一種生物復(fù)合肥及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物復(fù)合肥，屬于肥料領(lǐng)域，特別涉及生物肥料；所述肥料重量份數(shù)組成為：枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物8?15份，泡盛曲霉培養(yǎng)物5?10份，植物乳桿菌混合菌劑10?20份。用本品可提高糧食產(chǎn)量，提高蔬菜產(chǎn)量，還可改善蔬菜、糧食的品質(zhì)和風(fēng)味。CGMCC No.940520140702 CGMCC NO.1176320151130
【專利說明】
一種生物復(fù)合肥及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物肥加工方法，屬于農(nóng)用肥料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種生物復(fù) 合肥及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 化肥污染已成為當(dāng)今世界一大公害。農(nóng)業(yè)專家一致呼吁，治理環(huán)境，必須減少化肥 用量。業(yè)內(nèi)專家、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳文新院士認(rèn)為，目前我國過量施用化肥已到極限。以氮肥 為例，我國的平均施用量是美國的近3倍、澳大利亞的8倍多，這造成了土壤結(jié)構(gòu)被破壞、自 然界生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性降低等一系列嚴(yán)重問題。中國微生物學(xué)會農(nóng)業(yè)微生物學(xué) 專業(yè)委員會主任李俊博士指出，大力推廣微生物肥配合化肥施用就是解決這一問題的方法 之一。
[0003] 微生物肥是一種以微生物生命活動及其產(chǎn)物導(dǎo)致農(nóng)作物得到特定肥料效應(yīng)的微 生物活體制品，它在培肥地力、提高化肥利用率、抑制農(nóng)作物對重金屬及農(nóng)藥等有害物質(zhì)的 吸收、凈化和修復(fù)土壤、促進(jìn)農(nóng)作物秸桿和城市垃圾的腐熟利用、提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)等方面有 著不可替代的作用。微生物肥料的功效發(fā)揮主要是通過對傳統(tǒng)化肥、有機(jī)肥的增效作用，對 土壤的改良活化作用，以及微生物的生理作用等方式來實現(xiàn)的。
[0004] 因此，微生物肥料就有了化肥、有機(jī)肥、有益生物菌的多種肥力和功效，是活化肥 料養(yǎng)分、提高肥料效果、改良作物品質(zhì)、促進(jìn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增效的理想肥料。微生物肥料是活體 肥料，它的作用主要靠它含有的大量有益微生物的生命活動來完成。只有當(dāng)這些有益微生 物處于旺盛的繁殖和新陳代謝的情況下，物質(zhì)轉(zhuǎn)化和有益代謝產(chǎn)物才能不斷形成。因此，微 生物肥料中有益微生物的種類、生命活動是否旺盛是其有效性的基礎(chǔ)，而不像其它肥料是 以氮、磷、鉀等主要元素的形式和多少為基礎(chǔ)。正因為微生物肥料是活制劑，所以其肥效與 活菌數(shù)量、強(qiáng)度及周圍環(huán)境條件密切相關(guān)，包括溫度、水分、酸堿度、營養(yǎng)條件及原生活在土 壤中土著微生物排斥作用都有一定影響。
[0005] 多年以來，微生物肥料的多數(shù)加工方式只采用成品菌劑與填料混合，缺少發(fā)酵代 謝產(chǎn)物，嚴(yán)重影響了微生物肥料產(chǎn)品的肥效，例如公布號為CN103396252A的專利申請，公開 了一種含氨基酸的復(fù)合微生物肥料，其中添加的成品菌劑由枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌 和巨大芽孢桿菌按照一定比例混合組成。
[0006] 而且目前市場上的農(nóng)用微生物菌劑主要為單一的微生物菌種，難以還原微生態(tài)結(jié) 構(gòu)，同時普通菌種和農(nóng)作物的協(xié)同作用弱，不利如提高植物抗逆性和根系營養(yǎng)吸收，例如公 布號為CN102888356A的專利申請，公開了一種利用枯草芽孢桿菌制備微生物肥料的方法 及其應(yīng)用。雖然目前市場上已出現(xiàn)一些復(fù)合微生物菌劑，但其或者功能單一，或者其使用方 法受到限制，使用后的作物增產(chǎn)效果還不能達(dá)到令人滿意，所以目前仍需要開發(fā)適用于多 種施用途徑、具有綜合功能和良好增產(chǎn)效果的復(fù)合微生物菌劑或肥料。
[0007] 一株產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌，申請?zhí)枺?01310566374.5.本發(fā)明公開了 一株產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Li-2013- 02于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏 號為CGMCCNo. 7926。該菌株產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌Li-2010經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選獲得，該菌株具有強(qiáng)耐酸、耐熱性，產(chǎn)酶活力高的特點，應(yīng)用前景 非常廣闊。
[0008] 一株高效利用生物質(zhì)原料高產(chǎn)乳酸的新型植物乳桿菌，申請?zhí)枺?01310625005.9 本發(fā)明公開了一株高效利用生物質(zhì)原料高產(chǎn)乳酸的新型植物乳桿菌（Lactobacillus? plantarum)Li-2013-01，保藏編號為CGMCCNo .7928。其發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成為:牛肉膏12g、蛋 白胨60g、酵母膏30g、碳源120g、乙酸鈉30g、檸檬酸銨12g、磷酸氫二鉀12g、七水硫酸鎂 1.2g、七水硫酸猛0.3g，逐一溶解后，自來水定容至6L，調(diào)節(jié)pH7.0-7.2。該菌株可高效利用 各種生物質(zhì)原料，不僅可利用常見的淀粉質(zhì)原料、單糖、雙糖、六碳糖等，且可利用五碳糖， 代謝速率快，產(chǎn)乳酸濃度高，轉(zhuǎn)化率高，雜酸含量少，遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)。
[0009] 由于我國長期在微生物肥料方面研究缺乏投入，使得我國的微生物肥料產(chǎn)業(yè)依然 存在整體水平不高、技術(shù)創(chuàng)新不足、產(chǎn)品質(zhì)量與應(yīng)用效果表現(xiàn)欠穩(wěn)定的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生物復(fù)合肥，重量 份數(shù)組成為:枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物8-15份，泡盛曲霉培養(yǎng)物5-10份，植物乳桿菌混合菌劑 10-20 份。
[0011] 所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物制備:從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，逐級擴(kuò)培后的種 子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾、干燥后獲得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物。
[0012] 植物乳桿菌混合菌劑的重量份數(shù)組成為，植物乳桿菌CGMCC 7928 1-3份；
[0013] 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)CGMCC 11763 5-9份.
[0014] 植物乳桿菌劑的制備方法:從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)植物乳桿菌，逐級擴(kuò)培后的種子液轉(zhuǎn) 接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負(fù)壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加 載體：向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻;濃縮液與載體的重量比為〇. 5-0.6:1，載體 組成為:CaC03 20-30份，糊精10-15份。流化床干燥，干燥溫度50 °C。
[0015]泡盛曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng):孢子液接種到米曲霉固態(tài)發(fā)酵培 養(yǎng)料中，26-33 °C培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物。
[0016]所述高效微生物肥制備方法如下:按照上述比例將各種菌劑混合，或混合后制粒。 [0017]本發(fā)明采用的菌種如下：
[0018] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC 7926
[0019] 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)CGMCC 7928
[0020] 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)CGMCC 11763 [0021 ]泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484
[0022]上述三種菌種的保藏單位是中國普通微生物菌種保藏管理中心。地址:北京市中 關(guān)村北一條13號中科院微生物研究所;郵編：100080。
[0023]有益效果
[0024]本發(fā)明的肥料能夠增強(qiáng)作物的抗旱能力。發(fā)明的肥料能夠改良土壤。肥料中有益 微生物能產(chǎn)生糖類物質(zhì)與植物粘液，礦物胚體和有機(jī)膠體結(jié)合在一起，可以改善土壤團(tuán)粒 結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)土壤的物理性能和減少土壤顆粒的損失，在一定的條件下，還能參與腐殖質(zhì)形 成。所以施用微生物肥料能改善土壤物理性狀，有利于提高土壤肥力。
[0025]本產(chǎn)品使用方法簡單，每畝地使用量0.3-1公斤，成本僅為80-100元/畝，拌種或生 長期灌水前地表噴灑。
[0026] 土壤生物酶的轉(zhuǎn)化，在降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本、減少化肥的使用、恢復(fù)土壤生態(tài)地力和 有效提高農(nóng)作物產(chǎn)量等方面均能起到顯著的作用，充分發(fā)揮土壤的有機(jī)質(zhì)效能。
【具體實施方式】
[0027] 除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另 外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要 求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施 方案中的反應(yīng)條件、分離提取條件進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0028] 下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制 本發(fā)明。實施例1
[0029] 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02,該菌株已于2013年7月15日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號院3號），保藏號為CGMCC No.7926。
[0030] 所述菌株特性是產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的酶活力高，耐熱、耐酸性強(qiáng)。
[0031] 所述菌株制備的耐高溫α-淀粉酶酶活力為30000-35000u/ml;適用溫度范圍為 105-115°(：，最適反應(yīng)溫度110°(：，在110°(：酶活完全穩(wěn)定;適用反應(yīng)?田直范圍為3.0-7.0，在 pH值為3.0時酶活完全穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值為4.2。
[0032]所述菌株特點如下：
[0033] 所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運(yùn) 動性的好氧菌。鏡檢為長桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實 驗成陽性。
[0034] 所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is )Li-2013_02由一株產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的 枯草芽孢桿菌Li-2013經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選獲得，具體篩選步驟如 下：
[0035] (1)菌懸液的制備
[0036]將在平板劃線分離后長出的Li-2013單菌落接入種子培養(yǎng)基中，100r/min，40°C培 養(yǎng)12h后，取lmL培養(yǎng)液離心后用生理鹽水洗滌兩次，并重懸與9mL生理鹽水中。
[0037] (2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變
[0038]將菌懸液置于無菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射100s。將 經(jīng)過照射的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做 對照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報紙包好，置40°C培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板 上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋 后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C震蕩處理40min，將處理過的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂 布于氯化鋰平板。
[0039] (3)高產(chǎn)菌種的初篩
[0040] 將上述涂布均勻的平板，置40°C培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板上初篩出水解圈與菌 落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌LijOlS-OULijOU-i^lijOn- OSo
[0041] (4)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩
[0042] 將獲得的三株菌Li-2013-01，Li-2013-02, Li-2013-03在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的 250mL搖瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，種子接種量10% (V/V)，40°C、100r/min培養(yǎng)72h，離心取發(fā)酵上 清液制得粗酶液。
[0043] (5)酶活測定
[0044] 酶活單位的定義:lmL粗酶液，于105°C、pH 4.2條件下，1111；[11液化111^可溶性淀粉， [0045]即為1個酶活力單位，以U/mL表示。
[0046] 經(jīng)測定，菌株Li-2013-02,為穩(wěn)定的最高產(chǎn)菌株，且酶活達(dá)到30000U/mL。
[0047] 所述氯化鋰平板：淀粉 1%，蛋白胨 1%，（NH)2S〇4 0.4%，K2HP〇4 0.8%，CaCl2 0.2%，氯化鋰0.9%，瓊脂2%。
[0048] 所述的種子培養(yǎng)基:酵母粉0.5%，蛋白胨1%，可溶性淀粉l%，NaCl 1%。
[0049] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉5%-15%，豆餅粉4%-10%，（NH)2S〇4 0.4%，K2HP〇4 0.8%，CaCl2 0·2%〇
[0050] 所述的搖瓶培養(yǎng)條件：該菌在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種量10% (V/V)，100r/min、40°C發(fā)酵培養(yǎng)72h。
[0051 ]所述耐高溫的α-淀粉酶，其酶學(xué)性質(zhì)如下：
[0052] (1)該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，最適作用溫度在100-110°C之間，且在110°C以下保存 的，溫度穩(wěn)定性較好，而11 〇 °C以上保存長時間溫度穩(wěn)定性較差。
[0053] (2)該酶最適反應(yīng)pH值為4.2。在pH值3.0-7.0之間均有較高酶活力，在pH值為3.0 時酶活完全穩(wěn)定。
[0054] (3)酶活性：由本發(fā)明所提供的突變株Li-2013-02,制備的耐高溫α-淀粉酶酶活力 為30000-35000U/ml。
[0055] 本發(fā)明所提供的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)Li_2013-01，該菌株保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 7928，保藏地 址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。保藏日期 2013年7月15日。該菌株特點如下:在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈陽性， 無邊毛，不產(chǎn)芽孢;在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態(tài)為圓形，邊緣較 整齊。理化特征為:過氧化氫酶(_)，明膠液化(_)，吲哚實驗(+ )，運(yùn)動性(_)，發(fā)酵產(chǎn)氣(_)， 亞硝酸鹽還原(_)，發(fā)酵產(chǎn)氣(_)，產(chǎn)硫化氫氣體(_)，pH4.5MRS培養(yǎng)基中生長(+ )。
[0056] 本發(fā)明植物乳桿菌采用下述流程進(jìn)行選育：
[0057]原始出發(fā)菌種-試管活化-硫酸二乙酯(DES)誘變-平板初篩-亞硝基胍(NTG) 誘變-平板初篩-搖瓶復(fù)篩-傳代穩(wěn)定性試驗。
[0058]原始出發(fā)菌種為CICC20242,購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0059]本發(fā)明所采用的原始菌株在木聚糖培養(yǎng)基中，乳酸的產(chǎn)量為12.5g/L。為了提高其 乳酸產(chǎn)量，依次采用DES和NTG對該菌種進(jìn)行誘變，誘變采用MRS碳酸鈣平板進(jìn)行初篩，然后 采用500mL搖瓶發(fā)酵，生物傳感器分析儀對高產(chǎn)菌進(jìn)行復(fù)篩，選育優(yōu)良的植物乳桿菌菌株， 然后做傳代實驗，評價其遺傳穩(wěn)定性。
[0060]菌株CGMCC No. 7928遺傳穩(wěn)定性結(jié)果表明：經(jīng)過連續(xù)傳代十次，各項性能指標(biāo)都比 較穩(wěn)定，遺傳性較好，性狀沒有回復(fù)，因此把菌株CGMCC No.7928作為選育得到的目的菌株。 [0061 ]將目的菌株CGMCC No.7928做10L發(fā)酵罐實驗，結(jié)果表明：發(fā)酵72h后，以木聚糖為 碳源，植物乳桿菌CGMCC No.7928的乳酸濃度可以達(dá)到57g/L，與出發(fā)菌株相比提高了 356% 〇
[0062]將目的菌株CGMCC No.7928做10L發(fā)酵罐實驗，結(jié)果表明：發(fā)酵72h后，以葡萄糖為 碳源，植物乳桿菌CGMCC No. 7928的乳酸濃度可以達(dá)到68g/L。
[0063] 具體過程如下：
[0064] 培養(yǎng)基：
[0005]液體MRS木聚糖培養(yǎng)基（牛肉膏2g、蛋白胨10g、酵母膏5g、木聚糖20g、乙酸鈉5g、梓 檬酸銨2g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.2g、七水硫酸猛0.05g，逐一溶解后，自來水定容 1000mL，調(diào)節(jié)?!17.0-7.2);11?木聚糖篩選固體培養(yǎng)基（牛肉膏28、蛋白胨1(^、酵母膏58、木 聚糖90g、乙酸鈉5g、檸檬酸銨2g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.2g、七水硫酸錳0.05g，逐一 溶解后，自來水定容l〇〇〇mL，調(diào)節(jié)pH7 · 0-7 · 2，加入20g瓊脂）。
[0066] 1.硫酸二乙酯(DES)誘變選育
[0067] 1)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌一環(huán)，接入裝有50mL液體MRS木聚糖培 養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，40°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對數(shù)生長前期。
[0068] 2)取5mL菌液，5000rpm離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0069] 3)用pH7.0磷酸緩沖液稀釋成107個/mL菌懸液。
[0070] 4)取32mL ρΗ7·0的磷酸鉀緩沖液、8mL菌懸液、0.4mL DES在預(yù)先放入轉(zhuǎn)子的150mL 三角瓶中充分混合，使DES最終濃度為1 % (v/v)。
[0071] 5)在30°C搖床中150rpm反應(yīng)30min，取lmL混合液，加入0.5mL 25 %Na2S2〇3溶液中 止反應(yīng)。
[0072] 6)稀釋涂布于含90g//L木聚糖的MRS木聚糖篩選固體培養(yǎng)基平皿中。在40°C培養(yǎng)2 ~3天后挑取透明圈/菌落直徑最大的菌株，標(biāo)號為DES菌。
[0073] 2.亞硝基胍誘變
[0074] 1)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌DES-環(huán)，接入裝有50mL液體MRS木聚糖 培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，40°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對數(shù)生長前期。
[0075] 2)取5mL菌液5000rpm離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0076] 3)用pH6.0磷酸緩沖液稀釋成107個/mL菌懸液。
[0077] 4)取10mL菌懸液轉(zhuǎn)移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成終濃度為10mg/mL 的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0078] 5)在30°C下200rpm振蕩反應(yīng)30min，5000rpm離心10min收集菌體，用無菌生理鹽水 洗滌數(shù)次，中止反應(yīng)。
[0079] 6)適當(dāng)稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL，稀釋涂布于含90g/L木聚糖的MRS木聚糖 篩選固體培養(yǎng)基平皿中。在40°C培養(yǎng)2~3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株150支。
[0080] 3.搖瓶復(fù)篩
[0081] 1)在超凈臺上分別取各試管斜面上的植物乳桿菌一環(huán)，接入裝有50mL液體MRS木 聚糖培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，40°C培養(yǎng)3-4天，每天檢測葡萄糖濃度和L-乳酸濃度 變化。發(fā)酵結(jié)束后，比較150株菌種的木聚糖消耗速率和乳酸產(chǎn)生速率、乳酸的轉(zhuǎn)化率以及 雜酸含量。
[0082] 2)選擇木聚糖代謝速率快、乳酸濃度高、轉(zhuǎn)化率高以及雜酸含量少的菌種為最終 菌種，命名為Li菌。
[0083] 4.遺傳穩(wěn)定性試驗
[0084]將Li-2013-Ol菌株在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測每次傳代后 的發(fā)酵情況。實驗發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標(biāo) 都正常，說明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強(qiáng)。
[0085] 發(fā)明所述所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 11763，保藏地址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所， 郵編:100101。。
[0086] 植物乳桿菌益生特性如下：
[0087]本發(fā)明所提供的植物乳桿菌CGMCC N0.11763經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)能夠在pH為1.50的條件 下存活，在1 %膽鹽培養(yǎng)4小時后仍處于存活狀態(tài);植物乳桿菌CGMCC N0.11763降解亞硝酸 鹽速度快，分解能力達(dá)到10.9mg/h/kg，該菌種在生產(chǎn)泡菜時，整個發(fā)酵過程中亞硝酸鹽濃 度在4.8mg/kg以下；CGMCC NO. 11763在發(fā)酵60h小時后，對膽固醇降解率可達(dá)到64.76%。 CGMCC N0 · 11763黏附能力測定的自凝集率為95 · 71 %。
[0088] CGMCC N0.11763對膽固醇降解能力研究和測定：
[0089] 取lml CGMCC N0.11763母液接種于10mL的MRS膽固醇液體培養(yǎng)基（膽固醇含量 0· lmg/ml，pH 6 · 2)中，37°C的恒溫靜置分別培養(yǎng)20h、40h、60h備用，以接入lmL無菌水的MRS 膽固醇培養(yǎng)基為對照，取以上培養(yǎng)不同時間的菌液樣品及對照液各lml，9000r/min，4°C下 離心10min，得到發(fā)酵上清液，鄰苯二甲醛法測定上清液中膽固醇含量(具體為:取各上清液 0 . lml于相應(yīng)的試管中，加冰醋酸0.3ml，lmg/ml的鄰苯二甲醛0.15ml，緩緩加入濃硫酸 1. 〇ml，混合均勻。室溫靜置10min，于550nm下測吸光值）。每一處理3個重復(fù)，以同樣方法制 作膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算上清液中膽固醇含量及降解率，結(jié)果見表1?？芍?，CGMCC NO. 11763對膽固醇有很好的降解作用，在發(fā)酵60h小時后，降解率可達(dá)到64.76%。
[0090]表1對膽固醇的降解情況
[0092] CGMCC N0.11763菌株的耐膽鹽試驗：
[0093] 取CGMCCN0.11763菌液lmL接種菌種于含有不同膽鹽（含量梯度為0.0%、0.2%、 0.4%、0.6%、0.8%、1%)的1011^]\?5液體培養(yǎng)基(？!1=6.4)，置于37°(：下分別培養(yǎng)0、2、411， 每個處理3個重復(fù)。各取lml樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋度溶液，取0.1ml稀釋 液于MRS中涂布，于37°C生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48小時(每個稀釋度做3個平行)記錄計算平 板上的菌數(shù)個數(shù)。結(jié)果見表2?？芍摼谀扄}濃度為1 %處理4h后菌的生長量依然達(dá)到 Ο· 59±0·92 X 107(cfu/ml)，有很好的耐膽鹽能力。
[0094] 表2耐膽鹽能力檢測[(土s) X 107cfu/ml]
[0095]
[0096] 0611〇：從).11763菌株的耐酸試驗
[0097] 取CGMCC腸.11763母液按11111接種菌種于不同？!1值(？!1梯度為1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.0)的10mL MRS液體培養(yǎng)基，置于37 °C下分別培養(yǎng)0、2、4h，每一處理3個重復(fù)。各取lml 樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋溶液，取0.1ml稀釋液于MRS中涂布，于37°C生化 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48小時(每個稀釋度做3個平行)記錄平板上的菌落個數(shù)。結(jié)果見表3。說 明該菌具有很強(qiáng)的耐酸能力。
[0098]表3 耐酸能力檢測[(土s) X 107cfu/ml]
[0099]
[0100] CGMCC NO.11763菌株的黏附能力測定
[0101] 培養(yǎng)CGMCC NO. 11763(MRS液體培養(yǎng)基）、大腸桿菌DH5a(LB液體培養(yǎng)基)24h得發(fā)酵 液，分別置于3000r/min、4°C下離心10min，收集菌泥，分別用pH = 7.0的無菌磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震蕩混合均勻后，置于3000r/min、4°C下離心 lOmin，收集菌體）。自凝集率（％ :用無菌的roS將菌泥CGMCC NO. 11763制成在波長600nm處 的吸光值為〇. 4±0.1 (A0)的懸浮菌液及菌懸液，靜置24h后測定吸光值A(chǔ)24，自凝集率（％ ) 公式為(A0-A24)/A0。；他凝集率（％ :將CGMCC N0.11763和大腸桿菌DH5a的懸菌液調(diào)節(jié)成 在波長600nm處的吸光值為0.6 ± 0.1 (A0)的混合懸浮菌液。靜置24H后測定吸光值A(chǔ)24，他凝 集率（％ )公式為（A0-A24)/A0。測定結(jié)果見表4,可知CGMCC N0.11763的自凝集率為 95.71%，有很強(qiáng)的黏附能力。
[0102] 表4黏附能力表
[0104] 菌株生理特性
[0105] 所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 11763，保藏地 址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。
[0106] 該菌株特點如下:在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈陽性，無鞭毛， 不產(chǎn)芽孢;在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態(tài)為圓形，邊緣較整齊。
[0107] 理化特征為:過氧化氫酶(-)，明膠液化(-)，吲哚實驗( + )，運(yùn)動性(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣 (_)，亞硝酸鹽還原（_)，發(fā)酵產(chǎn)氣(_)，產(chǎn)硫化氫氣體(_)，pH4.0MRS培養(yǎng)基中生長(+ )。經(jīng)過 生理生化鑒定為為植物乳桿菌（Lactobacillus plan tarum)，命名為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)XH〇
[0108] 菌株能夠在57°C下生長良好，葡萄糖耐受能力為275g/L。
[0109] 本發(fā)明植物乳桿菌由采集人李建樹，從新疆維吾爾族老鄉(xiāng)家中酸奶中分離得到， 采集時間2015年6月2日。
[0110] 5L發(fā)酵罐試驗
[0111] (1)取斜面上的植物乳桿菌CGMCC N0.11763-環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無瓊 脂）（葡萄糖濃度為150g/L)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處 于對數(shù)生長中期。
[0112] (2)將對數(shù)期的菌種接入裝有3L MRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為150g/L)的5L發(fā)酵 罐中。接種量為10%，37°C下lOOrpm培養(yǎng)8小時，對數(shù)前期溶氧控制10% (通氣0.5L/min)，后 期厭氧培養(yǎng)63小時。發(fā)酵結(jié)束后，植物乳桿菌CGMCC N0.11763的乳酸產(chǎn)量達(dá)到110g/L。這樣 的產(chǎn)乳酸速率利于泡菜的快速發(fā)酵。
[0113] (4)將對數(shù)期的菌種接入裝有3L亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝 酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基）的5L發(fā)酵罐中。接種量為10%，37°C下lOOrprn培養(yǎng)8小時，對數(shù) 前期溶氧控制10% (通氣〇.5L/min)，后期厭氧，發(fā)酵過程根據(jù)亞硝酸鹽的消耗速率流加 20g/L的亞硝酸鈉溶液，培養(yǎng)2-3天。發(fā)酵結(jié)束后，計算發(fā)酵過程植物乳桿菌CGMCC N0.11763 對亞硝酸鈉的降解速率。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在該條件下，XH對亞硝酸鈉的降解速率可以達(dá)到653mg/ h/L〇
[0114] (5)將對數(shù)期的菌種10mL接入裝有2kg預(yù)處理過的白菜中，按照傳統(tǒng)泡菜方法進(jìn)行 加工，每12小時測定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個發(fā)酵過程中，XH菌對亞硝酸 鈉的分解速率為10.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鈉含量始終低于4.8mg/kg，遠(yuǎn)低于國家 標(biāo)準(zhǔn)GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
[0115] 泡盛曲霉菌劑的制備方法：
[0116] 斜面菌種活化培養(yǎng):將泡盛曲霉斜面菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，27 °C培養(yǎng)3天。 [0117]固體一級種子培養(yǎng):挑取泡盛曲霉斜面菌種接入裝有100克培養(yǎng)基的500毫升三角 瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)3天即可。
[0118] 固體二級種子培養(yǎng):將上述培養(yǎng)好的固體一級種子攪拌為碎塊后加入裝有1000克 培養(yǎng)基的5000_升三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:30 °C培養(yǎng)3天即可。
[0119] 固體發(fā)酵培養(yǎng):將二級搖瓶種子粉碎，加入裝有滅菌培養(yǎng)基的發(fā)酵池或托盤中混 合均勻后培養(yǎng)，曲料培養(yǎng)溫度控制在26-35 °C，濕度80-90 %，每隔10小時翻料一次，培養(yǎng)時 間5-7天；固體曲料的培養(yǎng)采用常用曲料培養(yǎng)技術(shù);待培養(yǎng)料長滿菌絲即可結(jié)束培養(yǎng)，培養(yǎng) 基預(yù)先經(jīng)高溫蒸煮滅菌處理，滅菌條件控制溫度121°C，時間1小時。
[0120] 干燥粉碎:發(fā)酵結(jié)束培養(yǎng)料在流化床或其他干燥設(shè)備上進(jìn)行干燥，干燥溫度控制 在60°C，干燥到水分含量在10%以下，然后將固體培養(yǎng)料進(jìn)行粉碎，物料粉碎孔徑在60目以 上。
[0121]培養(yǎng)基組成：固體原料:麩皮80，豆餅粉10 %，玉米淀粉10 %，添加等量自來水;初 始pH自然。
[0122] 實施例2
[0123] 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法：
[0124] 發(fā)酵液的獲得:采用斜面菌種逐級擴(kuò)培獲得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；
[0125] (1)-級種子培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌斜面菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100 毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0126] (2)二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中， 培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0127] (3)三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng) 基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0128] (4) 一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級種子罐， 發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量（V/V) 1: 0.5，罐壓 0.05MPa，培養(yǎng)時間24小時；
[0129] (5)發(fā)酵培養(yǎng):將一級種子罐菌種以10%接種量接入總?cè)莘e為1.5噸二級種子罐， 發(fā)酵培養(yǎng)基裝量1噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量(V/V) 1:0.5，罐壓 0.05MPa，培養(yǎng)時間24小時。發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾、干燥后獲得含枯草芽孢桿菌劑 在內(nèi)的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物。
[0130] 培養(yǎng)基組成:葡萄糖6%，酵母提取物1%，蛋白胨0.2%，CaC03 1%，ρΗ6.8。
[0131] 植物乳桿菌劑的制備方法：
[0132] (1) 一級種子培養(yǎng):將植物乳桿菌菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升， 培養(yǎng)溫度30 °C，培養(yǎng)時間24小時；
[0133] (2)二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中， 培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0134] (3)三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng) 基裝量1000毫升，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0135] (4) 一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以5%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級種子罐， 發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度30 °C，罐壓0.05MPa，培養(yǎng)時間18小時；
[0136] (5)發(fā)酵罐培養(yǎng):將一級種子罐菌種以5%接種量接入總?cè)莘e為3噸二級種子罐，發(fā) 酵培養(yǎng)基裝量2噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30°C，罐壓0.05MPa，培養(yǎng)時間22小時。發(fā)酵完畢發(fā)酵 液經(jīng)低溫負(fù)壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體：向濃縮液中添加混合好 的載體，混合均勻;濃縮液與載體的重量比為0.5:1，載體組成為:CaC0 3 25份，糊精12份，流 化床干燥，干燥溫度50 °C。
[0137] 培養(yǎng)基組成為:酪蛋白胨1 %，牛肉提取物1 %，酵母提取物0.5%，葡萄糖0.5%，乙 酸鈉0.5%，檸檬酸二胺0.2%八￥6611 80 0.1%，1(2耶04 0.2%，]\^504.7!120 0.02%， MnS〇4.H20 0.005%，CaC03 2%，瓊脂 1·5%，ρΗ6·8〇
[0138] 實施例3
[0139] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生物復(fù)合肥，重量 份數(shù)組成為:枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物10份，泡盛曲霉培養(yǎng)物8份，植物乳桿菌混合菌劑20份。
[0140] 植物乳桿菌混合菌劑的重量份數(shù)組成為，植物乳桿菌CGMCC 7928 1份；
[0141] 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)CGMCC 11763 8份.
[0142] 本發(fā)明采用的菌種如下：
[0143] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC 7926
[0144] 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)CGMCC 7928
[0145] 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)CGMCC 11763
[0146] 泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484
[0147] 上述菌種的保藏單位是中國普通微生物菌種保藏管理中心。地址：北京市中關(guān)村 北一條13號中科院微生物研究所;郵編：100080。
[0148] 實施例4
[0149] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生物復(fù)合肥，重量 份數(shù)組成為:枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物8份，泡盛曲霉培養(yǎng)物10份，植物乳桿菌混合菌劑20份。
[0150] 植物乳桿菌混合菌劑的重量份數(shù)組成為，植物乳桿菌CGMCC 7928 3份；
[0151] 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)CGMCC 11763 5份.
[0152] 產(chǎn)品效果實驗
[0153] 試驗地的選擇與試驗設(shè)計:試驗于2015年在寧夏鹽池縣花馬池鎮(zhèn)八堡村進(jìn)行。
[0154] 旱地田種植玉米10畝，分別在種植時使用本發(fā)明產(chǎn)品每畝0.5公斤，出苗1個月左 右通過鋤地松土方式使用發(fā)明產(chǎn)品0.5公斤，對照組使用常規(guī)肥料。
[0155] 發(fā)明產(chǎn)品使用玉米地玉米產(chǎn)量達(dá)到360公斤，對照組達(dá)到150公斤。
【主權(quán)項】
1. 一種生物復(fù)合肥，重量份數(shù)組成為:枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物8-15份，泡盛曲霉培養(yǎng)物5-10份，植物乳桿菌混合菌劑10-20份。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述生物復(fù)合肥，其特征在于，植物乳桿菌混合菌劑的重量份數(shù)組成 為，植物乳桿菌CGMCC 7928 1-3份，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC 11763 5-9 份。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述生物復(fù)合肥，其特征在于，生物復(fù)合肥，重量份數(shù)組成為:枯草芽 孢桿菌培養(yǎng)物8份，泡盛曲霉培養(yǎng)物10份，植物乳桿菌混合菌劑20份;植物乳桿菌混合菌劑 的重量份數(shù)組成為，植物乳桿菌CGMCC 7928 3份;植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC 11763 5份。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述生物復(fù)合肥的制備方法，如下:按照上述比例將各種菌劑 混合，或混合后制粒。
【文檔編號】C05G3/04GK105936599SQ201610248489
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】李秉京
【申請人】義烏市錦鈺信息科技有限公司