專利名稱：：用于蛋白質(zhì)的高壓重折疊的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及裝置，例如容器、多孔平板，以及用于將流體抽到容器和多孔平板的系統(tǒng)，其設(shè)計成在高流體靜壓下操作。本發(fā)明還涉及使用在高壓下重折疊蛋白質(zhì)的裝置的方法。
背景技術(shù)：
：很多蛋白質(zhì)與治療劑一樣有價值。這樣的蛋白質(zhì)包括人生長素和Y干擾素，人生長素用于在體內(nèi)產(chǎn)生不充足的生長素時治療異常身高，而Y千擾素用于治療腫瘤病和病毒病。蛋白質(zhì)藥物通常使用重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)，該技術(shù)能夠產(chǎn)生可與天然存在的源隔離的較大數(shù)量的蛋白質(zhì)，并且避免了通常出現(xiàn)于與天然存在的源隔離的蛋白質(zhì)的污染。蛋白質(zhì)的正確折疊對蛋白質(zhì)的正常機能是必不可少的。不正確折疊的蛋白質(zhì)朝Li人為對一些疾病的病理產(chǎn)生影響，這些疾病包括阿爾茨海默病、牛海綿狀腦病(BSE或"瘋牛"病)和人克羅伊茨費爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakobdisease)(CJD)以及帕金森氏??；這些疾病用于說明蛋白質(zhì)正確折疊的重要性。一些蛋白質(zhì)如重組的人生長素和重組的人Y干擾素在人體中的治療價值可用細(xì)菌、酵母和其它微生物表示。雖然大量的蛋白質(zhì)可在這樣的系統(tǒng)中產(chǎn)生，但是蛋白質(zhì)通常被誤折疊，并通常一起聚集在被稱為包含體的大7凝塊中。蛋白質(zhì)不能用在誤折疊的聚集狀態(tài)中。因此，解聚和正確重折疊這樣的蛋白質(zhì)的方法是很多研究的主題。重折疊蛋白質(zhì)的一種方法在蛋白質(zhì)的溶液上使用高壓，以便解聚、展開和正確重折疊蛋白質(zhì)。在美國專利No.6,489,450、美國專利申請乂^布No.2004/0038333和國際專利申請WO02/062827中描述了這樣的方法。這些公開內(nèi)容指出，蛋白質(zhì)聚集體或誤折疊的蛋白質(zhì)的某些高壓處理導(dǎo)致在良好合格率下保留生物學(xué)活性(即，蛋白質(zhì)被正確折疊，如生物學(xué)活性所要求的)的解聚蛋白質(zhì)的恢復(fù)。美國6,489,450、美國2004/0038333和WO02/062827在這里以引用方式全部并入。如美國2004/0038333中指出的，有時需要經(jīng)驗篩選程序來確定對蛋白質(zhì)的最佳重折疊條件。因此，需要有可用在方法中以快速確定最佳條件的適當(dāng)?shù)难b置，例如多孔平板、一次性單一樣品容器以及用于在高壓下混合溶液以便改變高壓下的溶液條件的裝置。96孔平板(一般具有8x12布置的孔)通常用于生物和生物化學(xué)中的高通量篩選。然而，當(dāng)前市場上可以買到的平板不適合于高壓應(yīng)用(例如，250巴或更高)。本發(fā)明提供適合于用在高壓下的這樣的裝置。目前用于高壓研究的單一樣品容器也具有缺點。由例如低密度聚乙烯和聚丙烯的材料制成的容器允許在高壓下有效質(zhì)量的氧傳遞。對于對溶液的氧化還原環(huán)境敏感的反應(yīng)來說，這樣的氧傳遞是非常不希望有的。本發(fā)明還提供了在希望時通過容器的壁來減少或消除氧的大量傳遞的裝置。目前使用的裝置的又一個缺點是不能在高壓處理期間調(diào)節(jié)溶液條件。本發(fā)明提供了一種裝置，該裝置允許在高壓處理期間通過能夠控制不同容器和溶液來改變?nèi)芤簵l件，同時這些容器和溶液在高壓裝置內(nèi)部。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明包括單一樣品容納裝置、多樣品容納裝置和適合用于高壓的溶液交換裝置。在某些實施方式中，裝置由聚合物制成，這使裝置的制造成本相對較低。這還允許裝置的注入模制，以4更于制造。在某些實施方式中，為了方便使用，裝置可為一次性的。當(dāng)樣品維持在高壓下時，溶液交換裝置允許改變樣品的溶液條件。在可選實施方式中，裝置可由基本上為不透氧的材料制成。在一個實施方式中，本發(fā)明包括多樣品容納裝置，其包括用于容納液體樣品的至少兩個室，其中當(dāng)受到高壓時，裝置將室保持為基本上封閉的系統(tǒng)。在另一實施方式中，本發(fā)明包括多樣品容納裝置，其包括a)主體，其由在高壓下維持整體性的材料制成；以及b)主體內(nèi)的多個樣品室，其適合于容納液體樣品；其中裝置不允許液體樣品在多個樣品室之間或在任何樣品室和周圍環(huán)境之間的有效傳遞。在前述多樣品容納裝置的進一步的實施方式中，多個樣品室包括至少2個樣品室、至少10個樣品室、至少16個樣品室、至少25個樣品室、至少36個樣品室、至少48個樣品室、至少72個樣品室或至少96個樣品室。在前述多樣品容納裝置的另一實施方式中，多個樣品室包括至少96個樣品室。在前述多樣品容納裝置的另一實施方式中，多個樣品室包括96個樣品室。在多樣品容納裝置的一個實施方式中，樣品室具有在裝置的頂側(cè)上的開口，且樣品室的開口通過在裝置的頂部放置密封墊而被密封，以便覆蓋樣品室的開口。通過恒定張力的夾具可將密封墊保持在適當(dāng)?shù)奈恢谩Ｔ诙鄻悠啡菁{裝置的另一實施方式中，在給樣品室裝填樣品之前，樣品室通過在樣品室的開口中放置熱密封的隔膜而被密封。樣品可經(jīng)由針注射通過隔膜被裝入。粘性聚合物膜可接著放置到裝置的頂部以及隔膜上，以確保充分的密封。在前述多樣品容納裝置的進一步的實施方式中，裝置的主體由選自下列組的材料形成聚對苯二甲酸乙二酯、高密度聚乙烯、聚苯乙烯和聚苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物。在前述多樣品容納裝置的另一實施方式中，主體由聚對苯二甲酸乙二酯形成。在前述多樣品容納裝置的另一實施方式中，主體由聚苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物形成。9在另一實施方式中，本發(fā)明包括用于液體樣品的壓力處理的容器，其中容器包括用于容納液體樣品的至少一個室，其中容器由柔韌的材料制成，其中材料可經(jīng)受高達約5千巴、優(yōu)選地高達約10千巴的壓力而沒有破損或破裂，并任選地在高壓時基本上是不可透氧的。(所示壓力是對整個容器的多維壓力，而不是差壓(differentialpressure)。)在一個實施方式中，容器在標(biāo)準(zhǔn)壓力時具有恒定的裝填容積。在另一實施方式中，容器在標(biāo)準(zhǔn)壓力時具有可變的裝填容積。在另一實施方式中，具有可變裝填容積的容器包括具有第一端和第二端的筒體?？梢苿拥娜迦胪搀w的第一端中；而可拆卸的部分固定到筒體的第二端，可拆卸的部分可被拆開，以允許移除筒體的容納物?？刹鹦兜牟糠挚蔀樯w，蓋可為帶螺紋的，并可與筒體第二端上的互補螺紋嚙合，或可搭鎖(snapon)，或可被磁性固定。在另一實施方式中，具有螺紋或嚙合蓋的其它方法的短的窄突出體從筒體的第二端延伸；為了以后的拆卸以允許移除筒體的容納物，蓋放置在突出體上。在一個實施方式中，窄突出體可具有Luer-Lok⑧配件(Luer-Lok⑧是新澤西州的FranklinLakes的Becton,Dickinson&Co的注冊商標(biāo)，用于互鎖連接系統(tǒng))。在另一實施方式中，具有可變裝填容積的容器包括具有第一端和第二端的筒體?？梢苿拥娜迦胪搀w的第一端中。密封的末端連接到筒體的第二端，該末端可被拆開，以允許移除筒體的容納物?？杀徊鸬粢栽试S移除筒體的容納物的密封的末端可為來自筒體的第二端的短的窄突出體。在一些實施方式中，末端可被手工拆掉；在其它實施方式中，末端不能被手工拆掉，而使用切割工具來拆掉。在另一實施方式中，用在可變?nèi)莘e裝填容器中的可移動的塞具有單向閥。單向閥塞允許容器內(nèi)的空氣和樣品在標(biāo)準(zhǔn)壓力下排出，同時防止來自容器外部的任何空氣、氣體或液體通過閥回流到容器中。在一個實施方式中，單向閥是止回閥。在另一實施方式中，單向閥是球止回閥(ballcheckvalve)。在另一實施方式中，單向閥是球-彈簧止回閥(ball-springcheckvalve)。在另一實施方式中，單向閥是閥瓣式止回閥。在另一實施方式中，10單向閥是鴨嘴回流閥。在另一實施方式中，單向閥是傘閥。在另一實施方式中，單向閥是擺動式止回閥。在另一實施方式中，單向閥是提升止回閥。在前述容器的進一步的實施方式中，容器由選自下列組的材料形成聚對苯二甲酸乙二酯、高密度聚乙烯、聚苯乙烯和聚苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物。在前述容器的另一實施方式中，容器由聚對苯二甲酸乙二酯形成。在前述容器的另一實施方式中，容器由聚苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物形成。在另一實施方式中，本發(fā)明包括用于在壓力下的溶液交換(溶液混合)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括容納第一液體樣品的第一容器和容納附加的液體樣品或樣品的一個或多個附加的容器，其中第一液體樣品和附加的液體樣品或樣品可以相同或不同，其中容器由可經(jīng)受高達約5千巴、優(yōu)選地高達約IO千巴壓力(對整個系統(tǒng)的多維壓力，而不是差壓)而沒有破損或破裂的材料制成，并任選地在高壓時基本上是不可透氧的，且其中一個或多個附加的容器的液體樣品可與第一容器的液體樣品混合，同時第一容器和附加的容器及其相應(yīng)的液體樣品可在混合之前、期間和之后維持在高壓。當(dāng)一個或多個附加的容器包括多個容器，即，兩個或多個附加的容器時，兩個或多個附加的容器的容納物可與第一容器的容納物混合，而與其它兩個或多個附加的容器無關(guān)(即，在不同時間)，或與其它兩個或多個附加的容器一道(即，同時或在預(yù)定的時間序列)。在混合或接觸之前的高壓、在混合或接觸期間的高壓以及在混合或接觸之后的高壓可為相同的壓力，或兩個都可為相同的壓力，而一個可為不同的壓力，或所有三個壓力都可為不同的壓力。在用于在壓力下溶液交換(溶液混合)的系統(tǒng)的另一實施方式中，該系統(tǒng)包括4皮指定為預(yù)混合容器的容納液體樣品(其中液體樣品可相同或不同)的至少兩個預(yù)混合容器以及被指定為接收容器的至少一個附加的容器，其中接收容器在傳遞之前可為空的，或在傳遞之前可包含液體或固體組份，其中容器由可經(jīng)受高達約5千巴、優(yōu)選地高達約10千巴壓力(對整個系統(tǒng)的多維壓力，而不是差壓)而沒有破損或石皮裂的材料制成，并任選地在高壓時基本上是不可透氧的，其中在容納液體樣品的至少兩個預(yù)混合容器中的液體樣品可移到液體樣品可相互接觸的至少一個接收容器中，以及容納液體樣品的至少兩個預(yù)混合容器、至少一個接收容器和液體樣品本身可在混合之前、期間和之后維持在高壓。在一個實施方式中，混合裝置如靜態(tài)混合器(例如用于HPLC溶劑混合的混合器)可置入容納液體樣品的至少兩個預(yù)混合容器和至少一個接收容器之間的流體通路中，以便促進液體樣品的混合。在其它實施方式中，來自一個或多個預(yù)混合容器的流可由閥獨立控制，以允許來自某些預(yù)混合容器的容納物流到接收容器中，同時防止從其它選定的預(yù)混合容器流出；在以后的時期，閥可設(shè)置成允許其它選定的預(yù)混合容器中的容納物流到接收容器中。在用于溶液交換(溶液混合)的系統(tǒng)的另一實施方式中，本發(fā)明包括第一容器和一個或多個附加的容器，其中第一容器包括用于容納第一液體樣品的室，第一容器由可經(jīng)受高達約5千巴、優(yōu)選地高達約10千巴壓力(對整個系統(tǒng)的多維壓力，而不是差壓)而沒有破損或破裂的柔韌材料制成，并任選地在高壓時基本上是不可透氧的；以及其中一個或多個附加的容器由可經(jīng)受高達約5千巴、優(yōu)選地高達約10千巴壓力(對整個系統(tǒng)的多維壓力，而不是差壓)而沒有破損或破裂的柔韌材料制成，并任選地在高壓時基本上是不可透氧的，且其中一個或多個附加的容器完全被第一容器包圍，以及其中一個或多個附加的容器包含附加的液體樣品，該液體樣品可相同，或與彼此和與第一液體樣品不同；其中一個或多個附加的容器當(dāng)在第一容器內(nèi)時可被打開(與其它附加的容器無關(guān)，或與附加的容器一齊)，從而允許第一液體樣品和附加的液體樣品混合。在一個實施方式中，一個或多個附加的容器包括可被維持在封閉位置的蓋，其中蓋可被打開，而沒有打開第一容器，且同時第一容器、一個或多個附加的容器以及所有的液體樣品可在混合之前、期間和之后維持在高壓。在另一實施方式中，蓋還能夠混合包含在第一容器中的液體樣品與包含在一個或多個附加的容器中的液體樣品。在另一實施方式中，蓋包括磁化部分，例如磁盤。在用于溶液交換(溶液混合)的系統(tǒng)的另一實施方式中，本發(fā)明包括用于液體樣品的壓力處理的容器系統(tǒng)，該容器系統(tǒng)包括第一容器，第一容12器包括用于容納液體樣品的室，其中第一容器由柔韌的材料制成，其中該材料可經(jīng)受高達約5千巴、優(yōu)選地高達約IO千巴壓力(對整個系統(tǒng)的多維壓力，而不是差壓)，而沒有破損或破裂，并任選地在高壓時基本上是不可透氧的；以及還包括至少一個附加的容器，至少一個附加的容器由柔韌的材料制成，其中該材料可經(jīng)受高達約5千巴、優(yōu)選地高達約10千巴壓力(對整個系統(tǒng)的多維壓力，而不是差壓)，而沒有破損或破裂，并任選地在高壓時基本上是不可透氧的，且其中第一容器和至少一個附加的容器由流動回路(flowloop)連接。流動回路包括允許在流動回路中只在一個方向流動的止回閥以及在容器系統(tǒng)受到高壓時能夠操作的泵。泵可由微處理器控制。當(dāng)微處理器包括在高壓裝置中時，它可通過也包括在高壓裝置中的電池或通過插入高壓裝置中的電力線供電?？蛇x地，裝置可由驅(qū)動軸控制，該驅(qū)動軸通過進入高壓室中的適當(dāng)密封的開口進入高壓室中。流動回路可通過旁路分流器(bypassshunt)繞過一個或多個附加的容器中的一個或多個；閥可關(guān)閉旁路分流器，并可將一個或多個附加的容器連接到流動回路，而與其它附加的容器無關(guān)或一道。在用于溶液交換(溶液混合)的所有實施方式中，至少一個附加的容器中的液體樣品在與第一容器中的液體樣品混合時，可改變第一容器中的第一液體樣品的溶液條件，使得合并的液體處于與笫一液體樣品和/或至少一個附加的液體樣品不同的溶液條件下。可被改變的溶液條件包括，但不限于pH、鹽濃度、還原劑濃度、氧化劑濃度、還原劑濃度和氧化劑濃度、離液劑濃度、精氨酸濃度、表面活性劑濃度、優(yōu)先排除的化合物濃度、配位體濃度、原來存在于溶液中的任何化合物或附加的另外反應(yīng)物或試劑濃度。在裝置的所有前述實施方式中，裝置可包括一種材料，該材料允許在高壓處理的持續(xù)時間期間由于氧越過材料的質(zhì)量傳遞造成的、不大于約0.2mM的樣品氧濃度變化。在另一實施方式中，該材料允許在高壓處理的持續(xù)時間期間由于氧越過材料的質(zhì)量傳遞造成的、不大于約O.lmM的樣品氧濃度變化。在另一實施方式中，該材料允許在高壓處理的持續(xù)時間期間由于氧越過材料的質(zhì)量傳遞造成的、不大于約0.05mM的樣品氧濃度變化。在另一實施方式中，該材料允許在高壓處理的持續(xù)時間期間由于氧越過材料的質(zhì)量傳遞造成的、不大于約0.025mM的樣品氧濃度變化。在另一實施方式中，該材料允許在高壓處理的持續(xù)時間期間由于氧越過材料的質(zhì)量傳遞造成的、不大于約0.01mM的樣品氧濃度變化。在另一實施方式中，該材料允許在高壓處理的持續(xù)時間期間由于氧越過材料的質(zhì)量傳遞造成的、不大于約10%的初始氧含量的樣品氧濃度變化。在另一實施方式中，該材料允許在高壓處理的持續(xù)時間期間由于氧越過材料的質(zhì)量傳遞造成的、不大于約5%的初始氧含量的樣品氧濃度變化。在另一實施方式中，該材料允許在高壓處理的持續(xù)時間期間由于氧越過材料的質(zhì)量傳遞造成的、不大于約2.5%的初始氧含量的樣品氧濃度變化。在另一實施方式中，該材料允許在高壓處理的持續(xù)時間期間由于氧越過材料的質(zhì)量傳遞造成的、不大于約1%的初始氧含量的樣品氧濃度變化。在前述實施方式中，高壓處理可持續(xù)約6小時、約12小時、約18小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時或約48小時。在另一實施方式中，本發(fā)明包括在高壓下改變?nèi)芤簵l件的方法，包括以下步驟在第一容器中的溶液中提供至少一種組份；提供至少一種試劑，以用于改變至少一個附加的容器的溶液條件，其中至少一個附加的容器的容納物與第一容器的容納物不接觸；在高壓下放置容器；以及使至少一個附加的容器的容納物與第一容器的容納物接觸。在另一實施方式中，第一容器和至少一個附加的容器的容納物通過對流混合。在另一實施方式中，第一容器和至少一個附加的容器的容納物通過攪拌混合。在另一實施方式中，第一容器和至少一個附加的容器的容納物通過擴散混合。在另一實施方式中，第一容器和至少一個附加的容器的容納物通過使容納物經(jīng)過混合器例如靜態(tài)混合器來混合。在另一實施方式中，第一容器和至少一個附加的容器的容納物傳遞到接收容器，其中接收容器在傳遞之前可為空的，或在傳遞之前可包含液體或固體組份；第一容器和至少一個附加的容器的容納物可在傳遞到接收容器期間或之后混合。在另一實施方式中，至少一個附加的容器包括在所述第一容器內(nèi)。在另一實施方式中，至少一個附加的容器與第一容器一起處于流動通路中。在一個實施方式中，本發(fā)明包括在高壓下改變?nèi)芤簵l件的方法，包括以下步驟在第一容器中的溶液中提供至少一種組份；提供至少一種試劑，以用于改變至少一個附加的容器中的溶液條件，其中至少一個附加的容器的容納物與第一容器的容納物不接觸；在高壓下放置容器；以及使至少一個附加的容器的容納物與第一容器的容納物接觸，其中使至少一個附加的容器的容納物與第一容器的容納物接觸一段時間。在一個實施方式中，以連續(xù)的方式^f吏至少一個附加的容器的容納物與第一容器的容納物接觸，由此第一容器的容納物的溶液條件連續(xù)地改變一段時間。在另一實施方式中，以逐步(不連續(xù))的方式(例如，通過混合溶液的部分、等待并混合溶液的附加部分)使至少一個附加的容器的容納物與第一容器的容納物接觸，由此第一容器的容納物的溶液條件逐步地改變一段時間。在此溶液條件逐步變化的一個實施方式中，第一容器的容納物的pH為約9到約l1、或約9.5到約10.5、或約10。在此溶液條件逐步變化的另一實施方式中，笫一容器的容納物的pH為約9到約11、或約9.5到約10.5、或約IO,并降低到約7到約8.9、或約7.5到約8.5、或約8的pH。在逐步方法的另一實施方式中，pH大約每24小時降低約0.01到約2pH單位，或大約每24小時降低約0.1到約1pH單位，或大約每24小時降低約0.1到約0.5pH單位，或大約每24小時降低約0.1到約0.4pH單位，或大約每24小時降低約0.1到約0.3pH單位，或大約每24小時降低約0.2pH單位。在本方法的一個實施方式中，第一容器中的溶液內(nèi)的至少一種組份是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可為非天然狀態(tài)，例如變性蛋白質(zhì)或聚集體蛋白質(zhì)；聚集體蛋白質(zhì)可為可溶性聚集體、不溶性聚集體、或包含體、或前面的任何混合物。在本方法的一個實施方式中，用于改變?nèi)芤簵l件的至少一種試劑是用于改變?nèi)芤旱膒H的試劑。在另一實施方式中，用于改變?nèi)芤簵l件的至少一種試劑是用于改變?nèi)芤旱柠}濃度的試劑。在另一實施方式中，用于改變15溶液條件的至少一種試劑是用于改變?nèi)芤旱倪€原劑濃度、氧化劑濃度、或還原劑濃度和氧化劑濃度的試劑。在另一實施方式中，用于改變?nèi)芤簵l件的至少一種試劑是用于改變?nèi)芤旱碾x液劑濃度的試劑。在另一實施方式中，用于改變?nèi)芤簵l件的至少一種試劑是用于改變?nèi)芤旱木彼釢舛鹊脑噭?。在另一實施方式中，用于改變?nèi)芤簵l件的至少一種試劑是用于改變?nèi)芤旱谋砻婊钚詣舛鹊脑噭?。在另一實施方式中，用于改變?nèi)芤簵l件的至少一種試劑是用于改變?nèi)芤旱膬?yōu)先排除的化合物濃度的試劑。在另一實施方式中，用于改變?nèi)芤簵l件的至少一種試劑是用于改變?nèi)芤旱呐湮惑w濃度的試劑。在另一實施方式中，用于改變?nèi)芤簵l件的至少一種試劑是用于改變?nèi)芤褐性瓉泶嬖诘娜魏位衔餄舛鹊脑噭?。在另一實施方式中，用于改變?nèi)芤簵l件的至少一種試劑是添加到溶液的附加的反應(yīng)物或試劑。在另一實施方式中，容器放置在至少約250巴的壓力下。在另一實施方式中，容器放置在至少約400巴的壓力下。在另一實施方式中，容器放置在至少約500巴的壓力下。在另一實施方式中，容器放置在至少約IOOO巴的壓力。在另一實施方式中，容器放置在至少約2000巴的壓力下。在另一實施方式中，容器放置在至少約2500巴的壓力下。在另一實施方式中，容器放置在至少約3000巴的壓力下。在另一實施方式中，容器放置在至少約4000巴的壓力下。在另一實施方式中，容器放置在至少約5000巴的壓力下。在另一實施方式中，容器放置在至少約6000巴的壓力下。在另一實施方式中，容器放置在至少約7000巴的壓力下。在另一實施方式中，容器放置在至少約8000巴的壓力下。在另一實施方式中，容器放置在至少約9000巴的壓力下。在另一實施方式中，容器放置在至少約10,000巴的壓力下。圖1示出本發(fā)明的多孔平板設(shè)計的一個實施方式的頂視圖。圖2A示出多孔設(shè)計的一個可能實施方式的側(cè)視圖?？椎捻敳坎糠值馗采w在"圓頂"中，以確保排出所有空氣。圖2B示出覆蓋圖2A孔的"圓頂"的側(cè)視圖。圖3示出具有密封墊和夾具組件的96孔平板實施方式的實施例，該密封墊和夾具組件可用于密封圖2A和圖2B的"圓頂"入口。圖4示出本發(fā)明的另一實施方式，其中熱密封的隔膜用于密封本發(fā)明的多孔實施方式的孔。圖5示出本發(fā)明的恒定裝填容積的容器的另一實施方式。圖6示出本發(fā)明的可變裝填容積的容器的另一實施方式。圖7A示出用在可變裝填容積的容器中的單向閥組件的截面圖。圖7B示出安裝在可變裝填容積的容器中的單向閥組件。圖8示出用于在高壓下混合溶液的本發(fā)明的實施方式。在圖8A中，示出二級容器在封閉位置。在圖8B中，示出二級容器在打開位置。圖9示出用于在高壓下混合溶液的本發(fā)明的另一實施方式。圖10示出通過在高壓時基本上不可透氧的材料演示氧傳遞的實驗結(jié)果。示出對氧傳遞和GSH濃度的儲存和加壓條件的效果；溶液條件是pH8.0、4mMGSH、2mMGSSG、500ml溶液、25°C、17小時。圖ll示出氧通過由各種聚合物(LDPE，低密度聚乙烯，頂部曲線；HDPE，高密度聚乙烯，從頂部起的第二條曲線；PS，聚苯乙烯，從頂部起的第三條曲線和從底部起的第二條曲線；PET，聚對苯二甲酸乙二酯，底部曲線)制成的注射器的壁的計算的傳遞，作為周圍環(huán)境的氧濃度的函數(shù)。對注射器壁的氧傳遞被計算為聚合物類型的函數(shù)，假定傳遞24小時、1/16英寸厚、1.5英寸長以及0.25英寸外徑。圖12示出作為樣品中氣泡尺寸的函數(shù)的負(fù)載在包含氣泡的樣品中的氧的量，其中氣泡尺寸被計算為樣品的體積百分比。曲線假定PV-nRT,其是對該計算的適當(dāng)?shù)慕啤D13示出溶液交換裝置的實施方式的概略圖。圖14示出圖13溶液交換裝置的橫截面。圖15示出在混合溶液之前圖13和圖14溶液交換裝置的壓力室部分。圖16示出在混合溶液之后圖13和圖14溶液交換裝置的壓力室部分。17圖17示出圖13和圖14溶液交換裝置的一個預(yù)混合容器。圖18示出圖13和圖14溶液交換裝置的接收容器。圖19示出用在本發(fā)明的可變裝填容積實施方式之一的止回閥匹配器。圖20示出用在本發(fā)明的不同實施方式中的止回閥，例如在圖19中示出的止回閥匹配器。箭頭指示被允許的流體流動的方向。圖20A示出安裝在圖19止回閥匹配器中的圖20的止回閥。圖21示出本發(fā)明的可變裝填容積實施方式，其中止回閥匹配器(安裝有止回閥，如圖20A所示)插入裝置中，以包含其中的液體。圖22示出在壓力下進行考馬斯藍溶液交換的實驗?？招牡恼叫伪硎緦嶋H樣品(位于實線上的右上正方形相應(yīng)于初始條件；具有誤差條的右下正方形相應(yīng)于溶液交換之后的條件)。實線表示根據(jù)染料的已知濃度的校準(zhǔn)線。圖23示出作為溶液條件的函數(shù)的回收溶菌酶的百分?jǐn)?shù)。從左到右1MGdnHCl壓力處理的聚集體，沒有溶液交換；0.5MGdnHCl壓力處理的聚集體，沒有溶液交換；在從1MGdnHCl到0.5MGdnHCl壓力下交換的聚集體溶液；1MGdnHCl大氣壓力控制的聚集體，沒有溶液交換；0.5MGdnHCl大氣壓力聚集體，沒有溶液交換；以及在分別從1GdnHCl到0.5MGdnHCl大氣壓力下交換的聚集體溶液。所有的樣品械J故置在25。C的50mMTris-HCl、5mMGSSG、2mMDTT、pH8.0的重折疊緩沖液中。具體實施方式"高壓"意味著至少約250巴的壓力。使用本發(fā)明的裝置時的壓力可為至少約250巴的壓力、至少約400巴的壓力、至少約500巴的壓力、至少約l千巴的壓力、至少約2千巴的壓力、至少約3千巴的壓力、至少約5千巴的壓力、至少約6千巴的壓力、至少約7千巴的壓力、至少約8千巴的壓力、至少約9千巴的壓力、或至少約10千巴的壓力。"封閉系統(tǒng)"意^^未著指物質(zhì)不能在系統(tǒng)和其周圍環(huán)境之間傳遞的系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)熱力學(xué)術(shù)語；然而，機械或熱能的傳遞可出現(xiàn)在封閉系統(tǒng)和其周圍環(huán)境之間。相反，"開放系統(tǒng)"允許物質(zhì)和/或機械或熱能在系統(tǒng)和其周圍環(huán)境之間傳遞。"隔離系統(tǒng)"是不允許與其周圍環(huán)境機械接觸或熱接觸的封閉系統(tǒng)，即，不發(fā)生機械或熱能傳遞到隔離系統(tǒng)或從隔離系統(tǒng)傳遞出來。"基本上封閉的系統(tǒng)"是小于約1%、更優(yōu)選地小于約0.5%、更優(yōu)選地小于約0.2%、更優(yōu)選地小于約0.1%、更優(yōu)選地小于約0.05%、仍然更優(yōu)選地小于約0.01%的樣品質(zhì)量可在系統(tǒng)和其周圍環(huán)境之間傳遞的系統(tǒng)。"液體樣品的有效傳遞"意味著包含在樣品中的約1%或更多的液體體積(在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力下測量)的傳遞。當(dāng)本發(fā)明的裝置設(shè)計成阻止液體樣品的有效傳遞時，在裝置的使用期間傳遞的樣品的量為不加壓的樣品體積的小于約1%、更優(yōu)選地小于約0.5%、更優(yōu)選地小于約0.2%、更優(yōu)選地小于約0.1%、更優(yōu)選地小于約0.05%、仍然更優(yōu)選地小于約0.01%。"在高壓時氧基本上不可透過，，、"在高壓時基本上不可透氧"或"在高壓時基本上氧質(zhì)量傳遞不可透過，，意味著這樣一種材料，該材料允許在高壓處理的持續(xù)時間期間由于越過材料的氧質(zhì)量傳遞造成的、不大于約0.3mM的樣品氧濃度變化。在另一實施方式中，該材料允許在高壓處理的持續(xù)時間期間由于越過材料的氧質(zhì)量傳遞造成的不大于約0.2mM、優(yōu)選地不大于約0.1mM、優(yōu)選地不大于約0.05mM、更優(yōu)選地不大于約0.025mM、還要更優(yōu)選地不大于約0.01mM的樣品氧濃度變化。以百分?jǐn)?shù)表示，該材料允許在高壓處理的持續(xù)時間期間由于越過材料的氧質(zhì)量傳遞造成的樣品初始氧含量的不大于約10%、優(yōu)選地不大于約5%、更優(yōu)選地不大于約2.5%、還要更優(yōu)選地不大于約1%的樣品氧濃度變化。眉f時^"并高壓裝置的主體可由各種各樣的材料制造。如果裝置沒有可傳遞壓力的至少一個可移動的表面(例如在圖6中示出的可變裝填容積的裝置)，則制成裝置的材料應(yīng)為柔韌的，以實現(xiàn)壓力傳遞。合適的材料不應(yīng)破裂、破碎或以其他方式在高壓處理下經(jīng)受整體性的任何失效或損失，高壓處理允許樣品從一個或多個樣品室泄露到外部周圍環(huán)境，或允許容器的外部周圍環(huán)境中的流體、氣體或其它材料泄露到一個或更多樣品室中，或允許樣品在樣品室之間泄露。當(dāng)然，這樣的泄露并不意味著包括技術(shù)人員有意希望的在一個或多個樣品室和外部周圍環(huán)境之間的有意傳遞，或在兩個或多個樣品室或其它室之間的有意傳遞。裝置必須用可經(jīng)受至少約250巴的壓力并仍然維持整體性的材料構(gòu)造。在另一實施方式中，材料可經(jīng)受至少約500巴的壓力，并仍然維持整體性。在另一實施方式中，材料可經(jīng)受至少約1千巴的壓力，并仍然維持整體性。在另一實施方式中，材料可經(jīng)受至少約2千巴的壓力，并仍然維持整體性。在另一實施方式中，材料可經(jīng)受至少約3千巴的壓力，并仍然維持整體性。在另一實施方式中，材料可經(jīng)受高達約5千巴、優(yōu)選地高達約10千巴的壓力，并仍然維持整體性。特定的壓力是對裝置的多維壓力，不是跨過裝置的壓力差或壓力降。也就是說，容器或用作裝置的容器放置在被加壓到特定壓力的壓力室中；雖然壓力室必須能夠經(jīng)受室內(nèi)對室外部的大氣壓力的高達5千巴或IO千巴的壓力差或壓力降，但是容器的材料不經(jīng)受這樣明顯有差異的壓力，而更確切的是來自所有方向的均勻壓力。所使用的材料還應(yīng)允許從周圍環(huán)境到樣品室的壓力傳遞，使得跨過裝置的壓力大致相等；也就是說，裝置內(nèi)任何兩個位置經(jīng)受的壓力差不大于總壓力的約1%、優(yōu)選地不大于約0.5%、更優(yōu)選地不大于約0.1%。在其它實施方式中，裝置內(nèi)任何兩個位置經(jīng)受的絕對壓力差小于約5巴、優(yōu)選地小于約2巴、更優(yōu)選地小于約1巴。在外部施加的壓力和裝置的任何內(nèi)部部分之間的任何差異不大于外部施加的總壓力的約5%、更優(yōu)選地不大于約2%、更優(yōu)選地不大于約1%、仍然更優(yōu)選地不大于約0.5%、還要更優(yōu)選地不大于約0.1%。因此，材料應(yīng)為柔韌的，以便傳遞壓力。在一個實施方式中，材料為聚合物。在另一實施方式中，聚合材料可被注入模制，用于廉價的批量生產(chǎn)。適當(dāng)?shù)木酆喜牧习ň蹖Ρ蕉姿嵋叶?、高密度聚乙烯、聚苯乙烯和聚苯乙?丁二烯嵌段共聚物?？山?jīng)受高壓處理但不一定是不可透氧的其它聚合物材料包括低密度聚乙烯、聚丙烯20^品的真舍量時;#啟廚#很多反應(yīng)，例如含半胱氨酸的蛋白質(zhì)的重折疊可被樣品的氧含量影響。一般蛋白質(zhì)重折疊實驗需要使用特定濃度的氧化還原試劑，如硫醇(例如，谷胱甘肽、胱胺、胱氨酸、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚醇；以還原形式、氧化形式或還原形式和氧化形式的混合物，例如二石克化物混合物(disulfideshuffling))。樣品中氧的濃度可被樣品中氣泡的出現(xiàn)影響，因為氣泡坤皮迫使在高壓時進入溶液，從而改變了樣品中的02濃度。樣品中氧的濃度還可受跨過裝置的壁的氧的擴散影響。樣品裝置一般放置在施加了壓力的室中；如果用在室中的流體是水，則溶解在室內(nèi)圍繞樣品裝置的水中的氧可擴散跨過裝置的壁。在下列部分"由于氣泡引起的氧濃度變化"和"在高壓時的氧滲透性"中處理這些考慮因素。由于氣《f/趟W處淡產(chǎn)^^估計氧濃度的約80。/。的變化由樣品中的氣泡引起，而約20%的變化由跨過注射器型裝置的壁的氧擴散引起(其中裝置在高壓時對氧傳遞基本上是不可透過的)。這強調(diào)了從樣品小瓶中盡可能多地除去氣泡的重要性。對于lml樣品中每25pl的空氣，載入0.2mM的O2,因為高壓將使空氣溶解到液體樣品中；該數(shù)量的氧與0.8mM的還原硫醇反應(yīng)。一般還原硫醇濃度的范圍從約1mM到約10mM(ClarkE.D.，"Proteinrefoldingforindustrialprocesses"Curr.Opin.Biotechnol.12:202-207(2001)),且在該范圍內(nèi)還原石克醇濃度的0.8mM變化將引起濃度從約8%到約80%的變化。在4mM還原硫醇的一般濃度，還原硫醇的0.8mM還原導(dǎo)致還原硫醇的溶液濃度的約20%的變化。這強調(diào)了去除所有氣泡的重要性，這很難用當(dāng)前技術(shù)發(fā)展水平的小瓶實現(xiàn)，且設(shè)計本發(fā)明來處理此問題。圖12示出由不同尺寸的氣泡引起的氧裝填。應(yīng)將氣泡的體積百分比盡可能低地保持到不大于樣品體積的約10%、更優(yōu)選地不大于樣品體積的約5%、仍然更優(yōu)選地不大于樣品體積的約2.5%、還要更優(yōu)選地不大于才羊品體積的約1%。在毐在^W處滲邊^(qū)用在裝置中的材料可選地在高壓時基本上對氧質(zhì)量傳遞是不可透過的。當(dāng)氧傳遞可能影響正使用該裝置研究或處理的樣品時，應(yīng)使用基本上不可透氧的材料。可選地，所使用的材料在高壓時基本上對其它氣體的傳遞也是不可透過的，例如二氧化碳，其可能影響正使用該裝置研究或處理的樣品。在高壓時基本上對氧質(zhì)量傳遞不可透過的材料包括，但不限于聚對苯二甲酸乙二酯(PET或PETE)、Mylar(Mylar是Dupont的注冊商標(biāo)，指定雙軸向的聚對苯二甲酸乙二酯聚酯膜)、高密度聚乙烯和聚苯乙烯?？蛇x地，如果容器壁被制造得足夠厚，則可使用氧較不易透過的材料。最后，氧較易透過的、包括但不限于聚苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物例如Styrolux(例如，Styrolux684D)的材料可與其它聚合物或其它材料的適當(dāng)涂層一起使用，以減少它們的氧滲透性。(Styrolux是德國Ludwigshafen的BASFAktiengesellschaft7>司以及賓夕法尼亞州Lenni的WestlakePlastics公司用于苯乙烯樹脂的注冊商標(biāo)。)當(dāng)氧影響正使用該裝置研究或處理的樣品時，實驗證據(jù)證實了在高壓時使用基本上不可透氧的材料的效用。高達約0.35微摩爾的02可在一般的壓力實驗期間被傳遞，足以明顯地改變?nèi)芤旱难趸€原環(huán)境。圖10示出以目前用于高壓處理的常規(guī)注射器進行的實驗。所使用的注射器是來自BectonDickinson的1ml低密度聚乙烯注射器。將pH8.0、4mMGSH(還原的谷胱甘肽)、2mMGSSG(氧化的谷胱甘肽)的500ml水溶液保持在2150巴17個小時。如圖10所示，充足的氧被傳遞，以將還原谷胱甘肽的濃度從4.0mM降低到3.5mM或更小。圖11示出跨過在高壓下使用的注射器的壁的氧傳遞的量的計算。該計算是針對1/16英寸厚、1.5英寸長以及0.25英寸外徑的注射器的。計算假定在2000巴的24小時實驗具有可變的周圍氧濃度；在周圍流體中的預(yù)期氧濃度可能為約0,3mM(在壓縮之前約10%的環(huán)繞物的體積由氣泡組成的假^L下)，并用圖11中的垂直虛線示出。氣泡中的氧通過簡單地^f吏用理想氣體法則來計算，以在標(biāo)準(zhǔn)溫度和壓力下計算氣泡中空氣的量；在較高壓力時，空氣將溶解到溶液中。使用在穩(wěn)態(tài)擴散的Fick法則來進行計算；當(dāng)聚合物中02的溶解性在高壓時明顯增加時，使用擴散系數(shù)，而不是滲透性系數(shù)。擴散系數(shù)從PolymerHandbook,4thEdition;編輯J.Brandup，E.H.Immergut和E.A.Grulke;副編輯，A.Abe，D.R.Bloch;紐約Wiley,1999中獲得。用這些假設(shè)，計算表明，在周圍液體中氧濃度的可能值處，大約0.2mM當(dāng)量的02在由HDPE制成的管中傳遞，以及0.6mM當(dāng)量的02在由LDPE制成的管中傳遞?？邕^聚丙烯裝置的氧傳遞沒有被計算，而是根據(jù)相對滲透性值，被認(rèn)為在HDPE和LDPE的值之間。聚對苯二甲酸乙二酯(PET和PETE)被計算成在假定條件下幾乎沒有氧的傳遞。因此，該計算證明，材料可明智地選擇成明顯減少或幾乎消除通過裝置的聚合物壁的氧傳遞。袁f《滋才式'；,/乙f我在一個實施方式中，高壓裝置包括在主體或平板中的多個孔("多孔平板")。這樣的實施方式的一個例子在圖1中示出。所示實施方式是96孔平板；由在高壓時基本上對氧質(zhì)量傳遞不可透過的柔韌材料制成的主體(1)具有用于容納液體樣品的96個孔。材料優(yōu)選地(但不是必須)選擇成使得平板可通過注入模制形成。一旦為多孔平板實施方式的主體選擇了適當(dāng)?shù)牟牧希捅仨殞悠芬霕悠肥抑?。在樣品孔中包含氣穴是不希望有的，因為在高壓下，空氣中的氧將被推到溶液中，從而改變了樣品的氧化還原環(huán)境，且氣穴的出現(xiàn)還可造成對材料的過多應(yīng)變。因此，將孔設(shè)計成在最大可能的程度上消除孔中留下的任何殘留空氣。圖2A示出孔設(shè)計(1)的一個可能的實施方式的側(cè)視圖?？?3)被部分地覆蓋在"圓頂"(4)中，以確保排出所有空氣。圓頂(4)在圖2B中較詳細(xì)地示出。區(qū)域(6)是用于樣品裝入的入口，且被形成圓頂?shù)膱怨滩牧?5)圍繞。入口U)應(yīng)足夠大，以便能夠插入適當(dāng)尺寸的吸液管尖端，用于試劑傳送和排出空氣。該圓頂設(shè)計實現(xiàn)了過量填充，以在密封之前使孔內(nèi)的所有空氣排出。此外，在過量填充期間，過多的樣品沿著圃頂?shù)膫?cè)面排出，并消除了樣品之間的交叉污染。圓頂U)在緊密地圍繞入口的(4A)區(qū)域內(nèi)具有基本上頂部平坦的表面，以便提供足夠的密封表面。尺寸選擇成使樣品能夠用標(biāo)準(zhǔn)尺寸的吸液管尖端裝入，以使樣品能夠排出，在圓頂?shù)牡撞坑凶銐虻臏喜蹃矸乐菇徊嫖廴荆⑻峁┣懊嫣岬降钠教鬼敳縼硖峁┏渥愕拿芊獗砻?。在多孔裝置的一個實施方式中，墊放置在多孔平板的頂部上，以密封孔。適合于這樣的墊的材料包括，但不限于硅橡膠。在一個實施方式中，墊具有大約1/8英寸的厚度，且長度和寬度基本上與和它一起^f吏用的多孔平板的長度和寬度一樣。墊應(yīng)由足夠柔韌的材料制成，以實現(xiàn)在圓頂頂部上的良好密封，并允許由于樣品內(nèi)壓力引起的體積變化造成的變形。因為在本實施方式中，在密封表面兩端沒有差壓，也就是說，孔內(nèi)樣品經(jīng)受的壓力基本上類似于墊經(jīng)受的壓力，與在大氣壓力下預(yù)期的墊相比，密封墊不需要提供任何附加的密封性能。如果所使用的密封材料在高壓時不U本上對氧是不可透過的，則可將在高壓時基本上對不可透氧的膜放置在密封墊上，以抑制氧傳遞。該膜可由包括但不限于Mylar⑧的材料制成。在使用密封墊的多孔裝置的該實施方式中，夾具固定在平板上，以便將力置于密封墊上，并實現(xiàn)孔的密封。夾具應(yīng)提供裝置兩端的均勻的力以及足夠的力，來確保充分密封。夾具還應(yīng)在整個加壓周期中提供恒定的力，由于在高壓時材料的收縮(特別是密封墊)，這需要恒定的張力夾具(不是恒定的力夾具)。圖3示出具有密封墊(3-1)和夾具組件(3-2)的96孔平板實施方式。在圖4示出的多孔平板的另一實施方式中，平板的孔沒有被圓頂和密封墊覆蓋；相反，在給孔裝入樣品之前，孔由熱密封的隔膜(4-2)覆蓋。這樣的隔膜通常在密封醫(yī)用小瓶時使用。熱密封的隔膜確保了密封的孔，并防止樣品污染。樣品通過用裝配有針的多通道吸液管而不是吸液管注入來裝入該實施方式的多孔平板中。針穿透隔膜，以便填充樣品孔。二級針也在填充的同時刺穿樣品，以便排出空氣，并允許孔全部充滿。設(shè)計成將溶液吸到多孔平板中的多通道吸液管在市場上可以買到；這樣的吸液管可容易適合于使用用于樣品裝填的針，而不是吸液管尖端。在樣品裝入之后，隔膜用二級粘性聚合物膜(4-1)覆蓋。該膜密封在樣品裝填期間產(chǎn)生的刺破的孔?？蛇x地，膜還可抑制隔膜兩端的氧擴散；也就是說，膜對氧基本上是不可透過的。用于粘性聚合物膜的可能材料包括，但不限于Mylar②。但定袁鎮(zhèn)容積的袁f在另一實施方式中，高壓裝置包括容器，其中容器的體積在標(biāo)準(zhǔn)壓力時是固定的；本實施方式指定恒定裝填容積的裝置。整個容器在暴露于高壓時成比例地收縮；一般，容器在2千巴時收縮其體積的約5%-10%,以及在4千巴時收縮其體積的約20%(估計的)；因此，為了制造該裝置，應(yīng)使用柔韌材料。在圖5中示出了這樣的實施方式的一個例子。該裝置由具有圓錐形底部的圓柱形筒組成。容器可制造有各種各樣的內(nèi)部體積；在表1中規(guī)定了具有250jiL、500fiL、750jiL或1000fiL的容器的尺寸的例子。容器的內(nèi)部可例如以50fiL的增量定刻度。圓柱形筒的頂部可帶有螺紋，以用螺帽(其可成形為圖5中的圓錐形底部，或其也可為圓柱形的)密封。當(dāng)在內(nèi)部和外部之間有至少約5psig的壓力差時(注意，5psig是差壓，不是總壓力；該量值的壓力差類似于包含碳酸飲料的商業(yè)瓶的壓力差)，有螺紋的螺帽應(yīng)能夠維持密封。恒定裝填容積的裝置的實施方式的一般尺寸在表l中給出(恒定裝填容積的裝置的這些特定實施方式的壁的厚度是1/16英寸)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>在另一實施方式中，高壓裝置包括可變裝填容積的容器。在圖6中示出該實施方式的例子。在該實施方式中，以類似于注射器的方式提供了具有可移動的塞(6-2)和可拆卸的蓋(6-3)的筒體(6-1)。在一個實施方式中，當(dāng)筒體垂直定向時，塞形成樣品室的底部，并充當(dāng)樣品室和外部環(huán)境之間的密封。塞可具有連接的柱塞桿或分離的柱塞桿(6-4),其可用于在充滿筒體之前，移到塞到期望的容積。筒體可例如以50nL的增量定刻度，以便引導(dǎo)塞放置到期望的容積。樣品包含在裝置的內(nèi)部空間(6-5)中。筒體可接著用期望的樣品填充，小心以便盡可能多地除去殘余空氣。接著，將可拆卸的蓋放置在筒體的頂部上。在可選實施方式中，筒體可在相反的方向填充，即，筒體可定向成使得蓋放置在筒體的底部上，而塞插入筒體的頂部中。在一個實施方式中，可拆卸的蓋是帶有螺紋的，并可被簡單地擰到筒體的頂部上。當(dāng)在內(nèi)部和外部之間有至少約5psig的壓力差時(注意，5psig是差壓，不是總壓力；該量值的壓力差類似于包含碳酸飲料的商業(yè)瓶的壓力差)，有螺紋的可拆卸的蓋應(yīng)能夠維持密封。之后，可在壓力下對樣品進行處理；在壓力處理之后，可移除蓋，并通過用柱塞桿推塞而倒出或推出筒體的容納物。在可選實施方式中，用在筒體的封閉端上的易破末端來代替可拆卸的蓋。在本實施方式中，液體樣品放置在筒體中，且塞插在筒體的頂部。易碎末端在高壓處理期間保持完好無損。在處理之后，拆掉末端，并通過用柱塞桿推可移動的塞而倒出或推出筒體的容納物。末端可設(shè)計成用手拆掉，或可設(shè)計成通過切割工具拆掉；見圖21可變裝填容積的裝置的例子，其中末端可通過切割工具來去除，以便排出樣品。在另一可選實施方式中，針可插在可移動的塞和筒體壁之間，以將樣品插入筒體中。當(dāng)樣品被力文入時，在可移動的塞上的單向閥允許排出筒體內(nèi)的空氣(見圖7A、圖7B以及下面單向閥組件的討論)。應(yīng)注意，因為可移動的塞將響應(yīng)于施加的壓力而移動，用于制造可變裝填容積的裝置的材料不需要與用在本發(fā)明的其它裝置中的材料一樣柔韌。在圖7A和圖7B中，示出可移動的塞(7)，其特別適合于高壓應(yīng)用，并可起單向閥塞的作用。在圖7A和圖7B中示出的實施方式是瓣塞或瓣閥，因為它依賴于瓣來允許液體的單向流動。在圖7A中，柔韌的瓣(7-1)用O型圏(7-2)形成密封。瓣(7-1)和O型圏(7-2)從內(nèi)部通道(7-4)密封外部環(huán)境(7-6)，內(nèi)部通道(7-4)在開口(7-7)向可變裝填容積的裝置的內(nèi)部打開。區(qū)域(7-3)是實體的。如圖7B所示，當(dāng)單向閥塞插入可變裝填容積的裝置的聚合物筒(6-1)中時，可向下壓塞，直到樣品開始從單向閥流出。這出現(xiàn)在當(dāng)柔韌的瓣(模制瓣)彎曲以允許樣品通過由圖7B中的箭頭指示的路徑逸出時。向下壓直到樣品流出閥確保盡可能多的從樣品排出，且也允許調(diào)節(jié)裝置中樣品的量。因為瓣可只在一個方向彎曲(遠離O型圏)，所以出現(xiàn)在樣品外部的空氣或任何其它物質(zhì)都不能回流到樣品中。適合于用作高壓樣品小瓶的另一可變裝填容積的裝置在圖21中示出，該裝置由聚合物樣品筒、止回閥匹配器、止回閥組件和O型圏密封件組成。在圖19中，示出用于可移動的塞(19-0)的另一設(shè)計，塞(19-0)對高壓應(yīng)用特別有用，并可起單向閥塞的作用；這個可移動的塞也用作止回閥匹配器(即，止回閥可插入可移動的塞(19-0)中)。塞可由各種材料制造，27包括但不限于Delrin(Delrii^是特拉華州Wilmington的E.I.DuPontdeNemoursandCompany的注冊商標(biāo)，用于縮醛樹脂)；塞可通過注入模制或通過機械加工制造。塞接觸液體樣品的區(qū)域是曲面(19-1)(注意，當(dāng)插入容納液體的容器中時，塞將從圖19所示的方向反向)；這個曲率確保從容器推出盡可能多的氣體。凹槽(19-3)允許安裝O型圏，以用容器的壁形成可移動的密封。該塞適合于在其內(nèi)腔(19-4)中接納止回閥，內(nèi)腔(19-4)可通過用手將止回閥插入匹配器中而容易安裝。閥塞/止回閥匹配器優(yōu)選地利用球-彈簧止回閥。圖20示出這樣的止回閥(20-1),其在市場上可以買到(TheLeeCo,PN#CCPX0003349SA，Westrook，Connecticut)。圖20中的箭頭指示止回閥中被允許的液體流動的方向。液體通過止回閥的內(nèi)腔(20-2)，從而通過壓縮閥彈簧(20-4)來向下推閥的球(20-3)。一旦流體不再流動，彈簧(20-4)就將球(20-3)推回，以密封閥。圖20的止回閥插入圖19的止回閥匹配器部件中；圖20A示出安裝有止回閥(20-1)的止回閥匹配器(19-0)。包括止回閥的止回閥匹配器插入容器中，以形成如圖21中的可變裝填容積的容器。容器(21-1)由可經(jīng)受高達約5千巴、優(yōu)選地高達約10千巴的加壓并可選地是不可透氧的柔韌材料制成。可變裝填容積的裝置的容器(21-1)可使用例如Styrolux⑧684D的材料在單腔模具(例如可從加利福尼亞OrangeCounty的PTGGlobal公司得到的模具)中進行注入模制。構(gòu)造的材料不限于Styrolux,并可進一步調(diào)節(jié)，以調(diào)整氧滲透性。容器包含液體樣品(21-2)。在一個實施方式中，可變裝填容積的裝置可容納高達1.2ml的液體體積，并可在150jiL-1200nL的體積范圍內(nèi)使用。具有止回閥(21-4)的匹配器(21-3)插入容器(21-1)的頂部中；止回閥被定向成使得容器內(nèi)的空氣和液體可向上流動，并流出容器，但阻止液體向下流動和流入容器中。當(dāng)匹配器被向下推到容器中時，空氣被推出止回閥；在液體樣品開始被推出容器之前，匹配器的凹形底部確保盡可能多的空氣被推出。于是，如所示的可變裝填容積的裝置可經(jīng)受高壓。袁_￡其滋才4';溶濕it換f溶濕;遂合J袁f在另一實施方式中，高壓裝置包括多個室，其中室的容納物可保持分離，或可混合在一起。這樣的裝置被指定為溶液交換裝置或溶液混合裝置。當(dāng)在高壓下處理液體樣品時，可混合容器的容納物，以改變液體樣品的化學(xué)溶液條件?？杀桓淖兊幕瘜W(xué)溶液條件包括，但不限于pH、鹽濃度、還原劑濃度、氧化劑濃度、離液劑濃度、精氨酸濃度、表面活性劑濃度、優(yōu)先排除的化合物濃度、配位體濃度、原來存在于液體樣品中的任何化合物濃度、或添加到溶液的附加反應(yīng)物或試劑添加物濃度中的任何一個或多個。在另一實施方式中，化學(xué)溶液條件通過將額外的試劑或反應(yīng)物添加到液體樣品來改變。這樣的試劑或反應(yīng)物可包括酶抑制劑、藥物、小有機分子(分子重量在約1000道爾頓以下)或蛋白質(zhì)衍生試劑。容器哞的容器其滋才^;:在包括多個室的一個這樣的實施方式中，其中室的容納物可保持分離，或可混合在一起，高壓裝置包括包圍一個或多個二級室的初級室，其中一個或多個二級室可被打開，而不打開初級室，由此一個或多個二級室的容納物被釋訪文，而與初級室的容納物接觸。在圖8A和8B中示出該實施方式的例子?？勺冄b填容積的容器，例如圖6或圖21的可變裝填容積的容器用作初級室，而一個或多個二級容器(8-l)放置在可變裝填容積的容器(6-5)的內(nèi)部中。(應(yīng)注意，可變裝填容積的容器僅僅作為例子使用；本發(fā)明的任何其它裝置，例如恒定裝填容積的容器可用作初級室。)二級容器的一端被密封。磁盤(8-3)放置在二級容器的另一端上，該磁盤構(gòu)造有通過二級容器的一個壁或側(cè)面、通過盤的中心并進入二級容器對面的壁或側(cè)面中的軸。盤應(yīng)設(shè)計有公差，以便盡可能準(zhǔn)確地配合到二級容器中。盤設(shè)計成在軸上自由地旋轉(zhuǎn)，從而以類似于常規(guī)蝶閥的方式有效地打開或關(guān)閉二級容器。斜面或有斜面的邊緣用于以對盤后部的盡可能緊密的公差實現(xiàn)磁盤的自由旋轉(zhuǎn)。該設(shè)計使磁盤能夠自由地旋轉(zhuǎn)，同時當(dāng)磁盤在封閉位置時提供有效的密封。當(dāng)使用該設(shè)計時，優(yōu)選地將初級容器維持在使得二級容器或容器在垂直位置的位置中，以便重力有助于將磁盤維持在其封閉位置。通過以垂直或平行方式放置在高壓容器外部周29圍的電線圏來啟動開關(guān)，初級室(包括二級容器)放置在該高壓容器中。水平線圏基本上平行于壓力容器內(nèi)的磁盤，以便產(chǎn)生將磁盤維持在封閉位置或密封位置的磁場。這在圖8A中示出。因為壓力容器通常由不銹鋼制成，所以線圏設(shè)計有適當(dāng)數(shù)量的圏、規(guī)范厚度和能夠產(chǎn)生足夠強的磁場以穿透壓力容器的內(nèi)部的電流?？蛇x地，壓力容器可由不減弱磁場的材料制成，差不多為鋼或其它這樣的鐵》茲性材料。用于控制磁盤的電線圏的另一布置包括以水平方式和垂直方式將線圏放置在樣品架周圍。在該設(shè)計中，磁場不必穿透壓力容器的鋼壁；然而，承載電流的電線必須插入壓力容器的內(nèi)部。這可通過由絕緣陶瓷而不是鋼來制造常規(guī)壓力容器的密封塞的底部來實現(xiàn)。當(dāng)磁盤保持在封閉位置時，水平場打開和水平場關(guān)閉，從而將磁盤維持在水平位置，并從初級容器的溶液容納物密封二級容器的溶液容納物。為了實現(xiàn)溶液交換，以適當(dāng)?shù)姆绞?例如，停止水平線圏中的電流并開始垂直線圏中的電流)控制水平線圏和垂直線圏中的電流，以如圖8B所示打開盤，從而允許二級容器的容納物(包括在二級容器的內(nèi)部空間(8-2)中)與初級容器的容納物接觸(包括在初級容器的內(nèi)部空間(6-5)中)。盤可用于產(chǎn)生混合行為；水平線圏和垂直線圏中的電流是交變的，使用交變電流來產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)的電磁場并翻轉(zhuǎn)磁盤。這使二級容器的的容納物向初級容器打開，而盤的運動實現(xiàn)了對流和溶液交換。在變化形式中，二級容器上的蓋可由驅(qū)動軸控制，該驅(qū)動軸通過進到高壓室內(nèi)的適當(dāng)密封的開口進入高壓室，并還通過適當(dāng)?shù)拿芊馔ㄟ^初級容器。^動回廖其滋才4:在包括多個室的另一個這樣的實施方式中，其中室的容納物可保持分離，或可混合在一起，高壓裝置包括由流動路徑連接的至少兩個室，其中室和流動路徑形成具有至少一個泵的閉合環(huán)狀回路。本實施方式的例子在圖9中示出。液體樣品放置在"離解"室(9-1)中，而第二溶液放置在"重折疊"室(9-2)中。附加的離解室、重折疊室和流動路徑可按需要添加。然后，裝置放置在壓力室中，并被加壓。當(dāng)希望混合液體樣品與第二溶液時，柱塞泵(9-5)被打開，從而使液體通過閉合環(huán)狀回路(9-3)循環(huán)。柱塞(9-7)可由磁性材料制成，從而實現(xiàn)通過磁場的抽吸率控制。微處理器控制的電池供電的線圏可連同室和流動回路一起放置在壓力室內(nèi)部，以便控制柱塞泵。(微處理器(9-8)和電池(9-9)優(yōu)選地嵌入氧化還原塊(9-4)中，以減少到微處理器本身的壓力傳遞。)可選地，用于控制初級容器/二級容器裝置中二級室金屬盤的金屬線圏的布置可用于控制柱塞。在又一變化形式中，裝置可由通過進到高壓室中的適當(dāng)密封的開口^高壓室中的驅(qū)動軸控制。一個或更多止回閥(9-6)確保不定向的流動。雖然為了容易理解圖，容器被標(biāo)記為"離解室"和"重折疊室"，但是應(yīng)認(rèn)識到，其它化學(xué)和生物化學(xué)處理可出現(xiàn)在任一或兩個室中。豫濕合容器/凝炎6^遂合J容器《滋才^:在包括多個室的另一個這樣的實施方式中，其中室的容納物可保持分離，或可混合在一起，高壓裝置包括一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括接納液體樣品的被指定為預(yù)混合容器的至少兩個容器。液體樣品通常在一個或更多條件或組成上不同，例如鹽濃度、pH等。(如果希望，液體樣品可為相同的。)系統(tǒng)還包括^:指定為接收容器或后混合容器的至少一個附加的容器，其中接收(預(yù)混合)容器在傳遞之前可為空的，或在傳遞之前可包含液體或固體組份。這樣的系統(tǒng)(100)在圖13中示出，并在圖14中示出詳細(xì)的橫截面。在圖14中，被塞(U2)密封的壓力室(102)支持包含分離的液體樣品的兩個預(yù)混合容器(120)和(122)。預(yù)混合容器示為與圖14中的尺寸大致相等；然而，容器的尺寸可相對于彼此變化，以便例如一個預(yù)混合容器可具有兩倍于其它預(yù)混合容器的體積。此外，為了簡單起見，只示出兩個預(yù)混合容器，但如果希望可使用更多預(yù)混合容器。預(yù)混合容器具有可移動的柱塞(128);液體導(dǎo)管(124)通向混合器(126)。混合器通向包含柱塞(132)的接收(后混合)容器(130)，柱塞(132)在圖14中示為頂著接收容器的頂部平齊。閥(104)、壓力發(fā)生器(108)和壓力線(110)與壓力室(102)的內(nèi)部(103)相通，并可將壓力室(102)的內(nèi)部加壓到高達例如2，000-2，500巴。閥(106)、壓力發(fā)生器(108)和液壓線(111)與布置在柱塞(132)下面的液體相通。圖15更詳細(xì)地示出壓力室(102)。液壓出口(134)從接收容器(130)中除去液體，從而使柱塞(132)從密封件(131)移開，即，柱塞(132)從混合器(126)的入口拉開。這接著使液體通過混合器(126)吸入預(yù)混合容器(120)和(122)中，其中液體在到接收容器(130)的途中混合。當(dāng)液體排出容器(120)和(122)時，柱塞(128)被向下拉；當(dāng)預(yù)混合容器(120)和(122)成為空的時，柱塞(128)靠著密封件(125)擱置。在另一實施方式(未示出)中，液壓可施加到柱塞(128)的外側(cè)，以便于流體從預(yù)混合容器(120)和(122)排出。圖16示出在預(yù)混合容器(120)和(122)內(nèi)的液體樣品傳遞到接收容器(130)之后的裝置。在流體從預(yù)混合容器(120)和(122)排出后，柱塞(128)靠著密封件(125)平齊。在接收容器(130)內(nèi)的柱塞(132)從密封件(131)被推開，以接納傳遞到接收容器的液體。圖17更詳細(xì)地示出預(yù)混合容器(120)。樣品通過入口(121)放入預(yù)混合容器(120)中；在放入樣品后，塞或止回閥可接著插入入口(121)中，以密封預(yù)混合容器。柱塞(128)具有密封有O型圏(129B)的環(huán)形凹槽(129A)，以便在柱塞和容器的壁之間形成密封。圖18更詳細(xì)地示出接收容器(130)。液體通過密封件(131)中的開口(136)進入接收容器中(止回閥，未示出，可選地布置在開口(136)中，以便阻止回流)；O型圏(135)增強密封。向下拉柱塞(132)的負(fù)液壓通過開口(134)被施加，負(fù)液壓又使液體從預(yù)混合容器流(沒有在圖18中示出)吸到接收容器(130)中。柱塞(132)具有O型圏(135)，以阻止液體在柱塞周圍傳遞。壓力室(102)可被加壓，以便對液體樣品產(chǎn)生2000-2500巴(也可使用更高或更低的值，例如250巴到10千巴，或1千巴到10千巴，或l千巴到5千巴)。因此，預(yù)混合容器、接收容器和因而液體樣品本身可在混合之前、期間和之后維持在高壓。裝置因此允許在高壓下分離地處理或培養(yǎng)兩個或更多溶液一段第一時間(例如，從約l分鐘到約l星期，或約IO分鐘到約48小時，或約1小時到約48小時，或約10分鐘到約24小時，或約1小時到約24小時，或約10分鐘到約12小時，或約1小時到約12小時，或約1小時到約6小時)。溶液可接著被混合在一起；混合溶液可被培養(yǎng)一段第二時間(例如，從約1分鐘到約1星期，或約10分鐘到約48小時，或約1小時到約48小時，或約10分鐘到約24小時，或約1小時到約24小時，或約10分鐘到約12小時，或約1小時到約12小時，或約1小時到約6小時)。在兩個培養(yǎng)時期都結(jié)束之后，壓力室被減壓，且將溶液從接收室除去，它在接收室中被分析用于各種特性(例如蛋白質(zhì)的正確重折疊)和/或用于期望的目的。可使用的裝置的例子包括高壓發(fā)生器，PN弁37-5.75-60，HighPressureEquipmentCo.,Erie,Pennsylvania(以注射器泵的形式，定為60,000psi);高壓管道系統(tǒng)(PN#60-9H4-304,HighPressureEquipmentCo.);高壓閥(PN#60匪11HF4，HighPressureEquipmentCo.);高壓密封管(PN#60-2HM4)以及套圏(來自HighPressureEquipmentCo.的PN#60-2H4)。預(yù)先混合容器可由透明石英筒體(WilmadGlass,Buena，JewJersey)制造；石英筒體可用裝配有O型圏(McMaster-Carr,Aurora,Ohio,PN9396K16,2-011，由硅橡膠制成)的制成的不銹鋼柱塞(高精度裝置，Boulder,Colorado)覆蓋。初級室的出口通過使用標(biāo)準(zhǔn)HPLC色譜法配件(PN#F-300-01，F(xiàn)國113，F(xiàn)畫126x，1576，Upchurch，OakHarbor,Washington)連接到靜態(tài)混合器。如圖所示的混合裝置是可選的；當(dāng)希望比簡單的擴散高的混合率時，或當(dāng)希望徹底的混合時，可使用這樣的混合器?？墒褂渺o態(tài)混合器，例如用在HPLC應(yīng)用中的混合器；這些混合器可從4艮多供應(yīng)商得到(例如，AnalyticalScientificInstruments,ElSobrante,California,靜態(tài)混合器PN#40200000.5)。靜態(tài)混合器的出口通過4吏用標(biāo)準(zhǔn)HPLC色i普法配件(例如前面描述的Upchurch配件)連接到二級重折疊室。溶遂奈斧的遂步錄，在預(yù)混合容器/接收(后混合)容器實施方式中，應(yīng)注意，溶液不需要在一個步驟中全部混合；也就是說，在預(yù)混合容器中的溶液的一部分可流到接收容器中，接著是在預(yù)混合容器中以及在接收容器中在剩余溶液的壓力下的繼續(xù)培養(yǎng)。以這種方式，可實現(xiàn)溶液條件的逐33步調(diào)節(jié)。在附加的實施方式中，預(yù)混合容器可具有單獨啟動的閥，用于在不同的時間點添加不同的預(yù)混合溶液。因此，例如，對于被指定為A、B、C和D的預(yù)混合容器，在預(yù)混合容器A中的液體樣品如蛋白質(zhì)溶液可被培養(yǎng)一段時間，接著(閥A和B打開，但閥C和D關(guān)閉)預(yù)混合容器A和B的容納物可流到接收容器中，以改變來自容器A的液體樣品的原始溶液條件。在進一步的培養(yǎng)時期之后，可打開預(yù)混合容器C的閥，且容器C的容納物流到接收容器中。在又一個培養(yǎng)時期之后，可打開預(yù)混合容器D的閥，且容器D的容納物流到接收容器中，如果希望，接著仍然是另一個培養(yǎng)時期。這可使用如期望的那樣多的預(yù)混合容器來實現(xiàn)，以便以逐步方式調(diào)節(jié)液體樣品的溶液條件。在流動回路實施方式中，可通過指定幾個容器例如容器A、B、C和D來實現(xiàn)溶液條件的逐步調(diào)節(jié)。溶液可在高壓下培養(yǎng)一段時間。接著可打開容器A和B的閥，從而允許這些容器之間的流動(以及當(dāng)其容納物與容器B的容納物混合時，容器A的溶液條件的改變)，而容器C和D的閥可保持在適當(dāng)?shù)奈恢?，其中在培養(yǎng)時期期間流動繞過容器C和D。閥可接著設(shè)置成允許容器C的容納物放置到流動回路中(例如，通過關(guān)閉容器C周圍的旁路分流器，并打開閥，以將容器C置于流動回路中)，其中容器C的容納物此刻與容器A和B的容納物在流動回路中混合(以及當(dāng)其容納物與容器C的容納物混合時，容器A的溶液條件的改變)，同時在另一培養(yǎng)時期內(nèi)流動繼續(xù)繞過容器D。最后，岡可打開，以將容器D置于流動回路中，同時關(guān)閉容器D周圍的旁路分流器，用于當(dāng)其容納物與容器D的容納物混合時，又一次調(diào)節(jié)流動回路中溶液的溶液條件以及又一個培養(yǎng)時期。這可按需要用流動回路中的具有適當(dāng)?shù)拈y和旁路分流器的很多容器來實現(xiàn)，以便以逐步方式調(diào)節(jié)液體樣品的溶液條件。這些實施方式可用于在不同條件下蛋白質(zhì)的重折疊。Lin在美國專利No.6,583,268以及Li，M.和Z.Su(2002)，Chromatographia56(1-2):33-38中提出在高pH下使用離液劑重折疊蛋白質(zhì)，接著是pH的逐步減小、蛋白質(zhì)溶液的稀釋以及超濾和凝膠色鐠法。使用如上所述的高壓裝置，壓力34調(diào)節(jié)的重折疊(250-5000巴的壓力)可在堿性pH(接近10.0)的非變性離液劑溶液中進^f亍，接著溶液的pH可以逐步方式逐漸減小，直到得到pH8.0的值。美國專利No.6,583,268中提出了每24小時0.2單位的速率，24小時是pH從10降低到8的10天中的一個時期；該速率可作為一般條件采用，或可在一個蛋白質(zhì)到另一個蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上確定最佳條件。高靜壓的使用可減小或消除使用高濃度的離液劑的需要，以促進聚集體分解。通過合并壓力和離液劑/pH調(diào)節(jié)的重折疊方法，期望獲得較高的重折疊產(chǎn)量。在一個實施方式中，本發(fā)明包括改變高壓下溶液條件的方法，包括以下步驟在至少一個第一容器中的溶液中提供至少一種組份；在至少一個附加的容器中為改變?nèi)芤簵l件提供至少一種試劑，其中至少一個附加的容器的容納物與至少一個第一容器的容納物不接觸；在高壓下放置容器；以及使至少一個附加的容器的容納物與至少一個第一容器的容納物接觸，其中使至少一個附加的容器的容納物與至少一個第一容器的容納物接觸一段時間。在一個實施方式中，以連續(xù)的方式使至少一個附加的容器的容納物與至少一個第一容器的容納物接觸，由此第一容器的容納物的溶液條件連續(xù)地改變一段時間。在另一實施方式中，以連續(xù)的方式使至少一個附加的容器的容納物與至少一個第一容器的容納物接觸，由此至少一個第一容器的容納物的溶液條件逐步地改變一段時間。在此溶液條件中逐步變化的一個實施方式中，pH改變，且第一容器的容納物的pH為約9到約11、或約9.5到約10.5、或約IO。在此溶液條件中逐步變化的另一實施方式中，第一容器的容納物的pH為約9到約11、或約9.5到約10.5、或約IO,并降低到約7到約8.9、或約7.5到約8.5、或約8的pH。在逐步方法的另一實施方式中，pH大約每24小時降低約0.01到約2pH單位，或大約每24小時降低約0.1到約1pH單位，或大約每24小時降低約0.1到約0.5pH單位，或大約每24小時降低約0.1到約0.4pH單位，或大約每24小時降低約0.1到約0.3pH單位，或大約每24小時降低約0.2pH單位。在溶液條件調(diào)節(jié)之前、期間或之后的培養(yǎng)時期可按需要為最佳的重折疊產(chǎn)量變化；例如，在高壓下的培養(yǎng)在溶液條件的調(diào)節(jié)之前可進行從約1分鐘到約1星期、或約10分鐘到約48小時、或約1小時到約48小時、或約10分鐘到約24小時、或約1小時到約24小時、或約10分鐘到約12小時、或約1小時到約12小時，或約1小時到約6小時的任何一段時間。對于溶液條件的逐漸的連續(xù)變化，調(diào)節(jié)可進行從約1分鐘到約1星期、或約10分鐘到約48小時、或約1小時到約48小時、或約10分鐘到約24小時、或約1小時到約24小時、或約IO分鐘到約12小時、或約1小時到約12小時，或約1小時到約6小時的任何一段時間。對于溶液條件的逐步調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)之間的時間間隔可為從約l分鐘到約l星期、或約IO分鐘到約48小時、或約1小時到約48小時、或約IO分鐘到約24小時、或約1小時到約24小時、或約IO分鐘到約12小時、或約1小時到約12小時，或約1小時到約6小時的任何一段時間。最后，在溶液條件調(diào)節(jié)到期望的目標(biāo)條件之后，在高壓下的培養(yǎng)可進行從約1分鐘到約1星期、或約10分鐘到約48小時、或約1小時到約48小時、或約10分鐘到約24小時、或約1小時到約24小時、或約IO分鐘到約12小時、或約1小時到約12小時，或約1小時到約6小時的任何一段時間。在如上所述的方法中，當(dāng)溶液條件變化時，至少一個第一容器的容納物可保留在第一容器中，如同用于溶液交換的容器中的容器實施方式的情況一樣?？蛇x地，當(dāng)溶液條件變化時，至少一個第一容器的容納物的所有或一部分可不再在第一容器中，如同流動回路或預(yù)混合容器/接收容器(后混合)容器實施方式的情況一樣，在這種情況下，第一容器的容納物的改變出現(xiàn)在部分地或完全遠離第一容器的位置。在這樣的情況下，應(yīng)理解，對改變至少一個第一容器的容納物的溶液條件的參考指改變原來在至少一個第一容器中的容納物的溶液條件(即，"至少一個第一容器的容納物"被理解為讀成"在溶液交換之前至少一個第一容器的原始容納物")。舉品放入摔^皇^一旦為裝置的主體選擇了適當(dāng)?shù)牟牧?，樣品就必須放入樣品室中。裝置適合于接收液體樣品，因而可使用用于液體傳遞的各種標(biāo)準(zhǔn)方法?？墒?6用本領(lǐng)域中公知的手持式或機械式吸液管、注射器、泵和其它液體傳遞工具。在加壓之前，應(yīng)小心從任何裝置排出盡可能多的殘余空氣，這幫助防止材料失效，并防止包含在空氣中的氧在系統(tǒng)中被溶解。裝置可填充有惰性氣體如氮或氬，以便當(dāng)施加壓力時防止不能排出的殘留氣體改變液體的氧含量。在某些附加的實施方式中，在將液體裝入室之前，一種或更多種氣體通過樣品噴射。這樣的氣體包括，但不限于相對惰性的氣體，例如氦、氮、氖、氬或氪，其中最好轉(zhuǎn)移盡可能多的溶解氧。通常期望氧的嚴(yán)格排出，但在期望溶液中的氧含量比正常高的某些情況下，空氣或氧本身可通過樣品噴射。在又一個實施方式中，真空可應(yīng)用于樣品，以便使氣體從樣品分離。在又一個實施方式中，使用惰性氣體噴射可跟隨有真空處理，以便除去盡可能多的溶解氧；噴射-抽吸循環(huán)可按需要重復(fù)。舉^皇^^封和#品放入本發(fā)明的幾個裝置提供其自己的密封，例如可變裝填容積的裝置使用用于密封目的的單向閥塞。對于沒有其自己的密封的裝置，例如96孔平板，樣品室可用由硅樹脂、橡膠或其它材料制成的密封件來密封。在一個實施方式中，密封材料對樣品孔的容納物是惰性的，因為液體樣品可在實驗期間開始與密封件接觸。當(dāng)使用在高壓時基本上不可透氧的密封件如橡膠時，在高壓時基本上不可透氧的第二密封件可應(yīng)用到第一密封件上，以減少或阻止氧質(zhì)量傳遞。除了可變裝填容積的裝置以外，單向閥塞還可用在各種其他裝置中，例如96孔平板(其中高達96個的單向閥塞用于密封室)。樣品室可在放入液體樣品之前或之后密封。如果樣品室在放入液體樣品之后密封，則避免了穿透密封件的必要性。然而，如果樣品室在放入液體樣品之前密封，則密封必須允許放入樣品。由例如橡膠或硅樹脂的材料制成的密封件可用針剌破，以便放入液體樣品；第二針可用于從室排出空氣。第二通氣針(ventingneedle)只在需要穿透密封件的程度上插入，并最低限度地延伸到室中，以便盡可能多得取出空氣。一旦空氣完全排出，且液體開始從室排出，室的填充便結(jié)束。因為橡膠和某些硅樹脂在高壓時基本上是氧相對不可透過的，因此可應(yīng)用第二密封層，以便阻止高壓時的氧質(zhì)量傳遞。在高壓時基本上不可透氧的Mylar⑧或其它適當(dāng)材料的層可鋪在第一密封件上。應(yīng)注意，雖然上面在藥物的背景下討論了高壓裝置，特別是用于蛋白質(zhì)的重折疊的高壓裝置，但是這些裝置的應(yīng)用不限于藥物或蛋白質(zhì)重折疊。裝置可用在需要樣品特別是液體樣品的壓力處理的任何應(yīng)用中。例如，Kunugi等人的Langmuir，15:4056(1999)研究了在不同壓力下水溶液中熱響應(yīng)聚合物的溫度和壓力響應(yīng)行為。壓力影響化學(xué)反應(yīng)是公知的；壓力可影響反應(yīng)動力學(xué)(具有負(fù)活化體積的反應(yīng)-皮較高的壓力加速；見Vaneldik等,ChemicalReviews89:549(1989)和Drljaca等，ChemicalReviews98:2167(1998))和反應(yīng)熱力學(xué)(具有較低的系統(tǒng)體積的轉(zhuǎn)換被較高的壓力協(xié)助；見J.M.Smith等,IntroductiontoChemicalEngineeringThermodynamics,NewYork:McGraw-Hill,2001)。通過下列例證性實施例將進一步理解本發(fā)明，其不是用來限制本發(fā)明的。實施例實施例1炎^孝馬身直染并W^^溶濕it^f溶遂;遂合J豸發(fā)在壓力處理期間研究了使用圖13-18中描述的溶液混合裝置的溶液交換。已知濃度的考馬斯藍染料的稀釋物放置在一個預(yù)混合容器(0.015mg/ml染料的1.0ml)中。在另一個預(yù)混合樣品容器中，放置1ml的純水。壓力慢慢增加到2000巴。在此壓力10分鐘之后，連接到室的側(cè)入口的高壓閥關(guān)閉，且高壓注射器縮回，以調(diào)節(jié)柱塞流動(先進行校準(zhǔn)，以使注射器泵的柱塞位置相對于預(yù)混合容器和接收溶液容器的柱塞位置相同)。樣38品被收集，且在570nm下測量UV/VIS吸收率，以確定交換后染料的最后濃度(圖22)。該數(shù)據(jù)與考馬斯藍的標(biāo)準(zhǔn)比較。進行三個連續(xù)的實驗，以確定在操作圖13-18中描述的溶液交換裝置之后出現(xiàn)的混合程度。0.55+/-0.5的吸收率值被測量，其相應(yīng)于0.0092mg/ml染料的染料濃度。后混合的染料溶液與純水的1:1稀釋應(yīng)導(dǎo)致在570nm具有0.43的吸收率的0.0075mg/ml的染料濃度(圖22)。研究證明，在操作裝置三次之后出現(xiàn)混合，且1.24體積的溶液包含與0.75體積的去離子水混合的考馬斯藍染料。該數(shù)據(jù)表明，溶液交換在壓力處理期間出現(xiàn)。實施例2在在力^理歡/《^溶濕it換森合W^^蛋^溶萄凍^在力,浙i本實施例證明，在壓力處理期間的溶液交換改變了來自蛋白質(zhì)聚集體的天然蛋白質(zhì)的重折疊和恢復(fù)。在前面的工作中，St.John等人證明，當(dāng)GdnHCl的非變性水平在壓力處理期間出現(xiàn)時，可最佳化蛋白質(zhì)聚集體的壓力引起的重折疊。St.John等人指出，在2000巴培養(yǎng)5天之后，溶菌酶重折疊恢復(fù)從在0.2MGdnHCl的ca.30%線性增加到在2MGdnHCl的ca.80%(StJohn,R.J"J.F.Carpenter,等.(2002)，BiotechnologyProgress18(3):565-571)。圖23示出來自當(dāng)前溶菌酶重折疊研究的結(jié)果，其中GdnHCl濃度在增壓到2000巴之前("沒有交換"樣品)和加壓期間("HP交換，，)控制。(大氣控制也運行，并證明壓力處理需要重折疊溶菌酶聚集體。)溶菌酶在高壓時以1MGdnHCl重折疊(沒有溶液交換)，從而導(dǎo)致ca.53%的重折疊產(chǎn)量。溶菌酶在高壓時也以0.5MGdnHCl重折疊，沒有溶液交換，從而導(dǎo)致ca.27。/。的重折疊產(chǎn)量。當(dāng)溶菌酶在初始的1MGdnHCl濃度重折疊時，接下來是在壓力處理期間溶液交換和還原到0.5MGdnHCl濃度，產(chǎn)生ca.47%的重折疊產(chǎn)量。因此，雖然后面兩個實驗都有0.5MGdnHCl的最后濃度，但是沒有交換的溶液具有比交換的溶液低得多的重折疊產(chǎn)量。在0.1MGdnHCl下重折疊的不交換的溶菌酶溶液具有比在0.5MGdnHCl下結(jié)束的溶液低得多的重折疊產(chǎn)量。高壓使疏水和靜電接觸不穩(wěn)定，但對氬鍵結(jié)合作用很小。另一方面，GdnHCl使氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定。因此，添加非變性水平的GdnHCl幫助促進溶菌酶的重折疊。在高壓溶液交換期間，最初較高的GdnHCl濃度(1M)將溶菌酶聚集體引入對聚集體分解更有利的環(huán)境。然后，結(jié)束在壓力下的溶液交換，以使最后的GdnHCl濃度為0.5M。如前所述，可以看到，即使0.5MGdnHCl"不交換，，的樣品和溶液交換的樣品的最后溶液條件均相同，首先在較高的1M離液劑濃度開始的能力在溶液交換的樣品中促進重折疊。1MGdnHCl"不交換，，的重折疊產(chǎn)量強調(diào)溶菌酶在2000巴當(dāng)存在1M胍時保留在天然結(jié)構(gòu)中(Randolph,T.W.，M.Seefddt，等.(2002)，BiochimicaEtBiophysicaActa-ProteinStructureandMolecularEnzymology1595(1-2):224-234)。因此，溶菌酶的重折疊產(chǎn)量沒有因高濃度離液劑的出現(xiàn)而降低。在降低離液劑濃度的壓力處理期間的溶液交換可能對增加蛋白質(zhì)的產(chǎn)量更有利，蛋白質(zhì)對胍HC1的出現(xiàn)更敏感。這些結(jié)果顯示，在高壓處理期間使用溶液交換技術(shù)來成功地增加蛋白質(zhì)聚集體的重折疊產(chǎn)量的能力。所使用的實驗條件如下聚集體母雞蛋白溶菌酶的水懸浮液放置在具有在pH8.0的50mMTris-HCl、1MGdnHCl、5mMGSSG、2mMDTT的一個預(yù)混合容器中。第二預(yù)混合容器充滿不含蛋白質(zhì)的在pH8.0的50mMTris-HCl、0MGdnHCl、5mMGSSG、2mMDTT。才羊品凈皮加壓10分鐘的一段時間到2000巴的最后壓力。蛋白質(zhì)保留在增強溶解的緩沖液中6小時，此時使用圖14所示的溶液交換裝置開始溶液交換。最后合并的溶液(現(xiàn)在在接收容器中)在解壓之前在2000巴下保留另外6小時。在2000巴和l巴的壓力下，測試控制，其中重折疊的相同的溶菌酶聚集在包含50mMTris-HCl、0.5或1MGdnHCl、5mMGSSG、2mMDTT的pH8.0溶液中。從接收容器收集樣品，且通過類似于由Jolles(Jolles,P.(1962)."LysozymesfromRabbitSpleenandDogSpleen"MethodsofEnzymology5:137)描述的方法的方法測量溶菌酶催化活性。40在這里通過確認(rèn)引用而參考的所有出版物、專利、專利申請和公布的專利申請的公開內(nèi)容由此在這里以引用方式全部并入。雖然為了理解清楚的目的，作為例證和例子在一些細(xì)節(jié)上描述了前述發(fā)明，但是對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，很顯然某些小的變化和更改將被實踐。因此，描述和例子不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.一種用于液體樣品的壓力處理的容器，其包括用于容納所述液體樣品的至少一個室，其中所述容器由柔韌的材料制成，其中所述材料可經(jīng)受高達10千巴的多維壓力，而沒有破損或破裂，并任選地在高壓時基本上是不可透氧的。2.如權(quán)利要求l所述的容器，其中所述容器在標(biāo)準(zhǔn)壓力下具有可變裝填容積。3.如權(quán)利要求2所述的容器，其中所述容器包括筒體，所述筒體具有第一端和第二端；可移動的塞插入所述筒體的所述第一端中；以及可拆卸的部分固定到所述筒體的所述第二端。4.如權(quán)利要求3所述的容器，其中所述可拆卸的部分是有螺紋的螺帽。5.如權(quán)利要求3所述的容器，其中所述可拆卸的部分是可從所述容器切掉或從所述容器拆掉的末端。6.如權(quán)利要求2所述的容器，其中所述可移動的塞包括止回閥。7.—種使樣品經(jīng)受高壓的方法，其包括將樣品引入權(quán)利要求l的所述容器中，使所述容器經(jīng)受高壓，以及將所述壓力減小到大氣壓力。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述樣品是聚集體蛋白質(zhì)和/或變性蛋白質(zhì)的溶液。9.如權(quán)利要求l所述的容器，其中所述容器由選自下列組中的材料形成聚對苯二甲酸乙二酯、高密度聚乙烯、聚苯乙烯和聚苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物。10.如權(quán)利要求l所述的容器，其中所述容器在標(biāo)準(zhǔn)壓力下具有恒定裝填容積。11.一種用于在高壓下溶液交換的裝置，其包括至少一個第一容器，其容納第一液體樣品；一個或多個附加的容器，其容納附加的液體樣品或樣品，其中所述第一液體樣品和附加的液體樣品或樣品可以相同或不同，其中所述容器由可經(jīng)受高達5千巴壓力而沒有破損或破裂的材料制成，并任選地在高壓下基本上是不可透氧的，且其中所述一個或多個附加的容器的所述液體樣品可與所述第一容器的所述液體樣品混合或接觸，同時笫一容器和附加的容器及其相應(yīng)的液體樣品可在混合或接觸之前、期間和之后維持在高壓。12.如權(quán)利要求ll所述的裝置，其中當(dāng)所述一個或多個附加的容器包括兩個或多個附加的容器時，所述兩個或多個附加的容器的容納物可與所述第一容器的容納物混合，而與所述其它兩個或多個附加的容器無關(guān)，或與所述其它兩個或更多附加的容器一道。13.如權(quán)利要求ll所述的裝置，其中容納液體樣品的所述至少一個第一容器是預(yù)混合容器(其中所述液體樣品可以相同或不同)；容納附加的液體樣品或樣品的所述一個或多個附加的容器是另一預(yù)混合容器，其中所述笫一液體樣品和所述附加的液體樣品或樣品可以相同或不同，以及所述裝置進一步包括至少一個附加的接收容器，其中所述接收容器在傳遞之前可為空的，或在傳遞之前可包含液體或固體組份；其中所有的所述容器由可經(jīng)受高達5千巴壓力而沒有破損或石皮裂的材料制成，并任選地在高壓時基本上是不可透氧的；其中在容納液體樣品的所述預(yù)混合容器中的所述液體樣品可傳遞到所述至少一個接收容器中，由此所述液體樣品可彼此接觸和/或混合；以及其中容納液體樣品的所述預(yù)混合容器、所述至少一個接收容器和所述液體樣品本身可在接觸和/或混合之前、期間和之后維持在高壓。14.如權(quán)利要求13所述的裝置，其進一步包括混合裝置，所述混合裝置置于容納液體樣品的所述預(yù)混合容器和所述至少一個接收容器之間的流體通路中。15.如權(quán)利要求14所述的裝置，其中所述混合裝置是靜態(tài)混合器。16.如權(quán)利要求ll所述的裝置，其中所述第一容器包括用于容納第一液體樣品的室，所述第一容器由可經(jīng)受高達5千巴壓力而沒有破損或破裂的柔韌材料制成，并任選地在高壓時基本上是不可透氧的；以及一個或多個附加的容器，其中所述一個或多個附加的容器由可經(jīng)受高達5千巴壓力而沒有破損或^s皮裂的柔韌材料制成，并任選地在高壓時基本上是不可透氧的；其中所述一個或多個附加的容器完全^^皮所述第一容器包圍，且其中所述一個或多個附加的容器包含附加的液體樣品，所述附加的液體樣品可相同，或與彼此和與所述第一液體樣品不同；其中所述一個或多個附加的容器當(dāng)在所述第一容器內(nèi)時可被打開，由此所述第一液體樣品和所述附加的液體樣品可接觸和/或混合。17.如權(quán)利要求16所述的裝置，其中所述一個或多個附加的容器包括可被維持在封閉位置的蓋，其中所述蓋可^iT開，而沒有打開所述第一容器；且同時所述第一容器、所述一個或多個附加的容器以及所有的液體樣品可在打開所述一個或多個附加的容器的所述蓋之前、期間和之后維持在高壓。18.如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述蓋還能夠?qū)谒龅谝蝗萜髦械乃鲆后w樣品與包含在所述一個或多個附加的容器中的所述液體樣品混合。19.如權(quán)利要求17所述的裝置，其中所述蓋包括磁化部分，例如磁盤。20.如權(quán)利要求ll所述的裝置，其中所述至少一個第一容器和所述一個或多個附加的容器連接在流動回路中。21.如權(quán)利要求20所述的裝置，其進一步包括止回閥，由此流體可在所述回路中只在一個方向流動。22.如權(quán)利要求ll所述的裝置，其中當(dāng)所述至少一個第一容器中的液體在與所述至少一個附加的容器中的液體混合和/或接觸時，所述至少一個笫一容器中的所述至少一個第一液體樣品的一個或更多溶液條件:故改變。23.如權(quán)利要求22所述的裝置，其中所述一個或多個溶液條件選自以下pH、鹽濃度、還原劑濃度、氧化劑濃度、還原劑濃度和氧化劑濃度、離液劑濃度、精氨酸濃度、表面活性劑濃度、優(yōu)先排除的化合物濃度、配位體濃度、原來存在于溶液中的任何化合物濃度、或附加的另外反應(yīng)物或試劑濃度。24.—種在高壓下改變?nèi)芤簵l件的方法，其包括提供容納第一液體樣品的至少一個第一容器；提供容納附加的液體樣品或樣品的一個或多個附加的容器，其中所述至少一個第一液體樣品之中的至少一個和所述附加的液體樣品或樣品與其余樣品不同；其中所述容器由可經(jīng)受高達5千巴壓力而沒有破損或破裂的材料制成，并任選地在高壓時基本上是不可透氧的，以及使所述一個或多個附加的容器的所述液體樣品與所述第一容器的所述液體樣品混合或接觸，由此改變所述至少一個第一液體樣品的溶液條件；同時在混合或接觸之前、期間和之后維持高壓。25.如權(quán)利要求24所迷的方法，其中所述至少一個第一液體樣品的所述一個或多個溶液條件選自以下pH、鹽濃度、還原劑濃度、氧化劑濃度、還原劑濃度和氧化劑濃度、離液劑濃度、精氨酸濃度、表面活性劑濃度、優(yōu)先排除的化合物濃度、配位體濃度、原來存在于溶液中的任何化合物濃度、或附加的另外反應(yīng)物或試劑濃度。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述至少一個第一液體樣品的所述一個或多個溶液條件是pH。27.如權(quán)利要求26所迷的方法，其中所述至少一個第一液體樣品的所述pH在溶液交換之前是約pH9到約pHll，而所述至少一個第一液體樣品的所述pH在溶液交換結(jié)束之后是約pH7到約pH8.9。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述至少一個第一液體樣品的所述pH以逐步方式變化。29.—種多樣品容納裝置，其包括用于容納液體樣品的至少兩個室，其中所述裝置當(dāng)經(jīng)受高壓時將所述室維持為基本上封閉的系統(tǒng)。30.—種多樣品容納裝置，其包括a)主體，其由在高壓下維持整體性的材料制成；b)在主體中的多個樣品室，其適合于容納液體樣品；其中所述裝置既不允許液體樣品在所述多個樣品室之間也不允許在任何樣品室和周圍環(huán)境之間有效傳遞。31.如權(quán)利要求30所述的裝置，其中所述多個樣品室包括至少96個樣品室。32.如權(quán)利要求30所述的裝置，其中所述主體由選自下列組的材料形成聚對苯二甲酸乙二醇酯、高密度聚乙烯、聚苯乙烯和聚苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物。全文摘要公開了用于在高壓處理期間容納樣品、特別是容納液體樣品的裝置。該裝置實現(xiàn)了各種功能，例如在多室裝置實施方式中樣品的高通量篩選，以及在高壓處理期間溶液條件的調(diào)節(jié)。裝置設(shè)計成在高壓條件期間維持整體性，并任選地基本上是不可透氧的。文檔編號B32B5/02GK101568427SQ200680051027公開日2009年10月28日申請日期2006年11月21日優(yōu)先權(quán)日2005年11月21日發(fā)明者J·D·安特曼,L·K·海斯特伯格,M·B·斯費爾特,R·L·克里斯曼,R·尼爾森,T·W·倫道夫申請人:巴羅福德公司