專利名稱：用于肽合成的方法和組合物的制作方法
1.簡(jiǎn)介本發(fā)明首先涉及肽合成的方法，特別是相當(dāng)于這里稱為T-1249(SEQ ID NO1)和T-1249肽的合成方法。該方法利用固相和液相合成方法來(lái)合成和將特定的肽片段組結(jié)合以得到所需要的肽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及可以作為所需肽(例如，T-1249)的合成中間體的單獨(dú)的肽片段。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及這樣的肽中間體片段組，它們可一起用于制備全長(zhǎng)的T-1249和類T-1249肽。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及用于提純肽的方法，特別是T-1249和類T-1249肽，以及作為合成目標(biāo)肽的中間體的單獨(dú)的肽片段。
2.背景技術(shù)近來(lái)，人們已經(jīng)識(shí)別出大量顯示出抑制與細(xì)胞融合有關(guān)的過(guò)程的能力，且更重要地，還顯示出有效的抗病毒活性的肽。見(jiàn)，例如，U.S.Pat.5,464,933；5,656,480；PCT申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 94/28920；WO 96/19495。當(dāng)這些肽開(kāi)始被廣泛地使用時(shí)，例如作為治療法，就需要能夠大規(guī)模的合成它們。
雖然已經(jīng)存在用于肽合成的技術(shù)，(見(jiàn)，例如，Mergler等人，1988，Tetrahedron Letters 294005-4008；Mergler等人，1988，TetrahedronLetters 294009-4012；Kamber等人(編輯)，Peptides，Chemistry andBiology，ESCOM，Leiden，1992，525-526；和Riniker等人，1993，Tetrahedron Letters 499307-9320)，但目前還沒(méi)有可以用于大規(guī)模的、商業(yè)化生產(chǎn)易純化的肽例如T-1249的技術(shù)存在。
3.發(fā)明概述本發(fā)明首先涉及肽合成的方法，特別是相當(dāng)于這里稱為T-1249(SEQ ID NO1)和類T-1249肽的合成方法。此種方法利用固相和液相合成方法來(lái)合成和將特定的肽片段組結(jié)合以得到所需要的肽。一般地，本發(fā)明的方法包含特定側(cè)鏈被保護(hù)的T-1249或類T-1249肽的肽片段中間體在固體載體上的合成，將保護(hù)的片段在溶液中偶合，形成保護(hù)的T-1249或類T-1249肽，隨后脫側(cè)鏈保護(hù)得到最終的T-1249或類T-1249肽。本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及具有在SEQ ID NO1中描述的氨基酸順序的T-1249肽的合成。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及可以作為所需肽的合成中的中間體的單獨(dú)的肽片段(例如，T-1249)。本發(fā)明的肽片段包含，但是不局限于，具有以下表1中所述的氨基酸序列的肽片段表1
本發(fā)明更進(jìn)一步涉及可以作為所需肽合成中的中間體的特殊的肽片段組。根據(jù)本發(fā)明的肽片段組包含組1-6，如以下表2所示。
表2組氨基酸序列相應(yīng)的T-1249的氨基酸序列的編號(hào)(SEQ ID NO1)1WQEWEQKITALL (SEQ ID NO2) 1-12EQAQIQQEKNEYEL(SEQ ID NO3) 13-26QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO4) 27-382WQEWEQKITALL (SEQ ID NO2) 1-12EQAQIQQEKNEYEL(SEQ ID NO3) 13-26QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO5) 27-393WQEWEQKITALL (SEQ ID NO2) 1-12EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO6) 13-394WQEWEQKITALL (SEQ ID NO2) 1-12EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW(SEQ ID NO8) 13-385WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL(SEQ ID NO7) 1-26QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO4) 27-386WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL(SEQ ID NO7) 1-26QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO5) 27-39本發(fā)明在某種程度上是基于發(fā)明人的意外發(fā)現(xiàn)，某些固相液相合成反應(yīng)的結(jié)合可以使高純度的T-1249和類T-1249肽第一次以高生產(chǎn)量和高產(chǎn)率大規(guī)模地生成制備。特別地，根據(jù)本發(fā)明的方法，T-1249和類T-1249肽可以一或多公斤的規(guī)模合成。已發(fā)現(xiàn)通過(guò)選擇用于固相合成的本發(fā)明的特定T-1249肽片段，可以開(kāi)拓高效固相偶合技術(shù)，而不必使用在通常的固相合成中所要求的3、4以至5倍過(guò)量氨基酸和試劑。本發(fā)明的方法在本發(fā)明的肽片段的固相合成中僅僅使用約0.5倍過(guò)量(約1.5當(dāng)量)的氨基酸。氨基酸和試劑量的減少使本發(fā)明的方法適合于T-1249和類T-1249肽的大規(guī)模合成。
另外，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)某些肽片段可以在固相在負(fù)載約＞0.5mmol/克的固相樹(shù)脂的情況下合成。這種負(fù)載在典型地固相肽合成中所實(shí)現(xiàn)的負(fù)荷范圍0.25-0.35mmol/克樹(shù)脂內(nèi)顯著地提高了生產(chǎn)量。而且，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在固相使用對(duì)酸極度敏感的樹(shù)脂來(lái)合成選擇的肽片段可以制備非常高純度的肽片段。根據(jù)本發(fā)明不必使用色譜技術(shù)對(duì)所制備的肽片段純化；片段可在使用前通過(guò)沉淀和/或研制做成，或以從樹(shù)脂直接得到的形式使用。使用對(duì)酸極其敏感的樹(shù)脂可以讓所合成的本發(fā)明保護(hù)的肽從樹(shù)脂上解離，而不伴隨側(cè)鏈保護(hù)基的除去。這樣可以減少雜質(zhì)，并可以以高純度和收率合成包含10個(gè)氨基酸或更多氨基酸的肽。
根據(jù)本發(fā)明的方法通過(guò)高純度的根據(jù)本發(fā)明制備的肽片段的偶合在液相合成的T-1249和類T-1249肽的雜質(zhì)分布是由那些不偶合的片段組成，并且包含相當(dāng)少量的根據(jù)常規(guī)技術(shù)，例如，僅僅是固相合成所合成的T-1249和類T-1249肽的十分相關(guān)的缺損類似物。因此，根據(jù)本發(fā)明制備的T-1249和類T-1249肽比那些根據(jù)傳統(tǒng)方法制備的肽更容易純化。特別地，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的T-1249可以在一次通過(guò)色譜中純化至＞90％的純度。例如，根據(jù)本發(fā)明的方法，T-1249肽可以使用5英寸柱以400g或更多的量加以純化。相反，使用常規(guī)的固相合成(SPPS)制備的T-1249很難純化，要求通過(guò)多次色譜分離。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)SPPS制備的T-1249，一般在8英寸柱上只能提純10克或更少的純?cè)稀?br> 出現(xiàn)于下面第9部分的實(shí)施例表明了T-1249全長(zhǎng)肽的組合合成。通過(guò)本發(fā)明的方法，T-1249和類T-1249肽及其中間體可以按照一或多公斤的規(guī)模制備。
本發(fā)明人還出乎意料地發(fā)現(xiàn)由于液相合成后得到的T-1249的高純度，使得肽例如T-1249及其它類T-1249肽，以及在此所述的某些肽片段可以使用大容量材料進(jìn)行純化。因此，本發(fā)明更進(jìn)一步涉及用于提純肽的方法，特別是T-1249和類T-1249肽，及作為合成目標(biāo)肽的中間體的單獨(dú)的肽片段。
3.1定義在此使用的氨基酸符號(hào)是常規(guī)的，如下所示常見(jiàn)氨基酸的縮寫氨基酸 單字母符號(hào) 通用縮寫丙氨酸 A Ala天冬酰胺 N Asn天冬氨酸 D Asp谷酰胺 Q Gln谷氨酸 E Glu異亮氨酸 I Ile亮氨酸 L Leu賴氨酸 K Lys苯基丙氨酸 F Phe絲氨酸 S Ser蘇氨酸 T Thr色氨酸 W Trp酪氨酸 Y Tyr4.附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1T-1249三片段方法。該圖描述了以下第8和9部分中列舉的實(shí)施例所用的反應(yīng)路線，用于全長(zhǎng)T-1249的合成，使用組1的中間體肽片段為原料，如上面表2所示，并且描述了本發(fā)明方法的一個(gè)非限制性實(shí)施方案。
5.發(fā)明詳述5.1全長(zhǎng)肽本發(fā)明涉及可用于合成T-1249肽的方法、肽片段、肽片段組。T-1249為一個(gè)具有39個(gè)氨基酸殘基的多肽，其序列來(lái)源于HIV-1，HIV-2和SIV gp41病毒多肽序列。T-1249具有以下氨基酸序列NH2-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-COOH當(dāng)然本發(fā)明的方法、片段和片段組及用于選擇片段和片段組的技術(shù)可以用來(lái)合成除了T-1249的類T-1249片段。在此使用的術(shù)語(yǔ)“類T-1249”是指在國(guó)際公開(kāi)申請(qǐng)?zhí)朠CT/US 99/11212(于1999年5月20日申請(qǐng))中列出的任何HIV或非HIV肽，在此全部引入作為參考。
除了上述的T-1249和類T-1249肽外，本發(fā)明的方法、片段和片段組可以用來(lái)合成具有修飾的氨基和/或羧基末端的肽。以T-1249為例，該肽可具有下面通式X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z其中X代表氨基；疏水基選自芐氧羰基、丹磺酰和叔丁氧羰基；乙酰基；9-芴基-甲氧基-羰基(FMOC)；或大分子的載體，選自脂質(zhì)-脂肪酸結(jié)合物(conjugate)、聚乙二醇和碳水化合物；且Z代表羧基；酰氨基；叔丁氧羰基；對(duì)硝基芐基酯基；或大分子的載體，選自脂質(zhì)-脂肪酸結(jié)合物、聚乙二醇、和碳水化合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用來(lái)合成具有上述通式，其中X為乙?；襔為酰氨基的肽。用于添加這樣的“X”和“Z”基團(tuán)的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的技術(shù)。
在一種優(yōu)選的方法中，T-1249和類T-1249肽及中間體可以使用在高和低pH值范圍下穩(wěn)定的任何非硅膠柱填充物(用于最大化裝載容量)包含但不限于鋯基填料、基于聚苯乙烯，聚丙烯酸或其它聚合物的填料加以純化。例如，在非硅膠裝載柱中填充顯示寬的pH值范圍，包含pH值大于7的、由Tosohaas(Montgomeryviile，PA)出售的柱填料。用這種原料填充的柱可以在低、中或高壓色譜法中根據(jù)本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)操作。
于下面第9部分的實(shí)施例表明了通過(guò)以下第5.2部分所述的肽中間體的偶合而進(jìn)行的T-1249肽的成功合成。
5.2肽中間體本發(fā)明包括，但是不局限于，具有上述表1中所列特定氨基酸序列的T-1249和類T-1249肽的肽片段中間體，和列于表2的肽片段中間體組。這些肽中間體，特別是列于表2的片段組，可用于制備T-1249和類T-1249肽。
列于表1或2中的肽片段的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈可以用標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)基例如叔丁基(t-Bu)，三苯甲基(trt)和叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)。t-Bu基團(tuán)為用于氨基酸殘基Tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)，Glu(E)和Asp(D)的優(yōu)選的側(cè)鏈保護(hù)基；trt基團(tuán)為用于氨基酸殘基Gln(Q)和Asn(N)的優(yōu)選的側(cè)鏈保護(hù)基；且Boc基團(tuán)為用于氨基酸殘基Lys(K)和Trp(W)的優(yōu)選的側(cè)鏈保護(hù)基。
優(yōu)選，本發(fā)明肽片段的Gln(Q)殘基用三苯甲基(trt)基團(tuán)保護(hù)。然而，如果要求任何本發(fā)明的肽片段在有機(jī)溶劑中具有較低的溶解性，則可能要從該片段的一個(gè)或多個(gè)谷酰胺殘基中除去三苯甲基保護(hù)基。
優(yōu)選，本發(fā)明每個(gè)肽片段的Asn(N)殘基是被保護(hù)的。另外，優(yōu)選Trp(w)殘基用Boc基團(tuán)保護(hù)。
根據(jù)列于上述表1中的式1-5肽的保護(hù)的肽片段包括，但不局限于列于以下表3中的化合物。
表3
列于上述表3中的肽的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈可以用如上所述標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)基例如用t-Bu，trt和Boc保護(hù)。表3中的肽的典型的合成見(jiàn)以下第7和8部分，其中應(yīng)用以下第5.3部分所討論的常規(guī)技術(shù)。
5.3肽合成正如以上的討論，本發(fā)明的一些單獨(dú)的肽片段優(yōu)選使用固相合成技術(shù)制備，而本發(fā)明的其它肽優(yōu)選使用固相和液相結(jié)合的合成技術(shù)制備，所述合成以制備在此所述的T-1249或類T-1249肽結(jié)束。然而，當(dāng)然本發(fā)明的肽片段可能通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)合成或制備。見(jiàn)，例如，Creighton，1983，ProteinsStructures and MolecularPrinciples，W.H.Freeman and Co.，NY，該文獻(xiàn)在此全部引入作為參考。
本發(fā)明的肽還可以如下合成連接該肽的氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)連接鍵為非肽鍵。這些可選擇的非肽鍵可能利用本領(lǐng)域人員熟知的反應(yīng)形成，并且可能包含但不局限于亞氨基、酯、酰肼、氨基脲和偶氮連接，略舉數(shù)例。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，包含如上所述的序列的T-1249和類T-1249肽可以用在它們的氨基和/或羧基末端的另外的化學(xué)基團(tuán)加以合成，以致于可以提高肽的，例如穩(wěn)定性、反應(yīng)性和/或溶解性。例如，可以在肽氨基末端增加疏水基例如芐氧羰基、丹磺酰基、乙?；蚴宥⊙豸驶鶊F(tuán)。同樣地，可以在肽的氨基末端添加乙?；?-芴基甲氧基羰基基團(tuán)。(見(jiàn)如上所述的T-1249的“X”修飾基團(tuán)。)另外，可將疏水基，叔丁氧羰基或酰氨基可加到肽的羧基末端。類似地，可將對(duì)硝基芐基酯或芐基酯基可接到肽的羧基末端。(見(jiàn)如上所述的T-1249的“Z”修飾基團(tuán)。)用于引入上述的修飾基團(tuán)的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)。
而且，T-1249和類T-1249肽可以通過(guò)合成以使它們的空間構(gòu)型改變。例如，可以使用肽的氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)D-異構(gòu)體合成，而不是通常的L-異構(gòu)體。
更進(jìn)一步，本發(fā)明肽的至少一個(gè)氨基酸殘基可以被一個(gè)已公知的非天然氨基酸殘基取代。諸如這些的改變都可以用來(lái)增加本發(fā)明肽的穩(wěn)定性、反應(yīng)性和/或溶解性。
T-1249或類T-1249肽的任一個(gè)可以被合成，以另外使大分子載體基團(tuán)共價(jià)地連接到其氨基和/或羧基末端。上述的大分子載體基團(tuán)可以包含，例如，脂質(zhì)-脂肪酸結(jié)合物、聚乙二醇、碳水化合物或其它的肽。因此如果另外的肽基團(tuán)是優(yōu)選的，如上所述的T-1249的“X”修飾基團(tuán)可以另外代表任一上述共價(jià)地連接到肽的氨基末端的大分子載體基團(tuán)。同樣地，如上所述的T-1249的“ Z”修飾基團(tuán)可以另外代表如上所述的任一大分子載體基團(tuán)。
優(yōu)選，本發(fā)明的肽片段使用標(biāo)準(zhǔn)的FMOC規(guī)程通過(guò)固相肽合成(SPPS)技術(shù)合成。見(jiàn)，例如，Catpino等人，1970，J.Am.Chem.Soc.92(19)5748-5749；Catpino等人，1972，J.Org.Chem.37(22)3404-3409.在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽片段的固相合成是在對(duì)酸極其敏感的固體載體上進(jìn)行的，該固體載體包括，但不局限于，2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂(見(jiàn)，例如，Barbs等人，1989，Tetrahedrbn Letters30(30)3943-3946)和4-羥甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸樹(shù)脂(見(jiàn)，例如，Seiber，1987，Tetrahedron Letters28(49)6147-6150，和Richter等人，1994，Tetrahedron Letters35(27)4705-4706)。2-氯三苯甲基氯和4-羥甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸樹(shù)脂可以從Calbiochem-Novabiochem公司，San Diego，CA購(gòu)買。
在本文中描述了可以用于固相肽合成中的用于制備和樹(shù)脂負(fù)載的常規(guī)的，非限制的方法。另外，在以下第6部分的實(shí)施例中描述了典型的樹(shù)脂的制備方法。
樹(shù)脂負(fù)載可以，例如，通過(guò)以下技術(shù)進(jìn)行將樹(shù)脂，優(yōu)選對(duì)酸極度敏感樹(shù)脂例如2-氯三苯甲基樹(shù)脂加入反應(yīng)室中。用氯代溶劑例如二氯甲烷(DCM)洗滌樹(shù)脂。排出溶劑，加入含有過(guò)量0.2-0.5當(dāng)量的二異丙基乙胺(DIEA)的0.5-1.5當(dāng)量氨基酸在約8-10倍體積的二氯乙烷(DCE)中的溶液。該氨基酸的N-末端應(yīng)該是被保護(hù)的，優(yōu)選用Fmoc保護(hù)，且該氨基酸的側(cè)鏈應(yīng)該在必要處或適當(dāng)?shù)牡胤奖槐Ｗo(hù)。該混合物用氮?dú)夤呐輸噭?dòng)2-24小時(shí)。
應(yīng)注意氯代溶劑例如DCM或DCE可使2-氯三苯甲基樹(shù)脂充分膨脹。
攪動(dòng)后，樹(shù)脂層排干并用DCM洗滌。樹(shù)脂上的活性部位用9∶1MeOHDIEA溶液末端封閉約20-30分鐘。排干樹(shù)脂層，用DCM洗滌四次并用氮?dú)獯迪锤稍锏玫截?fù)載的樹(shù)脂。
Fmoc為用于氨基酸N-末端優(yōu)選的保護(hù)基。根據(jù)要負(fù)載的氨基酸，其側(cè)鏈可能被或不被保護(hù)。例如，當(dāng)負(fù)載色氨酸(Trp)時(shí)，其側(cè)鏈應(yīng)該用Boc基團(tuán)保護(hù)。然而，亮氨酸(Leu)的側(cè)鏈不必保護(hù)。優(yōu)選，谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)和絲氨酸(Ser)被保護(hù)為叔丁基醚或叔丁基酯，且色氨酸(Trp)和賴氨酸(Lys)以叔丁氧羰基氨基甲酸鹽(Boc)加以保護(hù)。天冬酰胺(Asri)和谷酰胺(Gln)的酰胺側(cè)鏈可用三苯甲基基團(tuán)保護(hù)或不被保護(hù)。
帶有或者沒(méi)有所需側(cè)鏈保護(hù)基的、用于負(fù)載到樹(shù)脂上和肽合成中的Fmoc保護(hù)的氨基酸可由許多供應(yīng)商提供，包括Senn或Genzyme公司。作為上述步驟的替換，可以購(gòu)買已經(jīng)負(fù)載了適當(dāng)?shù)陌被岬臉?shù)脂。
在以下第6部分的實(shí)施例中描述了典型的樹(shù)脂制備方法。
固相肽合成技術(shù)可以根據(jù)例如，以下的非限制性的技術(shù)進(jìn)行將負(fù)載了的樹(shù)脂加入反應(yīng)室，并用一種溶劑，優(yōu)選二氯甲烷(DCM；優(yōu)選約10倍體積)處理，用氮?dú)鈹噭?dòng)或攪拌約15分鐘以便膨脹樹(shù)脂粒。DCM可使2-氯三苯甲基樹(shù)脂充分膨脹。當(dāng)樹(shù)脂珠膨脹時(shí)，樹(shù)脂在反應(yīng)室中的體積將增加3-6倍，并且活性部位展開(kāi)有利于反應(yīng)。樹(shù)脂膨脹后，從反應(yīng)室排干溶劑。
通過(guò)用2等分的20％哌啶在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)溶液每次處理樹(shù)脂約十分鐘可從末端胺或樹(shù)脂上除去Fmoc(9-芴基-甲氧基羰基)保護(hù)基。每次所用20％哌啶在NMP溶液中的體積取決于反應(yīng)進(jìn)行的規(guī)模。然后用等分量的NMP洗滌樹(shù)脂5-7次(約10倍體積)以除去Fmoc副產(chǎn)品(即二苯并亞甲基環(huán)戊二烯和其哌啶加合物)和殘余的哌啶。
四氯苯醌試驗(yàn)可用于確定殘余的吡啶是否被完全除去。四氯苯醌試液通過(guò)向約1毫升丙酮中加入一滴四氯苯醌甲苯飽和溶液制備。NMP洗液可以通過(guò)向四氯苯醌試液中加入一滴該洗液測(cè)試。藍(lán)色或紫色是存在仲胺的陽(yáng)性指示，表明殘余的哌啶仍然存在。重復(fù)用NMP洗滌直至不再觀測(cè)到藍(lán)色或紫色。
同時(shí)，將要添加到樹(shù)脂上的序列中后面的氨基酸活化以便在其羧基末端反應(yīng)。每個(gè)氨基酸的氨基末端應(yīng)該用Fmoc保護(hù)。根據(jù)要添加的氨基酸，其側(cè)鏈可被或不被保護(hù)。優(yōu)選，tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)、Glu(E)和Asp(P)的側(cè)鏈用t-Bu保護(hù)，Gln(Q)和Asn(N)的側(cè)鏈用trt保護(hù)，而Lys(K)和Trp(w)的側(cè)鏈用Boc保護(hù)。Leu或Ile的側(cè)鏈不必保護(hù)。
氨基酸可以如下活化。在室溫下將Fmoc-保護(hù)的氨基酸(1.5當(dāng)量)，1-羥基苯并三唑水合物(HOBT)(1.5當(dāng)量)，和二異丙基乙胺(DIEA)(1.5當(dāng)量)溶于一種極性，非質(zhì)子傳遞溶劑例如N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基乙酰胺(DMAC)(約7.5體積)。將溶液冷卻至0-5℃，而后加入O-苯并噻唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)或O-苯并噻唑-1-基四甲基四氟硼酸鹽(TBTU)(1.5當(dāng)量)，隨后攪拌5-15分鐘至溶解?；罨?-5℃進(jìn)行以使氨基酸的外消旋作用減到最小是至關(guān)重要的。最后向冷的溶液中加入HBTU，因?yàn)榛罨屯庀饔脹](méi)有它不能進(jìn)行。
將活化的氨基酸的溶液加到排干的樹(shù)脂中，用DCM沖洗(大約2.5體積)。注意氨基酸的活化在NMP中進(jìn)行是由于HBTU在DCM中不溶。然而，在此刻向反應(yīng)中加入DCM以維持樹(shù)脂粒的充分膨脹。反應(yīng)在20-30℃用氮?dú)馀輸噭?dòng)約1小時(shí)。用如下所述的定性茚三酮試驗(yàn)監(jiān)控偶合結(jié)束。
為使用定性茚三酮試驗(yàn)檢查反應(yīng)是否完全，可以抽出2-20毫克樹(shù)脂樣品并用甲醇洗干凈。向樣品中加入3滴76％苯酚的乙醇溶液，4或5滴0.2mMKCN的吡啶溶液，和3滴0.28M的茚三酮乙醇溶液。該樣品用乙醇稀釋至約0.5毫升，并被放入約75℃的加熱塊中5-10分鐘。藍(lán)色或紫色為存在游離氨基的陽(yáng)性指示，表明反應(yīng)還沒(méi)有完全?？梢詫悠愤M(jìn)一步稀釋至約3毫升以便更準(zhǔn)確地測(cè)量濃縮的樣品的變色程度。
如果在一小時(shí)后觀察到茚三酮試驗(yàn)顯陽(yáng)性，可繼續(xù)偶合反應(yīng)一小時(shí)。如果茚三酮試驗(yàn)在3小時(shí)后仍顯陽(yáng)性，排干樹(shù)脂，在大約10體積的NMP中洗滌一次，用0.5-1當(dāng)量的活化的氨基酸重復(fù)偶合反應(yīng)。
如果樹(shù)脂在偶合周期之間存儲(chǔ)過(guò)夜，可以將樹(shù)脂層排干并在氮?dú)夥障掠肗MP覆蓋。也可以，排干樹(shù)脂層，在氮?dú)夥障麓鎯?chǔ)，然后在繼續(xù)進(jìn)行下一個(gè)偶合周期之前用DCM洗滌使其達(dá)到要求的情況。如果完成的片段將在斷裂之前存儲(chǔ)過(guò)夜，應(yīng)將樹(shù)脂層用IPA洗滌至無(wú)NMP，因?yàn)樵贜MP中可發(fā)生顯著的脫Fmoc保護(hù)反應(yīng)。
判斷偶合完成之后，排干樹(shù)脂并用3等分量(大約10體積)的NMP洗滌。對(duì)于后面的肽片段的鏈節(jié)(即，氨基酸)重復(fù)此循環(huán)。繼最終的偶聯(lián)反應(yīng)之后，樹(shù)脂用4等分量(約10體積)的NMP洗滌，然后用2等分量(大約10體積)的DCM和2IPA洗滌。此樹(shù)脂結(jié)合肽可以用氮?dú)獯祾吒稍锘蛟诤嫦渲懈稍铩?br> 通過(guò)固相合成技術(shù)合成的肽可以根據(jù)例如以下的非限制性技術(shù)解離和分離該肽可以用本領(lǐng)域技術(shù)技術(shù)人員熟知的技術(shù)從樹(shù)脂上解離。例如，可以用1％或2％三氟乙酸(TFA)的DCM溶液或1％和2％TFA的DCM溶液結(jié)合來(lái)解離該肽。還可以用乙酸(HOAC)、鹽酸(HCl)或甲酸解離該肽。具體的解離試劑，溶劑和所需解離時(shí)間可取決于要解離的特定肽。解離后，解離的部分可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的分離步驟以分離肽。一般地，可將解離部分合并，在真空下濃縮，而后用極性質(zhì)子惰性溶劑重構(gòu)，極性質(zhì)子惰性溶劑例如乙醇(EtOH)、甲醇(MeOH)、異丙醇(IPA)、丙酮、乙腈(ACN)、二甲基甲酰胺(DMF)、NMD、DMAC、DCM等等，隨后用抗溶劑例如水或己烷沉淀或結(jié)晶，并通過(guò)真空過(guò)濾收集?；蛘撸摦a(chǎn)品可以在肽分離后用有機(jī)溶劑或水研制。
實(shí)施例見(jiàn)以下第7.1-7.6部分，描述了如表1、2和/或3中所示肽中間體的固相合成。
為合成全長(zhǎng)T-1249肽，可將上述的表1中的肽中間體偶合起來(lái)得到T-1149肽。例如，可將列于上述表2中的肽中間體組偶合起來(lái)以制備全長(zhǎng)T-1249肽。從中間體肽片段合成全長(zhǎng)T-1249的典型實(shí)施例見(jiàn)以下第9部分，且在圖1中示意地描述。
在某些實(shí)施方案中，可按照三片段方法合成T-1249。“三片段方法”合成是指由三個(gè)T-1249中間體肽片段開(kāi)始的T-1249合成反應(yīng)路線，使用固相和液相合成技術(shù)合成并偶合成為全長(zhǎng)T-1249肽。上述表2中所示中間體肽片段組1、2、3和4為優(yōu)選組。圖1描述了使用表2肽中間體組1合成全長(zhǎng)T-1249的典型的三片段方法。對(duì)于此組，可注意到在片段偶合過(guò)程中氨基酸殘基39(T-1249羧基的1-末端氨基酸殘基)是被單獨(dú)引入的。圖1中的T-1249合成反應(yīng)路線的頂點(diǎn)可通過(guò)第9.1部分的實(shí)施例證明。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的液相肽合成技術(shù)可以用于本發(fā)明的肽中間體片段的合成。以下第8部分的實(shí)施例描述了列于表1、2和/或3中的肽中間體的典型的液相肽合成。例如，在能顯示寬的pH值范圍，包含在高或低pH下pH穩(wěn)定的非硅膠裝載柱填充物中，為Tosohaas(Montgomeryviile，PA)出售的柱填充物。
6.實(shí)施例樹(shù)脂合成6.1.用于在2-CTC樹(shù)脂上負(fù)載氨基酸的優(yōu)選的典型方法將對(duì)空氣敏感的2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂(Senn Chemicals，批次A3573，1eq，12.0mmol，10.0g)加入到250毫升圓底燒瓶中，立即用準(zhǔn)備好的FmocLeuOH(1.0eq.，12mmol，4.24g)和二異丙基乙胺(5eq.，60.0mmol，5.20mL)的DCM(10體積，100mL)溶液處理。淤漿被封端并攪拌3小時(shí)。過(guò)濾除去溶劑并用DCM(5體積，50毫升)洗滌樹(shù)脂。樹(shù)脂上的殘余活性部位通過(guò)用9∶1 MeOH∶DIEA(5體積，5.0毫升DIEA和45毫升甲醇)處30分鐘進(jìn)行末端封端。除去溶劑并用3×5體積的DCM洗滌樹(shù)脂。干燥樹(shù)脂至恒重得到13.2克計(jì)算載荷為每克0.98mmol FmocLeuOH的負(fù)載的樹(shù)脂。
此方法還可以用于在2-CTC樹(shù)脂上負(fù)載FmocTrp(Boc)OH。
在此，在第6.2-6.3部分描述的為如下實(shí)施例，其中氯三苯甲基氯樹(shù)脂被可以用于在此所述的肽和肽中間體固相合成的氨基酸所取代。本發(fā)明的所有肽和肽片段可以通過(guò)使用以下第6.2和6.3部分所述的負(fù)載過(guò)程通過(guò)固相肽合成法(SPPS)合成。6.2Fmoc-Trp(Boc)-2-氯三苯甲基樹(shù)脂的制備材料MWeq.mmolesgramsmL2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂 -- 1.0 2525 --Fmoc-Trp(Boc)-OH -- 526.60 1.5 37.5 19.7二異丙基乙基胺(DIEA) 29.25 1.7 42.5 5.5 7.4二氯乙烷(DCE)-- ---- -- 250二氯甲烷(DCM)-- ---- -- 6×2509∶1甲醇∶DIEA -- ---- -- 200方法將2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂(25g，1eq.)裝入 500毫升肽合成容器并用250毫升DCM洗滌。排干樹(shù)脂層，加入含有Fmoc-Trp(Boc)-OH(1.5eq)和DIEA(1.7eq)在10體積DCE中的溶液。用氮?dú)馀輸噭?dòng)該混合物2小時(shí)。
排干樹(shù)脂層并用250毫升DCM洗滌。樹(shù)脂上的活性部位用200毫升9∶1 MeOH∶DIEA溶液末端封閉20分鐘。排干樹(shù)脂層，用4×250毫升DCM洗滌，并用氮?dú)獯迪锤稍锏玫?4.3克負(fù)載的樹(shù)脂。
通過(guò)從樹(shù)脂上解離Fmoc-氨基酸進(jìn)行定量HPLC分析，并用標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。HPLC原料分析顯示樹(shù)脂負(fù)載量為0.68mmol/克。柱Phenomenox Jupiter C18；300；5μ流速1mL/min檢測(cè)UV在260nm流動(dòng)相A0.i％TFA水溶液B0.1％TFA的乙腈溶液65％B isocratic保留時(shí)間約14分鐘6.3Fmoc-Leu-2-氯三苯甲基樹(shù)脂的制備材料MWeq.mmolesgramsmL2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂 -- 1.0250250 --Fmoc-Trp(Boc)-OH 353.421.5375132.5 --二異丙基乙基胺(DIEA) 129.251.7425 55 75二氯乙烷(DCE) -- -- -- -- 2000二氯甲烷(DCM) -- -- -- -- 6×15009∶1甲醇∶DIEA -- -- -- -- 1500方法將樹(shù)脂裝入3L肽容器并用1.5DCM洗滌。排干樹(shù)脂層，加入FmocLeuOH(1.5eq)和DIEA(1.7eq)在8體積DCE中的溶液。該混合物用氮?dú)夤呐輸噭?dòng)2小時(shí)。
排干樹(shù)脂層并用1.5升DCM洗滌。樹(shù)脂上的活性部位用1.5升9∶1MeOH∶DIEA溶液末端封閉30分鐘。排干樹(shù)脂層，用4×1.5升DCM洗滌，并用氮?dú)獯迪锤稍锏玫?45克負(fù)載的樹(shù)脂。
通過(guò)從樹(shù)脂上解離Fmoc-氨基酸進(jìn)行定量HPLC分析，并用標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。HPLC原料分析顯示樹(shù)脂負(fù)載量為0.72mmol/克。柱Phenomenox Jupi ter C18；300；5μ流速1mL/min檢測(cè)UV在260nm流動(dòng)相A0.1％TFA水溶液B0.1％TFA的乙腈溶液65％ B isocratic保留時(shí)間約8分鐘7.實(shí)施例肽的固相合成列于以下第7.1-7.6部分的實(shí)施例，描述了如表1、2和/或3中所示肽中間體的固相合成。7.1用于固相肽合成(SPPS)的優(yōu)選方法一般步驟在SPPS容器中裝料FmocLeu-樹(shù)脂(當(dāng)量)。該樹(shù)脂用5％哌啶DCM(7.5體積)處理，用氮?dú)獯祾?5-30分鐘。排干溶劑，樹(shù)脂用2×20％哌啶的NMP溶液(5體積)處理30分鐘以除去Fmoc保護(hù)基。在用20％哌啶/NMP第二次處理之后，樹(shù)脂用5-7×NMP(5體積)洗滌至四氯苯醌試驗(yàn)顯陰性。
同時(shí)，將后續(xù)氨基酸(1.5當(dāng)量)，HOBT(1.5當(dāng)量)和DIEA(1.5當(dāng)量)在3∶1NMP/DCM(10體積)中混合，直到在室溫下全部溶解并冷卻至0℃。加入HBTU，攪拌溶液10-15分鐘至固體溶解，然后加入到樹(shù)脂中。該懸浮液在氮?dú)夥障聰噭?dòng)1-3小時(shí)。用定性茚三酮試驗(yàn)監(jiān)控偶合結(jié)束。如果反應(yīng)在3小時(shí)后仍不完全(茚三酮試驗(yàn)持續(xù)陽(yáng)性)，應(yīng)該排干反應(yīng)器，并應(yīng)該用新鮮的活化氨基酸溶液(0.5當(dāng)量)重新進(jìn)行偶合。通常在重新偶合30分鐘-1小時(shí)后，可得到陽(yáng)性的茚三酮試驗(yàn)。對(duì)于片段中其余氨基酸重復(fù)此循環(huán)。在片段構(gòu)筑狀態(tài)下，用于洗滌的溶劑體積可能需要從5體積增加。對(duì)于AcAA1-12OH，乙酸酐封端是通過(guò)用吡啶(5當(dāng)量)，然后用乙酸酐(5當(dāng)量)在3∶1NMP/DCM(10體積)溶液處理去Fmoc保護(hù)(HAA1-12-樹(shù)脂)而進(jìn)行的。繼最終的偶合之后，用3×5-8體積的NMP洗滌樹(shù)脂，然后用2×10體積的DCM洗滌，并在真空烘箱中在40℃干燥至恒重。7.2從樹(shù)脂上解離肽的優(yōu)選方法以下方法描述了從樹(shù)脂上解離肽AcAA1-120H的方法。然而，還可以用與此相同的方法解離本發(fā)明的其它肽片段。方法A使用HOAc樹(shù)脂(1克，0.370mmol)用AcOH/MeOH/DCM(5∶1∶4，20體積，20毫升)的混合物處理，用氮?dú)鈹噭?dòng)1.5小時(shí)，并將溶液轉(zhuǎn)入圓底燒瓶中，攪拌，并用水(20體積)處理。將得到的白色淤漿濃縮(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，40℃浴)除去DCM，過(guò)濾收集產(chǎn)品。干燥至恒重得到0.69克(74％)AcAA1-12OH，純度87A％。如上二次處理樹(shù)脂，提供另外0.08克(8.5％)純度較小的(83面積％)AcAA1-12OH，建議所需反應(yīng)時(shí)間略＞1.5小時(shí)。方法B使用TFA樹(shù)脂(1wt，20克)用5-6×1.7體積的1％TFA的DCM溶液洗滌，每次3-5分鐘。在含有吡啶(與洗液中的TFA的體積比1∶1)的燒瓶中收集1％TFA/DCM洗液。合并含有洗液的產(chǎn)品(600毫升，30體積)，蒸餾除去DCM至最小器皿體積(～原始體積的1/3)。調(diào)節(jié)真空度使器皿溫度維持在15-25℃。加入乙醇(6.5體積)，并繼續(xù)蒸餾直至除去DCM(通過(guò)蒸餾物的溫度增加確定)。再次調(diào)節(jié)真空度使器皿溫度維持在15-20℃。最終器皿體積應(yīng)該在～8-9體積。將溶液冷卻至5-10℃，于30分鐘加入水(6.5體積)至沉淀出AcAA1-12OH。真空過(guò)濾收集固體，并用水(2-3體積)洗滌固體。淤漿在0-5℃攪拌30分鐘，通過(guò)真空過(guò)濾收集固體并干燥至恒重，得到16.80克AcAA1-12OH，收率90％，純度84面積％(A％)。7.3AcAA1-12OH后處理的優(yōu)選方法在65℃下加熱在70毫升甲醇(23.3體積)中的AcAA1-12OH(257-21-1，3.00克)，攪拌3小時(shí)。冷卻至室溫并攪動(dòng)過(guò)夜。抽濾過(guò)濾并在真空烘箱中(40℃)干燥至恒重，得到2.43g(81％)，純度90A％。HPLC條件Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.A0.1％TFA/水，B80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物60-80％B/30min典型樣品制備將1mg溶于0.10ml NMP，用1mL乙腈稀釋。在20μL環(huán)管中注射進(jìn)樣20μL。7.4FmocAA13-26OH的SPPS合成和從樹(shù)脂上的解離FmocAA13-26的SPPS合成如上所述從6.5g負(fù)載量1.02mmol/克的FmocLeuo樹(shù)脂開(kāi)始進(jìn)行?？砂凑战怆x方法A或B進(jìn)行(169/137，收率60％，純度85A％)。7.5FmocAA13-26OH的優(yōu)選的后處理方法FmocAA13-26OH(3.60克，85A％)在15毫升(5體積)乙腈中在78℃加熱。該淤漿用另外的溶劑處理，直至固體溶解(合計(jì)0.6毫升)。將溶液冷卻至室溫并攪拌7小時(shí)。抽濾過(guò)濾并干燥至恒重，得到2.6克(72％)，純度95A％的FmocAA13-26OH。HPLC條件Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.A0.1％TFA/水，B80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物60-80％B/30min典型樣品制備將1mg溶于0.10ml NMP中，用1mL乙腈稀釋。在20μL環(huán)管中注射進(jìn)樣20μL。7.6FmocAA27-38OH的SPPS合成和從樹(shù)脂上的解離FmocAA27-38OH的SPPS合成如上所述從10g負(fù)載量0.75mmol/克的FmocTrp(Boc)OR開(kāi)始進(jìn)行?？墒褂谜战怆x方法B(169/120/1，收率78％，純度87.9A％)。HPLC條件Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.A0.1％TFA/水，B80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物60-80％ B/30min典型樣品制備將1mg溶于0.10ml NMP，用1mL乙腈稀釋。在20μL環(huán)管中注射進(jìn)樣20μL。8.實(shí)施例肽片段的液相合成列于以下第8.1-8.4部分的實(shí)施例，描述了如表1、2和/或3中所示肽中間體的液相合成。8.1 通過(guò)HPheNH2至FmocAA27-38OH的液相偶合進(jìn)行的片段Fmoc-AA27-39-NH2的制備FmocAA27-39NH2可以通過(guò)將FmocAA27-38OH的羧基末端分別在DIEA和苯丙氨酸酰胺的存在下使用HBTU或TBTU和HOBT或HOAT轉(zhuǎn)化為活化的HOBT或HOAT酯制備。該反應(yīng)可在一極性，非質(zhì)子傳遞溶劑例如DMF或NMP中，在0至25℃進(jìn)行。反應(yīng)完成后，加入醇類或水混性的溶劑和/或水，沉淀出FmocAA27-39NH2。實(shí)施例將FmocAA27-38OH(169-120-1，5.40克，1.98mmol，1.00當(dāng)量)，HPheNH2(Bachem，0.390克，2.38mmol，1.20當(dāng)量)，HOBT，H2O(0.330克，2.16mmol，1.10當(dāng)量)溶于NMP(54毫升，10體積)中，用DIEA(0.16毫升，0.921mmol，1.10)處理，并在室溫下攪拌直至溶解(大約30分鐘)。該溶液用冰浴冷卻(內(nèi)部溫度T＝2-3℃)，一次加入hbTU(0.827克，2.18mmol，1.10當(dāng)量)，攪拌1小時(shí)，然后過(guò)夜。反應(yīng)通過(guò)薄層色譜法監(jiān)控(uv，10％MeOH/DCM，SM mid Rf，產(chǎn)品在上)。加入甲醇(54毫升，10體積)，然后于1小時(shí)期間滴加水(54毫升，10體積)形成能自由流動(dòng)的固體，將其另外攪拌2小時(shí)，然后過(guò)濾收集。用1∶1水/甲醇(2×25毫升)洗滌濾餅。在真空烘箱中在40℃下干燥過(guò)夜，得到5.30克(93％)FmocAA27-39NH2，純度81A％。HPLC分析還表明存在＜0.2％的原料FmoCAA27-38OH。ES pos＝2871(MH+)，ES neg＝2869(M-1).平均MW＝2870.HPLC 條件Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.A0.1％TFA/水，B80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物60-80％B/30min典型樣品制備將1mg溶于0.10ml NMP，用1mL乙腈稀釋。在20μL環(huán)管中注射進(jìn)樣20μL。8.2 通過(guò)除去FMOC基團(tuán)制備片段HAA27-39NH2Fmoc AA27-39NH2的Fmoc保護(hù)基可用堿例如哌啶或碳酸鉀在有機(jī)溶劑例如DCM、DMF、NMP、甲基叔丁基醚(MTBE)、己烷或它們的混合物中除去。實(shí)施例將FmocAA27-39OH(257-25-1，4.00克，1.39mmol)懸浮在40毫升(10體積)的MTBE和10毫升(2.5體積)的庚烷中，然后用哌啶(0.75毫升，8.34mmol，5.5當(dāng)量)處理。攪拌淤漿12小時(shí)，此時(shí)殘余0.5％起始物料(HPLC檢測(cè))并加入20毫升(5體積)庚烷。攪拌能自由流動(dòng)的淤漿1小時(shí)，然后抽濾過(guò)濾分離，并用1∶1 MTBE/庚烷洗滌3×7毫升(每次洗滌2體積)，在真空烘箱中在40℃干燥直至恒重，得到3.55克(96％)，純度83A％的257-40-1。HPLC條件Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.A0.1％TFA/水，
B80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物60-80％B/30min典型樣品制備將1mg溶于0.10ml NMP，用1mL乙腈稀釋。在20μL環(huán)管中注射進(jìn)樣20μL。8.3 通過(guò)片段Fmoc-AA13-26OH和HAA27-39NH2的溶液相偶合制備片段Fmoc-AA13-39-NH2FmocAA13-39NH2可以通過(guò)將FmocAA13-26OH的羧基末端分別在DIEA和HAA27-39NH2的存在下使用HBTU或TBTU和HOBT或HOAT轉(zhuǎn)化為活化的HOBT或HOAT酯制備。該反應(yīng)可在極性，非質(zhì)子傳遞溶劑例如DMF或NMP中，在0至25℃進(jìn)行。反應(yīng)完成后，加入醇類或水混性的溶劑和/或水，沉淀出FmocAA13-39NH2。實(shí)施例將FmocAA13-26OH(257-41-1，3.00克，0.8417mmol，1當(dāng)量)，HAA27-39NH2(2.23克，0.8417mmol，1當(dāng)量)，HOBT水合物(0.135克，0.884mmol，1.05當(dāng)量)溶于DMF(25毫升，30分鐘.)中，用冰浴冷卻，并先用DIEA(0.23毫升，1.33mmol，1.50當(dāng)量)然后用HBTU(0.335克，0.884mmol，1.05當(dāng)量)處理并攪拌。1小時(shí)后反應(yīng)基于起始原料的消耗(HBLC)完成90％，并升溫至室溫。4小時(shí)后，加入另外的HBTU(0.150克，0.395mmol，0.5當(dāng)量)，并將反應(yīng)攪拌過(guò)夜。滴加加入甲醇(50毫升)，而后滴加水(50毫升)使得膠質(zhì)化，在室溫?cái)嚢?6小時(shí)后固化為淤漿。過(guò)濾收集固體，用2×20毫升1∶1甲醇∶水洗滌，并干燥至恒重得到5.18克(99％)FmocAA13-39NH2，純度60A％。固體含有各5A％的酸和胺起始原料。HPLC條件Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.A0.1％TFA/水，B80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物60-80％B/30min典型樣品制備將1mg溶于0.10mlNMP，用1mL乙腈稀釋。在20μL環(huán)管中注射進(jìn)樣20μL。8.4 通過(guò)除去Fmoc基團(tuán)制備片段HAA13-39NH2FmocAA13-39NH2的Fmoc保護(hù)基可用堿例如哌啶或碳酸鉀在有機(jī)溶劑例如DCM、DMF、NMP、MTBE、己烷或它們的混合物中除去。實(shí)施例將FmocAA13-39OH(257-43-1，0.500克，0.0810mmol，1當(dāng)量)懸浮在9毫升(18體積)的2∶1 MTBE/庚烷中30分鐘，然后用哌啶(40μL，0.404mmol，5當(dāng)量)處理。攪拌淤漿2小時(shí)此時(shí)殘余40％的起始物料(HPLC檢測(cè))。加入另外的MTBE(3毫升，6體積)和哌啶(20μL，2.5當(dāng)量)，攪拌淤漿直至殘余＜1％起始物料(16小時(shí))。抽濾過(guò)濾反應(yīng)淤漿，用2×5毫升的1∶1 MTBE/庚烷洗滌，干燥至恒重，得到0.40克(90％)，純度約60-70A％。HPLC條件Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.A0.1％TFA/水，B80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物60-80％B/30min典型樣品制備將1mg溶于0.10mlNMP，用1mL乙腈稀釋。在20μL環(huán)管中注射進(jìn)樣20μL。9.實(shí)施例全長(zhǎng)T-1249肽的合成在此第9.1-9.2部分描述了應(yīng)用肽中間體片段制備全長(zhǎng)T-1249肽的實(shí)施例。
本部分的實(shí)施例表明從肽中間體片段可通過(guò)固相和液相合成技術(shù)偶合成功地制備全長(zhǎng)T-1249肽。9.1通過(guò)AcAA1-12OH與HAA13-39NH2的液相偶合制備片段AcAA1-39NH2在這里描述的合成路線代表了T-1249三片段方法的頂點(diǎn)-如圖1中示意地描述。AcAA1-39NH2可以通過(guò)將AcAA1-12OH的羧基末端分別在DIEA和HAA13-39NH2的存在下使用HBTU或TBTU和HOBT或HOAT轉(zhuǎn)化制備活化的HOBT或HOAT酯。反應(yīng)完成后，加入醇類或水混性的溶劑和/或水，沉淀出AcAA1-39NH2。實(shí)施例將HAA13-39(257-32-2，0.409克，0.0685mmol，1當(dāng)量)，AcAA1-12OH(257-21-1，0.174克，0.0685mmol，1當(dāng)量)，和HOBT水合物(0.013克，0.0822mmol，1.20當(dāng)量)溶于DMF(6.0毫升，12體積，30分鐘)中。該溶液用冰浴冷卻，并先用DIEA(18μL，0.1028mmol，1.5當(dāng)量)，然后用HBTU(0.031克，0.0822mmol，1.20當(dāng)量)處理。在0℃下攪拌4小時(shí)后，滴加水(6毫升)。攪拌得到的淤漿1小時(shí)，然后抽濾過(guò)濾分離。在真空烘箱中在40℃干燥過(guò)夜，得到0.545克(94％)的257-33-1，純度大約50A％。HPLC條件Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.
A0.1％TFA/水，B80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物60-80％B/30min典型樣品制備將1mg溶于0.10ml NMP，用1mL乙腈稀釋。在20μL環(huán)管中注射進(jìn)樣20μL。9.2 通過(guò)AcAA1-39NH2的側(cè)鏈脫保護(hù)制備T-1249本部分的實(shí)施例表明從肽中間體片段可通過(guò)固相和液相合成技術(shù)偶合成功的制備全長(zhǎng)T-1249肽。尤其，在這里描述的合成路線代表了T-1249三片段方法的最終的脫保護(hù)步驟-如圖1中示意地描述。優(yōu)選，AcAA1-39NH2的側(cè)鏈保護(hù)基通過(guò)使用95/5三氟乙酸/水和至多5wt/vol％的碳正離子清除劑例如二硫蘇糖醇，二巰基乙烷或胱氨酸的酸解除去。T-1249粗品從脫保護(hù)溶液中通過(guò)加入醚類例如MTBE、乙醚或二異丙醚而沉淀出來(lái)。實(shí)施例將AcAA1-39NH2(257-33-1，0.120克)用1.5毫升新鮮制備的TFA∶DTT∶水(95∶5∶5)溶液處理，并在室溫下攪拌4小時(shí)。加入MTBE(大約3毫升)，真空過(guò)濾收集沉淀。將細(xì)粉末在真空烘箱中干燥過(guò)夜。將該原料溶于3毫升含有1％HOAc的50％乙腈/水中，并放置15小時(shí)以便進(jìn)行色氨酸的吲哚側(cè)鏈的脫羧。直接分析該溶液，并發(fā)現(xiàn)與真正的T-1249共同洗脫出。HPLC測(cè)定純度近似為60％。HPLC條件Vydac C8，cat.No.208TP54，5μ，300A，0.9mL/min.，280nm.
A0.1％TFA/水，B80％i-PrOH/20％乙腈和0.1％TFA的混合物60-80％B/30min典型樣品制備將1mg溶于0.10ml NMP，用1mL乙腈稀釋。在20μL環(huán)管中注射進(jìn)樣20μL。
序 列 表<110>Kang等<120>用于肽合成的方法和組合物<130>7872-064<140>09/349,205<141>1999-07-07<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述肽片段<400>1Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln1 5 10 15Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp20 25 30Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe35<210>2<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述肽片段<400>2Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu1 5 10<210>3<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述肽片段<400>3Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu15 10<210>4<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述肽片段<400>4Gln Lys Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp1 5 10<210>5<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述肽片段<400>5Gln Lys Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe1 5 10<210>6<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述肽片段<400>6Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys1 5 1015Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe20 25<210>7<211>26<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述肽片段<400>7Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln15 10 15Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu20 25<210>8<211>26<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述肽片段<400>8Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys1 5 1015Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp20 2權(quán)利要求
1.一種合成下式的肽的方法X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z(SEQ ID NO1)，包括(a)將下式的側(cè)鏈保護(hù)的肽EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z(SEQ ID NO6)，其中氨基酸末端是去保護(hù)的；與下式的側(cè)鏈保護(hù)的肽反應(yīng)X-WQEWEQKITALL-COOH(SEQ ID NO2)得到下式的側(cè)鏈保護(hù)的肽X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z(SEQ IDNO1)；其中X為保護(hù)基、乙?；虼蠓肿虞d體基團(tuán)；且其中Z為保護(hù)基、酰氨基或大分子載體基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中X為保護(hù)基，選自9-芴基甲氧基-羰基(Fmoc)、叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(trt)、叔丁氧基羰基(Boc)、芐氧基羰基、丹磺酰和對(duì)硝基芐基酯基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中Z為保護(hù)基，選自9-芴基甲氧基-羰基(Fmoc)、叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(trt)、叔丁氧基羰基(Boc)、芐氧羰基、丹磺酰和對(duì)硝基芐基酯基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中X為大分子載體基團(tuán)，選自脂質(zhì)-脂肪酸結(jié)合物、聚乙二醇和碳水化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中Z為大分子載體基團(tuán)，選自脂質(zhì)-脂肪酸結(jié)合物、聚乙二醇和碳水化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包含除去下式的側(cè)鏈保護(hù)的肽的側(cè)鏈保護(hù)X-WQEWEQKITALLEQAQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z(SEQ ID NO1)
7.權(quán)利要求1或6的方法，其中X為乙?；?。
8.權(quán)利要求7的方法，其中Z為酰氨基。
9.權(quán)利要求1或6的方法，其中X為保護(hù)基，而且其中該方法進(jìn)一步包含將X修飾為乙?；牟襟E。
10.權(quán)利要求9的方法，其中Z為酰氨基。
11.權(quán)利要求1的方法，其中下式的側(cè)鏈保護(hù)的肽X-WQEWEQKITALL-COOH(SEQ ID NO2)通過(guò)固相肽合成方法合成。
12.權(quán)利要求4的方法，其中下式的側(cè)鏈保護(hù)的肽EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z(SEQ ID NO6)是通過(guò)下面方法合成的，包含將下式的側(cè)鏈保護(hù)的肽QKLDKWASLWEWF-Z(SEQ ID NO5)，其中氨基末端去保護(hù)；與下式的側(cè)鏈保護(hù)的肽反應(yīng)EQAQIQQEKNEYEL-COOH(SEQ ID NO3)得到下式的側(cè)鏈保護(hù)的肽EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z(SEQ ID NO6)
13.權(quán)利要求12的方法，其中下式的側(cè)鏈保護(hù)的肽QKLDKWASLWEWF-Z(SEQ ID NO5)是通過(guò)下面方法合成的，包含將下式的側(cè)鏈保護(hù)的肽QKLDKWASLWEW-COOH(SEQ ID NO4)與苯丙氨酸酰胺反應(yīng)得到下式的側(cè)鏈保護(hù)的肽QKLDKWASLWEWF-Z(SEQ ID NO5)
14.權(quán)利要求12的方法，其中下式的側(cè)鏈保護(hù)的肽EQAQIQQEKNEYEL-COOH(SEQ ID NO3)是通過(guò)固相肽合成方法合成的。
15.權(quán)利要求13的方法，其中下式的側(cè)鏈保護(hù)的肽QKLDKWASLWEW-COOH(SEQ ID NO4)是通過(guò)固相肽合成方法合成的。
16.一組肽片段，包含選自下面的組(a)WQEWEQKITALL (SEQ ID NO；2)，EQAQIQQEKNEYEL(SEQ ID NO3)，QKLDKWASLWEW(SEQ ID NO4)；(b) WQEWEQKITALL(SEQ ID NO2)，EQAQIQQEKNEYEL(SEQ ID NO；3)，QKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO5)；(c) WQEWEQKITALL(SEQ ID NO2)EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO6)；(d) WQEWEQKITALL(SEQ ID NO2)，EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW(SEQ ID NO8)；(e) WQEWEQKITALLEQAQIIQQEKNEYEL(SEQ ID NO7)，QKLDKWASLWEW(SEQ ID NO4)；和(f) WQEWEQKITALLEQAQIIQQEKNEYEL(SEQ ID NO7)，QKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO5)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的一組肽片段，其中一個(gè)或多個(gè)所述肽片段的側(cè)鏈?zhǔn)怯帽Ｗo(hù)基保護(hù)的。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的一組肽片段，其中所述保護(hù)基選自9-芴基甲氧基-羰基(Fmoc)、叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(trt)、叔丁氧基羰基(Boc)、芐氧羰基、丹磺酰和對(duì)硝基芐基酯基組成的基團(tuán)。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的肽片段組，其中該組包含WQEWEQKITALL(SEQ ID NO2)，EQAQIQQEKNEYEL(SEQ ID NO3)，和QKLDKWASLWEW(SEQ ID NO4)。
20.根據(jù)權(quán)利要求16的肽片段組，其中該組包含WQEWEQKITALL(SEQ ID NO2)，EQAQIQQEKNEYEL(SEQ ID NO3)，和QKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO5)。
21.根據(jù)權(quán)利要求16的肽片段組，其中該組包含WQEWEQKITALL(SEQ ID NO2)，和EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO6)。
22.根據(jù)權(quán)利要求16的肽片段組，其中該組包含WQEWEQKITALL(SEQ ID NO2)，和EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW(SEQ ID NO8)。
23.根據(jù)權(quán)利要求16的肽片段組，其中該組包含WQEWEQKITALLEQAQIIQQEKNEYEL(SEQ ID NO7)，和QKLDKWASLWEW(SEQ ID NO4)。
24.根據(jù)權(quán)利要求16的肽片段組，其中該組包含WQEWEQKITALLEQAQIIQQEKNEYEL(SEQ ID NO7)，和QKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO5)。
25.一種肽，選自WQEWEQKITALL(SEQ ID NO；2)，EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO3)，QKLDKWASLWEW(SEQ ID NO4)，QKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO5)，EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO6)，WQEWEQKITALLEQAQIIQQEKNEYEL(SEQ ID NO7)，和EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW(SEQ ID NO8)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的肽，其中一個(gè)或多個(gè)所述肽的側(cè)鏈?zhǔn)怯帽Ｗo(hù)基保護(hù)的。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的肽，其中所述保護(hù)基選自9-芴基甲氧基-羰基(Fmoc)、叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(trt)、叔丁氧基羰基(Boc)、芐氧基羰基、丹磺酰和對(duì)硝基芐基酯基。
28.根據(jù)權(quán)利要求25的肽，其中所述肽為WQEWEQKITALL(SEQ ID NO2).
29.根據(jù)權(quán)利要求25的肽，其中所述肽為EQAQIQQEKNEYEL(SEQ ID NO3)，
30.根據(jù)權(quán)利要求25的肽，其中所述肽為QKLDKWASLWEW(SEQ ID NO4)
31.根據(jù)權(quán)利要求25的肽，其中所述肽為QKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO5)
32.根據(jù)權(quán)利要求25的肽，其中所述肽為EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO6)
33.根據(jù)權(quán)利要求25的肽，其中所述肽為WQEWEQKITALLEQAQIIQQEKNEYEL (SEQ ID NO7)
34.根據(jù)權(quán)利要求25的肽，其中所述肽為EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (SEQ ID NO8)
全文摘要
本發(fā)明首先涉及肽合成的方法，特別是相當(dāng)于這里稱為T－1249和類T－1249肽的合成方法。該方法利用固相和液相合成方法來(lái)合成和將特定的肽片段組結(jié)合以得到所需要的肽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及可以作為所需肽(例如，T－1249)的合成中間體的單獨(dú)的肽片段。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及這樣的肽中間體片段組，它們可一起用于制備全長(zhǎng)的T－1249和類T－1249的肽。
文檔編號(hào)C07K17/08GK1450906SQ00812530
公開(kāi)日2003年10月22日 申請(qǐng)日期2000年7月5日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月7日
發(fā)明者B·布雷, M·安德森, P·E·弗里德里希, M·-C·康 申請(qǐng)人:特萊默里斯公司