本發(fā)明涉及一種熒光碳量子點(diǎn)的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥，又稱惡性腫瘤，是由控制細(xì)胞生長增殖機(jī)制失常而引起的疾病。癌癥像幽靈一般死死地糾纏著人類，每年要吞噬數(shù)百萬人的生命，致使人們"談癌色變"。在歐美等發(fā)達(dá)國家，癌癥為人類死因的第二位，在發(fā)展中國家亦位居第二位或第三位。癌癥的多發(fā)性和危害性，使關(guān)于癌癥治療方法的研究一直成為一個全球性的熱點(diǎn)問題。最近，基因療法的提出，為癌癥的治療提供了一個根本性療法。基因療法是指利用分子生物學(xué)方法將正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導(dǎo)入人體癌變的細(xì)胞或組織中，達(dá)到糾正基因的缺陷或者治療的作用，從而實現(xiàn)從根本上治療癌癥的一種現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)。而基因治療中最重要的一個環(huán)節(jié)是選擇適當(dāng)?shù)幕蜉d體?；蛑委熭d體一般分為病毒性載體和非病毒性載體。目前在臨床研究中廣泛使用的病毒載體缺點(diǎn)是對外源基因的容納量少(約為4.5–30kbp)、穩(wěn)定性差、會引起免疫系統(tǒng)反應(yīng)，此外在確保安全性上仍有些問題；目前非病毒性載體的研究越來越受到人們的重視。非病毒載體是新興的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，具有低毒、低免疫反應(yīng)、外源基因整合幾率低、無基因插入片斷大小限制，以及使用簡單、制備方便、便于保存和檢驗等優(yōu)勢。

納米粒子是粒徑在納米級別的一類微觀材料，其粒徑通常在0.1～100nm之間。當(dāng)材料粒徑小于100nm時，便會展現(xiàn)出與宏觀材料不同的的特殊性質(zhì)，如量子尺寸效應(yīng)、高比表面積、極強(qiáng)的吸波性、奇特的光學(xué)性能等。隨著納米科學(xué)與技術(shù)的飛速發(fā)展，將熒光納米粒子作為生物材料的研究是現(xiàn)階段納米科技研究中發(fā)展勢頭最迅速的領(lǐng)域之一，并在材料學(xué)、環(huán)境科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出非常重要的應(yīng)用前景。近年來，半導(dǎo)體熒光納米粒子以其優(yōu)異的光學(xué)性能及小尺寸特性，使其在細(xì)胞成像、細(xì)胞標(biāo)記、分析檢測、醫(yī)療診斷等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。然而，研究發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)中的重金屬離子，如Cd²⁺，在使用過程中會有一定的釋放，造成環(huán)境污染，而且對細(xì)胞也有較強(qiáng)的毒性。因此，尋找一種新的生物與環(huán)境友好型熒光納米材料顯得尤為迫切。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是要解決現(xiàn)有半導(dǎo)體熒光納米粒子存在重金屬離子，量子產(chǎn)率不高熒光性質(zhì)不穩(wěn)定的問題，提供一種正電性的基因載體功能的聚合物熒光碳量子點(diǎn)的制備方法。

本發(fā)明正電性的基因載體功能的聚合物熒光碳量子點(diǎn)的制備方法，包括以下步驟：

一、向去離子水中加入有機(jī)酸和陽離子高分子聚合物，在室溫下超聲溶解，使二者充分溶解，形成均勻的混合溶液；其中有機(jī)酸和陽離子高分子聚合物的質(zhì)量比為1:(1～5)，有機(jī)酸和去離子水的質(zhì)量比為1:(10～20)；

二、將步驟一得到的混合溶液裝入反應(yīng)釜中，在180～200℃條件下加熱反應(yīng)5～12h后，混合溶液顏色變成黑褐色；

三、向步驟二得到的黑褐色溶液中加入2倍體積的去離子水，高速離心除去底層的固體，保留溶液；

四、然后向步驟三得到溶液中加入2～3倍體積的去離子水，混合均勻后再次離心，去除固體，重復(fù)3～5次；然后使溶液通過滲析處理，除去未反應(yīng)的小分子，最終得到聚合物碳量子點(diǎn)水溶液，避光保存。

進(jìn)一步的，所述有機(jī)酸分子為葉酸、乙二胺四乙酸、組氨酸、鄰苯二甲酸或抗敗血酸。

進(jìn)一步的，所述陽離子高分子聚合物為聚乙烯亞胺、脫乙酰殼多糖、聚乙烯基吡啶、聚(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯、陽離子聚丙烯酰胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚脒或聚乙烯胺。

進(jìn)一步的，步驟一中所述超聲功率為80～100W。

進(jìn)一步的，步驟三中離心的速度為3000轉(zhuǎn)/分～18500轉(zhuǎn)/分。

進(jìn)一步的，步驟四中的離心速度為3000轉(zhuǎn)/分～18500轉(zhuǎn)/分。

上述方法制備的聚合物熒光碳量子點(diǎn)的應(yīng)用在于聚合物熒光碳量子點(diǎn)作為基因載體，將基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染和表達(dá)，具體方法如下：

將聚合物碳量子點(diǎn)水溶液稀釋至濃度為10～100mg/L，然后向聚合物碳量子點(diǎn)水溶液中加入DNA，形成碳量子點(diǎn)/DNA復(fù)合物，將得到的碳量子點(diǎn)/DNA復(fù)合物于細(xì)胞中進(jìn)行共培養(yǎng)24小時。

本發(fā)明的有益效果：

1、合成聚合物碳量子點(diǎn)的原料來源廣泛、廉價易得，聚合物碳量子點(diǎn)制備過程方法綠色環(huán)保，簡單方便、可大量合成生產(chǎn)；

2、該聚合物熒光碳量子點(diǎn)的尺寸均一，粒徑分布在2～8nm之間，在水中均勻分散；

3、合成的聚合物熒光碳量子點(diǎn)具有優(yōu)良的熒光穩(wěn)定性，量子產(chǎn)率高，可達(dá)到60％以上；陽離子高分子聚合物的加入使得碳量子點(diǎn)表面帶正點(diǎn)性，有利于電子在碳量子點(diǎn)表面轉(zhuǎn)移、傳遞，進(jìn)而提高量子產(chǎn)率。有機(jī)酸分子的加入，使得碳量子點(diǎn)表面富含羧酸根基團(tuán)和羥基基團(tuán)，促使碳量子點(diǎn)在水中很好的分散，具有穩(wěn)定的熒光性質(zhì)。

4、聚合物碳量子點(diǎn)表面富含正電荷，可以與基因通過庫侖力復(fù)合形成聚合物熒光碳量子點(diǎn)/DNA復(fù)合體，這是其應(yīng)用于基因載體的前提基礎(chǔ)；

5、熒光碳量子點(diǎn)生物毒性低，可實現(xiàn)細(xì)胞和組織的熒光成像，可以作為癌癥治療中的基因載體材料來使用。

通過制備表面正電性的熒光碳量子點(diǎn)，以正電性的碳量子點(diǎn)作為基因的載體，通過電荷相互作用與帶負(fù)電的DNA分子形成微觀復(fù)合體，復(fù)合物通過內(nèi)吞或內(nèi)噬作用進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)緊密的復(fù)合物可以保護(hù)DNA免受核酸酶的降解。由于碳量子點(diǎn)自身的熒光性質(zhì)可以實現(xiàn)對細(xì)胞進(jìn)行靶向標(biāo)記和成像，對基因轉(zhuǎn)染、表達(dá)的過程進(jìn)行示蹤?；蛲ㄟ^碳量子的載體作用在細(xì)胞內(nèi)得到高效的轉(zhuǎn)染和表達(dá)，最終實現(xiàn)糾正基因缺陷和治療的作用，從根本上達(dá)到治療疾病的目的。

附圖說明

圖1為實施例1制備的聚合物熒光碳量子點(diǎn)的透射電子顯微鏡鏡照片；

圖2為實施例1聚合物熒光碳量子點(diǎn)的紅外(FT-IR)光譜；

圖3為實施例1合成的聚合物熒光碳量子點(diǎn)水溶液的表面Zeta電勢圖；

圖4為實施例1聚合物碳量子點(diǎn)的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜；

圖5為實施例1中293T細(xì)胞的激光共聚焦熒光顯微鏡照片；

圖6為實施例1中HeLa細(xì)胞的激光共聚焦熒光顯微鏡照片。

具體實施方式

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：本實施方式正電性的基因載體功能的聚合物熒光碳量子點(diǎn)的制備方法，包括以下步驟：

一、向去離子水中加入有機(jī)酸和陽離子高分子聚合物，在室溫下超聲溶解，形成均勻的混合溶液；其中有機(jī)酸和陽離子高分子聚合物的質(zhì)量比為1:(1～5)，有機(jī)酸和去離子水的質(zhì)量比為1:(10～20)；

二、將步驟一得到的混合溶液裝入反應(yīng)釜中，在180～200℃條件下加熱反應(yīng)5～12h后，混合溶液顏色變成黑褐色；

三、向步驟二得到的黑褐色溶液中加入2倍體積的去離子水，高速離心除去底層的固體，保留溶液；

四、然后向步驟三得到溶液中加入2～3倍體積的去離子水，混合均勻后再次離心，去除固體，重復(fù)3～5次；然后使溶液通過滲析處理，除去未反應(yīng)的小分子，最終得到聚合物碳量子點(diǎn)水溶液，避光保存。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一所述有機(jī)酸分子為葉酸、乙二胺四乙酸、組氨酸、鄰苯二甲酸或抗敗血酸。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：步驟一所述陽離子高分子聚合物為聚乙烯亞胺、脫乙酰殼多糖、聚乙烯基吡啶、聚(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯、陽離子聚丙烯酰胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚脒或聚乙烯胺。其它與具體實施方式一或二相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一至三之一不同的是：步驟一中有機(jī)酸和陽離子高分子聚合物的質(zhì)量比為1:(2～4)。其它與具體實施方式一至三之一相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一至三之一不同的是：步驟一中有機(jī)酸和陽離子高分子聚合物的質(zhì)量比為1:3。其它與具體實施方式一至三之一相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：步驟一中有機(jī)酸和去離子水的質(zhì)量比為1:(12～18)。其它與具體實施方式一至五之一相同。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：步驟一中有機(jī)酸和去離子水的質(zhì)量比為1:15。其它與具體實施方式一至五之一相同。

具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式一至七之一不同的是：步驟一中所述超聲功率為80～100W。其它與具體實施方式一至七之一相同。

具體實施方式九：本實施方式與具體實施方式一至八之一不同的是：步驟二中在190℃條件下加熱反應(yīng)8～10h。其它與具體實施方式一至八之一相同。

具體實施方式十：本實施方式與具體實施方式一至九之一不同的是：步驟三中所述離心的速度為3000轉(zhuǎn)/分～18500轉(zhuǎn)/分。其它與具體實施方式一至九之一相同。

具體實施方式十一：本實施方式與具體實施方式一至九之一不同的是：步驟三中所述離心的速度為5000轉(zhuǎn)/分～15000轉(zhuǎn)/分。其它與具體實施方式一至九之一相同。

具體實施方式十二：本實施方式與具體實施方式一至九之一不同的是：步驟三中所述離心的速度為8000轉(zhuǎn)/分～12000轉(zhuǎn)/分。其它與具體實施方式一至九之一相同。

具體實施方式十三：本實施方式與具體實施方式一至九之一不同的是：步驟三中所述離心的速度為10000轉(zhuǎn)/分。其它與具體實施方式一至九之一相同。

具體實施方式十四：本實施方式與具體實施方式一至十三之一不同的是：步驟四中所述離心的速度為3000轉(zhuǎn)/分～18500轉(zhuǎn)/分。其它與具體實施方式一至十三之一相同。

具體實施方式十五：本實施方式與具體實施方式一至十三之一不同的是：步驟四中所述離心的速度為5000轉(zhuǎn)/分～15000轉(zhuǎn)/分。其它與具體實施方式一至十三之一相同。

具體實施方式十六：本實施方式與具體實施方式一至十三之一不同的是：步驟四中所述離心的速度為8000轉(zhuǎn)/分～12000轉(zhuǎn)/分。其它與具體實施方式一至十三之一相同。

具體實施方式十七：本實施方式與具體實施方式一至十三之一不同的是：步驟四中所述離心的速度為10000轉(zhuǎn)/分。其它與具體實施方式一至十三之一相同。

具體實施方式十八：本實施方式聚合物熒光碳量子點(diǎn)作為基因載體，將基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染和表達(dá)，具體方法如下：

將聚合物碳量子點(diǎn)水溶液稀釋至濃度為10～100mg/L，然后向聚合物碳量子點(diǎn)水溶液中加入DNA，形成碳量子點(diǎn)/DNA復(fù)合物，將得到的碳量子點(diǎn)/DNA復(fù)合物于細(xì)胞中進(jìn)行共培養(yǎng)24小時。

下面對本發(fā)明的實施例做詳細(xì)說明，以下實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方案和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。

實施例1：

一、在盛有去離子水的反應(yīng)器中，加入乙二胺四乙酸1.0g和脫乙酰殼多糖1.5g，在室溫下進(jìn)行超聲波振蕩，使二者充分溶解，形成均一的混合溶液。

二、將步驟一得到的混合溶液放入50mL反應(yīng)釜中，放入180℃的溫度條件下，反應(yīng)6h，混合溶液顏色變成黑褐色。

三、將步驟二得到的黑褐色溶液用30mL去離子水進(jìn)行分散離心處理，離心速度為5000轉(zhuǎn)/分，除去底層的塊狀固體，保留溶液；

四、然后向步驟三得到溶液中加入2倍體積的去離子水，混合均勻后再次離心，去除固體，重復(fù)3次；然后使溶液通過滲析處理(5000MwCO)，除去未反應(yīng)的小分子，最終得到聚合物碳量子點(diǎn)水溶液，避光保存。

將步驟四得到的碳量子點(diǎn)水溶液稀釋至濃度為50mg/L，將其與綠色熒光蛋白的脂粒DNA相互作用形成碳點(diǎn)/DNA復(fù)合物。將得到的碳點(diǎn)/DNA復(fù)合物分別于正常的細(xì)胞(293T)細(xì)胞和癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)進(jìn)行共培養(yǎng)24小時。

圖1為本實施例制備的聚合物熒光碳量子點(diǎn)的透射電子顯微鏡鏡照片，其粒徑為5.8nm。

圖2為本實施例制備的聚合物熒光碳量子點(diǎn)的紅外(FT-IR)光譜?？芍鼈冎饕械?OH，C＝O，N-H，C-H,C-O-C,C＝O等基團(tuán)。

圖3為本實施例制備的聚合物熒光碳量子點(diǎn)水溶液的表面Zeta電勢圖，其表面富含正電荷，表面電勢為+23.5eV。

圖4為本實施例制備的聚合物碳量子點(diǎn)的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，其激發(fā)峰位在350nm,發(fā)射波長在460nm，展現(xiàn)優(yōu)異的熒光性質(zhì)。圖4中1為激發(fā)光譜，2為發(fā)射光譜。

圖5為293T細(xì)胞的激光共聚焦熒光顯微鏡照片，圖6為HeLa細(xì)胞的激光共聚焦熒光顯微鏡照片。將聚合物碳量子點(diǎn)與綠色熒光蛋白基因復(fù)合后分別與正常細(xì)胞293T細(xì)胞和與宮頸癌細(xì)胞(HeLa)共同培養(yǎng)24h.基因在兩種不同的細(xì)胞中均得到了高效的表達(dá)，展現(xiàn)出綠色的熒光。

本實施例制備的聚合物碳量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率為62％，熒光穩(wěn)定性好，經(jīng)紫外照射3h，其熒光性質(zhì)不改變。熒光穩(wěn)定性好，在pH＝3-11的條件，0.1-1mol/L的NaCl水溶液條件下都能穩(wěn)定的存在，經(jīng)紫外照射3h，其熒光性質(zhì)不改變。

實施例2：

一、在盛有去離子水的反應(yīng)器中，加入葉酸0.5g和聚乙烯亞胺2.0g，在室溫下進(jìn)行超聲波振蕩，使二者充分溶解，形成均一的混合溶液。

二、將步驟一得到的混合溶液放入50mL反應(yīng)釜中，放入200℃的溫度條件下，反應(yīng)10h，混合溶液變成了黑褐色溶液。

三、將步驟二得到的黑褐色溶液用40mL去離子水進(jìn)行分散離心處理，離心速度為8000轉(zhuǎn)/分，除去底層的塊狀固體，保留溶液；

四、然后向步驟三得到溶液中加入3倍體積的去離子水，混合均勻后再次離心，去除固體，重復(fù)3次；然后使溶液通過滲析處理(5000MwCO)，除去未反應(yīng)的小分子，最終得到聚合物碳量子點(diǎn)水溶液，避光保存。

將步驟四得到的碳量子點(diǎn)水溶液稀釋至濃度為50mg/L，將其與黃色熒光蛋白的脂粒DNA相互作用形成碳點(diǎn)/DNA復(fù)合物。將得到的碳點(diǎn)/DNA復(fù)合物分別于正常的細(xì)胞(293T)細(xì)胞和癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)進(jìn)行共培養(yǎng)24小時。

本實施例制備的聚合物碳量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率為65％，熒光穩(wěn)定性好，在pH＝3-11的條件，0.1-1mol/L的NaCl水溶液條件下都能穩(wěn)定的存在，經(jīng)紫外照射3h，其熒光性質(zhì)不改變。

實施例3：

一、在盛有去離子水的反應(yīng)器中，加入鄰苯二甲酸1.5g和聚二烯丙基二甲基氯化銨2.0g，在室溫下進(jìn)行超聲波振蕩，使二者充分溶解，形成均一的混合溶液。

二、將步驟一得到的混合溶液放入100mL反應(yīng)釜中，放入200℃的溫度條件下，反應(yīng)12h，混合溶液變成了黑褐色溶液。

三、將步驟二得到的黑褐色溶液用50mL去離子水進(jìn)行分散離心處理，離心速度為10000轉(zhuǎn)/分，除去底層的塊狀固體，保留溶液；

四、然后向步驟三得到溶液中加入2倍體積的去離子水，混合均勻后再次離心，去除固體，重復(fù)3次；然后使溶液通過滲析處理(5000MwCO)，除去未反應(yīng)的小分子，最終得到聚合物碳量子點(diǎn)水溶液，避光保存。

將步驟四得到的碳量子點(diǎn)水溶液稀釋至濃度為50mg/L，將其與綠色熒光蛋白的脂粒DNA相互作用形成碳點(diǎn)/DNA復(fù)合物。將得到的碳點(diǎn)/DNA復(fù)合物分別于正常的細(xì)胞(293T)細(xì)胞和癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)進(jìn)行共培養(yǎng)24小時。

本實施例制備的聚合物碳量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率為64％，熒光穩(wěn)定性好，在pH＝3-11的條件，0.1-1mol/L的NaCl水溶液條件下都能穩(wěn)定的存在，經(jīng)紫外照射3h，其熒光性質(zhì)不改變。