專利名稱：一種水稻全基因組snp芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、功能基因組學(xué)、生物信息學(xué)和基因組育種領(lǐng)域，更具體涉及一種水稻全基因組SNP芯片及制備方法，同時(shí)還涉及這種水稻SNP芯片的用途。
背景技術(shù)：
分子標(biāo)記(Molecular marker)是指應(yīng)用大分子化合物，蛋白質(zhì)和DNA,在生物個(gè)體間的差異來標(biāo)識(shí)遺傳變異的技術(shù)方法。由于蛋白質(zhì)在個(gè)體間的差異較DNA小，而且難以檢測，因此，大部分分子標(biāo)記是利用DNA水平上的遺傳多態(tài)性，也稱為DNA分子標(biāo)記。分子標(biāo)記技術(shù)(Molecular marker technology)主要是指檢測DNA變異的分子生物學(xué)技術(shù)。分子標(biāo)記技術(shù)在作物研究中主要有以下4個(gè)方面的用途(I)遺傳連鎖圖的構(gòu)建和基因定位；
(2)種質(zhì)資源研究和品種鑒定；(3)生物性狀關(guān)聯(lián)分析和系統(tǒng)進(jìn)化研究；(4)分子育種和作物遺傳改良。隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)也逐漸向低成本、高通量、高精度方向發(fā)展。傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù),如RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism,限制性片段長度多態(tài)性)和SSR(Simple Sequence Repeat,簡單序列重復(fù))技術(shù)在過去的30年里發(fā)揮著重要作用。但是，傳統(tǒng)的分子標(biāo)記技術(shù)存在許多局限性，如通量低、數(shù)量少、操作過程繁瑣，不能滿足功能基因組研究的需求。另外，現(xiàn)代分子育種技術(shù)對分子標(biāo)記的要求越來越高，要求對基因進(jìn)行準(zhǔn)確操作，要求對全基因組遺傳背景進(jìn)行精確控制，要求對特定性狀進(jìn)行精準(zhǔn)改良，迫切需要大規(guī)模高通量的分子標(biāo)記技術(shù)。因此，開發(fā)和利用新型分子標(biāo)記技術(shù)，對于功能基因組研究和作物遺傳改良具有重要的理論和實(shí)踐意義。SNP(Single Nucleotide Polymorphism,單核苷酸多態(tài)性)，是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異形成的DNA序列上的多態(tài)性。理論上講，基因組DNA上任何一個(gè)核苷酸都有四種可能的堿基組成形式，但大多數(shù)情況下只有兩種堿基的變異，由一個(gè)堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換(Transitions)或顛換(Transversion)而變成另一個(gè)堿基,通常轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率要高于顛換，所以SNP標(biāo)記通常為雙等位基因(Vignal等，A review on SNP and other typesof molecular markers and their use in animal genetics. Genet Sel EvoI.2002,34:275-306.)。SNP標(biāo)記數(shù)量多，在基因組上分布廣。基于SNP的新型高通量分子標(biāo)記技術(shù)主要有兩大類一類是基于新一代測序技術(shù)的高通量分子標(biāo)記技術(shù)；另一類是基于基 因芯片技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)?；诘诙鷾y序技術(shù)開發(fā)分子標(biāo)記的方法已經(jīng)在水稻中得到了大量應(yīng)用，如Huang等利用Illumina/Solexa測序技術(shù)對水稻中一個(gè)包含150個(gè)家系的RIL (Recombinant Inbred Line,重組自交系)群體進(jìn)行了全基因組低覆蓋度測序獲得SNP標(biāo)記，對RIL進(jìn)行基因分型和構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖(Huang等，High-throughputgenotyping by whoIe-genome resequencing. Genome Res. 2009,19 :1068-1076) ;Xie 等發(fā)明了一種不依賴于親本的RIL群體基因分型方法,利用最簡約重組(Maximum Parsimonyof Recombination, MPR)原則從低覆蓋度測序RIL群體基因組序列信息中獲得SNP標(biāo)記推測親本基因型，大大降低了測序成本(Xie等，Parent-independent genotyping forconstructing an ultrahigh-density linkage map based on population sequencing.Proc Natl Acad Sci USA. 2010，107 :10578-10583) ;Yu 等對基于第二代測序技術(shù)開發(fā)的SNP標(biāo)記構(gòu)建的遺傳連鎖圖與用傳統(tǒng)分子標(biāo)記RFLP/SSR構(gòu)建的連鎖圖進(jìn)行了比較，闡述了基于測序的SNP構(gòu)建遺傳連鎖圖在基因定位中的優(yōu)勢(Yu等，Gains in QTL detectionusing an ultra-high density SNP map based on population sequencing relativeto traditional RFLP/SSR markers. PLoS One. 2011,6 :el7595)。最近，利用第二代測序技術(shù)對大量水稻品種進(jìn)行全基因組測序開發(fā)SNP標(biāo)記，用全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-WideAssociation Study,GffAS)得到了許多與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的位點(diǎn)(Huang等,Genome-wideassociation studies of 14 agronomic traits in rice landraces. Nat Genet. 2010,42 :961-967 ；Huang 等，Genome-wide association study of flowering time and grainyield traits in a worldwide collection of rice germplasm. Nat Genet. 2011)。但是，該方法也有一些不足，低覆蓋度的測序數(shù)據(jù)不能使標(biāo)記覆蓋每個(gè)個(gè)體，具有測序隨機(jī)性，大多數(shù)個(gè)體SNP位點(diǎn)基因型是通過生物信息學(xué)計(jì)算得到的，不同個(gè)體之間測序的單個(gè)SNP基 因分型數(shù)據(jù)很難進(jìn)行直接比較；而直接進(jìn)行深度測序，即使是像水稻這樣的小基因組，目前測序成本仍然很高，難以滿足大規(guī)模育種需求。利用測序獲得SNP標(biāo)記的另一種做法是對基因組DNA先經(jīng)過酶切等方法處理減小基因組的復(fù)雜性構(gòu)建復(fù)雜性降低的基因組DNA文庫，然后利用第二代測序技術(shù)進(jìn)行深度測序，如RAD (Restriction site Associated DNA,酶切位點(diǎn)關(guān)聯(lián) DNA)標(biāo)簽測序(Baird 等，Rapid SNP discovery and genetic mappingusing sequenced RAD markers. PLoS One. 2008, 3 :e3376)?；诘诙鷾y序技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)雖然通量高、靈活高效，但是短片段測序依賴于參照基因組序列、位于重復(fù)序列區(qū)域或者在參照基因組上沒有的區(qū)域很難檢測和分析，測序數(shù)據(jù)的處理、序列基因組定位和基因分型的計(jì)算等復(fù)雜過程對數(shù)據(jù)分析的要求較高，需要專業(yè)生物信息學(xué)人員才能完成。這些缺點(diǎn)一定程度上限制了該方法的廣泛使用，特別是在分子育種中大規(guī)模使用。另一種高通量分子標(biāo)記技術(shù)是基于基因芯片的技術(shù)。基因芯片(gene chip)又稱DNA芯片(DNA chip)或DNA陣列(DNA array)，指固定在玻片、硅片、尼龍膜等支持介質(zhì)上的核酸分子探針?biāo)鶚?gòu)成的點(diǎn)陣列(array)。基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)80年代提出來的，在21世紀(jì)初進(jìn)入飛速發(fā)展時(shí)期?；蛐酒谘邪l(fā)初期主要應(yīng)用于基因表達(dá)譜和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究(Birnbaum 等，Agene expression map of the Arabidopsis root.Science. 2003,302 :1956-1960 ;Wang 等，A dynamic gene expression atlas coveringthe entire life cycle of rice. Plant J.2010,61 :752-766 ；ffest 等，Global eQTLmapping reveals the complex genetic architecture of transcript-level variationin Arabidopsis. Genetics. 2007,175 :1441-1450 ；ffang 等，Aglobal analysis of QTLsfor expression variations in rice shoots at the early seedling stage. PlantJ. 2010,63 :1063-1074) 0現(xiàn)在更多地用于基因型分型和功能基因組學(xué)的研究?；诨蛐酒姆肿訕?biāo)記技術(shù)主要有SNP基因芯片(McNally等，Genomewide SNP variationreveals relationships among landraces and modern varieties of rice. Proc NatlAcad Sci USA. 2009，106 :12273-12278)、SFP (Single Feature Polymorphism，單片段多態(tài)性)(Borevitz 等，Large-scale identification of single-feature polymorphismsin complex genomes. Genome Res. 2003,13 :513-523)、DArT 技術(shù)(Diversity ArrayTechnology,多樣性芯片技術(shù))(Jaccoud 等，Diversity arrays a solid statetechnology for sequence information independent genotyping. Nucleic AcidsRes. 2001，29 :E25)、RAD 技術(shù)(Miller 等，RAD marker microarrays enable rapidmapping of zebrafish mutations. Genome Biol. 2007,8 R105 ；Miller 等，Rapid andcost-effective polymorphism identification and genotyping using restrictionsite associated DNA(RAD)markers. Genome Res. 2007，17 :240-248.)等。最初開發(fā)的基因表達(dá)譜芯片就可以應(yīng)用于檢測SFP，，用基因組DNA或RNA與基因表達(dá)譜芯片上的寡居核苷酸探針雜交即可，不需要專門開發(fā)標(biāo)記基因芯片，但是該方法獲得的標(biāo)記檢測結(jié)果假陽性高(Kumar 等，Single feature polymorphism discovery in rice. PLoS One. 2007，2 e284 ；Luo 等，SFP genotyping from affymetrix arrays is robust but largelydetects cis-acting expression regulators. Genetics. 2007，176 :789-800.)。DArT和RAD技術(shù)雖然不依賴于基因組序列，但是構(gòu)建基因組文庫費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且只能達(dá)到中等密度和通量，很難滿足分子育種中大規(guī)模、高密度和高精度要求。RAD芯片技術(shù)后來發(fā)展為利用第二代測序技術(shù)開發(fā)SNP標(biāo)記(Hohenlohe等，Population genomics ofparallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 2010，6 e 1000862 ;Emerson 等，Resolving postglacial phylogeography usinghigh-throughput sequencing. Proc Natl Acad Sci USA. 2010，107 :16196-16200)。SNP芯片是基因芯片技術(shù)中最適合用于大規(guī)模育種的基因分型技術(shù)。目前，玉米中IllrnninaInfinium MaizeSNP50芯片用于種質(zhì)資源鑒定和關(guān)聯(lián)分析(Ganal等，A large maize (Zeamays L.)SNP genotyping array !development and germplasm genotyping, and geneticmapping to compare with the B73 reference genome. PLoS One. 2011,6 e28334 ；Cook等，Genetic architecture of maize kernel composition in the nested associationmapping and inbred association panels. Plant physiology. 2011)，水稻中 AffymetrixGeneChip Rice 44K基因芯片用于水稻種質(zhì)資源遺傳多樣性分型和全基因組關(guān)聯(lián)分析(Zhao 等，Genome-wide association mapping reveals a rich genetic architectureof complex traits in Oryza sativa. Nat Commun. 2011，2 :467)，而不同密度的 IlluminaGoldenGate SNP基因芯片已經(jīng)應(yīng)用于水稻分子育種(Zhao等，Genomic diversity andintrogression in 0. sativa reveal the impact of domestication and breeding onthe rice genome. PLoS One. 2010,5 el0780 ；Chen 等，Development and applicationof a set of breeder-friendly SNP markers for genetic analyses and molecularbreeding of rice(Oryza sativa L.). Theor Appl Genet. 2011，123 :869-879 ;Thomson等，High-throughput single nucleotide polymorphism genotyping for breedingapplications in rice using the BeadXpress platform. Mol Breeding. 2011 :1-12)。水稻中GoldenGate SNP芯片雖然很多，但是由于技術(shù)的限制，一張芯片上的標(biāo)記數(shù)一般不超過3000，很難滿足育種中全基因組背景精確控制的需求，迫切需要高通量、重復(fù)性好、技術(shù)成熟的水稻育種芯片。 Illumina公司的Infinium SNP芯片技術(shù)是目前比較成熟和應(yīng)用廣泛的全基因組SNP檢測平臺(tái)。它應(yīng)用激光共聚焦光纖微珠芯片技術(shù)和獨(dú)特的微珠陣列BeadAiray技術(shù)生產(chǎn)的芯片可以承載巨大的微珠——SNP數(shù)目。目前該公司生產(chǎn)的人類SNP芯片最多可容納110萬個(gè)SNP標(biāo)記(http://www. illumina. com)。在芯片制作時(shí),每個(gè)包含50個(gè)脫氧核苷酸的SNP探針序列與特定的微珠耦聯(lián)，微珠種類根據(jù)承載的SNP數(shù)目決定，從幾千至百萬以上，每類微珠由其特定的地址序列和SNP探針序列進(jìn)行編碼和檢測。每種類型的微珠在每張芯片上平均重復(fù)30次，從而保證每個(gè)SNP被檢測的成功率和可重復(fù)性。IlluminaInfinium SNP芯片在人類、小鼠、玉米等物種的基因組變異研究中已得到廣泛應(yīng)用，但在水稻中還沒有這類芯片的報(bào)道。為了使水稻功能基因組研究成果得到利用，不斷滿足水稻大規(guī)模商業(yè)化育種需求，申請人設(shè)計(jì)制作了這款SNP基因芯片。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種水稻全基因組SNP芯片，命名為RICE6K水稻SNP芯片。該芯片上的SNP位點(diǎn)包括兩類，一類是從水稻品種測序數(shù)據(jù)中篩選出的多態(tài)性好并且具有代表性的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針(本文稱為第一類探針)，另一種是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的已克隆的水稻重要功能基因的與功能相關(guān)的SNP/INDEL位點(diǎn)設(shè)計(jì)的探針(本文稱為第二類探針)。其中，第一類探針包含從核心親本基因組序列及520個(gè)水稻品種重測序數(shù)據(jù)比較分析中篩選出的5，556個(gè)SNP位點(diǎn)，第二類探針包含與40個(gè)水稻功能基因的功能位點(diǎn)相關(guān)的80個(gè)SNP/INDEL位點(diǎn)，總共檢測5，636個(gè)SNP/INDEL位點(diǎn)。RICE6K水稻SNP芯片是采用IlluminaInfinium專利制造技術(shù)(美國專利，US Patent#US6, 429, 027)制作的光纖微珠芯片，每張芯片可同時(shí)檢測24個(gè)樣品。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了一種水稻全基因組SNP芯片及制備方法，用于本發(fā)明的水稻SNP檢測芯片的特異性探針。本發(fā)明獲得的5，636個(gè)SNP/INDEL位點(diǎn)具有SEQIDNo. 0001 SEQ ID No. 5636所示的DNA序列和特征。本發(fā)明所說的RICE6K水稻全基因組SNP芯片是指根據(jù)這5，636條序列利用Infinium專利設(shè)計(jì)制造技術(shù)(美國專利，USPatent#US 6，429，027)制作的芯片。本發(fā)明所說的RICE6K水稻全基因組SNP芯片上的SNP/INDEL位點(diǎn)是指SEQ ID No. 0001 SEQ ID No. 5636所示的序列中方括號(hào)([])中的核苷酸。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供了一種水稻全基因組SNP芯片在檢測水稻DNA樣品(水稻種質(zhì)資源分子標(biāo)記指紋分析、秈稻和粳稻雜交群體基因型、育種材料的遺傳背景、水稻種子)中的應(yīng)用，由于該芯片設(shè)計(jì)時(shí)傾向于挑選在秈稻和粳稻兩個(gè)亞種間具有多態(tài)性的SNP位點(diǎn)，所以優(yōu)選檢測秈稻和粳稻兩個(gè)亞種間的雜交群體，同時(shí)還適用于檢測秈稻或粳稻亞種內(nèi)的雜交群體。該芯片可以對水稻品種資源進(jìn)行分子標(biāo)記指紋分析、對雜交群體后代進(jìn)行基因型鑒定、對具體材料的重要功能基因進(jìn)行鑒定和表型預(yù)測。一種水稻全基因組SNP芯片的制備方法，包括以下步驟URICE6K SNP芯片上的第一類探針的獲得申請人:利用Illumina新一代測序技術(shù)對水稻核心親本材料進(jìn)行了基因組測序。另外，2010年年底，Huang等公布了 520個(gè)水稻地方品種的基因組重測序數(shù)據(jù)(Huang等，Genome-wide association studies of 14 agronomic traits in rice landraces. NatGenet. 2010,42 :961-967)。申請人從公共數(shù)據(jù)庫下載了此數(shù)據(jù)，并以日本晴基因組(MSU第 6. I 版，http:"rice. plantbioloRY. msu. edu/)為參考序列，使用 MAQ 軟件(http://sourceforRe. net/pro iects/maq)將這些基因組序列數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配分析。探針設(shè)計(jì)的具體步驟如下(I)先按照下述標(biāo)準(zhǔn)鑒定得到了 4，236，029個(gè)高質(zhì)量SNP 僅當(dāng)測序序列在基因組上的匹配分?jǐn)?shù)(mapping quality)至少為20時(shí),該序列才用于鑒定SNP ； 計(jì)算基因組上每位點(diǎn)不同堿基的測序質(zhì)量分?jǐn)?shù)(base quality)的總和，SNP位點(diǎn)必須只有兩種堿基的測序質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和大于100，并且這兩種堿基每種都有至少10條測序序列支持；SNP位點(diǎn)的兩種堿基每種至少有5條匹配分?jǐn)?shù)超過40的序列支持，并且對應(yīng)的堿基測序質(zhì)量都超過20 ;該SNP位點(diǎn)總的測序覆蓋度大于或等于50并小于或等于1000。(2)進(jìn)一步使用更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)獲得1，559，745個(gè)候選SNP 除去在至少5個(gè)品種中呈現(xiàn)雜合狀態(tài)的SNP位點(diǎn)；
除去測序覆蓋度小于80或大于800的SNP位點(diǎn)； 將所有品種分為秈稻和粳稻，并計(jì)算SNP的次要等位基因在這兩個(gè)亞種中的頻率，除去在所有品種、秈粳亞種中次要等位基因頻率均小于0. 2的SNP ； 除去仍然與左右兩側(cè)SNP距離均小于50bp的SNP。(3)由于探針長度為50bp，設(shè)計(jì)時(shí)需要選擇較保守序列，以免影響雜交。為了獲得合適的探針，申請人還做了以下分析 分別提取SNP左側(cè)和右側(cè)50bp序列(如果50bp內(nèi)含有其他SNP，則不提取)，使用 BLAT 程序(Kent 等，BLAT-the BLAST-Iike alignment tool. Genome Res. 2002,12 656-664.)比對基因組。如果兩側(cè)序列在基因組上均存在兩個(gè)或以上同一性(identity)超過85%的匹配，則去除該SNP ； 分別提取秈稻品種珍汕97和明恢63(見遺傳資源表I)對應(yīng)的SNP左側(cè)和右側(cè)50bp序列，并與粳稻日本晴參照序列(MSU第6. I版，http://rice. plantbioloRY. msu.edu/)相比較，如果兩側(cè)序列均不一致，去除該SNP。通過上述分析，申請人獲得了 105，5959個(gè)符合探針設(shè)計(jì)要求的SNP，其中有35. 5%的SNP基本已在秈粳亞種中固定(秈粳亞種內(nèi)占主要地位的等位基因類型不同，并分別占據(jù)90%以上的比例)，42. I %的SNP在秈稻亞種中具有多態(tài)性，而16. 9%的SNP在粳稻亞種中具有多態(tài)性。申請人:進(jìn)一步分析了 SNP之間的連鎖不平衡。將染色體分為每IOOkb—個(gè)區(qū)段，計(jì)算區(qū)段內(nèi)所有SNP兩兩之間的r2(r為皮爾森相關(guān)系數(shù)，Pearson correlationcoefficient)。經(jīng)過嘗試，申請人以r2 = 0. 64作為閾值，利用一種貪婪算法(Carlson等，Selecting a maximally informative set of single-nucleotide polymorphismsfor association analyses using linkage disequilibrium. Am J Hum Genet. 2004,74 106-120.)，將相互間r2彡0. 64的SNP分為一組，一共獲得86，075組SNP。由于組內(nèi)的SNP高度連鎖不平衡，只需要取一個(gè)代表性的SNP即可提供同組SNP的大部分信息。每組選擇最多 3 個(gè) SNP，共獲得 187，284 個(gè)“標(biāo)簽 SNP(tag SNP) ”。這些 SNP 由 Illumina 公司(http://www. illumina. com/)進(jìn)行打分，去除Score分值小于0. 6的SNP,共獲得115，740可供定制芯片的SNP。由于該芯片設(shè)計(jì)主要針對秈稻和粳稻兩個(gè)亞種間雜交群體的鑒定及分型，因此申請人根據(jù)SNP在秈粳亞種中的分布情況，將染色體分為IOOkb —個(gè)區(qū)間，每個(gè)區(qū)間優(yōu)先選擇秈粳兩個(gè)亞種間基本固定的SNP，如果不夠兩個(gè)，則選擇其他類型的SNP。由于Infinium技術(shù)的原因，A/T、G/C變化的SNP需要使用兩個(gè)探針檢測(Infinium I)，而其他類型的SNP只需要一個(gè)探針(Infinium II)。為了在芯片上放置盡可能多的SNP，申請人定義了一套打分系統(tǒng)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)嘗試的結(jié)果，定義:總分S = MAF*100+ (非A/T、G/C變化的SNP) *3. 5 (其中MAF為Minor allele frequency,最小等位基因頻率)。去除總分S小于33的SNP,最后共獲得5，556個(gè)SNP位點(diǎn)。2、RICE6K SNP芯片上的第二類探針的獲得到2010年年底，水稻中已經(jīng)成功克隆了 600多個(gè)基因，其中大量基因控制重要農(nóng)藝性狀如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗生物和非生物脅迫、營養(yǎng)利用效率等，這些基因具有很大的育種潛力(Jiang Rice functional genomics research Progress and implications forcrop genetic improvement. Biotechnol Adv. 2011)。申請人希望能夠一次性對部分功能基因進(jìn)行鑒定，于是設(shè)計(jì)了基因功能性SNP/INDEL探針。具體步驟如下
首先，查詢大量文獻(xiàn)從公共數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中獲得功能基因的不同等位基因形式，特別是在水稻品種間能夠反映基因功能的序列差異。如果不同等位基因之間的功能性差異為單堿基的差異(SNP)并且單側(cè)有50個(gè)堿基是相同的，那么直接用這50個(gè)堿基的保守序列作為候選探針位點(diǎn)；如果功能性位點(diǎn)是插入或缺失(INDEL)的差異，則使用兩種方法設(shè)計(jì)探針，一種是將INDEL轉(zhuǎn)換為SNP檢測，即根據(jù)INDEL單側(cè)保守序列設(shè)計(jì)探針，插入序列的第一個(gè)堿基和缺失序列的下一個(gè)堿基差異作為待測SNP(共顯性標(biāo)記)，另一種方法是探針直接設(shè)計(jì)在INDEL序列上，使得插入的等位基因能夠雜交檢測到信號(hào)，而缺失的等位基因雜交不上只有極低的檢測信號(hào)(顯性標(biāo)記)。用這種方法共設(shè)計(jì)了 80個(gè)SNP/INDEL候選探針位點(diǎn)，可檢測40個(gè)水稻功能基因。以上兩種方法獲得的候選探針序列位點(diǎn)共5，636個(gè)，按照Illumina InfiniumiSelectHD要求設(shè)計(jì)探針制作芯片。兩種方法獲得的探針序列位點(diǎn)特征沒有明顯差異，在芯片制作過程中不加以區(qū)分，芯片制成之后兩類探針的芯片檢測實(shí)驗(yàn)操作也完全相同，視為同一套探針組。第一批芯片制作得到符合檢測要求的有效位點(diǎn)數(shù)5，102個(gè)，包含30多個(gè)基因的68個(gè)功能性位點(diǎn)。以下實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果均指第一批芯片的檢測結(jié)果。一種RICE6K水稻SNP芯片在檢測水稻DNA樣品中的應(yīng)用，包括下列步驟I.水稻基因組DNA提取根據(jù)檢測需要從水稻種子、葉片等組織抽提基因組DNA。其中水稻幼嫩葉片DNA抽提推薦采用Promega植物基因組抽提試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)流程抽提。2. DNA樣品質(zhì)量檢測用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)判斷電泳結(jié)果，保證基因組DNA完整性好，且該基因組DNA片段長度大于IOkb ;用紫外分光光度計(jì)測量基因組DNA中蛋白質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)污染水平，基因組DNAA260/280比值應(yīng)在I. 8-2. 0之間，A260/230比值應(yīng)在I. 8-2. 2之間。將DNA濃度稀釋到工作濃度50ng/ul。3.基因芯片檢測按照11 lumina Infinium基因芯片檢測標(biāo)準(zhǔn)流程操作(Infinium HD Assay Ultra Protocol Guide, http://www.illumina.com/)。芯片掃描使用Illumina HiScan芯片掃描儀。4.數(shù)據(jù)分析Illumina HiScan掃描結(jié)果用GenomeStudio軟件分析基因型。本發(fā)明與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果I)通量高。芯片上包含5000多個(gè)SNP位點(diǎn)，按照Illumina Inf inium檢測標(biāo)準(zhǔn)流程3天就可以得到一個(gè)樣本的分布于全基因組的約4500個(gè)位點(diǎn)的基因型，I張芯片可以同時(shí)檢測24個(gè)樣品，一個(gè)流程可以做8張芯片，即3天可以得到192個(gè)樣品共86. 4萬個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)(4500*24*8)；2)重復(fù)性好。不同批次檢測同一份樣品技術(shù)重復(fù)達(dá)到99. 9%以上，其重復(fù)性和準(zhǔn)確性比同類芯片技術(shù)好；3)適用性廣。由于大多數(shù)SNP位點(diǎn)是來自于520多個(gè)水稻品種的測序數(shù)據(jù)，這些SNP位點(diǎn)具有廣泛的代表性。根據(jù)申請人對100多份水稻種質(zhì)資源初步檢測結(jié)果，秈稻之間、粳稻之間、秈稻和粳稻之間能夠檢測到的多態(tài)性SNP位點(diǎn)平均分別約為800、1000和2600個(gè)，可廣泛適用于不同類型的水稻品種特別是秈稻和粳稻兩個(gè)亞種間雜交群體的基因分型；4)基因功能預(yù)測。芯片中包含已克隆的40個(gè)水稻重要功能基因的80個(gè)功能性SNP/INDEL位點(diǎn)，檢測這些位點(diǎn)就知道材料中這些基因的功能，根據(jù)基因功能推測其表型，普通分子標(biāo)記技術(shù)僅針對個(gè)別基因開發(fā)功能性標(biāo)記。


圖I.為一種基因功能性SNP/INDEL探針設(shè)計(jì)例子的示意圖。圖中顯示的是水稻中的“綠色革命基因” Sd-I兩種等位基因一高桿基因型(Nipponbare,日本晴)與DGWG(Dee-geo_woo-gee,矮源低腳烏尖)類半矮桿基因型(Milyang 23，密陽23)的序列比對。相對于野生型Sd_l，DGWG類突變型sd_l從第一個(gè)外顯子中部起有383 bp的缺失，包括外顯子I和2的278 bp序列及105 bp的內(nèi)含子(Monna等，Positional cloning of rice semidwarfing gene, sd_l rice “green revolutiongene，，encodes a mutant enzyme involved in gibberellin synthesis. DNA Res. 2002,9 :11-17.)。針對這383bp的INDEL申請人設(shè)計(jì)了 3條探針探針I(yè)DOlgOOSDl. I和IDOlgOOSDl. 2為INDEL探針，探針序列位于INDEL內(nèi)部，野生型基因組DNA與探針雜交分別延伸一個(gè)堿基A和C而檢測到高信號(hào)，DGWG類突變型由于缺失探針對應(yīng)的基因組序列不能與探針雜交而只有極低的信號(hào)；0s01g66100. I為SNP探針，探針序列位于INDEL邊界，邊界正好有個(gè)SNP的差異(T/A)，可以作為普通SNP探針檢測，檢測該位點(diǎn)為T則為野生型，A為突變型。方框表示Sd-I基因起始密碼子ATG，箭頭表示探針序列所在位置和方向，三角型指不的喊基為探針與基因組DNA雜交后延伸的喊基。圖2.為一種Sd-I基因功能性SNP和INDEL探針檢測效果示意圖。水稻株高基因Sd-I功能性SNP/INDEL探針設(shè)計(jì)見圖I.該圖顯示71個(gè)水稻DNA樣品的檢測結(jié)果。SNP探針0s01g66100. I檢測結(jié)果表明，26個(gè)樣品為野生型(AA基因型)，21個(gè)為DGWG (Dee-geo-woo-gee，矮源低腳烏尖)類(BB基因型)，另外21個(gè)為雜合(AB基因型);INDEL探針I(yè)DOlgOOSDl. I檢測結(jié)果表明50個(gè)樣品的Sd-I基因至少有一個(gè)等位基因383 bp沒有缺失，與野生型一致，其他的樣品與DGWG類一致。圖3.為一種RICE6K水稻SNP芯片上所有探針位點(diǎn)在全基因組上分布示意圖。參照基因組為日本晴(水稻基因組MSU注釋第6. I版)，染色體上的每一條短線表示I個(gè)SNP位點(diǎn),三角形指示著絲粒的位置。圖4.為一種秈稻之間、粳稻之間以及秈稻和粳稻之間多態(tài)性SNP頻率分布示意圖。RICE6K SNP芯片檢測106份水稻種質(zhì)資源(18個(gè)粳稻，88個(gè)秈稻)后兩兩之間的比較。4a為秈稻(indica)之間,4b為粳稻(japonica)之間,4c為秈稻和粳稻兩個(gè)亞種之間。圖5.為一種RICE6K水稻SNP芯片對秈稻和粳稻雜交得到的一個(gè)F2植株檢測的
結(jié)果示意圖。粳稻巴里拉(Balilla)和秈稻南京11 (Nanjing 11)雜交F2植株全基因基因型。AA為巴里拉純合基因型，BB為南京11純合基因型，AB為雜合基因型，圓點(diǎn)表示著絲粒位置。圖6.為一種回交育種定向改良材料的背景分析示意圖。
該圖顯示B親本供體基因?qū)階親本回交BC4F1的兩個(gè)家系基因型。染色體上的短線表示含有供體親本基因型，即為雜合基因型AB，圓點(diǎn)表示目標(biāo)基因所在的位置，三角形指示著絲粒位置。圖7.為秈稻品種93-11與其衍生系安選6號(hào)之間差異位點(diǎn)分布示意圖。第8染色體上每條黑色短線代表一個(gè)差異SNP位置。三角形指示著絲粒位置。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :RICE6K SNP芯片制備方法URICE6K SNP芯片上的第一類探針的獲得申請人:利用Illumina新一代測序技術(shù)對水稻核心親本材料進(jìn)行了基因組測序。另外，2010年年底，Huang等公布了 520個(gè)水稻地方品種的基因組重測序數(shù)據(jù)(Huang等，Genome-wide association studies of 14 agronomic traits in rice landraces. NatGenet. 2010,42 :961-967)。申請人從公共數(shù)據(jù)庫下載了此數(shù)據(jù)，并以日本晴基因組(MSU第 6. I 版，http:"rice. plantbioloRY. msu. edu/)為參考序列，使用 MAQ 軟件(http://sourceforRe. net/pro iects/maq)將所有品種重測序數(shù)據(jù)匹配到參考序列。探針設(shè)計(jì)的具體步驟如下(2)先按照下述標(biāo)準(zhǔn)鑒定得到了 4，236，029個(gè)高質(zhì)量SNP 僅當(dāng)測序序列在基因組上的匹配分?jǐn)?shù)(mapping quality)至少為20時(shí),該序列才用于鑒定SNP ； 計(jì)算基因組上每位點(diǎn)不同堿基的測序質(zhì)量分?jǐn)?shù)(base quality)的總和，SNP位點(diǎn)必須只有兩種堿基的測序質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和大于100，并且這兩種堿基每種都有至少10條測序序列支持；SNP位點(diǎn)的兩種堿基每種至少有5條匹配分?jǐn)?shù)超過40的序列支持，并且對應(yīng)的堿基測序質(zhì)量都超過20 ;該SNP位點(diǎn)總的測序覆蓋度大于或等于50并小于或等于1000。。(2)進(jìn)一步使用更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)獲得1，559，745個(gè)候選SNP 除去在至少5個(gè)品種中呈現(xiàn)雜合狀態(tài)的SNP位點(diǎn)； 除去測序覆蓋度小于80或大于800的SNP位點(diǎn)； 將所有品種分為秈稻和粳稻，并計(jì)算SNP的次要等位基因在這兩個(gè)亞種中的頻率，除去在所有品種、秈粳亞種中次要等位基因頻率均小于0. 2的SNP ； 除去通過上一步后仍然與左右兩側(cè)SNP距離均小于50bp的SNP。
(3)由于探針長度為50bp，設(shè)計(jì)時(shí)需要選擇較保守序列，以免影響雜交。為了獲得合適的探針，申請人還做了以下分析 分別提取SNP左側(cè)和右側(cè)50bp序列(如果50bp內(nèi)含有其他SNP，則不提取)，使用 BLAT 程序(Kent 等，BLAT-the BLAST-Iike alignment tool. Genome Res. 2002,12 656-664.)比對基因組。如果兩側(cè)序列在基因組上均存在兩個(gè)或以上同一性(identity)超過85%的匹配，則去除該SNP ； 分別提取秈稻品種珍汕97和明恢63 (見遺傳資源表I)對應(yīng)的SNP左側(cè)和右側(cè)50 bp序列，并與粳稻日本晴參照序列(MSU第6. I版，http://rice, plantbiology. msu.edu/)相比較，如果兩側(cè)序列均不一致，去除該SNP。通過上述分析，申請人獲得了 105，5959個(gè)符合探針設(shè)計(jì)要求的SNP，其中有35. 5%的SNP基本已在秈粳亞種中固定(秈粳亞種內(nèi)占主要地位的等位基因類型不同，并占據(jù)90 %以上的比例)，42. I %的SNP在秈稻亞種中具有多態(tài)性，而16. 9 %的SNP在粳稻亞種中具有多態(tài)性。 申請人:進(jìn)一步分析了 SNP之間的連鎖不平衡。將染色體分為每IOOkb—個(gè)區(qū)段，計(jì)算區(qū)段內(nèi)所有SNP兩兩之間的r2(r為皮爾森相關(guān)系數(shù)，Pearson correlationcoefficient)。經(jīng)過嘗試，申請人以r2 = 0. 64作為閾值，利用一種貪婪算法(Carlson等，Selecting a maximally informative set of single-nucleotide polymorphismsfor association analyses using linkage disequilibrium. Am J Hum Genet. 2004,74 106-120.)，將相互間r2彡0. 64的SNP分為一組，一共獲得86，075組SNP。由于組內(nèi)的SNP高度連鎖不平衡，只需要取一個(gè)代表性的SNP即可提供同組SNP的大部分信息。每組選擇最多 3個(gè)SNP，共獲得 187，284 個(gè)“標(biāo)簽 SNP (tag SNP)”。這些 SNP 由 Illumina 公司(http://www. illumina. com/)進(jìn)行打分，去除Score分值小于0. 6的SNP,共獲得115，740可供定制芯片的SNP。由于該芯片設(shè)計(jì)的主要針對秈稻和粳稻兩個(gè)亞種間雜交群體的鑒定及分型，因此申請人根據(jù)SNP在秈粳亞種中的分布情況，將染色體分為IOOkb —個(gè)區(qū)間，每個(gè)區(qū)間優(yōu)先選擇兩個(gè)秈粳亞種間基本固定的SNP,如果不夠兩個(gè),貝U選擇其他類型的SNP。由于Infinium技術(shù)的原因，A/T、G/C變化的SNP需要使用兩個(gè)探針檢測(Infinium I)，而其他類型的SNP只需要一個(gè)探針(Infinium II)。為了在芯片上放置盡可能多的SNP，申請人定義了一套打分系統(tǒng)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)嘗試的結(jié)果，定義:總分S = MAF*100+ (非A/T、G/C變化的SNP) *3. 5 (其中MAF為Minor allele frequency,最小等位基因頻率)。去除總分S小于33的SNP,最后共獲得5，556個(gè)SNP位點(diǎn)。2、RICE6K SNP芯片上的第二類探針的獲得到2010年年底，水稻中已經(jīng)成功克隆了 600多個(gè)基因，其中大量基因控制重要農(nóng)藝性狀如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗生物和非生物脅迫、營養(yǎng)利用效率等，這些基因具有很大的育種潛力(Jiang Rice functional genomics research Progress and implications forcrop genetic improvement. Biotechnol Adv. 2011)。申請人希望能夠一次性對部分功能基因進(jìn)行鑒定，于是設(shè)計(jì)了基因功能性SNP/INDEL探針。具體步驟如下首先，查詢大量文獻(xiàn)從公共數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中獲得功能基因的不同等位基因形式，特別是在水稻品種間能夠反映基因功能的序列差異。如果不同等位基因之間的功能性差異為單堿基的差異(SNP)并且單側(cè)有50個(gè)堿基是相同的，那么直接用這50個(gè)堿基的保守序列作為候選探針位點(diǎn)；如果功能性位點(diǎn)是插入或缺失(INDEL)的差異，則使用兩種方法設(shè)計(jì)探針，一種是將INDEL轉(zhuǎn)換為SNP檢測，即根據(jù)INDEL單側(cè)保守序列設(shè)計(jì)探針，插入序列的第一個(gè)堿基和缺失序列的下一個(gè)堿基差異作為待測SNP(共顯性標(biāo)記)，另一種方法是探針直接設(shè)計(jì)在INDEL序列上，使得插入的等位基因能夠雜交檢測到信號(hào)，而缺失的等位基因雜交不上只有極低的檢測信號(hào)(顯性標(biāo)記)(圖I和圖2)。用這種方法共設(shè)計(jì)了 80個(gè)SNP/INDEL候選探針位點(diǎn)，可檢測40個(gè)水稻功能基因。以上兩種方法獲得的候選探針序列位點(diǎn)共5，636個(gè)，按照Illumina InfiniumiSelectHD要求設(shè)計(jì)探針制作芯片。第一批芯片制作得到符合檢測要求的有效SNP/INDEL位點(diǎn)為5，102個(gè),這些位點(diǎn)在全基因組上的分布如圖3所示。實(shí)施例2 RICE6K水稻SNP芯片在檢測水稻DNA樣品中的應(yīng)用
I.水稻基因組DNA提取根據(jù)檢測需要從水稻種子、葉片等組織抽提基因組DNA。其中水稻幼嫩葉片DNA抽提采用Promega植物基因組抽提試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)流程抽提(Wizard Magnetic 96 DNA Plant System Kit,貨號(hào) FF3760 或 FF3761,美國 Promega 公司)。2. DNA樣品質(zhì)量檢測用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I % (W/W)的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR System，美國Bio-Rad公司)判斷電泳結(jié)果，保證基因組DNA完整性好，且該基因組DNA片段長度大于IOkb ;用紫外分光光度計(jì)(NanoDrop2000，美國ThermoScientific公司)測量基因組DNA中蛋白質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)污染水平，基因組DNA A260/280比值應(yīng)在I. 8-2. 0之間，A260/230比值應(yīng)在I. 8-2. 2之間。將DNA濃度稀釋到工作濃度50ng/
ul O3.基因芯片檢測按照11 lumina Inf inium基因芯片檢測標(biāo)準(zhǔn)流程操作(Infinium HD Assay Ultra Protocol Guide, http://www.illumina.com/)。芯片掃描使用 Illumina HiScan 芯片掃描儀(HiScan,美國 Illumina 公司)。4.數(shù)據(jù)分析Illumina HiScan 掃描結(jié)果用 GenomeStudio 軟件(http://www.illumina. com/)分析基因型實(shí)施例3 RICE6K水稻SNP芯片在水稻種質(zhì)資源分子標(biāo)記指紋分析中的應(yīng)用利用RICE6K SNP芯片，申請人對106份微核心水稻種質(zhì)資源進(jìn)行分子標(biāo)記指紋分析。RICE6K芯片檢測這106份水稻品種基因組DNA，在5，102個(gè)有效檢測位點(diǎn)中，有636個(gè)位點(diǎn)在大于3個(gè)品種中檢測基因型為雜合位點(diǎn)，申請人認(rèn)為這些位點(diǎn)的檢測能力較差，剩余4466個(gè)高質(zhì)量位點(diǎn)用于106個(gè)品種的基因分型。根據(jù)基因分型結(jié)果對這106份水稻品種進(jìn)行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)全部18份粳稻聚為一類，其他88份秈稻聚為另一類。申請人分析了這批RICE6K SNP芯片能夠檢測到的任意兩個(gè)品種之間多態(tài)性SNP位點(diǎn)數(shù)。結(jié)果表明，粳稻與粳稻之間，秈稻與秈稻之間，秈稻與粳稻兩亞種之間多態(tài)性SNP比例平均分別為18. 2%、23. 4%和 58. 9% (圖 4)，對應(yīng)位點(diǎn)數(shù)為 813、1046 和 2630 個(gè)。該結(jié)果表明，RICE6K SNP芯片可優(yōu)先適用于檢測秈稻與粳稻兩亞種之間雜交群體基因分型，也可用于粳稻與粳稻之間、秈稻與秈稻之間雜交群體，具有廣泛的適應(yīng)性。實(shí)施例4 RICE6K水稻SNP芯片在檢測秈稻和粳稻雜交F2群體基因型中的應(yīng)用粳稻巴里拉(Balilla)和秈稻南京11 (Nanjing 11)(見遺傳資源表2)雜交Fl植株上收獲的種子在室內(nèi)發(fā)芽，取發(fā)芽一周的幼嫩葉片抽提基因組DNA進(jìn)行基因芯片實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以親本巴里拉、南京11以及雜種Fl為對照(親本一次重復(fù)，雜種兩次重復(fù))。經(jīng)過分析，親本巴里拉和南京11之間有差異，并且在雙親中判斷為純合基因型、在雜種Fl兩次重復(fù)均判斷為雜合基因型的位點(diǎn)共有3，775個(gè)，占有效位點(diǎn)數(shù)的74.0% (3775/5102)，用這些位點(diǎn)對F2群體的67個(gè)單株進(jìn)行基因分型(圖5)。兩親本巴里拉和南京11具有明顯的表型差異。巴里拉是典型的粳稻品種，半矮桿、植株緊湊、穗子小、籽粒卵圓形，而南京11是典型的秈稻品種，高桿、植株披散、穗子大、籽粒橢圓型。利用RICE6K SNP芯片檢測，兩親本相關(guān)功能基因基因型結(jié)果與表型相符(表I)，并且在F2群體中有分離。例如水稻Sd-I基因(MSU L0C_0s01g66100)SNP探針0s01g66100. I檢測71個(gè)單株(2親本+2雜種F1+67雜種F2)有26個(gè)為巴里拉純合基因型(AA)，21個(gè)為南京11純合基因型(BB)，其余24個(gè)為雜合基因型(AB)(圖2a) ;INDEL探針I(yè)DOlgOOSDl. I檢測結(jié)果有50個(gè)單株為插入基因型(巴里拉純合基因型和雜合基因型)，其余21個(gè)為缺失基因型(南京11純合基因型)(圖2b)，兩者結(jié)果一致。
該結(jié)果表明，RICE6K SNP芯片對秈稻和粳稻兩個(gè)亞種間的雜交群體具有很好的基因分型能力，并且對重要功能基因型具有很好的檢測能力。表I.巴里拉和南京11部分功能基因檢測結(jié)果
某K型
基因 MSU位點(diǎn)探針 m田護(hù)土口土古丄”_巴里拉南足11
Sd-IL0c_0s01g66100IDOlgOOSDl. I半矮桿高桿
IDOlgOOSDl.2半矮桿高桿
0s01g66100.1半矮桿高桿
TAClL0c_0s09g359800s09g35980.1植株緊湊植株披散
GnlaLOC—OsOlglOl 10OsOlglOl 10.1小穗大穗
OsOlglOl 10.2小穗大穗
SaFL0c_0s01g396700s01g39670.1粳型秈型
S5L0c_0s06gll0100s06gll010.1粳型秈型
0s06gl 1010.2 粳型秈型GW2 L0c_0s02gl4720 0s02gl4720.2 寬粒窄粒qSW5/GW5 GeneBank AB433345 Os05g00GW5.1 寬粒窄粒_ID05g00GW5.3 寬粒_窄粒實(shí)施例5 RICE6K水稻SNP芯片在檢測水稻育種材料的遺傳背景中的應(yīng)用為了檢驗(yàn)RICE6K水稻SNP芯片在育種中的應(yīng)用效果，申請人對回交育種中間材料進(jìn)行了遺傳背景分析。供體親本B (秈稻)兩個(gè)優(yōu)異基因?qū)胧荏w親本A(粳稻)以改良A親本的缺陷。經(jīng)過4輪回交得到BC4F1，回交過程中用傳統(tǒng)分子標(biāo)記(SSR)進(jìn)行目標(biāo)基因前景選擇，以保證優(yōu)異基因在回交過程中沒有丟失。用RICE6K SNP芯片檢測了經(jīng)過表型篩選和SSR分子標(biāo)記輔助選擇得到的BC4F1材料29份，具有代表性的兩個(gè)家系基因型結(jié)果如圖6所示。圖6a所示的家系除了目標(biāo)基因區(qū)段以外，其他背景基因型都與受體親本一致，而圖6b所示的家系除目標(biāo)基因區(qū)段以外，在第4、8和9染色體有三個(gè)區(qū)段帶有供體親本片段。為了盡量保持A親本的優(yōu)良特性，優(yōu)先選擇圖6a所示的家系進(jìn)行后續(xù)育種工作。該結(jié)果表明，RICE6K水稻SNP芯片可以成功分析秈稻和粳稻兩個(gè)亞種間回交育種群體的遺傳背景，并指導(dǎo)育種。用傳統(tǒng)SSR等分子標(biāo)記分析遺傳背景不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且由于數(shù)量有限不能覆蓋整個(gè)基因組。RICE6K水稻SNP芯片可以準(zhǔn)確、快速、高效地進(jìn)行全基因組遺傳背景選擇，優(yōu)先用于秈稻和粳稻兩個(gè)亞種間雜交群體，即使是用于亞種內(nèi)的雜交群體，其標(biāo)記密度也遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)SSR等分子標(biāo)記。實(shí)施例6 RICE6K水稻SNP芯片在檢測水稻種子真實(shí)性中的應(yīng)用 目前我國三系雜交水稻種子真實(shí)性檢測僅使用24個(gè)SSR位點(diǎn)判斷是否是相同品種(中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T20396-2006)。申請人使用RICE6K水稻SNP芯片檢測了兩份雜交水稻種子真實(shí)性，第I份待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品(特優(yōu)009)(見遺傳資源表3)共檢測到4，968個(gè)位點(diǎn)，其中僅I個(gè)位點(diǎn)基因型不一致，一致性為99. 98 %，第2份待測種子與標(biāo)準(zhǔn)樣品(岳優(yōu)9264)(見遺傳資源表4)共檢測到4，876個(gè)位點(diǎn)，全部位點(diǎn)基因一致，一致性為100%。第I份樣品經(jīng)國標(biāo)規(guī)定的24個(gè)SSR標(biāo)記檢測基因型完全一致。申請人:還用RICE6K水稻SNP芯片檢測了 2份常規(guī)稻，第I份待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品(玉香油占)(見遺傳資源表5)共檢測到4，794個(gè)位點(diǎn)，其中僅2個(gè)位點(diǎn)基因型不一致，一致性為99. 96%，第2份待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品(R1303)(見遺傳資源表5)共檢測到4，696個(gè)位點(diǎn)，其中有4個(gè)位點(diǎn)基因型不一致，一致性為99. 91%。申請人:用RICE6K水稻SNP芯片檢測了 5份被稱為93_11的待測樣品(見遺傳資源表6，7)，以I份93-11的標(biāo)準(zhǔn)樣品(見遺傳資源表2)和93-11衍生系安選6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)樣品(見遺傳資源表7)為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中的2份待測樣品與93-11標(biāo)準(zhǔn)樣品基因型一致性達(dá)到99. 9%以上，4，900多個(gè)位點(diǎn)中僅有1-4個(gè)位點(diǎn)基因型不一致；而與安選6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)樣品基因型一致性為99. 3%，有約70個(gè)SNP位點(diǎn)有差異。于是，申請者比較了 93-11和安選6號(hào)之間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們之間約70個(gè)差異位點(diǎn)都集中在第8染色體的一個(gè)區(qū)間(圖7)。從以上檢測結(jié)果可以看出，RICE6K水稻SNP芯片適合于進(jìn)行三系雜交水稻和常規(guī)稻的真實(shí)性檢測，其結(jié)果比SSR分子標(biāo)記更具有說服力。同時(shí)也反映出RICE6K水稻SNP芯片檢測同樣的樣品技術(shù)重復(fù)可達(dá)到99. 9%以上。序列表
權(quán)利要求
1.一種水稻全基因組SNP芯片，其特征在于所說的SNP芯片是指根據(jù)SEQ No. OOfSEQID No. 5636所示序列利用Infinium專利設(shè)計(jì)制造技術(shù)制作的芯片。
2.權(quán)利要求I所述的一種水稻全基因組SNP芯片在水稻種質(zhì)資源分子標(biāo)記指紋分析中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求I所述的一種水稻全基因組SNP芯片在檢測水稻雜交群體基因型中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I所述的一種水稻全基因組SNP芯片在檢測水稻育種材料的遺傳背景中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求I所述的一種水稻全基因組SNP芯片在檢測水稻種子中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻全基因組SNP芯片及其應(yīng)用，步驟(1)芯片上第一類探針的獲得通過測序獲得親本的基因組序列，結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫中的其他水稻品種重測序數(shù)據(jù)，以日本晴基因組為參考序列，使用MAQ軟件將所有測序數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配、分析，最后從中篩選出SNP標(biāo)記；(2)芯片上第二類探針的獲得從公共數(shù)據(jù)庫獲得水稻功能基因，尋找反映基因功能的序列差異，據(jù)此設(shè)計(jì)出SNP/INDEL探針；(3)利用Infinium芯片制造技術(shù)制作SNP芯片。(4)測試芯片的準(zhǔn)確性和應(yīng)用效率。本芯片可應(yīng)用于水稻種質(zhì)資源分子標(biāo)記指紋分析、種子真實(shí)性檢測、雜交后代基因分型，以及其他相關(guān)研究中。
文檔編號(hào)C40B40/06GK102747138SQ20121005577
公開日2012年10月24日 申請日期2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月5日
發(fā)明者周發(fā)松, 喻輝輝, 張啟發(fā), 李菁, 謝為博 申請人:中國種子集團(tuán)有限公司