專利名稱：一種降低膽固醇的基因工程菌和激活因子的發(fā)現(xiàn)及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種降低膽固醇的基因工程菌(Comamonas testosteroni)和激活因子的發(fā)現(xiàn)，該有效的工程菌株和激活因子可作為降低膽固醇的藥物，飼料添加劑和非類固 醇的醛類和酮類殺蟲劑的農(nóng)藥殘留的清除劑應用。屬于生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甾體類化合物水解酶(3aHSD)是Comamonas testosteroni菌體內(nèi)關(guān)鍵酶，此酶主要的功能是有效地分解雌(留)稀二酮，5a 二氫睪丸酮，雄留酮，膽汁酸，類固醇等物 質(zhì)，這些雌(留)稀二酮，5a二氫睪丸酮，雄留酮，膽汁酸，類固醇等物質(zhì)，均來自于膽 固醇的代謝。
膽固醇的形成和代謝共有如下途徑1.膽固醇作為細胞的結(jié)構(gòu)成分。2.膽固醇 的生理轉(zhuǎn)變在腎上腺皮質(zhì)一皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮，醛固酮等調(diào)節(jié)糖鹽代謝。在睪丸和卵巢 可轉(zhuǎn)變雌(留)稀二酮，5a 二氫睪丸酮，雄留酮等類固醇。在肝臟膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁 酸。人體膽固醇小部分來自食物，大部分由體內(nèi)自行合成。正常情況下體內(nèi)合成量可 自動調(diào)節(jié)，以保持一定的水平，過多過少都不利健康。但對中老年人，由于內(nèi)分泌水平 的改變，或因精神過度緊張，體力活動減少，或患高血壓、肥胖等病，脂質(zhì)代謝失調(diào)， 使血清膽固醇增多，臨床實踐證明，當血漿總膽固醇高于200mg%時，隨著膽固醇的升 高，動脈粥樣硬化程度顯著增加，冠心病發(fā)病率呈直線上升。許多資料表明，血漿總膽 固醇達時，冠心病的發(fā)病率比血漿總膽固醇為200mg%時高7倍，死亡率高2 倍。每降低的血漿總膽固醇濃度，就可相對降低2%的心腦血管病的危險性(包括發(fā) 病率、惡化率和死亡率)；每增加的血漿總膽固醇濃度，心腦血管病的危險性就會升 高約2%。人類天然缺欠是膽固醇的代謝中小腸黏膜缺乏調(diào)節(jié)機制，使得食物中大量的 膽固醇和類膽固醇淤積于血漿中，而這些類膽固醇代謝緩慢，大約20-30年才能代謝完 成，由此并發(fā)了血脂升高或動脈粥樣硬化的后果。
本發(fā)明在Comamonas testosteroni染色質(zhì)DNA中克隆出的一段DNA片段560bp編碼了一種提高細菌活性片段蛋白，可以促進留體類化合物水解酶的基因表達，作為降低 膽固醇的藥物，將3aHSD提取純化制備腸溶型制劑，增加人類小腸對類膽固醇的調(diào)節(jié)， 將大量的β膽固醇等類固醇分解為C02和水，達到治療高膽固醇血癥的目的，預防動 脈硬化和心臟病。同時采用留體類化合物水解酶作為飼料添加劑和農(nóng)藥殘留的清除劑應用。發(fā)明內(nèi)容
C.testosterone, 3a HSD酶是一種可降解多種類固醇化合物的關(guān)鍵酶，能催化類膽固醇類化合物分解及非類固醇的醛類和酮類殺蟲劑，分解殺蟲劑的毒副作用.但是由于 3aHSD酶表達量甚微，很難達到應用的目的，本發(fā)明通過提高3aHSD酶基因的強啟動子 重組，獲得高3a HSD酶表達的菌株，具有明顯的降低膽固醇和分解醛類和酮類殺蟲劑作用，使本菌株得到生產(chǎn)應用.
首先將tac啟動子基因克隆到克隆到質(zhì)粒pK18的BamHI酶切位點中，再將激活 子基因克隆到tac啟動子的下游構(gòu)成PK^artw質(zhì)粒。將此質(zhì)粒整合到C.testosterone中， 得到變異株C.T.從而構(gòu)建成為具有留體類化合物水解酶高表達基因得工程菌。
上述工程菌.主要特征為
(1)本工程菌具有獨特的分解類固醇類化合物和脂肪的功能，用其表達產(chǎn)物可以 降低膽固醇類化合物，用于制備低膽固醇飼料添加劑和降低膽固醇藥物.
( 在自然環(huán)境中，有許多的化學農(nóng)藥污染，本工程菌具有可以降低膽固醇類化 合物和非但固醇類醛類和酮類殺蟲劑，凈化環(huán)境.
實施方案
實施例1:
(1)用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌，在培養(yǎng)基中加入20-30ug/ml卡那霉素，即可維持 3aHSD酶的高表達，從 而提高基因表達產(chǎn)物的水平。
(2)用本工程菌(Comamonas testosterone)0.1mlOD600nm = 1.0 時，提取的表達產(chǎn)物連續(xù)喂養(yǎng)小鼠2周，小鼠血液中膽固醇和甘油三酯含量與正常對照小鼠比較有降低 趨勢.


圖1.降低膽固醇的基因工程菌Comamonas testosteroni和激活因子基因重組原理圖。將tac啟動子基因克隆到克隆到質(zhì)粒pK18的BamHI酶切位點中，再將激活子基因 克隆到tac啟動子的下游構(gòu)成質(zhì)粒
圖2.重組工程菌表達3aHSD酶電泳圖片。
工程菌提高酶活性的菌
野生型菌未具有提高酶活性的菌
3 α-HSD:純化的甾體類化合物水解酶
M 分子量標準條帶
kDa 分子量
圖3.重組工程菌表達3aHSD酶對市售牛奶膽固醇分解功能的檢測圖。
1，為未加3aHSD酶作用組，
2，3分別為3aHSD酶作用組，圖中結(jié)果可以看出，牛奶中為加入3aHSD酶或具 有明顯的分解膽固醇的作用，兩個試驗組和對照組結(jié)果，經(jīng)統(tǒng)計學分析差具有顯著性差 異(P < 0.01)。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明是通過基因篩選和重組得到一種留體類化合物水解酶高表達工程菌株。
2.通過研究的得到高表達激活子變異株。
3.該工程菌株有效的提高微生物分解化學有害物質(zhì)的能力。
4.使用工程菌表達產(chǎn)物具有特異性降低動物或人類血液中膽固醇含量的能力，因 此，用其表達產(chǎn)物可以制備降低固醇類化合物和脂肪的藥物，也可以制備降低固醇類化 合物和脂肪的飼料添加劑和農(nóng)藥的污染清除。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降低膽固醇的基因工程菌的發(fā)現(xiàn)及應用，該菌株是通過高表達的3α-羥基固醇脫氫酶(甾體類化合物水解酶)(3a-Hydroxysteroiddehydrogenase，3a-HSD具有特異性降低動物或人類血液中β膽固醇含量的能力，用其表達產(chǎn)物可以制備降低固醇類化合物的藥物，也可以制備分解非類固醇的醛類和酮類殺蟲劑固醇類化合物清楚農(nóng)藥殘留和低β膽固醇的飼料添加劑。屬于生物領(lǐng)域。本研究采用基因工程方法和高效液相色譜等手段得到高表達的3α-羥基膽固醇脫氫酶菌株，可提高膽固醇的分解，應用于藥物研究和動物飼料添加劑。
文檔編號A62D101/04GK102021136SQ20091019218
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月9日
發(fā)明者任政華, 霍澤仁 申請人:任政華, 霍澤仁