白的合成。另外，抗肌萎縮蛋白小基因也可為雜合基因，其中一些結構域被來自utrophin或血影蛋白基因的同源結構域替代(Tinsley等，自然360，591-593 ；Koenig等，細胞(Cell)53，219-216 )。尤其是utrophin與抗肌萎縮蛋白在結構和功能上是高度同源的，因此它們的主要結構域應該是可以互換的(Tinsley等，自然384，349-353 ；Deconinck等，自然醫(yī)學3，1216-21 ；Rafael等，自然遺傳學19，79-82 )。例如，在抗肌萎縮蛋白小基因中，抗肌萎縮蛋白的N-末端和/或C-末端結構域可被utrophin的相應部分替代。同樣地，其中央棒狀結構域可由來自utrophin或血影蛋白基因的棒狀重復序列組成。抗肌萎縮蛋白小基因小于AAV病毒載體的5kb包裝極限。另外，使用與本發(fā)明所描述的構建抗肌萎縮蛋白小基因的類似方式來構建utrophin小基因也成為可能。因為一些DMD患者完全缺乏抗肌萎縮蛋白，故抗肌萎縮蛋白小基因的產物也可能為一種新抗原。將抗肌萎縮蛋白的結構域用utrophin的那些結構域替換可降低免疫應答。
術語“小抗肌萎縮蛋白”指由抗肌萎縮蛋白小基因編碼的多肽。最重要的是，小抗肌萎縮蛋白具有使肌肉免于發(fā)生營養(yǎng)不良的病理現(xiàn)象和癥狀的生物學功能。
符號“Δ”(δ)是包含有上述缺失的抗肌萎縮蛋白小基因的前綴。
“哺乳動物受試對象”指哺乳動物綱的任何成員，包括但不限于人類和非人類的靈長目動物(如黑猩猩)和其它類人猿和猴；農場動物如牛、綿羊、豬、山羊和馬；馴養(yǎng)的哺乳動物如狗和貓；實驗動物包括嚙齒類動物如小鼠、大鼠和豚鼠等。本術語不指具體的年齡和性別。這樣，不論是雄性的還是雌性的成年、新生及胎兒受試對象都含蓋在其中了。
術語“表達盒”指的是遺傳物質構建體，它包含編碼序列和足夠的在受體細胞中指導編碼序列正確轉錄和翻譯的調控信息。
B.發(fā)明詳述為了探究用病毒載體作為DMD基因治療的可行性，我們設計了產生新抗肌萎縮蛋白小基因的策略，其中所述抗肌萎縮蛋白小基因足夠小，以至于可被包裝入逆轉錄病毒或AAV載體，且仍保留了保護肌肉免于病理癥狀所需的基本功能。我們已產生了這樣的小基因，其刪除了高達75％的中央棒狀結構域(24個棒中的20個；4個鉸合部中的2個)以及幾乎所有的C-末端結構域(外顯子71-78)(圖1)。這些新抗肌萎縮蛋白小基因只有11kb全長抗肌萎縮蛋白編碼序列的三分之一(1/3)，明顯小于廣泛用于mdx小鼠的轉基因和基因治療研究的6.3kb貝克-型小抗肌萎縮蛋白基因(England等，自然343，180-2 )。該小基因包含抗肌萎縮蛋白基因的N-末端序列、抗肌萎縮蛋白基因的C-末端富含半胱氨酸(CR)結構域、抗肌萎縮蛋白基因的至少H1和H4以及至少4個棒狀重復序列。棒狀重復序列可選自抗肌萎縮蛋白、utrophin或血影蛋白基因的棒狀重復序列，優(yōu)選地選自抗肌萎縮蛋白基因的24個棒狀重復序列，且最優(yōu)選地選自抗肌萎縮蛋白基因的R1、R2、R3、R22、R23和R24棒狀重復序列?？筛淖兛辜∥s蛋白小基因的N-末端，以提高表達效率且不影響基因產物的功能。例如原來在抗肌萎縮蛋白基因翻譯起始ATG密碼子周圍的序列可用Kozak序列替換，以增加蛋白質合成的效率。在本發(fā)明的一個實施方案中，在編碼序列上游的三個核苷酸可由“AAA”變?yōu)椤癈CA”且編碼序列中的第四個核苷酸可由“C”變?yōu)椤癎”。此外N-末端的一部分或全部可由utrophin基因的對應部分替換。同樣，抗肌萎縮蛋白小基因的CR結構域也可用utrophin基因的對應部分替換。
可用多種方法將抗肌萎縮蛋白小基因導入哺乳動物受試對象?？捎没虿挥没诹黧w動力學的方法或基于電穿孔的方法，將在表達盒中的該基因以裸DNA形式導入受試對象?？捎梅遣《据d體如脂質體或病毒-脂質體復合體，或用病毒載體如腺病毒、HSV、桿狀病毒、逆轉錄病毒、慢病毒且優(yōu)選地用AAV，將該基因導入受試對象?？辜∥s蛋白小基因的表達可受一系列調控元件的調控，后者包括但不限于AAV末端反向重復序列(ITR)、逆轉錄病毒長末端重復序列(LTR)、巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子和/或增強子、CMV增強子和小雞β-肌動蛋白啟動子(CB啟動子)、α-肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、肌肉特異的肌酸激酶(MCK)啟動子和/或增強子等。另外，也可使用上述啟動子的修飾變體和合成的肌肉啟動子(Li等，同上)等。
可用免疫熒光染色和免疫印跡(Western印跡)來檢測抗肌萎縮蛋白小基因的表達。該小抗肌萎縮蛋白的功能可通過測定小抗肌萎縮蛋白是否可在肌纖維質膜上恢復失去的DAP復合體(包括肌聚糖復合體)來檢測，其中所述肌聚糖復合體在未經治療的由于原發(fā)性抗肌萎縮蛋白缺陷而引起的營養(yǎng)不良肌肉中未發(fā)現(xiàn)。為了進一步研究新的小抗肌萎縮蛋白的功能，必須證實它們可保護肌肉免于病理表型。在mdx小鼠中病理變化開始于大約三周齡時，此時出現(xiàn)明顯的肌纖維的退化/再生。此過程的特點在于在肌纖維中出現(xiàn)中央核，這是肌營養(yǎng)不良的初級病理征象?；蛑委熀笾醒氤珊爽F(xiàn)象的消失或減少說明治療是成功的。肌纖維中核的位置可由DAPI染色或H&E染色確定。
可用來自Vector Laboratories(Burlingame，CA)的Mouse-on-MouseKit，除了冷凍切片可立即用封閉緩沖液處理而無需固定步驟外，按照廠商提供的方法對厚度為8μm的肌肉冷凍切片進行免疫熒光染色，(Li等，基因治療(Gene Ther)6，74-82 )?？辜∥s蛋白的單克隆抗體(NCL-Dys3和NCL-Dys2)和抗α-、β-和γ-肌聚糖的單克隆抗體(NCL-α-SARC，NCL-β-SARC和NCL-γ-SARC)可購自Novocastra LaboratoriesLtd(Burlingame，CA)。肌細胞核可用0.01％DAPI(Sigma，St.Louis，MO)復染10分鐘。用Nikon TE-300熒光顯微鏡照相。
在營養(yǎng)不良的肌肉中，質膜的損傷和滲漏是其主要的生理缺陷，也是主要的病理原因。為了判斷AAV小抗肌萎縮蛋白治療是否可以有效地保護質膜免受機械損害，通過靜脈內注射伊文氏藍染料進行肌纖維膜完整性試驗。伊文氏藍是一種廣泛用于活體的紅色熒光染料，它可被正常肌纖維排除，但可被由于收縮性受損而含有營養(yǎng)不良肌纖維的滲漏細胞膜攝入。以前對mdx小鼠的研究揭示凋亡肌核主要在伊文氏藍染色陽性的肌纖維中找到，因此質膜滲漏和肌細胞凋亡相關(Matsuda等，生物化學雜志(JBiochem)(東京)118，959-64 )。
可將伊文氏藍染料(10mg/ml，PBS配制)以0.1mg/g體重注射入C57/B10小鼠、mdx小鼠和AAV載體處理的mdx小鼠尾靜脈。染料注射后，使得小鼠繼續(xù)游泳20分鐘。伊文氏藍注射后15小時，收集肌肉并冷凍切片。可在熒光顯微鏡下用羅丹明濾光片觀察伊文氏藍染色陽性的肌纖維。
對用含抗肌萎縮蛋白小基因的AAV載體處理后mdx小鼠肌收縮力的改善進行了評估。向2至3月齡的mdx小鼠脛骨前(TA)肌肉注射AAV-MCK-3990載體。注射方式為處理同一動物的一條腿，而另一條腿不處理。后者用作對照。AAV處理后6個月，mdx小鼠用戊巴比妥鈉麻醉(70mg/kg，i.p.)，并移去所有的TA肌，將TA肌置于直立組織室內用于體外進行力測量。肌肉用陰極電流的單相位矩形脈沖(持續(xù)1.0-ms)刺激(Grassmodel S-88刺激器和電流增幅器)。用遞送持續(xù)500ms的75pps刺激頻率來評估最大僵直力(P0)。測定P0后，測定TA肌在反復的拉長活化期間(這會誘發(fā)對肌肉的最大損傷)持續(xù)力產生的能力。在拉長前測定的最大力稱為PISO。接下來，以1.0L0/s的恒速將肌肉從100拉長至110％L0。刺激訓練每2分鐘重復一次(工作負載循環(huán)為0.004)，共進行10個循環(huán)。PISO的改變用于指示與由拉長活化造成的損傷相關的肌肉功能損傷。
C.優(yōu)選的實施方案下列實施例僅用于例示一些實施方案，而并不用于限制本權利要求的范圍，權利要求的范圍只受本說明的限制。
實施例1抗肌萎縮蛋白小基因和攜帶該小基因的AAV載體本實施例描述了高度截短的抗肌萎縮蛋白小基因和攜帶該小基因的AAV載體的構建。該抗肌萎縮蛋白小基因構建體主要通過PCR克隆法制備，PCR克隆法使用了Pfu聚合酶(Stratagene，CA)并以人抗肌萎縮蛋白cDNA(GenBank#NM 004006)作為模板。為了一致，核苷酸的編號只包括11,058bp抗肌萎縮蛋白的蛋白質編碼序列(SEQ ID NO1)。
如在圖1中所描述的那樣，抗肌萎縮蛋白小基因Δ4173(SEQ ID NO2)包含核苷酸1-1992(N-末端，鉸合部H1以及棒R1、R2和R3，SEQ ID NO3)和8059-10227(棒R22、R23和R24，鉸合部H4以及CR結構域，SEQ IDNO4)和11047-11058(抗肌萎縮蛋白的最后3個氨基酸，SEQ ID NO5)。
抗肌萎縮蛋白小基因Δ3990(SEQ ID NO6)包含核苷酸1-1668(N-末端，鉸合部H1以及棒R1和R2，SEQ ID NO7)、7270-7410(鉸合部H3，SEQ ID NO8)、8059-10227(棒R22、R23和R24，鉸合部H4和CR結構域，SEQ ID NO4)和11047-11058(抗肌萎縮蛋白的最后3個氨基酸，SEQID NO5)。
抗肌萎縮蛋白小基因Δ3849(SEQ ID NO9)包含核苷酸1-1668(N-末端，鉸合部H1以及棒R1和R2，SEQ ID NO7)、8059-10227(棒R22、R23和R24，鉸合部H4和CR結構域，SEQ ID NO4)和11047-11058(抗肌萎縮蛋白的最后3個氨基酸，SEQ ID NO5)。
抗肌萎縮蛋白小基因Δ3531(SEQ ID NO10)包含核苷酸1-1341(N-末端，鉸合部H1和棒R1，SEQ ID NO11)、8059-10277 (棒R22、R23和R24，鉸合部H4和CR結構域，SEQ ID NO4)和11047-11058(抗肌萎縮蛋白的最后3個氨基酸，SEQ ID NO5)。
抗肌萎縮蛋白小基因Δ3510(SEQ ID NO12)包含核苷酸1-1668(N-末端，鉸合部H1和棒R1和R2，SEQ ID NO7)、8407-10277(棒R23和R24，鉸合部H4和CR結構域，SEQ ID NO13)和11047-11058(抗肌萎縮蛋白的最后3個氨基酸，SEQ ID NO5)。
抗肌萎縮蛋白小基因Δ3447(SEQ ID NO14)包含核苷酸1-1992(N-末端，鉸合部H1以及棒R1、R2和R3，SEQ ID N03)、8794-10277(棒R24，鉸合部H4和CR結構域，SEQ ID NO15)和11047-11058(抗肌萎縮蛋白的最后3個氨基酸，SEQ ID NO5)。
通過平末端連接Pfu擴增的每一單獨片段的PCR產物而制備上述構建體，這樣所有的蛋白質編碼序列被一起精確地剪接在一個框架內。反應中用到的PCR引物列在表1中
表1抗肌萎縮蛋白片段的克隆中所用的PCR引物引物名稱 引物序列(5′-3′) 序列位置正向引物F1(ATG-A)ATTTTCACCATGGTTTGGTGGGAAGAAG 1-19(28bp) SEQ ID NO16F2(H3-1) CAGCCTGACCTAGCTCCTGGACTGA 7270-7294(25bp) SEQ ID NO17F3(R22-1)ACTCATAGATTACTGCAACAGTTCC 8059-8083(25bp) SEQ ID NO18F4(R23-1)AGTTCTGACCAGTGGAAGCG 8407-8427(20bp) SEQ ID NO19F5(R24-1)ACCCTTGAAAGACTCCAGGAAC 8794-8816(22bp) SEQ ID NO20反向引物R1(R1-2) TCTATGTAAATTGCTTTGTT 1341-1361(20bp) SEQ ID NO21R2(R2-2) GTAAAAGAACCCAGCGGTCT 1668-1644(25bp) SEQ ID NO22R3(R3-2) CTGTGCTGTACTCTTTTCAAGTTTT 1992-1968(25bp) SEQ ID NO23R4(H3-2) AGGTACCTCCAACATCAAGGAAGAT 7410-7386(25bp) SEQ ID NO24R5(Tail-2A) CTACATTGTGTCGGGAGTTTCCATGTTGTC 11058-11047 SEQ ID NO2510227-10210(30bp)然后將抗肌萎縮蛋白小基因亞克隆入包含一個MCK啟動子、一個來自質粒p(+enh206)358MCKCAT的595bp Hind III/BstE II片段(Shield等，分子細胞生物學(Mol Cell Biol)16，5058-68 )和一個60bp小polyA信號序列的AAV載體質粒(SEQ ID NO26)，產生AAV載體構建體AAV-MCK-Δ4173(SEQ ID NO27)，AAV-MCK-Δ3990(SEQ ID NO28)，AAV-MCK-Δ3849(SEQ ID NO29)，AAV-MCK-Δ3531(SEQ IDNO30)，AAV-MCK-Δ3510(SEQ ID NO31)和AAV-MCK-3447(SEQID NO32)。
同樣，也可將抗肌萎縮蛋白小基因克隆入包含一個CMV啟動子(620bp)和小polyA信號序列的AAV載體質粒(SEQ ID NO33)，產生AAV載體構建體AAV-CMV-Δ3990(SEQ ID NO34)，AAV-CMV-Δ3849(SEQID NO35)。此外，將抗肌萎縮蛋白小基因Δ3849克隆入包含一個MCK增強子、一個CMV啟動子和小polyA信號序列的AAV載體質粒，產生AAV載體構建體AAV-E-CMV-Δ3849(SEQ ID NO36)。
按照Xiao等人所描述的三質粒共轉染法精確產生重組病毒載體原液(引用同上)。接下來用以前公開的方法經CsCl密度梯度超速離心純化AAV病毒載體兩次(Snyder等，人類遺傳學最新方法(Current Protocols inHuman Genetics)，編輯Dracopoli等[John Wiley & Sons Ltd.，紐約]，12.1.1-12.2.23頁 )。病毒顆粒數(shù)的載體滴度通過DNA斑點印跡法測定(Snyder等，引用同上)，每毫升約有5×1012個基因組拷貝(GC)。
實施例2DAP復合體的恢復本實施例描述了抗肌萎縮蛋白小基因產物能否仍保留其主要的生物化學功能，其中所述主要的生物化學功能包括膜下定位和與抗肌萎縮蛋白相關蛋白(DAP)復合體的相互作用。健康C57/B10小鼠和營養(yǎng)不良mdx小鼠購自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，Maine)。將50μl(5×1010GC)不同的AAV小抗肌萎縮蛋白載體注入十日齡mdx幼鼠或50日齡mdx成鼠后腿腓腸肌。
在載體注射后第3月和第6月時，收集肌肉以評估小抗肌萎縮蛋白的表達和DAP復合體的生物化學恢復情況，其中所述DAP復合體由于抗肌萎縮蛋白的原發(fā)性缺陷而缺失。對AAV處理肌肉的薄切片上用人抗肌萎縮蛋白特異性抗體(Dys3)進行IF染色，在大多數(shù)肌纖維中顯示出廣泛的載體轉導以及小抗肌萎縮蛋白的正確膜下定位，尤其在用含有抗肌萎縮蛋白小基因Δ3849或Δ3990的AAV載體處理的肌肉中(圖2a和2b；圖3a)。如所預期的那樣，當用能夠識別小鼠和人抗肌萎縮蛋白C-末端區(qū)域的抗體(Dys2)對年齡相當?shù)慕】礐57/B10小鼠的相應肌肉進行染色時，顯示出難區(qū)分的抗肌萎縮蛋白染色模式(圖2b)。如所預期的那樣，該抗體(Dys2)不能對AAV處理的mdx肌肉染色，因為我們的抗肌萎縮蛋白小基因缺乏C-末端區(qū)域(數(shù)據(jù)未顯示)。這個結果進一步證明了小抗肌萎縮蛋白是來自AAV載體的。相一致的是，除了極少數(shù)發(fā)生體細胞回復突變的肌纖維可被Dys2抗體識別外，未處理的mdx對照肌肉顯示無抗肌萎縮蛋白染色(圖2b)。而且，用AAV小抗肌萎縮蛋白載體注射成年mdx肌肉(腓腸肌)，在注射AAV MCK載體后第2月和第4月(圖3c-3f)或注射AAV CMV載體后第6月(圖3g和3h)檢查抗肌萎縮蛋白表達時，顯示出相似的結果。重要的是，沒有針對持續(xù)表達來自AAV載體的人源性小抗肌萎縮蛋白的肌纖維進行損害的細胞毒T淋巴細胞(CTL)，無論這些AAV載體是由CMV啟動子驅動的，還是由肌肉特異性的MCK啟動子驅動的。
分別用抗α，β和γ肌聚糖的三種抗體進行免疫熒光染色，在鄰近于抗肌萎縮蛋白抗體染色處的所有連續(xù)薄切片中都顯示陽性結果。這些結果為小抗肌萎縮蛋白的生物化學功能提供了證據(jù)，它們雖缺乏C-末端結構域但仍能與DAP復合體相互作用。
實施例3營養(yǎng)不良病理學的改善本實施例顯示抗肌萎縮蛋白小基因產物可保護肌肉免于表現(xiàn)出營養(yǎng)不良的病理表型。mdx小鼠的病理現(xiàn)象開始于約三周齡時，表現(xiàn)為大量的肌纖維退化/再生。該過程的特點在于肌纖維中存在中央核，是肌肉營養(yǎng)不良的主要病理跡象?；蛑委熀笾醒氤珊爽F(xiàn)象的消失或減少表明治療是成功的。因此，我們最初選擇對出現(xiàn)中央成核現(xiàn)象前的mdx幼鼠(10日齡)檢測AAV抗肌萎縮蛋白構建體，以了解是否可預防肌肉的退化/再生。
在中央成核現(xiàn)象開始前用AAV小抗肌萎縮蛋白(包含多于兩個棒狀結構域)處理，處理后第3月和第6月時對mdx肌肉進行組織學檢查，通過抗肌萎縮蛋白免疫染色和肌核DAPI復染，可觀察到在小抗肌萎縮蛋白陽性的肌纖維中幾乎全是(～98％)外周成核現(xiàn)象(圖2a，圖2b第一列，圖3a和表2)。在載體處理的mdx肌肉中小抗肌萎縮蛋白的表達和中央成核現(xiàn)象之間的相互排斥恰好反映出正常肌肉中的情況(圖2b和表2)。另外，小抗肌萎縮蛋白表達陽性的肌纖維也顯示一致的肌纖維大小和多邊形形狀，與正常肌肉沒有明顯不同(圖2a和2b)。相反，未處理的mdx肌肉顯示出廣泛的(75.4％)中央成核現(xiàn)象(表2)及其它營養(yǎng)不良的病理征象，包括肌纖維大小的廣泛變異、圓形肌纖維和纖維化(圖2b)。值得注意的是，用構建體Δ2796和M3(分別含2個棒和1個棒，見圖1)處理的mdx肌肉除了小抗肌萎縮蛋白的IF染色陽性外顯示出與未處理的mdx肌肉相同的形態(tài)，其中小抗肌萎縮蛋白的IF染色陽性在改善肌肉形態(tài)學、病理學及預防肌肉變性/再生和中央成核現(xiàn)象方面是沒有作用的(圖5a和5b，表2)。因此，用攜帶含有兩個以上棒(見圖1)的小基因的AAV載體處理營養(yǎng)不良肌肉可預防營養(yǎng)不良病理現(xiàn)象，并在小抗肌萎縮蛋白陽性區(qū)域中導致正常的組織學形態(tài)(包括外周成核現(xiàn)象、一致的肌纖維大小和無纖維化等)。這些結果明確地證明了在mdx幼鼠中由于新的小抗肌萎縮蛋白的治療作用而使肌肉退化不存在。
我們隨后在已發(fā)生了廣泛退化/再生的成年mdx小鼠(45日齡)中對攜帶含兩個以上棒的抗肌萎縮蛋白小基因的AAV載體進行測試，以了解是否能停止或逆轉這些病理進程。在載體注射時，大多數(shù)(～75％)的肌纖維已經經歷了退化/再生，并顯示出中央成核現(xiàn)象。在AAV小抗肌萎縮蛋白注射后第2月、第4月和第6月時，觀察到廣泛的抗肌萎縮蛋白的表達，并且在抗肌萎縮蛋白陽性區(qū)域中出現(xiàn)正常的肌纖維形態(tài)和無纖維化(圖3a和3b)。相反，未處理的mdx小鼠肌肉(圖3b)或未成功進行載體基因轉移的處理肌肉區(qū)則顯示出進行性退化和纖維化。另外，在小抗肌萎縮蛋白陽性肌纖維中觀察到中央成核現(xiàn)象的減少(從載體處理前的約75％到載體處理后的35～50％，見表2)。在健康小鼠的肌肉中也觀察到了中央成核現(xiàn)象的部分逆轉，其中所述健康小鼠的肌肉曾經歷過如肌毒素處理的瞬時病理變化，大多數(shù)肌核仍保持中央定位(Martin等，肌神經(Muscle Nerve)11；588-96 )。在以攜帶全長抗肌萎縮蛋白cDNA的無功能腺病毒載體處理成年mdx肌肉后也觀察到持續(xù)存在的中央成核現(xiàn)象?；谝陨嫌^察，我們新的小抗肌萎縮蛋白基因(含兩個以上棒)在改善年幼和成年mdx肌肉營養(yǎng)不良的病理學方面顯示出治療效果。
實施例4保護肌纖維膜的完整性本實施例顯示了含兩個以上棒的小抗肌萎縮蛋白(見圖1)能夠保護肌纖維膜的完整性。最初，將伊文氏藍注射入mdx小鼠的尾靜脈，其中mdx小鼠在三個月前的幼年時間(10日齡)已用AAV載體處理。年齡相當?shù)奈刺幚韒dx小鼠和健康C57/B10小鼠用作對照。使得小鼠不停游泳20分鐘以誘生機械應力。然后收集肌肉，進行抗肌萎縮蛋白表達和伊文氏藍染料攝入的檢查。如所預料的，健康小鼠的肌肉在肌肉切片中表現(xiàn)出一致的抗肌萎縮蛋白染色且染料不被肌纖維攝取(見圖4a，第一行)。AAV載體處理的肌肉表現(xiàn)出和健康肌肉一致的結果，因此抗肌萎縮蛋白的表達與伊文氏藍染料的攝取之間相互排斥(見圖4a，第二行到第四行)。染料攝取(紅色熒光)僅僅出現(xiàn)在缺乏小抗肌萎縮蛋白表達的肌纖維中，位于未被AAV載體轉導的區(qū)域中(見圖4a，第二、三、四行)。相反，未處理的mdx肌肉顯示出抗肌萎縮蛋白的缺乏和廣泛的染料攝入(圖4a，最下行)。更重要的是，以AAV小抗肌萎縮蛋白處理成年mdx肌肉，載體注射后2個月和6個月時進行分析，在保護肌纖維免于發(fā)生質膜滲漏方面也達到了類似結果(圖4b)。這些結果明確地表明了，不論在mdx幼鼠還是在成年mdx小鼠，新的小抗肌萎縮蛋白都具有維護膜完整性和保護肌纖維免受機械損傷的生理功能。
表2.在幼年和成年mdx小鼠中AAV小抗肌萎縮蛋白基因轉移動物*載體注射時注射后％抗肌萎縮蛋白和載體n的年齡的月份陽性纖維 ％中央核**mdx+Δ3510412天 3 35～80 1.06(68/6413)mdx+Δ3531412天 3 25～40 1.72(37/2140)mdx+Δ3849410天 3 56～88 1.02(72/7098)mdx+Δ3990410天 3 50～80 0.99(56/5652)mdx+Δ4173410天 3 15～25 0.93(26/2791)mdx+Δ3849410天 6 40～60 2.80(51/1824)mdx+Δ3990210天 6 35～45 2.30(34/1478)mdx+Δ3849250天 2 35～50 34.76(510/1467)mdx+Δ3990250天 2 35～4034.18(685/2004)mdx+Δ3849450天 4 20～2544.24(615/1390)mdx+Δ3990450天 4 20～3046.18(695/1505)C57/B10 4不注射 N/A 100 1.45(56/3860)mdx 4不注射 N/A ＜1 75.4(2382/3160)mdx+Δ2796412天 3 30～4572(3888/5400)mdx+M3810～12天 3 20～6581(5589/6900)注*未處理的對照mdx和C57/B10小鼠在實驗結束時約三個月大。AAV載體由MCK啟動子驅動。
**所有這些數(shù)據(jù)均收集自免疫熒光染色和DAPI復染后所拍攝的抗肌萎縮蛋白陽性肌纖維，除了具有廣泛的中央成核現(xiàn)象和極少的抗肌萎縮蛋白陽性的未處理mdx小鼠外。
實施例5肌肉力量的恢復本實施例表明了在mdx小鼠中小抗肌萎縮蛋白可恢復肌肉力量。在用含抗肌萎縮蛋白小基因的AAV載體處理mdx小鼠后，對肌肉收縮力的提高進行了評估。將AAV-MCK-Δ3990載體注射入2～3月齡mdx小鼠的脛骨前(TA)肌肉。注射方式為處理同一動物的一條腿，而另一條腿不處理。后者用作對照。AAV處理后6個月時，以戊巴比妥鈉(70mg/kg，i.p.)麻醉mdx鼠，移除整個TA肌，并將TA肌置于直立組織室內用于體外進行力測量。肌肉用陰極電流的單相位矩形脈沖(持續(xù)1.0-ms)刺激(Grass modelS-88刺激器和電流增幅器)。用遞送持續(xù)500ms的75pps刺激頻率來評估最大僵直力(P0)。測定P0后，測定TA肌在反復的拉長活化期間(這會誘發(fā)對肌肉的最大損傷)持續(xù)力產生的能力。在拉長前測定的最大力稱為PISO。接下來，以1.0L0/s的恒速將肌肉從100拉長至110％L0。刺激訓練每2分鐘重復一次(工作負載循環(huán)為0.004)，共進行10個循環(huán)。PISO的改變用于指示與由拉長活化造成的損傷相關的肌肉功能損傷。如圖6所示，在10個循環(huán)的拉長活化后，未處理的TA肌(n＝8)只有23％的力輸出保留，而以AAV處理的TA肌(n＝8)具有近40％的力輸出保留。該結果強有力地表明抗肌萎縮蛋白小基因能保護肌肉免于機械力引起的損傷，因此恢復了肌肉力量。
總之，這些實施例表明抗肌萎縮蛋白基因能成功地減少到其11kb全長編碼序列的1/3，且無損于其保護肌肉免于營養(yǎng)不良類型的基本功能。另外，我們首次證明了攜帶新的人抗肌萎縮蛋白小基因的AAV載體的肌肉注射在哺乳動物模型中可產生有效的且長期的治療作用。來自AAV載體的小抗肌萎縮蛋白的持續(xù)表達，以及明顯缺乏針對表達人抗肌萎縮蛋白的肌纖維的CTL免疫反應，都使我們認識到了在營養(yǎng)不良的肌肉中生物化學的和生理學的缺陷能得到長期矯正。
實施例6逆轉錄病毒載體的構建和測試基于逆轉錄病毒的基因轉移載體被廣泛用于將轉基因永久導入到體外培養(yǎng)的細胞中。這些靶細胞可以是穩(wěn)定的細胞系，或是來自新分離的組織或骨髓的原代細胞培養(yǎng)物。部分原代細胞培養(yǎng)物可能包含有祖細胞或干細胞，如造血干細胞和肌源性干細胞。這些干細胞具有分化成成熟肌細胞即肌管和肌纖維的能力。因此，從由于抗肌萎縮蛋白基因突變所致抗肌萎縮蛋白缺乏的患者體內分離出干細胞，然后在體外經逆轉錄病毒載體感染干細胞將抗肌萎縮蛋白小基因進行基因轉移可能是一種治療肌營養(yǎng)不良的有效方法。為了檢測逆轉錄病毒載體的可用性，我們將抗肌萎縮蛋白小基因Δ3990或Δ3849(PCR產物)克隆入逆轉錄病毒載體質粒pLNCX(Clontech，加利福尼亞，美國)的StuI位點。分別獲得在CMV啟動子控制下攜帶抗肌萎縮蛋白小基因Δ3990或Δ3849的兩種逆轉錄病毒載體質粒。通過將載體質粒pLNCXΔ3990或pLNCXΔ3849轉染入包裝細胞系AmphoPack293(Clontech，加利福尼亞，美國)產生逆轉錄病毒載體顆粒。以上這些逆轉錄病毒顆粒用于感染從mdx小鼠肌組織中分離的成肌細胞。選擇性藥物G418用于殺死那些未被逆轉錄病毒載體感染的細胞，其中逆轉錄病毒載體攜帶Neor基因，可賦予G418抗性。含Δ3990或Δ3849小基因的G418抗性成肌細胞用含2％馬血清的DMED培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導分化為肌管。這些分化的肌管用抗小基因蛋白產物的單克隆抗體(Dys-3)進行免疫熒光染色。大多數(shù)的肌管因抗肌萎縮蛋白小基因的表達而陽性染色，這說明小基因可通過逆轉錄病毒成功地導入肌祖細胞。此類逆轉錄病毒載體感染的祖細胞或干細胞可用于迪謝納肌營養(yǎng)不良和貝克肌營養(yǎng)不良的間接體內基因治療。
序列表<110>肖嘯<120>編碼抗肌萎縮蛋白小基因的DNA序列及其使用方法<130>DE1142<140><141><150>60/200,777<151>2000-04-28<160>36<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>11058<212>DNA<213>人<400>1atgctttggt gggaagaagt agaggactgt tatgaaagag aagatgttca aaagaaaaca 60ttcacaaaat gggtaaatgc acaattttct aagtttggga agcagcatat tgagaacctc 120ttcagtgacc tacaggatgg gaggcgcctc ctagacctcc tcgaaggcct gacagggcaa 180aaactgccaa aagaaaaagg atccacaaga gttcatgccc tgaacaatgt caacaaggca 240ctgcgggttt tgcagaacaa taatgttgat ttagtgaata ttggaagtac tgacatcgta 300gatggaaatc ataaactgac tcttggtttg atttggaata taatcctcca ctggcaggtc 360aaaaatgtaa tgaaaaatat catggctgga ttgcaaccaa ccaacagtga aaagattctc 420ctgagctggg tccgacaatc aactcgtaat tatccacagg ttaatgtaat caacttcacc 480accagctggt ctgatggcct ggctttgaat gctctcatcc atagtcatag gccagaccta 540tttgactgga atagtgtggt ttgccagcag tcagccacac aacgactgga acatgcattc 600aacatcgcca gatatcaatt aggcatagag aaactactcg atcctgaaga tgttgatacc 660acctatccag ataagaagtc catcttaatg tacatcacat cactcttcca agttttgcct 720caacaagtga 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權利要求
1.編碼抗肌萎縮蛋白小基因的分離的核苷酸序列，其包含(a)一個N-末端結構域；(b)四至六個棒狀重復序列；(c)抗肌萎縮蛋白基因的H1結構域和抗肌萎縮蛋白基因的H4結構域；以及(d)富含半胱氨酸的結構域，其中N-末端結構域選自抗肌萎縮蛋白基因的N-末端結構域、抗肌萎縮蛋白基因改變的N-末端結構域或utrophin基因的N-末端結構域；棒狀重復序列選自抗肌萎縮蛋白基因的棒狀重復序列、utrophin基因的棒狀重復序列或血影蛋白基因的棒狀重復序列；富含半胱氨酸的結構域為抗肌萎縮蛋白基因的富含半胱氨酸結構域或utrophin基因的富含半胱氨酸結構域。
2.權利要求1的分離的核苷酸序列，其還包含抗肌萎縮蛋白基因的C-末端結構域的最后三個氨基酸。
3.編碼抗肌萎縮蛋白小基因的分離的核苷酸序列，其包含a)抗肌萎縮蛋白基因的N-末端結構域或抗肌萎縮蛋白基因改變的N-末端結構域；b)抗肌萎縮蛋白基因的四至六個棒狀重復序列；c)抗肌萎縮蛋白基因的H1結構域和抗肌萎縮蛋白基因的H4結構域；d)抗肌萎縮蛋白基因的富含半胱氨酸結構域，其中所述核苷酸序列少于5,000個核苷酸。
4.權利要求3的分離的核苷酸序列，其還包含抗肌萎縮蛋白基因的H2結構域和/或抗肌萎縮蛋白基因的H3結構域。
5.權利要求3的分離的核苷酸序列，其包含抗肌萎縮蛋白基因的四個棒狀重復序列。
6.權利要求3的分離的核苷酸序列，其包含抗肌萎縮蛋白基因的五個棒狀重復序列。
7.權利要求3的分離的核苷酸序列，其包含抗肌萎縮蛋白基因的六個棒狀重復序列。
8.權利要求3的分離的核苷酸序列，其由SEQ ID NO2組成，或由SEQ ID NO2的充分互補鏈組成。
9.權利要求3的分離的核苷酸序列，其由SEQ ID NO6組成，或由SEQ ID NO6的充分互補鏈組成。
10.權利要求3的分離的核苷酸序列，其由SEQ ID NO9組成，或由SEQ ID NO9的充分互補鏈組成。
11.權利要求3的分離的核苷酸序列，其由SEQ ID NO10組成，或由SEQ ID NO10的充分互補鏈組成。
12.權利要求3的分離的核苷酸序列，其由SEQ ID NO12組成，或由SEQ ID NO12的充分互補鏈組成。
13.權利要求3的分離的核苷酸序列，其由SEQ ID NO14組成，或由SEQ ID NO14的充分互補鏈組成。
14.重組腺伴隨病毒載體，其包含可操作地連接至表達調控元件的權利要求1的核苷酸序列。
15.權利要求14的重組腺伴隨病毒載體，其中表達調控元件為MCK啟動子或CMV啟動子。
16.重組腺伴隨病毒載體，其包含任一可操作地連接至表達調控元件的權利要求8、9、10、11、12和13的核苷酸序列。
17.權利要求16的重組腺伴隨病毒載體，其中調控元件為MCK啟動子或CMV啟動子。
18.對哺乳動物受試者的迪謝納肌營養(yǎng)不良和貝克肌營養(yǎng)不良進行治療的方法，其包括(i)提供包含可操作地連接至表達調控元件的權利要求1的抗肌萎縮蛋白小基因的載體；(ii)對哺乳動物受試者在一定條件下施用有效量的所述載體，其中所述條件導致抗肌萎縮蛋白小基因在所述哺乳動物受試者體內以提供治療效果的水平表達。
19.權利要求18的方法，其中載體為重組腺伴隨病毒。
20.權利要求18的方法，其中載體為逆轉錄病毒。
21.對哺乳動物受試者的迪謝納肌營養(yǎng)不良和貝克肌營養(yǎng)不良進行治療的方法，其包括(i)提供包含可操作地連接至表達調控元件的權利要求1的抗肌萎縮蛋白小基因的載體；(ii)對哺乳動物受試者在一定條件下施用有效量的所述載體，其中所述條件導致抗肌萎縮蛋白小基因在所述哺乳動物受試者體內以提供治療效果的水平表達，其中抗肌萎縮蛋白小基因具有的核苷酸少于5,000，該核苷酸包含(a)抗肌萎縮蛋白基因的N-末端結構域或抗肌萎縮蛋白基因改變的N-末端結構域；(b)抗肌萎縮蛋白基因的四至六個棒狀重復序列；(c)抗肌萎縮蛋白基因的H1結構域和抗肌萎縮蛋白基因的H4結構域；以及(d)抗肌萎縮蛋白基因的富含半胱氨酸結構域。
22.權利要求21的方法，其中載體為重組腺伴隨病毒。
23.權利要求21的方法，其中載體為逆轉錄病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一系列保留了基本生物功能的新抗肌萎縮蛋白小基因?？辜∥s蛋白小基因的表達可被一個調節(jié)元件及一個小的聚腺苷酸化信號調控。整個基因表達盒可輕易地包裝入病毒載體，優(yōu)選地為AAV載體。本發(fā)明還定義了抗肌萎縮蛋白的最小功能結構域，并提供了優(yōu)化和產生抗肌萎縮蛋白小基因新變體的方式。最后，本發(fā)明提供了治療迪謝納肌營養(yǎng)不良(DMD)和貝克肌營養(yǎng)不良(BMD)的方法。
文檔編號C07K14/47GK1439051SQ01809935
公開日2003年8月27日 申請日期2001年4月27日 優(yōu)先權日2000年4月28日
發(fā)明者肖嘯 申請人:肖嘯