專利名稱：：一種聚乙烯亞胺修飾的碳納米管及其復(fù)合物、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及碳納米管領(lǐng)域，具體涉及一種聚乙烯亞胺修飾的碳納米管(PEI-g-MWCNTs)及其復(fù)合物，及其制備方法及用途。
背景技術(shù)：
：用碳納米管作為載體將外源性DNA導(dǎo)入細(xì)胞引起人們研究興趣。用混酸(硫酸硝酸=3:1)，硝酸氧化切割的碳納米管的側(cè)壁或端口帶有羧基官能團(tuán)，寡DNA可以直接吸附在碳納米管的表面，并能夠?qū)爰?xì)胞中。端氨基二乙烯基修飾的碳納米管通過陽離子功能基團(tuán)與DNA骨架上的負(fù)電荷通過靜電作用能夠濃縮質(zhì)粒DNA、寡DNA，并能夠?qū)①|(zhì)粒DNA有效導(dǎo)入細(xì)胞。這種功能化碳納米管(f-CNT)/DNA復(fù)合物的基因表達(dá)是裸DNA的10倍。聚乙烯亞胺(PEI)是最有效的非病毒基因傳遞載體之一，但是它的體內(nèi)基因傳遞的毒性太高。通常，聚乙二醇(PEG)-融合的PEI和低分子量的PEI毒性低，但是轉(zhuǎn)染效率也很低，相反，高分子量的PEI(22kDa或25kDa)轉(zhuǎn)染效率高，毒性也很大?；谶@些結(jié)果，低分子量的PEI與生物降解物質(zhì)相互融合，嘗試用于基因傳遞是否在提高轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)降解成低分子是否能夠降低毒性。盡管這些可降解PEI能夠降低毒性，但是轉(zhuǎn)染效率仍然比PEI低。據(jù)報(bào)道PEI的高轉(zhuǎn)染效率是由于它的高氨基密度的內(nèi)涵體緩沖效應(yīng)引起的。基于此，文獻(xiàn)[l]報(bào)道了氨基功能化的碳納米管與氨基丙啶反應(yīng)在碳納米管表面聚合物生成PEI結(jié)構(gòu)單元，生成聚乙烯亞胺修飾的碳納米管(PEI-g-MWCNTs)，凝膠電泳試驗(yàn)證實(shí)DNA被安全固定在聚乙烯亞胺修飾的碳納米管，聚乙烯亞胺修飾的碳納米管傳遞質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率是PEI的數(shù)倍(25kDa)，是裸DNA的四個(gè)量級。但是，由于該文獻(xiàn)是采用PEI單元直接在碳納米管表面聚合，僅僅通過熱分析間接證明PEI在碳納米管表面的含量為8。/。(PEI-g-MWCNTs/mg)左右。但是，該文獻(xiàn)不能夠證實(shí)PEI分子量的大小對轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性的影響。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種特定分子量范圍的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管及其基因或藥物納米復(fù)合物，其在特定濃度范圍時(shí)，對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率高且細(xì)胞毒性小，本文還提供了該聚乙烯亞胺修飾的碳納米管及其基因或藥物納米復(fù)合物的制備方法和用途。為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管，所述的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管結(jié)構(gòu)式如下其中PEI的數(shù)均摩爾質(zhì)量為22-600kDa。本發(fā)明還提供了一種聚乙烯亞胺修飾的碳納米管的復(fù)合物,包括:聚乙烯亞胺修飾的碳納米管，其結(jié)構(gòu)式如下其中聚乙烯亞胺的數(shù)均摩爾質(zhì)量為22-600kDa，以及濃縮結(jié)合到聚乙烯亞胺之中的質(zhì)粒DNA。本發(fā)明還提供了一種聚乙烯亞胺修飾的碳納米管的復(fù)合物，包括聚乙烯亞胺修飾的碳納米管，其結(jié)構(gòu)式如下
發(fā)明內(nèi)容<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中聚乙烯亞胺的數(shù)均摩爾質(zhì)量為22-600kDa，以及濃縮結(jié)合到聚乙烯亞胺之中的質(zhì)粒DNA，以及吸附在碳納米管表面的阿霉素。本發(fā)明還提供了一種聚乙烯亞胺修飾的碳納米管/質(zhì)粒DNA/阿霉素納米復(fù)合物在制備抑制腫瘤生長的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種聚乙烯亞胺修飾的碳納米管/質(zhì)粒DNA復(fù)合物在制備轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞體外及動物體內(nèi)的基因治療的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明再提供了一種聚乙烯亞胺修飾的碳納米管的制備方法，在碳納米管的氧化切割與拋光后包括步驟2、PEI嫁接碳納米管氧化切割的碳納米管、鹽酸乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺放入磷酸鈉緩沖溶液中，再加入超分子聚乙烯亞胺(Mn=22-600kDa)，反應(yīng)24h,反應(yīng)混合物加入到IO倍過量的無水乙醇中，用濾膜過濾，洗滌后得到聚乙烯亞胺修飾的碳納米管。本發(fā)明最后提供了一種聚乙烯亞胺修飾的碳納米管與質(zhì)粒DNA復(fù)合物的制備方法，在碳納米管的氧化切割與拋光后包括步驟2、PEI嫁接碳納米管氧化切割的碳納米管、鹽酸乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)放入磷酸鈉緩沖溶液中，再加入超分子聚乙烯亞胺(Mn=22-600kDa)，反應(yīng)混合物加入到IO倍過量的無水乙醇中，用0.22|im聚四氟乙烯濾膜過濾，洗滌后得到聚乙烯亞胺修飾的碳納米管；步驟3、PEI-g-MWCNTs與質(zhì)粒DNA復(fù)合PEI-g-MWCNTs溶解在磷酸鈉緩沖溶液中，將該緩沖溶液與質(zhì)粒DNA按修飾在碳納米管表面的PEI的氮原子數(shù)N與DNA中負(fù)電荷數(shù)P的比例范圍為14混合，溫浴，靜止后，得到所述的復(fù)合物。本發(fā)明的PEI-g-MWCNTs與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物，具有轉(zhuǎn)染效率高和對細(xì)胞毒性小的優(yōu)點(diǎn)，尤其在濃度為30iug/ml時(shí)，轉(zhuǎn)染效率大于90%，細(xì)胞有效性大于80%。具體實(shí)施方式實(shí)例1:MWCNTs的氧化切割與拋光原始MWCNTs(購自深圳納米港)浸泡在6MHC1七天，依次用氫氧化鈉稀溶液，去離子水洗滌并干燥，得到去金屬催化劑的純凈MWCNTs。將100mg純凈MWCNTs放入3:1的80mlH2S04/HN03混合溶液中，在40-50GC水浴中超聲24h。離心分離(7000rpm，5min),沉淀物加入去離子水稀釋，通過0.22pm的聚四氟乙烯膜過濾，用去離子水充分洗滌，放入到4:1的濃50mlH2S04/30%H202的混合溶液中于70QC條件下攪拌30min.，得到氧化切割與拋光的MWCNTs。實(shí)例2:PEI嫁接MWCNTs氧化切割的MWCNTs(20mg)、鹽酸乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)放入50ml磷酸鈉緩沖溶液(PBS)中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌24h后，加入聚乙烯亞胺(Mn=22-600kDa)，繼續(xù)攪拌24h。反應(yīng)混合物加入到10倍過量的無水乙醇中，用0.22pm的聚四氟乙烯膜過濾，依次用無水乙醇、去離子水淋洗，得到的PEI-g-MWCNTs在去離子水中分散性好、懸浮穩(wěn)定l個(gè)月。而切割、拋光的MWCNTs在2h后沉淀。實(shí)例3:PEI-g-MWCNTs中聚乙烯亞胺的含量超分子PEI嫁接到MWCNTs表面的重量通過熱分析(TGA)氮?dú)鈿夥罩蝎@得。本發(fā)明采用的MWCNTs在60(^C時(shí)穩(wěn)定，PEI在500QC完全分解，MWCNTs重量損失約2.5%，而PEI-g-MWCNTs損失10.5%,嫁接的PEI的重量約為8%。PEI嫁接的MWCNTs在去離子水中懸浮穩(wěn)定1個(gè)月，分散性好。而本發(fā)明的MWCNTs在2h后發(fā)生沉淀。實(shí)例4:紫外光譜切割、拋光的MWCNTs在250nm有紫外吸收，而PEI-g-MWCNTs在257nm有紫外吸收。實(shí)例5:熒光光譜分析切割、拋光的MWCNTs在500nm有弱發(fā)射峰，PEI-g-MWCNTs沒有發(fā)射峰。實(shí)例6:掃描電鏡和透射電鏡特征用透射電鏡(TEM)和掃描電鏡試驗(yàn)證實(shí)PEI嫁接到MWCNTs的表面。PEI-g-MWCNTs的透射電鏡圖像顯示嫁接的PEI在MWCNTs表面黑色斑點(diǎn)，而不是均勻的結(jié)合在碳納米管的表面，，這是由于彎曲的碳納米管表面的缺陷，氧化切割后生成不均勻的分布的羧基，嫁接的PEI也不會均勻的纏繞在MWCNTs表面。而掃描電鏡顯示彎曲的MWCNTs表面缺陷多，氧化切割后形成不均勻分布的羧基，PEI在MWCNTs表面的嫁接是非均勻覆蓋。實(shí)例7:激光拉曼試驗(yàn)PEI-g-MWCNTs與切割、拋光的MWCNTs的拉曼光譜類似，表明PEI-g-MWCNTs用PEI修飾后仍然保留了MWCNTs的固有特性。g口1591cm"的G帶，1282cm"的D帶，D帶來自MWCNTs壁的碳缺陷。實(shí)例8:PEI-g-MWCNTs的核磁共振試驗(yàn)PEI-g-MWCNTs的NMR光譜與PEI相比較，重水(020)作溶劑，PEI-g-MWCNTs的&NMR光譜在=3.1ppm是由于嫁接PEI的信號，但是PEI-g-MWCNTs信號峰寬，表明嫁接到MWNTs表面的PEI自由度降低。PEI的部分氨基被質(zhì)子化(PEI的pKa大于8.0)。質(zhì)子化或部分質(zhì)子化的PEI促使PEI-g-MWCNTs形成穩(wěn)定的懸浮液，調(diào)節(jié)pH^9時(shí)，PEI-g-MWCNTs在5h內(nèi)沉淀。實(shí)例9:PEI-g-MWNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的；電位研究;電位顯示PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物帶正電性，易于結(jié)合帶負(fù)電性的細(xì)胞膜，促進(jìn)細(xì)胞的胞吞作用。實(shí)例10:PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物PEI-g-MWCNTs溶解在磷酸鈉緩沖溶液(pH=7.2)中，質(zhì)粒p53DNA被稀釋到選擇的濃度為2嗎/ml，將該緩沖溶液與質(zhì)粒DNA按一定比例(修飾在碳納米管表面的PEI的氮原子數(shù)(N)與DNA中負(fù)電荷數(shù)(P)的比例范圍是l-4)混合，在5()GC水浴中0.5h，靜止后，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染和檢驗(yàn)細(xì)胞毒性。具體的，取N:P分別為l.O，1.5，2.5，4四個(gè)比值分別進(jìn)行上述操作。實(shí)例11:PEI/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物將溶解在磷酸鈉(PBS)緩沖溶液中PEI與質(zhì)?；虬匆欢ǖ腘:P比例(修飾在碳納米管表面的PEI的氮原子數(shù)(N)與DNA中負(fù)電荷數(shù)(P)的比例范圍是1-4，在50GC水浴中0.5h，靜止后，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染和檢驗(yàn)細(xì)胞毒性。具體的，取N:P分別為l.O，1.5，2.5，4四個(gè)比值分別進(jìn)行上述操作。實(shí)例12:PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物在十二垸基硫酸鈉和氯化鈉溶液中的穩(wěn)定性PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對鹽溶液的穩(wěn)定性用凝膠電泳試驗(yàn)證明。對比研究裸質(zhì)粒DNA、PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的"/()十二烷基硫酸鈉(SDS)、PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的水溶液、PEI-g-MWNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的0.5M氯化鈉溶液、PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的1M氯化鈉溶液以及PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的1.5M氯化鈉溶液。凝膠電泳在磷酸鈉緩沖溶液(20mM,pH:7.2)中室溫條件下運(yùn)行，電壓80V，60min。觀察DNA帶(UV，X=254nm)。結(jié)果顯示PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物在大于1M氯化鈉溶液或1%十二垸基硫酸鈉溶液中穩(wěn)定性差。實(shí)例13:PEI/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對Hela和293T細(xì)胞的毒性^\復(fù)\^合細(xì)\\物活^\率^\10|tig/ml20|ug/ml30pg/ml100嗎/mlHela細(xì)胞52%17%8%5%293T細(xì)胞35%16%5%3%兩萬個(gè)Hela細(xì)胞和293T細(xì)胞分別種植在96孔板中，孵育24h，在100(XLDMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中PEI/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的濃度為5-100嗎/ml，N/P比為4，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100新鮮DMEM代替，每孔分別加入20pLMTT。在37°C，C02培養(yǎng)箱中細(xì)胞孵育4h，加入100pL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過570nm每孔吸光率測定細(xì)胞的有效性，測試細(xì)胞的存活率。具體的，如上表所示，PEI/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的濃度依次為每毫升IO嗎、20嗎、30嗎、100pl，進(jìn)行上述操作，存活率分別如上表所示。10實(shí)例14:PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對Hela細(xì)胞的毒性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>兩萬個(gè)Hela細(xì)胞種植在96孔板中，孵育24h，在100pLDMEM/10%胎牛血清(FBS)溶液中PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的濃度分別為10-100嗎/ml，N/P比為4，再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100新鮮DMEM代替，每M另!Lta入20|nLMTT。在37。C，032培養(yǎng)箱中細(xì)胞孵育4h，加入100fiL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過570nm每孔吸光率測定細(xì)胞的有效性，測試細(xì)胞的存活率。具體的，如上表所示，取PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的濃度依次為每毫升lO]ug、20嗎、30^1、100嗎，進(jìn)行上述操作，存活率分別如上表所示。實(shí)例15:PEI-g-MWCNTs對Hela和HEK293T細(xì)胞的毒性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>兩萬個(gè)Hela和HEK293T細(xì)胞種植在96孔板中，孵育24h，在100DMEM/10。/。胎牛血清(FBS)溶液中PEI-g-MWCNTs濃度為10-100|Lig/ml,再孵育24h后除去培養(yǎng)介質(zhì)，用100j^L新鮮DMEM代替，每孔分別加入20pLMTT。在37。C，(302培養(yǎng)箱中細(xì)胞孵育4h，加入lOO^iL二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。通過570nm每孔吸光率測定細(xì)胞的有效性，測試細(xì)胞的存活率。具體的，如上表所示，取PEI-g-MWCNTs的濃度依次為每毫升10iiig、20嗎、30嗎、IOO嗎進(jìn)行上述操作，存活率分別如上表所示。實(shí)例16:PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的轉(zhuǎn)染細(xì)胞試驗(yàn)本發(fā)明使用Hela細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)(JPC)定量研究轉(zhuǎn)染效果。將實(shí)例IO-中構(gòu)建的N:P分別為1.0，1.5，2.5，4的PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物溶液加入到平面培養(yǎng)的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染時(shí)間分別是4h。然后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)。熒光酶標(biāo)儀檢測顯示其轉(zhuǎn)染效率分別是47%，66%，84%,95%。實(shí)例17:PEI/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物的轉(zhuǎn)染細(xì)胞試驗(yàn)將實(shí)例11中構(gòu)建的N:P分別為1.0，1.5，2.5，4的PEI/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物溶液加入到平面培養(yǎng)的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染時(shí)間分別是4h。然后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)。熒光酶標(biāo)儀檢測顯示其轉(zhuǎn)染效率分別是17%，22%，34%，45%。實(shí)例18:PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物對小鼠肺和脊髓內(nèi)鞘的體內(nèi)轉(zhuǎn)染PEI-g-MWCNTs與質(zhì)粒DNA的N:P比例為2.5和4，質(zhì)量濃度為30嗎/ml。對小鼠尾靜脈注射PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA復(fù)合物，48h后處死小鼠，取小鼠肺和脊髓進(jìn)行切片，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染效率分別約92%和95%。實(shí)例19:PEI-g-MWCNTs/人未甲基化寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)納米復(fù)合物對小鼠脾細(xì)胞和胰腺細(xì)胞的體外免疫活性PEI國g-MWCNTs與CpG-ODN的N:P比例分為1.0，1.5，2.5，4.0，質(zhì)量濃度為30嗎/ml。對小鼠脾細(xì)胞和胰腺細(xì)胞分別用上述不同比例的PEI-g-MWCNTs/CpG-ODN復(fù)合物孵育3天，對脾細(xì)胞免疫活性分別增加25%,31%，45%，58%，對胰腺細(xì)胞免疫活性分別增加33%,37%，46%,67%。實(shí)例20:PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒p53DNA納米復(fù)合物對鼠骨肉瘤細(xì)胞的體外基因治療PEI-g-MWCNTs與質(zhì)粒p53基因的N:P比例分別為2，4，質(zhì)量濃度為30嗎/ml。鼠骨肉瘤細(xì)胞用PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒p53DNA復(fù)合物孵育3天，體外基因治療顯示腫瘤增長受抑制分別為35%，43%。實(shí)例21:PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒p53DNA納米復(fù)合物與阿霉素混合物轉(zhuǎn)染鼠骨肉瘤細(xì)胞的體內(nèi)基因治療PEI-g-MWCNTs與p53基因的N:P比例為2，質(zhì)量濃度為30嗎/ml。與質(zhì)量濃度為10|ag/ml的阿霉素混合。鼠骨肉瘤細(xì)胞用PEI-g-MWCNTs/p53基因復(fù)合物與阿霉素混合液孵育3天，鼠骨肉瘤細(xì)胞增長受抑制率為47%。實(shí)例22:PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒p53DNA納米復(fù)合物與阿霉素混合物轉(zhuǎn)染鼠骨肉瘤細(xì)胞的體內(nèi)基因治療PEI-g-MWCNTs與p53基因的N:P比例為4，質(zhì)量濃度為30/ml，與質(zhì)量濃度為20|iig/ml的阿霉素混合。鼠骨肉瘤細(xì)胞用PEI-g-MWCNTs/P53基因復(fù)合物與阿霉素混合液孵育3天，鼠骨肉瘤細(xì)胞增長受抑制率為63%。實(shí)例23:PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒p53DNA/阿霉素納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染鼠骨肉瘤細(xì)胞的體外基因治療PEI-g-MWCNTs與p53基因的N:P比例分別為2和4，阿霉素吸附在PEI-g-MWCNTs/p53基因復(fù)合物上的分子數(shù)為6x1016個(gè)，質(zhì)量濃度為30嗎/ml。鼠骨肉瘤細(xì)胞用PEI-g-MWCNTs/p53基因復(fù)合物孵育3天，鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示腫瘤增長受抑制分別為55%和70%。結(jié)論及分析PEI嫁接到MWCNTs含量在8%左右；PEI在MWCNTs表面的局域分布是由于碳納米管表面的羧基不均勻分布的結(jié)果；PEI-g-MWCNTs濃縮質(zhì)粒DNA的復(fù)合物的形貌特征是質(zhì)粒DNA被PEI-g-MWCNTs中的PEI濃縮，在MWCNTs表面形成納米顆粒；PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA復(fù)合物在十二烷基硫酸鈉中不穩(wěn)定，在高濃度氯化鈉溶液中不穩(wěn)定，在去離子水或磷酸鈉緩沖溶液中穩(wěn)定；PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA復(fù)合物對細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率大于95%(細(xì)胞為Hela細(xì)胞，HEK293T細(xì)胞,293T細(xì)胞,K562細(xì)胞)。體內(nèi)試驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染效率也高于90%，其轉(zhuǎn)染效率比裸DNA大4個(gè)量級，比單獨(dú)PEI高20倍。本發(fā)明的效果顯示PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒DNA復(fù)合物對上述細(xì)胞的有效性大于80%，比單獨(dú)PEI對細(xì)胞的有效性高4-5倍。人未甲基化寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)是對人體具有免疫活性的核酸，但是，對人體直接注射CpG-ODN的免疫效果很差。本發(fā)明利用PEI-g-MWCNTs與CpG-ODN構(gòu)成PEI-g-MWCNTs/CpG隱ODN納米復(fù)合物有利于保護(hù)CpG-ODN在細(xì)胞酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性，提高其利用度，實(shí)驗(yàn)表明，PEI-g-MWCNTs/CpG-ODN納米復(fù)合物對脾細(xì)胞免疫活性最高為58%，對胰腺細(xì)胞免疫活性最高為67%。上述PEI,MWCNTs，PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒p53DNA納米復(fù)合物細(xì)胞毒性結(jié)果表明，MWCNTs沒有細(xì)胞毒性，PEI600K毒性很高。PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒p53DNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染鼠骨肉瘤細(xì)胞的體外抑制率最高為43%。PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒p53DNA納米復(fù)合物與阿霉素混合物對鼠骨肉瘤細(xì)胞的體內(nèi)抑制率最高為63%。PEI-g-MWCNTs/質(zhì)粒p53DNA/阿霉素納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染鼠骨肉瘤細(xì)胞的體外基因治療效率最高為70%。(1)YLiu，D.C.Wu，W.D.Zhang，X.Jiang，C.B.He,T.S.Chung,S.H.Goh,andK.W.Leong,聚乙烯亞胺嫁接的多壁碳納米管用于非共價(jià)鍵固定和有效傳遞DNA，Angew.Chem.Int.Ed"2005,44，4782—4785。權(quán)利要求1、一種聚乙烯亞胺修飾的碳納米管，所述的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管結(jié)構(gòu)式如下其特征在于，其中聚乙烯亞胺的數(shù)均摩爾質(zhì)量為22-600kDa。2、一種聚乙烯亞胺修飾的碳納米管的復(fù)合物,包括聚乙烯亞胺修飾的碳納米管，其結(jié)構(gòu)式如下其中聚乙烯亞胺的數(shù)均摩爾質(zhì)量為22-600kDa，以及濃縮結(jié)合到聚乙烯亞胺之中的質(zhì)粒DNA。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管的復(fù)合物，其特征在于,所述的質(zhì)粒DNA包括P53DNA，綠色熒光蛋白表達(dá)，以及人未甲基化寡聚脫氧核苷酸質(zhì)粒DNA。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管的復(fù)合物，其特征在于，所述的碳納米管表面的PEI的氮原子數(shù)(N)與所述的質(zhì)粒p53DNA中負(fù)電荷數(shù)(P)的比值范圍為1-4，在磷酸鈉緩沖溶液中的質(zhì)量濃度為10-100|Lig/mlo5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管的復(fù)合物，其特征在于,所述的碳納米管表面的PEI的氮原子數(shù)(N)與所述的質(zhì)粒p53DNA中負(fù)電荷數(shù)(P)的比值為l.O，1.5，2.5，4，所述的磷酸鈉緩沖溶液中的質(zhì)量濃度為30嗎/ml。MWCNTs6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管的復(fù)合物，其特征在于，所述的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管表面的PEI的氮原子數(shù)(N)與人未甲基化寡聚脫氧核苷酸質(zhì)粒DNA中負(fù)電荷數(shù)(P)的比值范圍為1-4，在磷酸鈉緩沖溶液中的質(zhì)量濃度為10-100|iig/ml。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管的復(fù)合物，其特征在于，所述的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管表面的PEI的氮原子數(shù)(N)與人未甲基化寡聚脫氧核苷酸質(zhì)粒DNA中負(fù)電荷數(shù)(P)的比值為l.O，1.5，2.5，4，所述的磷酸鈉緩沖溶液中的質(zhì)量濃度為30pg/ml。8、根據(jù)權(quán)利要求2所述的碳納米管的復(fù)合物在制備轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞體外及動物體內(nèi)的基因治療的藥物中的應(yīng)用。9、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管的復(fù)合物，其特征在于，在碳納米管表面吸附阿霉素后構(gòu)成聚乙烯亞胺修飾的碳納米管/質(zhì)粒DNA/阿霉素的復(fù)合物。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管/質(zhì)粒DNA/阿霉素納米復(fù)合物在制備抑制腫瘤生長的藥物中的應(yīng)用。11、一種聚乙烯亞胺修飾的碳納米管的制備方法，其特征在于，在步驟1的碳納米管的氧化切割與拋光之后包括步驟2、PEI嫁接碳納米管氧化切割的碳納米管、鹽酸乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺放入磷酸鈉緩沖溶液中，再加入分子量為22-600kDa的超分子聚乙烯亞胺，反應(yīng)24h，反應(yīng)混合物加入到IO倍過量的無水乙醇中，用濾膜過濾，洗滌后得到聚乙烯亞胺修飾的碳納米管。12、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的制備方法，其特征在于，步驟2中所述的過濾用0.22pm聚四氟乙烯濾膜來完成。13、一種聚乙烯亞胺修飾的碳納米管與質(zhì)粒DNA的復(fù)合方法，其特征在于，在步驟1的碳納米管的氧化切割與拋光后包括步驟2、PEI嫁接碳納米管氧化切割的碳納米管、鹽酸乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺放入磷酸鈉緩沖溶液中，再加入分子量為22-600kDa超分子聚乙烯亞胺，反應(yīng)混合物加入到IO倍過量的無水乙醇中，用0.22pm聚四氟乙烯濾膜過濾，洗滌后得到聚乙烯亞胺修飾的碳納米管；步驟3、聚乙烯亞胺修飾的碳納米管與質(zhì)粒DNA復(fù)合聚乙烯亞胺修飾的碳納米管溶解在磷酸鈉緩沖溶液中，質(zhì)粒DNA被稀釋到選擇的濃度為2嗎/ml，將該緩沖溶液與質(zhì)粒DNA按修飾在碳納米管表面的PEI的氮原子數(shù)(N)與DNA中負(fù)電荷數(shù)(P)的比例范圍為1~4混合，溫浴，靜止后，得到所述的復(fù)合物。14、根據(jù)權(quán)利要求13的一種聚乙烯亞胺修飾的碳納米管與質(zhì)粒DNA的復(fù)合方法,其特征在于，在步驟3中的所述的PEI的氮原子數(shù)(N)與DNA中負(fù)電荷數(shù)(P)的比值為1.0或1.5或2.5或4。全文摘要本發(fā)明公開了一種聚乙烯亞胺修飾的碳納米管及其質(zhì)粒DNA的復(fù)合物，本發(fā)明采用的質(zhì)粒DNA包括P53DNA，綠色熒光蛋白表達(dá)(JPC)以及人未甲基化寡聚脫氧核苷酸質(zhì)粒DNA。本發(fā)明的聚乙烯亞胺修飾的碳納米管與質(zhì)粒DNA的復(fù)合物，具有轉(zhuǎn)染效率高和對細(xì)胞毒性小的優(yōu)點(diǎn)，尤其在濃度為30g/ml時(shí)，轉(zhuǎn)染效率大于90％，細(xì)胞有效性大于80％。該聚乙烯亞胺修飾的碳納米管的質(zhì)粒DNA復(fù)合物在制備轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞體外及動物體內(nèi)的基因治療的藥物中有廣闊的應(yīng)用前景，而聚乙烯亞胺修飾的碳納米管/質(zhì)粒DNA/阿霉素納米復(fù)合物在制備抑制腫瘤生長的藥物中也有著廣泛應(yīng)用。文檔編號C01B31/00GK101428788SQ200810201238公開日2009年5月13日申請日期2008年10月15日優(yōu)先權(quán)日2008年10月15日發(fā)明者于伯章,馬繼飛,慶黃申請人:中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所