專利名稱：阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供一株阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌株及其生產(chǎn)的菌劑，屬于生物高技術領 域，是利用微生物的方法降解化學農(nóng)藥殘留，適用于環(huán)境污染的治理和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠 色無公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工。
背景技術：
阿維菌素(Avermectins簡稱AVM)是從阿維鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出的一種新 型、高效生物農(nóng)藥，已在很多國家登記使用，是目前中國應用最廣泛的理想抗寄生蟲藥，廣 泛適用于蔬菜、果樹、棉花和花卉等作物，阿維菌素的產(chǎn)量和用量近年來增長迅速。模擬農(nóng)藥飄移和流失來評價阿維菌素對土壤環(huán)境的作用證實其半衰期為20-47 天，而滅菌土壤中不會發(fā)生阿維菌素的代謝。對阿維菌素與土壤結合能力的研究表明，阿維 菌素與土壤顆粒緊密結合，使之成為環(huán)境中的不流動農(nóng)藥，在土壤中易形成結合態(tài)殘留。阿 維菌素的長期大量使用帶來了環(huán)境污染及農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留等問題，研究阿維菌素的微生 物降解對于保護環(huán)境及保障農(nóng)產(chǎn)品安全具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
技術問題本發(fā)明的目的在于針對生產(chǎn)實踐中的實際問題和需求，開發(fā)研制出一種 新型的農(nóng)藥殘留降解菌劑，能夠加快土壤和植株中阿維菌素農(nóng)藥的降解，一定時間以后使 用過降解菌劑的處理中殘留量降低99%以上，且費用較低。使用該降解菌劑既可以消除環(huán) 境中特別是土壤中阿維菌素農(nóng)藥的污染，又可在農(nóng)作物的正常生長過程中正常使用阿維菌 素農(nóng)藥進行病蟲害的防治，從而保證農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素農(nóng)藥殘留含量符合綠色食品要求。技術方案下面為本發(fā)明的主要內(nèi)容一株阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌，該菌株革蘭氏染色為陰性，2010年03月05日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院 3號，中國科學院微生物研究所。菌種保藏號為CGMCC NO. 3640，經(jīng)鑒定為伯克霍爾德氏菌 (Burkholderia sp.)，主要生物學特性，LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后可以形成直徑為0. 5-1. 5mm 菌落，菌落圓形、白色帶略微黃色、表面光滑、有光澤、邊緣整齊，甲基紅和VP反應為陰性， 接觸酶測定陽性，氧化酶測定陰性，吲哚試驗為陰性，該菌株能以阿維菌素為唯一碳源和能 源進行生長，在實驗室條件下對阿維菌素的降解率達85%以上。用上述的阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌生產(chǎn)的降解菌劑，是通過以下方法生產(chǎn)而成1.將試管種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；2.將上述培養(yǎng)好的菌種按5 %的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期， 種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖IOg ΙΛ酵母膏Ig ΙΛ (NH4)2SO4 1. Og IANaCl 0. 5g Γ1，其余為水，pH 7. 2-7.5 ；3.將種子液按5%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基 相同；
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4.在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1 0.6-1. 2，攪拌速度 為180-240轉/分，培養(yǎng)溫度為30°C，全流程培養(yǎng)時間為48-60小時，發(fā)酵結束后菌體數(shù)量 達到10億個/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。有益效果本發(fā)明提供一種消除阿維菌素農(nóng)藥殘留的降解菌劑，菌株能以阿維菌素 為唯一碳源和能源進行生長。使用該發(fā)明生產(chǎn)的農(nóng)藥殘留降解菌劑具有生產(chǎn)成本低，使用方便，去除效果好的 優(yōu)點，適合治理環(huán)境中阿維菌素造成的污染和在全國糧油蔬菜生產(chǎn)出口基地或有綠色食品 商標標志的地方大面積推廣使用。本發(fā)明對于保護生態(tài)環(huán)境，保護人民的身體健康，提高農(nóng) 產(chǎn)品的附加值具有重要的意義。菌株AW64能夠加快土壤和植株中阿維菌素農(nóng)藥的降解，一 定時間以后使用過降解菌劑的處理中殘留量降低99%以上。使用該降解菌劑既可以消除環(huán) 境中特別是土壤中阿維菌素農(nóng)藥的污染，又可在農(nóng)作物的正常生長過程中正常使用阿維菌 素農(nóng)藥進行病蟲害的防治，從而保證農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素農(nóng)藥殘留含量符合綠色食品要求。 并且該菌為革蘭氏陰性菌，在田間的存活時間適當，不會影響以后農(nóng)藥使用效果。降解菌劑產(chǎn)品直接施用可使土壤中農(nóng)藥阿維菌素殘留量降低99%以上，能夠有 效地消除土壤污染，緩解植株受藥害癥狀，解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥阿維菌素殘留超標問題， 可生產(chǎn)出無毒無公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品。該降解菌劑可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設備進行生產(chǎn)。 本發(fā)明成功的解決了環(huán)境中特別是土壤中農(nóng)藥阿維菌素農(nóng)藥的殘留超標問題，既充分發(fā)揮 化學農(nóng)藥阿維菌素在植物病蟲害防治中的高效快速的作用，生產(chǎn)出無毒無公害的綠色農(nóng)產(chǎn) 品，又可以修復環(huán)境中阿維菌素農(nóng)藥的污染。
四

圖1接種量對菌株AW64降解阿維菌素的影響圖2初始pH對菌株AW64降解阿維菌素的影響圖3溫度對菌株AW64降解阿維菌素的影響圖4農(nóng)藥濃度對菌株AW64降解阿維菌素的影響圖5外加營養(yǎng)原素菌株AW64降解阿維菌素的影響圖6 土壤中菌株AW64對阿維菌素的降解的影響
五具體實施例方式1菌株的分離和鑒定取污染土壤5g，力卩入到IOOml的無機鹽培養(yǎng)基(NH4NO3 1. 0，KH2PO4 0. 5， K2HPO4L 5，NaCl 1.0, MgSO4 · 7H20 0. 2，pH 7. 0)中，添加阿維菌素至 50mg/kg 作為唯一碳 源，于30°C，150rpm搖床培養(yǎng)獲得富集液，連續(xù)稀釋涂布添加阿維菌素的LB平板，挑取單 菌落在無機鹽加阿維菌素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別提取檢測，通過紫外掃描，高效液相色譜 驗證其降解能力。最終經(jīng)初篩、復篩，得到一株阿維菌素高效降解菌株AW64，48h對50mg/ kg阿維菌素的降解率大于90%。該菌經(jīng)多次轉接后，進一步純化并鑒定為伯克霍爾德氏菌 屬(Burkholderia sp.)。其主要生物學特性為LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后可以形成直徑為 0. 5-1. 5mm菌落，菌落圓形、白色帶略微黃色、表面光滑、有光澤、邊緣整齊，甲基紅和VP反 應為陰性，接觸酶測定陽性，氧化酶測定陰性，吲哚試驗為陰性，該菌株能以阿維菌素為唯一碳源和能源進行生長，在實驗室條件下對阿維菌素的降解率達90%以上。2實驗室生物降解實驗2. 1接種量對AW64菌株降解阿維菌素的影響AW64培養(yǎng)至對數(shù)期，以2%、5%、10%、15%的接種量接入阿維菌素為50mg/L的無 機鹽鹽培養(yǎng)基(NH4NO3 1. 0，KH2PO4 0. 5，K2HPO4 1. 5，NaCl 1. 0，MgSO4 · 7Η20 0. 2，pH 7. 0) 中，30°C、150rpm搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)48h取樣檢測。如圖1 結果顯示，2%、5%、10%、15% 接種量的降解率分別為70%，81%，92%，88%，接種量越大，AW64降解阿維菌素的速率得 到加快，但超過10%以后效率增加不明顯。2. 2初始pH對菌株AW64降解阿維菌素的影響AW64在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期后以10 %的接種量接入初始pH為4. 0、5. 0、 6. 0,7. 0,8. 0,9. OUO阿維菌素為50mg/L的基礎鹽培養(yǎng)基中，30°C，150rpm搖床振蕩培養(yǎng)， 48小時后取樣檢測。如圖2 菌株在pH為6. 0-9. 0之間降解性能良好，pH低于6. 0或者高 于9.0降解性能顯著受到抑制。2. 3溫度對菌株AW64降解阿維菌素的影響AW64在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，以10%的接種量接入阿維菌素為50mg/L的基 礎鹽培養(yǎng)基中，分別于10°C、20 V、25°C、30 V、35°C >40 V >50°C, 150rpm搖床振蕩培養(yǎng)，48 小時后取樣檢測。如圖3所示菌株在20-40°C之間降解性能良好，溫度低于20°C或者高于 40°C降解性能顯著受到抑制，最適降解溫度為35°C。2. 5農(nóng)藥濃度對菌株AW64降解阿維菌素的影響AW64在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，以10%的接種量接入阿維菌素濃度分別為5、 10、50、100、200、400、800mg/L的基礎鹽培養(yǎng)基中，30°C、150rpm搖床振蕩培養(yǎng)，48小時后 取樣檢測。如圖4所示400mg/kg的阿維菌素對降解有一定的抑制作用，菌株能夠很好的 降解低濃度的阿維菌素(5mg/kg)。2. 6外加營養(yǎng)元素對菌株AW64降解阿維菌素的影響AW64在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，無菌水洗滌兩次后加入等體積的無菌水制成 菌懸液，以10%的接種量接入阿維菌素濃度為50mg/L且分別添加0. 2%的葡萄糖、酵母膏 和蛋白胨，30°C、150rpm搖床振蕩培養(yǎng)，48小時后取樣檢測。如圖5所示，外加營養(yǎng)元素對 降解沒有影響。3菌株AW64在土壤中對阿維菌素的降解試驗稱取IOmg阿維菌素農(nóng)藥，溶于IOOml的丙酮中，將農(nóng)藥拌入過篩風干菜園土中， 使其濃度為50mg/kg。將處理好的土樣置于花盆中，噴施水使其含水量達到飽和含水量的 40 %，放置36h待用，準備一定量的AW64菌液，離心后等體積無菌水清洗懸浮。在處理中添 加菌液，所加菌液為先前制備的無菌水清洗懸浮的菌液，添加約7. 0 X 106CFU/g (以干土計) 的降解菌株，對照中添相同體積的無菌水，分別于2、4、6、8、10、12、14天后取土樣檢測農(nóng)藥 濃度。結果如圖6 表明菌株AW64能夠加快土壤中阿維菌素的降解，經(jīng)過兩周的降解，土壤 中的阿維菌素被降至檢測不出。4用上述的阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌生產(chǎn)降解菌劑1.將試管種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；2.將上述培養(yǎng)好的菌種按5%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖IOg ΙΛ酵母膏Ig ΙΛ (NH4)2SO4 1. Og IANaCl 0. 5g Γ1，其余為水，pH 7. 2-7.5 ；3.將種子液按5%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基 相同；4.在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1 0.6-1. 2，攪拌速度 為180-240轉/分，培養(yǎng)溫度為30°C，全流程培養(yǎng)時間為48-60小時，發(fā)酵結束后菌體數(shù)量 達到10億個/ml，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑，每桶 20公斤。5AW64菌株對南豐蜜桔中阿維菌素殘留修復試驗于2007年3月到11月在江西南豐縣市山鎮(zhèn)密桔園進行。試驗區(qū)總面積 2000m2,處理和對照各重復3次，每個重復小區(qū)面積約為333m2。阿維菌素施藥劑量均為當?shù)?農(nóng)戶正常使用劑量，為河北保定農(nóng)藥廠生產(chǎn)的20g/L阿維菌素乳油稀釋2000倍噴施，分別 噴施3次。處理小區(qū)在第2次和第3次噴藥后3天分別噴施菌劑AW64，菌劑由南京農(nóng)業(yè)大 學微生物中試工廠生產(chǎn)，菌數(shù)1. 3X101(lCFU/ml，菌劑稀釋100倍噴施，每畝用量為5L。最 后1次施菌劑后第7天分別在對照和處理小區(qū)用五點取樣法采蜜桔鮮樣500g檢測阿維菌 素含量。結果如表1，對照中阿維菌素平均殘留為0. 247mg/kg，而處理中無任何殘留。表1阿維菌素降解菌株AW64在南豐蜜桔上的應用
權利要求
一種阿維菌素殘留降解菌，其特征在于，該微生物是革蘭氏染色陰性的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)的菌株AW64，其保藏號為CGMCC 3640。
2.一種用權利要求1所述的阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌株生產(chǎn)的降解菌劑，是通過以下 方法生產(chǎn)而成1)將試管種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；2)將上述培養(yǎng)好的菌種按5%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種子 罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖IOg L—1，酵母膏Ig Γ1, (NH4)2SO4 l.Og L^NaCl 0. 5g L-1， 其余為水，PH 7. 2-7. 5 ；3)將種子液按5%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；4)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1 0.6-1.2，攪拌速度為 180-240轉/分，培養(yǎng)溫度為30°C，全流程培養(yǎng)時間為48-60小時，發(fā)酵結束后菌體數(shù)量達 到10億個/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高效降解農(nóng)藥阿維菌素的菌劑，屬于生物高技術領域。所用菌株為AW64，鑒定為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)，能以阿維菌素為唯一碳源和能源進行生長，48h對50mg/kg阿維菌素的降解率大于90％，降解菌劑產(chǎn)品直接施用可使土壤和南豐蜜桔中農(nóng)藥阿維菌素殘留完全去除，能夠有效地消除土壤污染，解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中阿維菌素殘留超標問題，生產(chǎn)出無毒無公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品。
文檔編號A62D3/02GK101928688SQ20101020422
公開日2010年12月29日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權日2010年6月21日
發(fā)明者宋瑤, 朱建春, 李 榮, 李順鵬, 王融, 蔣建東 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學